Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Спонтанная популяционная изменчивость Aureobasidium pullulans (DBY.) Arnaud в связи с полисахаридообразованием

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Спонтанная популяционная изменчивость Aureobasidium pullulans (DBY.) Arnaud в связи с полисахаридообразованием"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБНРГСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ

ИНСТИТУТ

на правах рукописи

РГ6 ОД

Р f M КЛЕЦКО

; '' ' Людмила Ивановна

НДК 582.282.21:575.222.?

СПОНТАННАЯ ПОПНЛЯЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ

AUREOBASIDÎUM PULLULÀNS (D BY. ) ARNAUD В СВЯЗИ С ПОАИСАХАРИДООБРАЗОБАНИЕМ

03.00.07 - МИКРОБИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБНРГ -1994

Диссертационная.работа выполнена на кефадра микробиологии Санкт-Цатврбургского хидшко-фармацавтичеокогв института

, Научный руководитель - ■ доктор биологических наук, заслуженный деятель науки РФ, академик США, профессор Н-,П. ЕДИШВ

Научный консультант • кандидат биологических наук, старший каучвдй сотрудник ■ Ы.И. ПРОНИНА ■

Официальные оппоненты;' ' доктор биологических наук Ь'.П, ЯЩЩЩ. ^ кандидат биологических наук А.Д.. КОШУНАРСКАЯ

Ведущая .организачия - Цооковскай Государственный Университет

им. Ы.В. Яошн<?со$§

Защита' соотоится июня б * часов

на заседании специализированного совета К 084,63,Ш при Санкт-Дзтербургском химико-фармацевтическом институте цладреоу ' 197376, Санкг-Цетербург, ул. проф, Пмова, 14.-.

С диссертацией моано ознакомиться в библиотеке Санкт- Цатер-бургокого химико-фармацевтического института,.

.Автореферат разоолан мая 1994 года

S

Ученый оекретарь . . ■ ^ /)

специализированного оовета, п (J^cA

какл"дйт Спслогичеоких наук ■ ^ A.B. ШММОНА

Актуальность темы . Вид АигеоЬаа1<11щп ри1Хи!аая

используется в настоящее время в странах СНГ, Японии, США кяк продуцент экзогликанов. Ня кафедре микробиологии СПХФИ имеется коллекция культур данного видя, в которую включен штамм 8 А. ри13и1аав

- продуцент оригинального экзоглюкана - аубаэидана; Тахнслогня его получения была апробирована на Красноярском заводе медцрепараюв, где впоследствии был создан ОПР на получение данного полиса;^ ридм. Ранее было установлено, что опытные серии ауб^зидана, полученные на КЗМП, я затем - и на Ладыжинском биофармацевтическом объединении "Энзим" отличались друг от друга по ряду показателей, что могло о *-висеть от популяционной вариабельности культуры-продуцента, однако эта проблема оставалась недостаточно исследованной. Данная работа посвящена изучению спонтанной популяционной изменчивости А. рц11ц-

1ааа 8 в связи с синтезом аубазидака.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в определении закономерностей спонтанной популяционной изменчивости А. ри11и1ав» 8

в зависимости от условий, культивирования, а также влияния факторов стабилизирующего отбора в отношении наиболее продуктия-ных по экзогликану вариантов. Конкретные задачи были следующими:

- определить подлинность таксономической принадлежности исследуемых культур;

- изучить диапазон вариабельности всех культур на разных средах;

- оценить стабильность продуцентов при хранении;

- изучить зкзогликяны, продуцируемые всеми тест-культурами;

- отобрать и исследовать наиболее продуктивные варианты с цольп . выработки практических рекомендаций.

Научная новизна. В результате исследований установлено, чгв стручту.ы популяций А. рц11и1ааа 8 и ого вариантов аасыл дин«кичку:

часгрт» йо.чникнолеичя различных м.1р?о.:оп!"ееких типов » их »л*№И<х/

- 2 -

Т -3

(«ХОДОВ ДОСТАТОЧНО ВЫСОКА (10" - 10 ). '

Выявлена коррелятивная связь между уровнем активности образования экоогликянов отдельными вариантами и их морфолого-культуряльны-

МИ СВОЙСТВАМИ'. *.

Док*з*ко стабилизируюгце? действие питательного агара Сябуро не трлько в отношении морфолого-культуряльных, ко и физиолого-био--,гкмических характеристик A. pullulana 8 и его вариантов.

Показано, что эффект стабилизации полисахаридйобразования связям с изменением соотношения клеток различных морфологических типов к. pullulons прч замене сусло-агара на ягяр Сябуро.

Установлено, что вариантам A. pullulana 8 свойствоння

различная степень стабильности при хранении.

Установлено генетическое единообразие геномов исследуемых культур A. pullulons 8 и его вяриянтов с помощью полимерязной цепной реакции с универсальным пряймером 45.

Показано, что обработка - клеток A. pullulons 8 и его

вариантов акридиновым оранжевым приводит к стябилизяции культур ( зя исключением "белого" вяриянтя) по морфолого-культуряльшм признакам , а также к увеличению их способностей к синтезу экзогликяня .

Практическая значимость. Установлено, что использование агара Сябуро для получения посевного материала сопровождается сужением диапазона вариабельности культур по образованию окзогликанов и возрастанием частоты вариантов, обладающих большей способностью синтезировать аубязидан.

Покязянс, что для стабилизации на высоком уровне полис»х*ридо-обрязовяния необходимо, чтобы в процессе ферментации в популяции продуцента преобладали клетки низковяри«больчых продуктивных типов; г*то мо-кет быть достигнуто двумя путя.чи: лиЛо использованием стабили-аируищей среды Сябуро .для полу ""и иг- инокулк""», либо кскусгтввпнь^.« сс';лянием популяцию-ассоциатор,

Одним кэ предпочтительных"способов сохранения яиэнесгюсоонши продуцентов является их хранение ня скошенном сусло-ягяре при 4-5°С в течение год« без пересевов ( до Ю лет - по наблюдению М.И. Прониной).

При сокращенном времени вырящивяния посевного материал« ( от 7 суток ня сусл'р-ягяре - по регляменту-, до 2 суток ня агяре Сябуро -по няшим дянным) и сокращенной длительности форментяции ( от 120 чясов - но регляменту,- до 96 часов- по данным няших экспериментов) можно достичь регляментного выходя экзогликяня в случяе культивиро-вяния продуцентов ня среде Чяпекя-Докся с исходным знячением рН 4,0 (вместо 6,2 - 6,4).

При ферментации четырехсуточных культур продуцентов ня среде Чяпекя-Докся с исходным рН 6,2 - 6,4' ( либо с рН 4,0) в течение 120 чясов удяется достигнуть двухкрятного увеличения вы::одя конечного продуктя.

Полученные реэультяты мсгут быть использованы для совершенство-зяния биотехнологии яубазидяня в лабораторных и производственных условиях.

Апробация ряботы. Материалы диссертяции были доложены ня Пленарной Сессии микробиологического обществ« и Няучного Совет* по проблеме "Микробиология" РАН ня конференции "Микробиология в биотехнологии" (1993) и ня заседаниях сотрудников кафедры микробиологии СПХФИ (1992, 1993, 1994).

Публикяции. Мятериялы диссертяции опубликовяны в трех стятьях в журнллях "Микробиология" РАН, "Микология и фитопатология" РАН.

Объем и структуря диссертяции. Диссертация состоит из вьедения( обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и библиографии. Ряботя наложена ня ^^-стряницях, содержит ¿тР. тяг.лиц, (С. рисунков. Список wnipywoi', литйр^туры иото''Ни:'ов.

Материалы и методы исследования.

В качеств.е объекта исследования использовали культуру А. ри1-1и1апз штамм 8 - продуцент оригинального экзоглюкана

аубазидчн», а также 4 его спонтанных варианта.

Изучение некоторых морфологических и биохимических свойств А, ра11и1апя 8 проводили в соответствии со "Схемой стандартного описания новых видов дрожжей"(Бабьева, Голубев, 1979).

Изменчивость культур по морфолого-культуральным признакам изучали на трех средах: сусло-агаре, агаре Сабуро и среде Лодцвр и • Крвгер ван Ридж с добавлением 1,0$ ( ННд)2 (Блинов ,1964).

Для рассева использовали взвесь дрожжевых клеток двухсуточных куль -

с

тур, выращенных на сусло-агаре, густотой 1,0*10 кл/мл. Количество клеток в суспензии определяли в камере Горяева. Исходную суспензию разводили стерильной водой в Ю* - 10^ раз и по 0,1 мл каждого разведения вносили в чашки Петри и распределяли шпателем по поверхности среды. Чашки с посевами инкубировали в течение 7 суток при 25 + 1°С. При описании морфологической изменчивости культур учитывали размер выросших колоний, их форму и окраску, обр»зование меланинов, наличие воздушного мицелия.

Ферментации проводили при 25Й°С в колбах ЭрлеимеИера вместимостью 750 мл со 100 мл жидкой питательной среды Чапека-Докса с 5,0% сахара-рафинада при непрерывном перемешивании на качалках (И- 220 об/ мин) в течение % часов. Засев ферментационных колб проводили посевным матери*лом, выращенным в аналогичных условиях в течение 48-50 часов.

Выход полисахарид« определяли чесовым методом. Культуральную жидкость центрифугировали при 35 ООО об/мин в течение 10 мин для отделения клеток от полисахарид», к суперн*т«нту приливали дв* обьом» 96% этанола. Отделенный ет ' н»пое-лочноП жидкости полисахарид

- 5-

пцеушивали до постоянного веся при Ю5°С.

Исследуемые культуры pullulans хранили и ряЕмножялн

ня скошенном сусло-ягяре в пробирках дияметром 20 мм , рН до стерилизации устанавливали равным 6,2 - 6,4. Культуры выращивали на скошенном сусло-агарз в течение 7 суток при 25 + 1°С и хранили Е холодильнике при 4-6°С. Кроме того, для длительного хранения продуцентов

яубяэидяня использовали лиофилизяцию с применением различных сред: 0,3% водного раствора аубазидана; 10% раствора сахарозы; среды, состоящей из 10% раствора сахарозы, 1,5% желатина, 0,1% агар-агар»; сусла с 7% сахара; снятого молока. Режим лиофилизацил : при ( -£0°) С в течение 24 часов, затем медленный подогрев до 5°С в течение 4-6 часов. Ампулы запаизали под вакуумом и сохраняли в холодильнике пр;; 4-6°С. После окончания процесса лиофилиэации определяли жизнеспособность лиофильно ьысушенных культур.

Образцы чистых полисахаридов получплн из неразбавленной фсрчон-тационьой массы с помощью ультрацентрифуги MOM 3170 В ( 35 000 об,'мин 10 мин). Супернат»нт очищяли от остатков питательной среди и продуктов метаболизма двухкратным осаждением 96% этанолом. Осадок растворяли я дистиллированной воде и затем вновь осаждали 95% этанолом. Полисахарид высушивали при 40°С в таченне 6-8 ч-сов. Полученные образцы анализировали по следующим показателям: удельному вращению - н« автоматическом поляриметре "Terlcin - Elmer-241" соотношению гликозлдяцх связей - методом перподатного окисления ( У1еУгУи Lange ,1933).

Клеточные лизаты получали по методу Булата и др.11992). Мицелия л ьную пленку трехсуточной культуры суспендировали в лиэирующем буфере и инкубировали 3 часа. Для очистки и осаждения ДНК использе-вали последовательно смесь хлороформ-скт«нод, изопропанод и эгаиол. Осадок, содержащий ДНК, растворяли г буфере ТЕ с РНКазой А и полученный лизат - грубый препарат ДНК - хранили при 4-б°С.

Иох-ичвразную цепную раакцнч (1ЩР) проводит в 30 мкл буфера, содлркащяго 10-200 ИР аН«Л1МИрулмО<» Г9НОЧ1ИМ» ДЧК (0,1 - I МКЛ лип>тя>.

2 ~ 3 ед тер\<ост«бильной ДНК- полииерязы '"^'УТЩ^ ЪЬепаорЬИив (Кябоев и др., 1909), по 40-100 нг пряймеров. ПЦР (30 циклов), осуществляли н" термоциклере в режиме: денатурация -92°С, 50 сек; отжиг - 53°С, 60 сек; синтез - 70°С, 70 сен. Использовали универсяльиый пряйчер 45 ( Булят и др., 1992; Чакроусоь ; 1993).

Разделение смеси ямплифицировянных фря тентов ДНК проводили в «гярозном геле (1,7$), который окряшивяли бромистым этидием и фотографировали ня пленку "Микрят - 300 " в УФ-свете (302 нм) (Мяниятис и др., 1984).

Для обработки культур якридиновым' орянжовым (АО) готовили ряс-твор последнего в стерильной дистиллированной воде в концентрации 5 мг/мл, стерилиэовяли фильтровянием через фильтр Звйтця, зятем дс~ бявляли в рясплявленный и охляжденный до 40°С сусло-ягяр до дости-кения концентрации 200 мкг/мл. Среду ряэливяли в пробирки, которые зясевяли культурями двухсуточного возрястя, прадвярительно вырящен-ными ня сусло-ягяре. В целях повышения эффектя действия АО проводили по 5 последовятельных пересевав кяждой из исследуемых культур ня питательную среда' с АО в пробиркях.

Статистическую обработку дянных проводили по известным методям ( Жуковя, Коммунярскяя, 1978).

Результаты исследований и их обсуждение I. Спонтяинчя изменчивость А» риНиХолхо в популяциях

В результате нящих исследовяний устяновлено, что популяция клеток ри11и1«шя 8 _ гетерогення и расщепляется при ряссевях ня ягяркзовянних питательных средах ня несколько типов, отличающихся по морфолого-культурялыши и физиолого-биохимическим ПрИЗНЯКЯМ.

В тяблице I предст^Блени д-чп'ыг по г.понтяш'ой изменчирости Д. ри11и1<ше» щт^и-.«» £1 и его б*рк»итов при ря*витии мя сррд--ч: у.*п-

Т«бЛИЦ» I.

Спонтрннгя изменчивость А, ри11и1ааа щт«мчн В и его вг.рк'пгтоа по морфолого-культуряльным признякпм нп средах различного сост»бя

Название среды Число просмотр. клонов ___Частот ' I я_ПЕоявле! П Ш 1 1у А_____ у

очень крупные, светлобежезые, морщинистые ■ 1 очень крупные, бежевые, еек-ториоов»нные, морщинистые да i аа р. к <и я лай я к а а> р.« ¡ТОО о v и оГ я « 03 ю о 0> « я ог ж ч р.« !й о ц> ф я и я т к о»я У,X ч к 'V м » « «

Сусло-«гар Агяр Сабуро Среда Лоддер Исходный штамм

1359 1163 592 62,25 87,02 65,60 21,64 9,71 1,10 5,07 1,60 5,30 7,91 32,60

Сусло-»гар Лгяр Сабуро Сред» Лоддер "Светлобежевый" 'вариант

918 юса ■ 426 59,00' 97,80 83,50 21,70 13,40 1,00 0,40 4,90 1,30 11,50

Сусло-агар Агчр С»буро Сред» Лоддер "Бежовый" вариант

1407 1411 400 11,40 92,40 87,60 62,00 19,80 1,30. 3,10 3,40 6,10 4,50 9,СО

Сусло-агар Агар С*буро Среда Лоддер "Черный" вариант

1021 707 472 17,00 87,70 75,60 13,60 62,40 1,10 0,70 5,90 11,60 24,40

Сусло-агар . Агар С«буро Сред* Лоддер "Белый" вариант

2280 696. [>12 •^,30 24,40 Г., 30 1,00 0,30 67,50 74,40 91.00 о,90 1,20 . "2,«0 | _______!

личного состав.*. Для определения границ морфологической вариабельности культур их ряссевяли на 3-Х средах: сусло-агаре, агаре Сабуро и среде " Лоддер и Крегер вац Ридж(с добавлением 1,0$ ( яя^)г 30^). Популяционный состав ПрОДУЦвНТОВ зависел ОТ состава ПИТЯТвЛЬНОЙ среды. Н»ибольш»я вариабельность культур проявлялась при рассеве на сусло-*г»ре ( выявлено 5 морфологических типов), няимвньш»я - при рассеве на агаре Сабуро и среде Лоддер и Крегер вян Ридж с добавлением 1,0$ (N114)2 304 ^ П0 три морфологических типа на каждой среде).

Основным морфологическим типом для штамма 8 во всех случаях являлся морфологический тип - "светлобежевый": частота его появления в популяции составляла 62,25$ - 87,02$.

В свою очередь при рассевах вариантов штамм* в на сусло-агаре основным для них являлся тип, определяющий название соответствующего морфологического варианта. Так, в популяции "светлобежевого" варианта колонии"светлобежевого" типа составляют 59,0%; в популчции "бежевого" варианта - "бежевого" - 62,00%; частота встречаемости колоний "черного' типа У "черного" варианта - 62,40$; "белого" типа у "белого" вариан -та - 87,50%. При р»ссевах на агаре Обуро и среде Лоддер и Крегер в»н Ридж ( с добавлением 1,0$ (^4)2 304 ) У всвх вари»нтов, за исключением "белого", основным являлся "светлобежевый" тип. Что касается "белого" вариант«, то в составе его популяций при рассевах На различных средах ВО ЕСвХ СЛуЧ'ЯХ ОСНОВНЫМ ЯВЯЛЯЛСЯ "бвЛЫЙ" М0рф0Л0-гический тип - 74,40$ - 91,80$', что свидетельствует о его большей генетической стабильности.

Т»ким образом, применительно к популяциям исходной культуры и морфологических вяриянтов А. рц11и1еша 8 , сусло-агар является дифференцирующей, а *г*р Обуро - стабилизирующей средой. Использов«-ние среды Лоддер и Крегер в«н Ридж к качестве стабилизирующей возможно, но не экономично из-п* значительной ( ло 32,80$) частоты появления карликовых морфологических В"РИ«!1Т0Ч, х»р*ктсрияук)!дихсЯ НИЗКИМ уровнем »ктмяиоети обгьзованир поп:«саяагкга..

- э -

При р»адеплении популяции микрооргяниэмоэ н* вярлянчы гдловрл-менно с изменением 'культуральныь характеристик меняются , к»к известно, многие физиологические особенности тест-аультур. С целью шяв-ления коррелятивной связи между уровнем »ктивности обр»пов»ния энзо-глик'нов отдельными вяриянтями и их морфолого-нул ьтур»л ъными сно!:ет~ з»ми был проведен янялиз образования полисях*ридя рязличны»и типями колоний А. ри11и1аде о.

Кяк было;.установлено рянве, естественная популяция штямм» 8 характеризуется высокой вяри»бельностьп по биосинтезу *уб»вид»н*, коэффициент, изменчивости ( с^) рявен 37,80?.'.

Популяции исследуемых в»ри»нтов риН^апо 8 ( вид единых с сусло-ягяря, кяк видно из тяблицы 2 и рис. I., тякке хяряитериоу-ются энячительным р«зм»хсм спонтянной изменчивости в отношении продукции яубязидян»: от няименьсего у "бежевого" вяриянт» (25,3?%) до наибольшего у "кошчневого" (46,0®).

Существует зависимость между морфологическими особенностями но • лоний и их биосинтетическлми способностями: наибольшее количество экээглик*н» синтэзируют культуры "б'алог~" вяриянтв, нчименьаее -"коричневого" (т»бл. 2),

Применение среды Сябуро для вырящивяния посевного м«тери»ля ПрИ-ЗЭЛО К суЛвНИП ДИЯПЯ30КЯ ВяриябелЫЮСТИ КуЛЬТур ПО сбр»30Б»НИЮ экзо-' глик»нов ( в пределах контроля) и к увеличению частоты вариантов, обладающих большей ( по сравнению с контролем) способность» синтегиро-вять яуб«зидян (тябл. 3, рис. I).

Тяким обрязом, ягяр Сябуро окяэ»лся стабилизирующей средой не только в отношении морфвлого-культур«льных, нэ и физиолого-биохимк-ческих хяряктериоткк ри11и1апя .

Эффект стабилизации полисяхяридообряаов»ния связан с изменением соотношения клегок различных морфологических типов А» ри11и1пля при зямене оусло-«г»р* н» ягяр Сябуро.

В результате изучвнчч изменения пвпулшп:онного соот»в« 6

в прецесев ферментации на ерем Чяпекя-Докгя при вир^ияякии пс^я

Таблиц* 2.

Изменчивость 8 д.. pallulcna , . по признаку образования полисахарид«

оти выр»пив»нии посевного м»териал* на сусло-»г^ре

■ Няганеноврние в'ри^нтоэ Образование полисяхаркдя, % к контролю Коэффициент изменчивости {с*},¡6 Ч«СТОТа ВариянТОВ С ИЗ-мекенной активностью , %

X i и предела колеб*ний пляс-вяриянты минус-варианты

"светлобеяевкЯ" 96,67 + 5,74 57,36 # 131,62 23,02 0 0

"белый" 98,15 ± 7,22 31,00 i- 192,00 38,23 7,41 Í 5,04 1.,, 0

"бежевый" 119,00 i 6,88 76,90 ^ 200,00 25,85 5,00 £ 4,87. 0

"черный" 90,00 î 8,75 31,00* 192,00 40,06 5,88 £ 5,71 0

Таблиц» 3.

Изменчивость исследуемых вариянтов . Л. риНоХапо шт^кмя 8 по признаку образования

аолнсяхярид» при вирадивянии посевного материала на ягяре Сябуро

1 Наименование ; вариантов Образование полисахарида, % к контролю Коэффициент изменчивости Частот* вариантов с измененной ЯКТИЕНОСТЬЮ, %

! х ± т пределы колебалий плюс-вяриянга минус-аяри»¡2ты -

| "светлобежевый" ! 107,89+ 4,30 61,00 * 137,50 ■ 17,36 0 0

| "белый" 1 108,101 5,15 61,00 4- 150,00 21,82 0 0

{ "коричневый" ! Ь . ' 1 100,53 ± 5,16 61,00 * 150,00 22,36 5,26 £ 5,12 0

40 30

20

10

0

t«

и о н к

к

X

я.

£

30 -

20 10

о

40

30

20 10

0

30 20

10

0

50 40

30

20

х ± 2 6

S

(II)

(а)

30 20 10 0

х±2<5

ÍL

40 80 120 160 _ х± 26 '

:t2<S

0 40 80 120 160

РИС. 1. Образование П0ЛИС»Х»рИД» Вариантами ШТ«ММ» 8

(I) - при выр»цив»нии посевного

м»тери»л» н» сусло-»г»ре,

(II) - при выр»Щ7в«нии посевного

м*тери»л» на *г»ре С»буро; (»)-"светлобежевый" в»ри»нт, (б)- "белый", (в) -"коричневый". (г) -"бежевый", (л)- "черный".

О 40 80 120 160 200 240

Образование полисах»рил* J к контр.

нсго материала на сусле-*гаре и агаре Сябуро устяновлено, что в по-

I

пуляции А. рц11и1апв 8 в случае с сусло-агаром преобладали клетки основного "светлобежевого" и "черного" типов ( 34,77% и 46,17$ соответственно), а при использовании посевного материала, выращенного на агаре Сабуро - "светлобежевого" и "бежевого" типов (65,37$ и 10,39$ соответственно): Культуры "черного" типа , как ¡было указано' ранее, характеризуются боле<* низшим, чем у "бежевого" уровнем активности

синтеза ЭКЗОГЛИКанОВ| ' . '

В популяциях морфологических вариантов А, ри11и1апя 0, •

за исключением "белого", при выращивании посевного материала на агаре Сабуро также доминировали клетки продуктивных низковарцабельных . "светлобежевого" и "бежевого" типов. В популяции "белого" варианта при ферментации преобладали клетки, формирующие при рассева на 'сусло-агаре колонии "белого" типа (71,0| - 92,8Й).

Следует обратить внимание на то, что к концу ферментации в популяции "черного" варианта наблюдали высокий (16,3$) процент клеток ииэкопродуктивного"коричневого"типа, тогда как для популяций остальных исследуемых вариантов это не было характерно.

Таким обраВСЧ, эффект стабилизации- Полисяхаридообразования При использовании агара Сабуро объясняется изменением соотношения клеток различных морфологических типов в пользу клеток низковариабвльных продуктивных типов.

При исследовании способности к синтезу полисахарида у искусственно созданных популяций-ассоциантов, в составе которых преобладали клетки тех или иных морфологических типов, было обнаружено, что выход полисахарида при использовании В КячеСТВЙ ПОССВНОГО материала культур относительно ниэковариабельного Продуктивного варианта с одним из внеоковариабельннх увеличивался с уменьшением коэффициента вариабельности последних. Так, способность ;< синтезу полисахарида. у ассоциации Культур "бвЖвВОГО" И "коричневого" вариантов - Сам»Я НИЗ-

kfík' выход "иатшшого" полисахарида - 7,93 г/л, ч'со составляет t>9,W ир отношении к контролю (8,94 г/л). Выход полисахарида при сочетании "бежевого"- н "белого" вариантов - 9,ЗР г/л (105,0% к контролю);

"бежевого" и "черного" - 10,51 г/л (118,0% к контролю).

- ■ ** .

В ассоциации высоковариабвльного "белого" варианта и ВЫСОКОВЯ-pj; »бального "чорндге" , обладающего бодее низкой продуктивностью и •меньшей скоростью роста, основными являлись клетки "белого" тина и нивкеняриабвльиего и'менее продуктивного "сввтлобежеьоге" (57,53% и 42,14:''. соответственно). При предварительной стабилизации ассвциацтов ( выращиванием посевного материала на среде Сябурс) доля клеток "белого" типа, в искусственной, популяции составляла 74,86%. Отсутствие колоний "черного" типа при рассевах спр£двлялрсь, вероятно, его низкой скоростью роста ( по рравнению с' остальными вариантами), а также . • ■ i

ecpfe« селективными" преимуществами клеток "белого" типа. .

Таким образом, для стабилизации полисяхаридообразовяния нвобхс-дяно, к те бы r процессе ферментации в популяции продуцента-преобладали клетки низковгриабельных-продуктивных типов, что может быть дестигпу-то двумя путями: либо использованием стабилизирующей среды Счбуро Яля получения >.нокулюма, либо искусственным созданием популяций-ао-ооцуантов. - •

Наиболее простым в исполнении и эффективным является первый путь, особенно при использеьчннн в качества продуцента "белого" вариан т^, попудкция которого в данном случае менее гетерогення, я предуктнв-НО^гь нлеток .авизирующего в значительной степени "белого" кипа достаточно высока.

2. СцвНЙЯ стабильности спонтанных вариантов при хр*неник

puiiulwiB С, свойствен-»'* различная степень ста-,C»*i и»: ПК при 'хранении , что л.у|?„ш »сего и^лястр!груотой результатами

опытов.по сохранению культур в лйофилыю высушенном состоянии.

Из табл. Ц видно, что варианты обладают различной степенью резистентности к высушиванию вне зависимости от состава сред. Яянг.'.-.-ль -шим диапазоном защищенности характеризуется "белый" вариант, наименьшим - "черный".

К сожалению, все культуры A. pullulans 8. оказались

и -

кэчувствительными к лиефи^изации. -

Одним из предпочтительных способов сохранения прдуцентов,, гаррц-тарутоцич полную вьгдйв«емость культур и сохранение их биосиптетичэс-ких способностей является хранение н* косяках сусло-»гара при 4-bftC ( срок наблюдения - I год). Но данным М.И. Прониной культуры ' A.pul-ltilasa О могут сохраняться в таких условиях до 10 лет без периодических пересевов. Из табл. 5 видно, что состав популяций продуцента?» после хранения в точение I года ( без пэресевов) в вышен*зс. иных условиях изменялся , обеспечивая, очевидно, выжигание наиболее приспособленных форм. При этом нэ наблвд«лось существенных колебаний в образовании экзогликанов, диапазон вариации культур по этому признаку И количество винтззируомого полисахарида оставались на исходном уровне ( рис. 2, Тйбл. 6).

3. Экэогликаны, образуемые вариантами A» pulJ.ulaae 8

Все варианты л. pullulans 8 в регламентных условиях культивирования синтезировали аубазмД*Н. При использовании в качоствр ферментационной ерэды для получения пул.тулаца продуктами фер.<аит»ци:1 были полисахариды РАЗЛИЧНОЙ структуры С Преобладанием - ГЛИКОСИД--ннх связей. Очевидно, A. pullülans й - продуцент аубазидан»- г определенных условиях выращивания может синтезировать экзогл'.'.л^нч, отличные по строения от »уб»зидана.

"Гя&ВСр» 4

1г..тиЗ»и»ег'гь бг»-токотсшй различных вариантов 6

(%) поел., хранения

з т«чея«1& '4-х ¿ет в лио$чяьн« гысушеяком состояния при ?емаег»туэе' 4 - П° С

^ост^в

суспензионной среди

' 0,3!С водный раствор ; »у5»яид«н» №1)

Нчкменовяниэ зятэи»нтое-

"езетлобежевый"■

"бежевйй-"

"белый'"

"черный"

сг !

1(К раствор • с®х»розы С 'Г2)

1,03 Ю"

1,'25 1СГ4

.54

1 10% р-т> с»хпрозы,-' \,Ы- кел*тиня,

. - 2,73

' 1,10 10-

6,45

5,00 10"

сусло с 7%сях»р« (М) б,67 Ю"4

4,00 10'

-4

1,50 КГ1.

снятое молоко (!го>

4.00 10"

1.73 1С"

0

0

Габяица 5.

лзучеиие стабильности вариантов A. pollulsms 8 при хранении их в течение I годя

н» сусло-пгррг при температуре 4 - 5° С по морфологическим признакам

Наименование ааои=нтов • ! Число просмотренных . колоний Соотношение различных морфологических типов в популяции, %

"светло-бежевый" "бежевый" "черный" '"белый" "светлобеже-вый да"

1,! "сзотлобежевый" 1241 35,37 3,06 . 0 0,73 60,84

"белый" 1 1583 ■2,27 0,06 4,80 . •92,10 • 0,76

"бежевый" 1105 55,20 ■ 21,90 12,58 9,95

"верный" • 1127 2,84 • \2»04 84,12 . 3,55 7,45

сО 50 40

30

20

(О 10

1 • 0

н

о. 40

()

^ 1 30

! 20

к О 10

о

0

,

«9

;§ . 40

30 20

Ю

О

60 40 30'

'20

10 О

I .. (

1Л

40 ВО 120 160 2 ± 2 6

'40 80 160 200 х ± 2 6 '

"светлобежевый" вариян'

"белый" вариант

"бежевый" вариант

40 60 120 160 200 ' • х ± 2<£

"черный" вариант

Образование ПОЛИС"Харида, % к контролю

О 40 80 120. 200 Рис» 2. Образование полисахарида вариантами I. риНШвПИ В после хранения при 4-5°С в течение Гюд* н* с.уоло-*гяр(>

Г'> блицэ 6.

Образование экзоглпкяня различными вариантами А» роИиЛа&е а после хранения

на сусло-»г»ре в течение I года при температуре 4-5° С

.'•¡эименовянне гарантов Сбртзов.чние ПОЛЙС*Х»рИД» , % к контролю Коэффициент Частота вариантов с измененной яКТИВНОСТЫа, %.

х £ я пределы колебяни:*! изменчивости (С },% фшс-■ зррияетм минус-'■ варианты

"светлобежевый" 96,67+ 5,74 57,36 * 131,62 23,02 0 0

"белый" 98,15+ 7,22 31,00 192,00 38,23 7,41+ 5,04 0

1 | "бежевый" 119,00+ -6,88 • 76,90 т 200,00 25,85 о", 00 £ЯГ,87 0 ".

| "черный" ■90,00 + 8,75' . 31,00 * 192.,00 40,06 5,88± 5,7.1 0 !

4. Хкр»1ГГврИСТЦК* культур после обряботии акриди-

новым оранжевым

Структуры падуляций А. ри11и1аад а . л его вариант'«« очень динамичны: частота возникновения различных морфологических типов и • их вз. имных переходе« достаточно высока - 10"^), чтв характерно

для процесса диссоциации. Частота случайных мутаций, как известно, на несколько порядков ниже.

Процесс диссоциации у бактерий создает фенотипическое разнообразие ферм на .единой генетической основе, а в его регуляции, вереятнв определенный «клад могут гнести мигрирующие генетически» элементы ■ ,{ транспозвиы, прсфагн,'плазмиды, I З-элементы).

У дро,жжеЙ изввйтны чидлер- и 2-хмикронн«я плазмиды, Ту -фактор). У А. ри11а1вкэ половой процесс не обнаружен, и , может быть, столь высокая частота взаимных переходов различных морфологических »иле« объясняется переносе»- генетической информации с участием каких-либо мигрирующих генетических Элементов.

При сравнении геномов исследуемых культур А. ри11и1ахш

с помощьп полнылразной цепной реакции с универсальным праймвром 45 1 *

не биле обнаружено различий между ДНК у вариантов - продуцентов полисахаридов. ■

Обработка клеток Д. ри11и1оио в АО привела к стабилизации культур ( 81» исключением "белого" вариант*) по морфолего-культураль-мым признакам, а'также к увеличению ( на 40% -70$) их биесинтети-чг-.кчх. способностей.

Свхр»»енив культур в точение 15 месяцев н* косяках сусло-агара п коб»гл»ниом АО в концентрации 200 хкг/мд при температуре 4-5®С не СНИЗИЛ» еффвмт» стабилизации вариантов Л. ри11и1апв 8 по мпр Иу»|,"Ура>Ь1[<».*М Ирмнакам, не спасс'шос^ь к сннтеяу ГЖВОГЛ'ИКАНРП у ООЙХ вудкт^р "еаняько снизилась.

Результаты обработки 1. pullulans 8 АО аналогичны в отношении всех вариантов, з" исключением "белого". После обработки АО значительно увеличилась гетерогенность его популяции, а способность к синтезу аубазидан* понизилась; после сохранения в течение 15 месяцев на косяках.сусло-агара с добавлением АО активность синтеза &кзогли-кяна стабилизировалась и, даже, возросла.

• " 1 ' .

5. Исследование") наиболее продуктивных вариантов в стандарт-

них условиях^культивирования ' , .

Поиск высокоактивных в отношении синтеза экзегликанея продуцентов проводили как среди культур наиболее стабильного и продуктивного "белого" варианта, Тан И СрбДИ ОСТАЛЬНЫХ вариантов.

Отобранные культуры "белого" варианта использовали при определении условий биосинтеза с целью сокращения его продолжительности. Для сравнения в д»нном эксперимента брали культуры "белого кратер-НОГО" варианта, ВЫДвЛбННОГО И8 ПОПуЛЯЦИИ обработанного АО "бвЛОГО" при его рассеве на сусло-агаре.

В результате установлено, что возможно сокращение сроков выращивания посевного материала до 2-х суток на агаре Сабура ( вместо 7 на сусло-аг»ре), длительности ферментации - до 90 часов с сохранением регламентного выхода зкзогликана при культивировании Продуцентов на среде Ч»пека-Докс* со значением рН 4,0 ( вместо 6,2 - 6,4).

Можно достичь также почти двухкратного увеличения выхода полисахарид» при культивировании чотЫрехсуточных культур продуцентов на • среде Ч»пек*-Докса с pfí 6,2 - 6,4 ( либо с рН 4,0) в течение 120 часов.

Кроме того, обнаружено, что культуры "белого" варианта в сравнении с "белыми кратерными" обладают большей адаптационной способностью к неблагоприятным воздействиям внешней среды, -что иллюстрируется кривыми роста и выжив»емости данных культур при фармеитациях на средах различного состав* ( рис. 3,4):

1-Ша

w к

« ■ о

S i

Ы I

г

s

№

к S

MC?

!• 10

72 9ô

120

- "белый" вяриянт '¡«•••-"белый крятерный" вярипнт

Чосы феривнт»ции

Рис. 3. Кривые ростя четырехсуточных культур "белого" и "белого . крятерн'ого" врриянтов в процессе ферментяций ня средях; И - Чялегся'-Дбкся,' pli =, 6,2 - 6,4 ; №2 - Чяпекя-Докся ,р1М,0; JÎ3 - Чяпекя-Докс'я, рН = 4,0, с 1,5$ лептоня.

r g

S

•л

о »

§

ю о и о

■и X m

о

Я

Mû

МО

МО

-"белый" вяриянт - "белый крятерный" вяриянт

Ч»сы ферментации

Рис. 4. Изменение ц числ» жизнеспособных клеток четырехсуточных культур "белого" и "белого крмернсго" вярнянтов при 4epfteiiT"H.Mfi.v н* средях:

!П - ';«пикя-Допс«., pli « о,:; - о,4; ("*-) - 4яизья~Доксй, fH - 4,0;(«•-)/•".) ~ Ччшк* -Доне» с цел:ого-' (1,8 г/л), pli 4,0

ВЫВОДЫ

1.При изучении закономерностей спонтанной изменчивости ри11и1авз 8

и его вариантов установлено,-что их популяции гвтврогенны И включапт В Себя, В Зависимости ОТ СОСТава ПЙТ*ТвЛЬНОЙ СреДЫ, 3-5 морфологических типов, характеризующихся высек!?й частей возникновения (Ю-1 -КГ3) и Отличающихся пв мерфологв-культуральиым и фИЗК0Л0Г0-бИ0ХИМИч|)СКИМ признакам. '

2. Максимальное число морфэлогических типов (пять) форм!фуется на сусло-агаре, минимальное ( Три) - на агара Сабуро. Поэтому сусло-агар явялотся дифференцирующей, а агар Сабуро - стабилизирующей средой.

3. Снижение вариабельности продуцентов пэ признаку синтеза зкЗо-гликана может быть достигнуто благодаря использованию стабилизирующей среды для Шфащивания инокулюма или искусствеИнох«у созданию популяций-ассоциантов, в составе которых преобладают клетки низковариабвльных продуктивных типов ("светлэбежевого" и "болевого") Наиболее эффективным и простым па исполнении является пзрэый

путь, особенно при использовании в качестве продуцента стабильного и продуктивного "белого" йариаита.

4. Штамм 8 А. ри11и1апз и ого варианты отличаются высоким уровнем • выживаемости и стабильности синтеза полисахаридов при длительном хранении н» косяках сусло-агара при 4-5°С без периодических пяре-сеаов ( до 10 лет).

Ь, при варьировании УСЛОВИЙ Процесса биосинтеза аубазидана ПО ТЯКИМ параметрам как ВОЗрасТ ПОССВНОГО материаласССТав ферментационной среды и значение рН установлен®, что возможно: - получение зкэогликана в предусмотренном регламентам количестве (V - 1Р. г/л) при использорании в качеств« посевного материала • ".»УССУТ0«Ч0-И культуры продуцент», ВКР«Щ«НН0Й на агаре С'бурЭ

- ¿i • - •••

(вместо семисуточной на сусло-агаре - по регламенту) и последующем выращивании ее на ферментационной среде Чапека-Докса с исходным рН 4,0 в течение 96 часов; .. повысить выход целевого продукт« в дв»;раза, если использовать прсевной материал в возрасте четырех суток, выращенный нй агаро Сабуро , и проводить ферментацию на среде Чапека-Докса с исходным рН 4,0 ь точение 120 часов.

6, Показано, что обработка A. pullulana 8 и его вариантов (за исключением "белого") акридиновым оранжевым в концентрации 200 миг/мл приводит к стабилизации продуцентов по морфологе- культу-ральным. признакам и к повышению ( на 40 - 70%) их способностей

. синтезировать зкзегликян.

Эффект,стабйлизации >культур по морфвлогс-культуряльным признакам сохраняется в Течение 15 месяцев ( время наблюдения) при 4-$вС ня сусло-агаре с добавлением акридинового оранжевого в концентрации 200 мкг/мл, однако способность к синтезу полисахарида несколько снижается..

7. Пслучеинйе данные могут быть положены в основу рекомендаций для включения в сущестэующий 0ПР на яубазидан/ поело их апробации в производственных условиях.

Статьи, опубликованные по теме диссертации *

I. Плинов Н.П., Пронина M.U., Коссиор Л.А., Погребная А.В., Ананьева Е.П,, Сапунова Т,Я., Клоцко Л.И. Особенности мутагенеза и гибри-Д(нации Aurooboeiditm pullulans (О* B-Jr) Xrxiaud Ц Riiodotorule. rubra ( fionue) ¿odder ' - продуцентов полисахаридов// Микология и фитопатология РАН, 1390. Т; ?4, енп.2, с, 136 - 140.

i.. Ктян&* ¡i,П., Пронин» М.И,, Погребая А.В., Коссиор ^.А., Клецке Л.И. ' я xvmmvíockhx му.тягонв» на изменчивость

ЬигчлЪивМию. pvillulana (E.BY), JLranuii шт»м>« b - ирочуцянт* «уб«аи-

дли*// Микребиелегия РАН, 1991, т. 60, в un, 4, е. 674- б'/9. 3. Един»» Н.П., Клецке Л,И. , Прении» М.И, Cnентмжсд п»пуляцие нигч: изменчивость АцгеоЬааШлзд pullulwie (D. Bï) j Axaau^//-Ммнелегин к ^т»и*те*вгия РАН, 1994, , вши i.

U'