Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунобиологические свойства экзогликанов некоторых видов аспорогенных дрожжей

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологические свойства экзогликанов некоторых видов аспорогенных дрожжей"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИИ

ИНСТИТУТ

На правах рукописи

УДК 615.339:582.288:615.031: 612.017:616—097:576.314

КАРАВАЕВА Анна Владимировна

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭКЗОГЛИКАНОВ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ АСПОРОГЕННЫХ ДРОЖЖЕЙ

Специальность: 03.00.07 — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Работа выполнена на кафедре микробиологии Санкт-Петербургского химико-фармацевтического института и в отделе иммунологии института экспериментальной медицины АМН РФ.

Научные руководители: заслуженный деятель науки РСФСР, доктор биологических наук, профессор Блинов Н. П.; доктор медицинских наук Огурцов Р. П.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Аркадьева Г. Е.; доктор медицинских наук Кубась В. Г.

Ведущее учреждение — научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера.

заседании Специализированного совета К 084.63.01 по биологическим наукам Санкт-Петербургского зимико-фармацевтического института по адресу: 197022, С.-Петербург, ул. проф. Попова, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Защита состоится

1992 г. в

часов на

Ученый секретарь Специализированного совет кандидат биологических наук

Автореферат разослан

Н. В. Кириллова

-■лтц

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время поиск средств и тособов избирательного воздействия на отдельные субпопуляции клё-ж иммунной системы остается одним из важнейших направлений в об-юти иммуноФармакологии. Селективная модуляция тех или иных зеньев иммунитета целесообразна при иммунодефиците, .некоторых гтоиммунных заболеваниях, инфекциях. Тем более это важно, когда, зятельность человека привела к большим изменениям окружающей-сре-1 и к появлению новых факторов, которые оказывают неблагоприятное тяние на физиологические, адаптационные возможности организма и, частности, на'иммунную систему человека и животных. Снижается гнкцпональная активность клеток системы мононуклеарных фагоцитов !МФ/, Т- и Ц-лимфоцитов, что приводит к нарушению нормального шунного'ответа и создает благоприятные условия для роста забо-¡ваемости, в том числе и СПИД.

: Известно большое количество иммуномодуляторов различного прохождения, однако используемый в медицинской практике арсенал их ¡велик и механизм'действия таких средств изучен недостаточно.

Наиболее приемлемыми экзогенными яммуномодуляторами являются шества микробного происхождения, в ответ на'воздействие которых иганизм, выработал систему взаимоотношений и'борьбы в течение дольной зволюции. Среди подобных гоялуномодуляторов полисахаридные >епарагы вызывают, несомненно, наибольший интерес. Перспектив-сть изучения гликанов определяется тем, что при широком спектре ологической' активности они обладают весьма низкой токсичностью пирогбнной активностью, и практически не вызывают раздражения. • аней. '

Известно, что изучаемые нами зкзогликакы аспорогенных ожжей ролов Rhodetorula, Cryptecoocus-, А.цгвоЪав1й1ша тивируют СМФ, а также способны коррегировать ряд. дефектов СМФ асунская Е.Б., 1986 ; Турина C.B., 1988/. В этой связи актуаль-дальнейшее изучение механизмов их действия на компоненты им- ' нной системы, в том числе -,на функцию лимфоцитов. . .

Настоящая работа проводилась з соответствии 'с планом НИР ЗХФИ по теме: "Дрожжевые полисахариды: генетико-селекцйонные следования продуцентов, биосинтез и свойства полимеров

/№ государственной регистрации 01.86.0073347/. Тематика вклоте! в программу ГШ 0.74.05 18Н2.

Цель и запачи исслепованид. : / Цель исследования' - изучение воздействия экзогликанов

дрожжей родов с&ге&Л&г/^бъ.

на функцию иммунной системы организма. 7

Задачи исследования:

1. Изучить распределение и длительность пребывания гликаш в организме мышей. ,

2. Исследовать лммуногенные свойства гликанов.

3. Оценить воздействие глйканов на митогенную активность лимфоцитов.

4. Определить влияние гликанов на мнтоген-индуцированную пролиферацию лимфоцитов разного происхождения.

5. Изучить супрессорную активность лимфоцитов под действа! родэксмана. . . •

6. Оценить влияние родэксмана на интерлейклн-1 /ИЛ-1/- и

" инте!5л9Йкин-2'УиЛ-2/-подойную активность в.культуре клеток пер: ферической крови человека и на активность рекомбикантных челов ческих ИЛ-1/3 и ИЛ-2.

Научная новизна -работу. В результате проведенных иселедов ний установлен®, что при введении гликанов мышам они /ПС/ лока лизуются преимущественно в органах ШФ. Длительность пребывани полисахаридов в организме зависела, от их молекулярной .массы и разветвленности молекул, Выявлена Зависимость силы иммунного о вета на гликаны от их молекулярной массы и'длительности пребыв ния в' организме. Показано, что данные полисахариды не являлись митогенами, но изменяли пролиферативный ответ лимфоцитов на ма тогены. Так,, при внесении гликанов в культуру лимфоцитов и при . .введении их мышам ответ на Т-клеточные митогены /ФГА-Р и Кон А . подавлялся; ЛЦС-индуцированный ответ в опытах ин витро не изме нялся, тогда как в 'опятах ин виво повышался. Из этого сл'едуе , .что. гликаны непосредственно действуют на Т-лимфоциты, но не не . В-люуфощты. Нами установлено,, что'. снижение. бласттрансформации в ответ на Т-клеточные митоганы было обусловлено прямым и

опосредованным действием полисахаридов на Т-лимфоциты ; прямое -благодаря экранированию лектиновюс рецепторов, опосредованное -через иммунорегуляторные клетки /Т-судрессоры/ и макрофаги. Показано, что лозы и сроки введения родэксмана, повышающие функ- ' циональнув активность В-лимфоцитов соответствовали дозам и срокам-, при которых родэксман проявлял адт-ювантную активность. Дозы и сроки, повышайте активность Т-супрессоров, соответствовали дозам и срокам, при которых глнкан не проявлял адъювантную активность, выявляемую по возрастанию антителообразования к эритроцитам барана. Родэксман незначительно стимулировал ИЛ-1- и ИЛ-2-полобную активности в культуре лейкоцитов и не изменял активность рекомбйнантних и Ш1-2.

Практическая ценность работы.'Родэксман. криелан, аубазидан г. ПС Сг. 1иг«о1ив как иммуномодуляторы могут быть рекомендованы для апробации в клинических условиях для коррекции нарушенного иммунитета вследствии инфекций и метаболических отклонений /например, при атеросклерозе, диабете/.

Апробация работы. Результаты работы представлены на П Все- . союзной конференции "Результаты и перспективы научных исследований микробных полисахаридов" /Ленинград, 1984/,"на совместном заседаний Ленинградского научного общества микробиологов и эпи-' , демиологов и Ленинградского научного общества иммунологов /Ле-. нияград, 1986/, на рабочем совещании "Иммуномодуляторы природного происхождения" /Владивосток, 1990/..

Публикации.' По материалам диссертации опублккойано 4 работы.

Объем и структура работы'. Диссертация изложена на 148, страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2-х глав собственных исследований, обсуждения полученных ■' .результатов, выводов, указателя литературы, включающего 48 оте-' чественных и 159 иностранных щеточников. Работа иллюстрирована .20 таблицами и 16-рисункамц. • ." "

МАТЕРИМЫ И МЕТОДЫ ИССВДОВАШЯ

В работе использовали следующие виды дрожхей: Bboâotorula • rubra BKU-ï-341, Cryptoooeous luteolue IFO 0411 /из института ферментации в г. Осака; Япония/, Cryptoooeous elinorii BKM-I5II, luxeobtusidtim pailulana8 /СПбХФИ/, а также образуемые ими эхзогликаны.

Гликан, образуемый вь. rubra BlOi-Y-341 /родэксман/ -линейный манная с альтернативно чередующимисяJ8—1,3— и Jf-1,4^ связями, молекулярная масса 500 кДа, рН водных.растворов - 7,0 ; удельное вращение в 0,1 н №аОН -80°.

. Гликан, образуемый Or. luteolue ISO 0411 - разветвленный гетерополисахарид /полиуронид/, основная цепь которого представляет собой *с-1,3-с'вязанний маннан, а боковые цепочки содержат остатки глюкуроновай кислоты и ксилозы, присоединенные к основной цепи JL-гликоэипными связями, Монрсахаридный состав: манноза /56,9?/, ксилоза /15,25?/, глюкуроновая кислота /21,1%/. Молеку-, лярная масса - 500 к Да ; рН водных растворов - 4,0 ; удельное врашеЬие в 0,1 н JteOH -21°.

Гликан, образуемый Or, elinovii ВКМ-1511 /криелан/ - разветвленный гетерополисахарид /полиуронид/, основная цепь которого представляет собой Я-1,3-евязанный маннан, а боковые'цепи со-, держат остатки; глхясуроновой кислоты,: галактозы, ксилозы и фукозы, присоединенные'?, основной,цепи <Ь- и yi-гликозидными связями. Ыоно-сахаридаый состав: йанноза /33,5^/, ксилоза /12%/, галактоза /31%/, глюкуроновая кислота /22,556/, фукоза /1%/. Молекулярная масса ^ 500 нЦа ; рН водных растворов - 3,9 ; удельное вращение в ОД н JraOH +51°'. :

Гликан, образуемый!, pullulons в /аубазидан/,- разветвленный глюкан, основная цепь которого представляет собой J$-I,3-связанные остатки Л-глв^опиранозы, каждый.' третий остаток в поло. жении Cg имеет боковую цепь, содержащую cL-i ,4-связанные глюко-, зидные остатки.. Молекулярная масса - /5 - 9/ х I06 Да ; рН водных

растворов - 7,0 ; удбльцое вращение в 0,1 н ЛаОН -18°. • ,.,'.; Б экспериментах использовали 1000 мышей-самцов .с массой тела 18. - 20 г линий СВА и C57BL ; 12 кроликов породы Шиншила, самцов, массой тела 2 кг, полученных из питомника АМН СССР "Рад-полово".

Иммунные сыворотки против A. pUllulans, Cr. elinovii, Rh\ rubra получали при внутривенном введении кроликам в течение 10' дней 2 млрд взвеси в физиологическом растворе клеток двух суточных культур в возрастающих количествах /от 0,2 мл до 2,0 мл/.

Иммунные сыворотки против экзогликанов получали при их вну- ' трибргсшинном введении мышам линии СБА в дозах I, 10, 100 и 1000 мкг/мышь. Кровь отбирали пастеровской пипеткой из ретробуль-бариого синуса глаза через 5, 7, 14, 21 и 28 суток. Антитела к . Полисахаридам в сыворотке определяли иммуно-Ферментным методом.

Для иммобилизации антигенов /гликанов/ на иммунологических платах использовали метод, разработанный Бобровником С.А. и Ста-родубом Н.Ф. /1988/. Исследуемые сыворотки вносили в платы в разведениях от I/IÛ до Г/5120. В реакции использовали кодаюгат имму-. ноглобулина цротив глобулина мыши с пероксилазой хрена /ЛенНИИВС/ и субстратную смесь /0,8 мг/мл 5-аминосалициловой кислоты /sigma" / рН = 6,0 с 0,04$ Н202/. Результаты учитывали на мультиска-нв /"Tlterteo" / при длине воны 450 им.

Для изучения действия родэксмана на образование антител к эритроцитам барата /ЭБ/ мышей линии C57BL иммунизировали взвесью' ЭБ /0,25 мл внутривенно/ в количестве ю' клеток на мышь. За 7 и I сутки до иммунизации и через I сутки после иммунизации животным вводили родэксман внутрибршинно в лозах I, 10 и 1000 мкг/мышь. Кровь брали через неделю после инъекции ЭБ. Интенсивность антите-лообразования у мышей оценивали по результатам реакции гемаг-.глютинации, которую ставили общепринятым методом.

Для изучения распределения и длительности пребывания гликанов в организме' мышей полисахариды вводили внутривенно мышам ли- • нии СВА в дозе 1,5 мг/мышь. Через 2 часа, 3, 7, 10, 21, 28, 50 и 78 суток животных обескровливали, извлекали печень, почки, селезенку, тимус, брыжеечные'лимфатические узлы, легкие и головной мозг; готовили срезы тканей в криостате при температуре камеры -215°С. Присутствие гликанов в мазках крови, перитонеальном экс-.судате и органах мышей определяли непрямым методом иммунолюминес-ценции /Зубжицкий Ю.Н., Аркадьева Г.Е., 1967/. . • Влияние гликанов на пролифераТивный ответ спленоцитов и ти-моцитов мышей определяли по реакции бласттрансформации /РБТ/ этих. клеток, которую ставили.по методу Мещеряковой И.Е. и др. /1979/.,

В качестве стандартных стимуляторов-литогенеза использовали фито-гемагглютшшн-Р /ФГА-Р/ и конканавалин А /Кон А/ фирмы "Calbio-ohem" /, липополисахарид из' Е. coli /ЛПС/ фирмы "Sigma" . Мито-гены вносили в культуру.в оптимальной дозе: ФГА - 10, Кон А - 5, ЛПС - 20 мкг/мл. Клетки'культивировали 48 часов при 37°С. %-ти-мидин /"Изотоп", Ленинград/.вносили за сутки до окончания опыта ■ из расчета конечной удельной .активности метки 3,7 х I04 Бк/мл. Для подсчета радиоактивности счет вели с помощью ^-счетчика /"EaoSetta" LKB/.

РБТЛ периферической крови человека ставили.в культуре цельной крови /Назаров П.Г., Пуринь В.И., 1975/ или с лейкоцитами, выделенными с помощью желатина традиционным методом, содержащими-или не содержащими адгезирующие клетка. ФГА вносили в дозах 2, 5, 10 и 20 мкг/мл, Кон А - I, 2, 5 и 10 мкг/мл. Клетки культивировали 3-е суток при 37°С. ^Н-тимидин вносили на 2-е сутки. Родэксман в культуру лимфоцитов добавляли в дозах 10, 40, 80, 160 и 320 мкг на флакон /Змл/. Аубазидан и полиурониды использовали в дозе 100 мкг. Все гликаны добавляли либо за 2 часа до внесения лекти-тов, либо череа 2 ча.са после.

Удаление адгезирующих клеток из суспензии лейкоцитов, выделенных на желатине, осуществляли при инкубации их в пластиковых чашках Петри в течение 2-х часов. В культуру лимфоцитов добавляли Кон А в дозе 10 мкг/мл и 'родэксман в дозе 1000-мкг на флакон.

■Для проведения РБТЛ при отдельной стимуляции гликанами адГе-зируювдх клеток лейкоциты разделяли на прилипающие и н.еприлипаю-щие к стеклу инкубацией во флаконах диаметром 20 мм в течение 2-х часов при 37°С. Прилипшие клетки'культивировали-сутки со 100 мкг гликана. Затем фракцию прилипавдйх к стеклу клеток отмывали, -от полисахарида, добавляли к ним фракцию непридипаицих к- стеклу лейкоцитов и Кон А в. дозе 10 мкг/мл. Клетки продолжали культивиро.-' вать еще 2-е суток. ^Н-тцмидин вносили за -сутки до.;, снятия культур".

Судрессорную .активность лимфоцитов человека определяли по методу shou l. .и др'. /1976/. Оценивали влияние родэксмана на-су-.прессорную-активность лимфоцитов человека при добавлении его в дозе 200 мкг или 10 мкг на флакон /4 мл/ в культуру клеток-су-прессоров, стимулированных и не стимулированных Кон А.

Для изучения влияния родэксмана на супрессорную активность спленоцитов, гликан вводили внутрибрюшинно мылам линии СВА в дозах I, 10, 100 и 1000 мкг/мышь. Супрессорную активность спленоцитов определяли через I и 7 суток после инъекции полисахарида. Супрессорнне клетки /2 х 10^ клеток/мл / индуцировали Кон А в дозе 20 мкг/мл и инкубировали 48 часов при 37°С. Затем клетки-су пресс орн облучали Х-лучами в дозе 1000 R, отмывали.и добавляли в клетки-мишени. Клетки-мишени,- I-суточная культура спленоцитов, стимулированная Кон А в дозе 5 мкг/мл. Реакцию продолжали также как и в РБТ спленоцитов мышей /см. выше/.

Получение ИЛ-I и ИЛ-2: к неприлипшим к стеклу клеткам добавляли Кон А в дозе 10 мкг/мл или родэксман в дозе 50 мкг/мл и культивировали их в течение 48 часов ; к прилипшим к стеклу клеткам добавляла ЛПС в дозе 20 мкг/мл или родэксман в дозе 50 мкг/мл и инкубировали их 24 часа. Супернатанты■собирали и хранили при -20°С до определения активности интерлейкинов.

Активность ИЛ-I определяли по костимуляции тимоцитов мыши / Oppenhaim J.J. и др., 1980/. Кон А вносили в дозе I мкг/мл. Су-пернатант, содержщий ИЛ-I, добавляли к клеткам-мишеням в конечном разведении от 1/5 до 1/40. Активность ИЛ-2 определяли по индукции пролиферации лимфобластов человека / Gillis s. и др., 1978/. Клетки-мишени получали стимуляцией лимфоцитов периферической кро- 1 вичеловека лимфоцитарным митогеном /НИИЭМ, МЗ БССР/ в конечной ' концентрации 5% в течение 4-х суток. Супернатант, содержащий ИЛ-2, добавляли к клеткам-мишеням в конечном разведении от 1/8 до 1/60. Затем тест-культуру инкубировали еще 3-е суток, "%-тимидин вносили за 5*часов до окончания культивирования. . •

Для' изучения влияния родэксмана на способность лимфоцитов реагировать на рекомбинанткые ИЛ-1/3 а ИЛ-2 50 мкг/мл гликана и ИЛ-2 в дозе 36 ед/мл или ИЛ-I¡S в дозе Ю00 ед/мл добавляли к клеткам-мишеням. Реакцию проводили в соответствии с выше описанной' методикой. ' | '

Реакцию спонтанного розеткообразования с ЭБ ставили по метолу Mendeа N. и др. /1974/, с, эритроцитами мыши - по методу Gupta S. и др, /1976/. Теофиллин-резистентные Т-клётки определяли по методу Limatibul з. и др. /1978/. Для. оценки влияния гликанов на спонтанное розеткообразованиё их добавляли в дозах I и 0, Гмг/рлл к суспензии лейкоцитов /3 х 10®.клеток/мл /. Пробы инкубировали

30 минут при 37°С, отмывали, ресуспендировали и ставили реакцию спонтанного роэеткообразования.

Результаты экспериментов обрабатывали методом вариационной ■ статистики с вычислением среднего арифметического. Достоверность различий сравниваемых величин оценивали с помощью параметрического критерия Стьюдента /ГОСТ П.004-74/ и непараметрического критерия УаЙта-Уклкоксона /Гублер Е.В. и Гепкин A.A., 1969/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ '

Известно, что интенсивность фиксации антигена в лимфоидных-органах обусловливает интенсивность и длительность проявления иммунологических реакций. Непрямым методом лкминесцирумцих антител было показано, что аубазидан, криелан и родэксман до трех суток -циркулировали в крови, а затем фиксировались в органах мышей. Длительность пребывания гликанов в'организме зависела от их молекулярной массы и разветвленности молекул. Наиболее длительное /более двух месяцев/ пребывание отмечено после введения разветвленного, обладающего наибольшей .молекулярной массой //5-9/ х 10®/ глюкана, аубазидана. Разветвленный гетерополисахарид /криелан/ с молекулярной массой, в 10 раз меньшей, находился в организме мышей до 35 суток, а линейный маннан /родэксман/ с такой же массой-всего три недели. Наши данные согласуются'с результатами исследования Ebert E.H. и др. /1968/, показавших, что'низкомолекулярные фракции декстрайЬв выводились из организма морских свинок быстрее, чем высокомолекулярная. •

Из литературы известно, что. характерной особенностью распределения гликанов является то, что они выявляются в цитоплазме пе-ритонеальных и тканевых макрофагов /Закенфельд Г.К., 1990/.-'Родэксман, криелан и аубазидан. не были Исключением. Этот факт может служить свидетельством непосредственного активирующего действия полисахаридов-на макрофаги, что подтверждает, ранее- полученные сведения. , .

На лимфоцитах гликаны не были обнаружены. Однако исследователи, используюаде радиоизотопную-метку в изучении распределения ■ пневмококкового полисахарида / Kaplan М.Ни др., 1950/ и ПС Candida 'tropicalis /Соколова И.П., 1970/, выявили их на лимфоцитах. Возможно, применяемый нами метод, не позволил обнаружить

полисахариды на этих клетках. Доказательство току - наши опыты по ингибиции спонтанного розеткоббразования гликанами /см. ниже/.

Зависимость икмуногенности гликанов от химической структуры и длительности пребывания их в организме изучали при иммунизации мышей различными дозами полисахаридов в динамике. Оказалось, что' чем больше была молекулярная масса, разветвленность молекулы и длительность пребывания в орагнизые гликанов, тем в более поздние сроки появлялись антитела при более высокой дозе полисахарида и. тем более слабыми были антигены. Так, антитела к аубазигану выявлялись на 21-й день при дозе I мг/Ълдь, к криелану - также на 21-е сутки, но при дозе 100 мкг/мьшь и незначительное количество при ттозе 10 мкг/мышь на 5-е сутки, к родэксману - на 5-й лень при дозе I мкг/мшь'и несколько меньше на 14-е сутки при-дозе 10 мкг/мшь.. Подобную закономерность мы выявили впервые. Более того, среди декстранов различных молекулярных масс, полученных гидролизом из нативного, наблюдали противоположную закономерность / Howard J.G. и др., 1975/..Трудно объяснить этот факт, но скорее всего, это связано с тем, что в процесс синтеза антител вовлекаются специфическое и неспецифическое-стимулирующее действие гли- ■ канов, причем механизм послепнего различен для каждого из них.

Обшим для всех изученных полисахаридов была слабая иммуноген-ность, что, вероятно, связано с активацией ими супрессорных кле- ' ток, возможность которой была доказана наш /см. ниже/. Таким образом, при длительном применении гликанов их антигенные свойства нивелируются или полностью исчезают.

Нами установлено, что родэксман, криелан, аубазидан и ПС Сг. ' luteol'us не являлись митогенами в опытах ин витро и при введе- ■ нии мышам во всех испытанных дозах.

Бласттрансформация лимфоцитов периферической крови человека в опытах ин витро на стандартные Т-клетючные митогены /ФГА-Р и Кон А/ под действием гликанов была подавлена /табл. I/, а на В-клбточный /ЛПС/ в культуре спленоцитов мышей - не изменялась. Та. ким образом, можно думать, что полисахариды непосредственно воздействовали на Т-лимяоциты, но цв на В-лимфоциты.

Эффект подавления РБТ.был доэозависимым /рис. I/. С увеличением дозы гликанов уменьшалось включение 3Н-тимилина в лектин-ин-' дуцированные лимфоциты. В то же время, если подавление бласттрадс-формации-лтаЛчэиитов происходило, при всех испытанных дозах Кон А,

Реакция бласттрансформации лейкоцитов человека на Кон А пол действием гликанов.

Исследуе- Включение Н-тимидина при внесении в культуру, имп/мин

мыв гли-------------"-------------------ё-----------я

каны - Кон А Кон А + ПСа ПС + Кон А0

родэксман 506 ± 28 15738 ± 1899 х865? ± 785 х7894 ± 2552

аубазидан 408 ± 57 8061 ± 3347 5181 ± 2548 .', 4240 t 1750

криелан ' 506 * 28 1573S ± 1899 х8583 ± 2393 ^5933 ± 1589

ПС Cr. lu- 517 i 32 3317 ± 1816 2773 ± 1553 3807 ± 2570

teolua

Примечание. Доза Кон А - 20 мкг/мл, доза ПС - 100 мкг, а - ПС добавляли через 2 часа после Кон А,' б - Кон А добавляли через 2 часа после ПС, x-pi 0,05 , хх - р * 0.001.

то включение метки в ФГА-индуцированных культурах снижалось только при субоптимальных дозах митогена; '.Вероятно, это могло быть связано с тем, что оптимальные и субоптимальные дозы ФГА-Р активировали различные субпопуляции.Т-клеток /Чередеев А.Н.,1984/ и что Кон А и ФГА-Р индуцируют штогенез различными путями /Heven P.J. ,1985/.'

Поскольку рецепторы для углеводов /мембранные лектины/ были обнаружены на мембранных компонентах различных клеток, мы' вправе предположить, что один из возможных-механизмов' ингибиции пролиферации - экранирование лектиновых рецепторов на лимфоцитах полисахаридами. В качестве примера можно привести работу Kieda с. и др. /1979/. Авторы обнаружили мембранные лектины на -Т-лимфоцитэх человека.'Возможность связывания .ПС Str. pneumoniae с лимфоцитами, человеческой крови показали Ur С. с Соавторами /1987/. .

Возможность полисахаридов реагировать с лимфоцитами удалось подтвердить и нам при изучении их способности ингибировать. спонтанное розеткообразование. Показано, что в зависимости от дозы 1 гликаны /кроме аубазидаяа/ снижали процент розеток с эритроцитам*

• барана и мыши в 2 -_3 раза, т.е. происходило их /ПС/ связывание

с лимфоцитами. Более того, поскольку количество розеток с теофил-

• лин-резистентными Т-клетками не изменялось при общем' снижении ро-зёткообразугацих Т-лимфоцитов,■можно думать, что гликаны /кроме родэксмана/ обладали большей способностью соединяться с теофиллш чувствительными Т-клетками /Т-супрессораш/. То, что в данных

+20 К

А

1ПЗП

Б

12 3

В

12 3

-20 ' -40

-60

-80

Рис. I. Реакция бласттрансформации на ФГА лимфоцитов периферической крови человека, обработанных различными дозами родэксмана.

Примечание. Дозы ФГА: 1-2 мкг/мл, 2-5 мкг/мл,-

3-10 мкг/мл, 4-20 мкг/мл ;

лозы ПС: А - 10 мкг, Б - 80 мкг, В - 320 мкг ;

К - контроль ФГА ;

по вертикали - отклонение от контроля, %. ■

опытах аубазидан не был эффективным свидетельствовало о том, что в механизм ингибиции пролиферации - данным гликаном вовлекались другие процессы, которые будут рассмотрены ниже.

Если снижение бласттрансформации,обусловлено только экранированием лектинових рецепторов, то предварительное перед углеводом внесение митогена в культуру должно отменять или сильно снижать ингибирущеа действие гликанов, поскольку рецепция лектинов '.идет в первые минуты инкубации /Хоробрых В.В., 1983/. В наших опытах, независимо от схемы внесения углеводов, пролиферация лейкоцитов, на Кон А снижалась по. сравнению с контролем /введение одного Кон А/ в одинаковой степени /табл. I/. Предварительное пере;! ФГА внесение гликанов более эффективно подавляло пролиферацию, чем последующее. Таким образом, мы считаем, что,' во-первых, инги-■биция бласттрансформации была в большей степени обусловлена экранированием рецепторов в ФГА-индуцированных культурах, чем Кон А-йндуцированных и', во-вторых, в процесс ингибиции вовлекались другие механизмы.. Это может быть опосредованное действие гликанов ' через иммунорегуляторные1 клетки и макрофаги.

То, что гликаны оказывают опосредованное действие на Т-лим-фоциты доказывает и тот факт, что при введении родэксмана мышам

Влияние родэксмана на лектин-индуцированную реакцию бласттрансформации спленоцитов мышей. •

Время

Доза ПС; ния ПС, икг/«шь сутки

Включение Н-тимидина после добавления в культуру, имп/мин

ФГА

Кон А

5816 I 9061 10 4773 .100 6090 1000 4745

± 687 i 1727 :± 352 ± 633 ± . 751

18298 25077 ' 17765 15245 ХЮ771

i 2377 ± 3122 ± 3507 . ± 825 í 2033

"±"2377" t 2230 i 3173 ± 2853 i 1784

56926 ± 7356 48929; í 6595 53610 ± 7817 55860 ±-11631 47265 ±. 7792

5816 I 7061 10 4661 100 • 3341 1000 '4473

±- 68| ± 2079 ± 831 ± 481 ± 900

18298 13962 13493 ' И885 .х11294

56926 ± 7356, 56863 ± ,5836' х35290 ± . 4459 х30526 ± 10930 хх27829 ± 6427

Примечание. Доза Кон А - 5 мкг/мл, доза ФГА - 10 мкг/шг, х - р * 0,05 , хх - р * 0,001.

подавление включений метки спленоцитами и тимоцитами со временем нарастало с максимумом на 7-е сутки /табл. 2/. Также как и в опытах 'ин витро эффект усиливался, с увеличением дозы полисахарида /от I до 1000 мкг/мышь / и бшг более выраженным в отношении клеток, стимулированных Кон А.

Показано также,' что при введении родэксмана мышам, в отличие от результатов в опытах ин витро, гликан изменял ответ лимфоцитов 'на ЛПС /табл. 3/. Через сутки после инъекции полисахарида бласт-трансфорлация клеток на ЛПС усиливалась и к 7-му дню снижалась почти до нормы. Таким образом, воздействие гликанов на В-лимфо-"циты также.было опосредованным. • -

Повышение гликанавд функциональной активности В-клеток может быть одной из причин их адъювантного действия. Сравнивая результаты, полученные при стимуляции ЛПС-индуцированной пролиферации и антнтелообразования к ЭБ родэксманом,.наблюдали корреляцию между повышнием функциональной.активности В-лимфоцитов через сутки после введения гликана и усилением адъювантного действия при

I

7

Влияние родэксмана на бласттрансформацию спленоцитов - мышей, вызванную ЛПС.

———————-------- - - ------ ----

Включение Н после введения родэксмана через, имп/мин

RS 7 :

- ■ на фоне ЛПС н^'фоне ЛПС

_ 8187 + 928 17430 ± 2179

I 6657 + 250 24676 ± ШЗ30 6077 + 309х • 9865 ± 1063хх

10 9873 + 509 38546 ± 3536хх '8682 + 920 ' I85I6 ± 3068

100 7263 ± 198 38712 ± 3356х* 9504 + 1109 25643 ± 4089х

1000 7462 ± 469 38505 ± 3347х* 8524 + 417 I9I93 ± 1949

Примечание, х - р ^ 0,05 , хх - р * 0,001.

инъекции родэксмана за день и через день после иммунизации ЭБ /табл. 3 и 4/. С увеличением дозы полисахарида в обоих случаях усиливался стимулирующий эффект. Поскольку гликаны не оказывают прямого действия на B-клетки, возможно, они действовали через Т-хелперы, тем более, что нами была показана тенденция к усилению интерлейкин-2-подобной активности. Такой же точки зрения придер-. живаются Dreaaer D.W. и Phillips J.M, /1974/, которые считают, что адъювантный эффект лентинана обусловлен в основном Т^хелпера-ми, т.к. у тимэктомированных мышей иммунный отрет на ЭБ отсутство-' вал, С другой стороны, данный феномен можно обменить снижением активности Т-супрессоров.. Нами было показано, что через сутки после введения родэксмана в дозе I и 10 мет/мышь снижалась активность индуцированных супрессоров примерно на 90^. ' 'I При иммунизации мышей ЭБ через 7 дней после введения родэксмана наблюдали обратную зависимость от дозр полисахарида: чем меньше доза, тем сильнее антителообразование. При этом функциональная активность B-клеток практически не менялась. Таким образом, в данном случае о корреляции говорить нельзя. Скорее всего ёто связано с активацией'-функции Т-супрессоров. В наших опытах наибольшая супрессорная активность отмечалась, через неделю после введения ролэксмана; в наибольшей используемой дозе /индекс супрессии спонтанных супрессоров увеличивался в 30 раз при дозе tOOO мкг/мышь/. •■ . '

Таблица 4

Влияние родэксмана на антителообразование к эритроцитам барана у мышей, /оцен. индекс по Сергиеву/.

Время введения ПС

за 7 суток до иммунизац;ш

за I сутки до иммунизации

через I сутки после иммунизации

I . х257 ± 28. 195'± 12 197 ± 33

.Доза ПС, мкг/мышь ~~ 10 1000

.167 ± 20

230 ± 36 х283-± 48 х242 ± 27

163 ¿ 24 291 ± 66 . х369 ± 80

Примечание, х - р £ 0,05.

Возрастанием супрессорной активности Т-лимфоцитов можно также объяснить ингибицига пролиферации клеток на ФГА и Кон А. Так как в период максимального подавления ответа на Т-клеточные мито-гены спленоцитов' и.тимоцитов мышей /через 7 суток после введения родэксмана/ возрастала и спонтанная супрессорная активность., причем максимально эффективной дозе при подавлении включения метки соответствовала и максимальная супрессорная активность /табл. '2/. В опытах ин витро также с увеличением дозы возрастал индекс супрессии спонтанных и индуцированных супрессоров /с ~Ъ% и -1% при-дозе.10 мкг до 23$ и 20$ при дозе 200 мкг соответственно/ и усиливалась ингибиция бдасттрансформации лимфоцитов. Снижение ответа на митогены гликаната связывают с регуляцией супрессорно-хелпер-ных фракций Т-клеток Натшег с. и др. /1976/, Ышше1 РЛ.А. и др. /1978/, Г1есо1е11а Е. и др. /1981/ в отношении глюкана 2. сегеу1в1ае и маннана С. а1Ъ1оапэ .

Угнетение ответа лимфоцитов на митогены могло быть обусловлено' супрессирующим действием'активированных гликанами макрофагов. В наших.экспериментах фракция прилипающих к стеклу лейкоцитов /макрофагов/, предварительно стимулированная гликанами в'течение суток, снижала включение %-тимидина лимфоцитами в ответ на Кон А /табл. 5/. Удаление из культуры лейкоцитов адгезирующих клеток приводило к снижению степени ингибиции пролиферации лимфоцитов на Кон А /с 32$ до 58$/. Таким образом, нельзя исключить супрессирую-щее пействиэ макрофагов на бласттрансформацию лимфоцитов. Подобное

Влияние активированных гликаном макрофагов на Кон А- индуцированную РБТЛ человека, / имп/мия /.

Иссле'дуе- Включение при добавлении в культуру лимфоцитов

мне ГЛИ- 1------------------:------------------------

каны - Кон А + н.а.Мф Кон А + а.Мф

родаксман 1564 + 151 I06II + 2507 3819 £ 452p .'

аубазидан 5186 + 1695 19499 + 2760 8607 + 2515х

ПС Cr. lu- 2200 + 232 17006 + 3518 8901 + 2047х

teolus

криелан 2512 192 5937 + 733 3689 + 454х

Примечание. н.а.Мф - неактивированные макрофаги, а.Мф - активированные макрофаги, х — р — 0,05 , хх - р ^ 0,001.

влияние макрофагов связано скорее всего с тем, что активированные полисахаридами, они повышали синтез простагландина Eg, который, как известно, может изменять различные реакции Т-лимфоцитов', в том числе и бластогенез /ßoldyna U.E. и др., 1980/.

• По данным Walker С. и др. /1983/ простагландин Eg ингибиро-вал пролиферацию мышиных гшоцитов на ФГА и Кон А через ингибицию продукции ИЛ-2. На активность ИЛ-Г простагландин Eg не влиял . /.Euqul Е.и.ии др., 1988/. Однако стимулирующее действие на ИД-1-подобную активность различных гликанов обнаружили многие 'авторы /Sugavara I. И др. , 1984 ; Daley I/. И-др., 1985 ; Stimpel Ii. И Др. 1984; Hechev N. и др., 1988 и др./. Исследователи, которые изучали влияние полисахаридов на синтез ИЛ-2, также'отмечали усиление продукции лимфокина /Wong X.С. , 1987 ; Sakagaml X." и др., 1988; Lombprdi С. и др.', 1984/. Родаксман, внесенный в'культуру лейкоцитов, незначительно стимулировал как'ИЛ-I-, так и ИЛ-2-подобную активности /примерно на 40% /. Таким образом, мы не обнаружили связи между активностью интерлейкинов и снижением бласт-трансформации Т-лимфоцитов.' Возможно, регуляция осуществляется другими механизмами. Например, гликаны могут блокировать рецепторы к йнтерлейкинам и тем самым изменять чувствительность лим- • фоцитов к ним /ИЛ/,.поскольку и ИЯ-1 и ИЛ-2 являются лектинами, •Т.е.- связывают углеводы'/jiuchmore A.V. и др., 1987; sherblem '/ А.Р. и др., 1989/.'Тем не менехэ эту возможность пришлось

отвергнуть, t.к. при добавлении родэксмана в тест-культуру лимфоцитов вместе с рекомбянянтными Ш-1/3 я ИЛ-2 активность, последних не изменялась. ..."

Таким образом, икшбирующее действие гликанов на пролифера-тивный' ответ лимфоцитов, индуцированный ФГА и Кон. А, был обусловлен как прямым действием ¡полисахаридов на Т-лимфоциты /экранирование лектиновых рецепторов/, так и опосредованно.через иммуноре-гуляторные клетки /Т-сузгрвссоры/ и макрофаги.

Há основе ранее известных фактов и полученных нами данных . можно предположить оледузшдай механизм действия изученных гликанов. Подобно глюкану. s. ««rav-ieiae данные полисахариды активировали непосредственно систему мононуклеарных фагоцитов и, подобно лентинану, непосредствешо воздействовали на Т-клетки. В результате активированные макрофагу приобретали бактерицидные и туыори-цидные свойства. Продукты активации макрофагов воздействовали на 'пролиферацию, дифференциацию и кооперацию Т- и В-лимфоцитов, а также на сами макрофаги- .Действуя на Т-клетки, гликаны регулировали супрессорно-хелперкне функции лимфоцитов, что приводило к усилению или ослаблению активности В-лимфоцитов. Известно также, что сыворотка мышей, получавших ПС Cr. luteolue , усиливала функциональную активность макрофагов /Турина C.B., 1988/. Фактором, воздействующим на макрофаги могут быть третий компонент компле- . мента СЗв /криелан активирует комплемент по альтернативному пути /Кашкина М.А. и др., IS8G)//, майсрсфаг активирующий фактор /МАФ/ и колониестимулирующий -фактор /КСФ/, выделяемые Т-лимфоцитами /лентинан усиливал выдельение как МАФ, так и КСФ /Chibara G., 1983/ /. .

. Активированные инт®|швйкином-1 Т-хелперы могли повышать генерацию цитотоксических Т-лпш|юцитов и' НК клеток. Прямых доказательств подобного действия изученных гликанов пока не получено. . . Сумма таких воздействий в конечном счете приводила к усилению гемопозза, противоинфекционного и противоопухолевого-иммунитета, рапиопротекторЕсшб действия. . ■ •

Столь разнообразная активность гликанов.определяет широкие возможности их применении- Например, при функциональной неполноценности системы мононуклеарных фагоцитов и вторичной недостаточности систем Tf и. В-лимфоцитов, при профилактической вакцинации- . для усиления антнтелообразования, при. нарушении миелопоэза.

ВЫВОДЫ

Изучено распределение гликанов в организме мышей:

1.1. Родэксман, криелан и аубазидан локализуются преимуществен' но в цитоплазме перитонеалышх макрофагов и макрофагов

всех иммукокомпетентных органов, начиная с третьих суток.

1.2. Пбеле внутрибркшшного введения длительность выявления гликанов в организме животных возрастает с увеличением молекулярной массы и разветвленкости молекул полисахаридов, то есть была наибольшая для аубазидана и наименьшая для родэйсмана. • ..■■-'

2. Родэксман, криелан и аубазидан вызывают слабый иммунный ответ , при введении мышам в дозах от I до 1000; мкг/мышь. Иммуноген-

- ность гликанов снижается с увеличением; молекулярной массы и длительности пребывания их в организме.

3. Родэксман, криелан, аубазидан и ПС Сх. luteolus во всех испытанных дозах ин витро /от 10 до 320 мкг/ и ин виво /от I до 1000 мкг/мышь / не являются митогенами для спленоцитов и тимо-

• цитов мышей, для лимфоцитов периферической крови человека.

4.'В опытах ин витро пролиферативный ответ лимфоцитов на'Т-кле-.1 точные митогены /ФГА-Р и Кон А/ снижается в присутствии ро-

дзксмана, криелана, .аубазидана и ПС Фг. luteolus в зависи-г мости от дозы, но на изменяет ответ-сшгашцитов мышей-на В-клеточный митоген /ЛПС/.

5.'В опытах на мышах родэксман повышает функциональную активность

• В лимфоцитов и усиливает антителообразование к эритроцитам барана через одни сутки.после его внутриФрюшинйого введения в дозах qt I до 1000 мкг/мышь. "

5. Экзоглидианы снижают бласттрансформацда лимфоцитов в ответ на Т-клеточныё митогены как за счет экранирования.лектиновых рецепторов /прямое действие полисахарида® го Т-лимфоцитн/, так и благодаря воздействию на иммунорегушторные клетки /Т-суп-.• рессоры/ и макрофаги /опосредованно® действие/. 7. 3 культуре клеток крови человека ро давимая в дозе 200 мкг усиливает супрассорную активность Т-лшфшвршв, в дозе 10 мкг -.

• снижает'ее ; в опытах на мышах проявляется аналогичная закономерность через 7 суток после введения родэксыана -

■'• 1000 мкг/мышь полисахарида активировали Т-супрессоры, тогда ' как I и 10 мкг/мышь ингибирокаяй их. .

8, Ропэксман в дозе 50 мкг/шг незначительно стимулировал интер-лейкин-I- И интерлейкин-2-подобную активность в культуре, лейкоцитов и не изменял активность рекомбинантных Ш-IJS и ИЛ-2.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ 'ДИССЕРТАЦИИ

I. Кашкина М.А., Огурцов Р.П., Аркадьева Г.Е., Караваева. A.B. Распределение и длительность пребывания аубазидана в организме мышей //Результаты и перспективы научных исследований микробных полисахаридов: Тез. докл. П Всес.кою$.,2-3 июля 1984,-Л. ,1984.-C.I6I. ; •

,2. Кашкина M.A.-, Огурцов Р.П., Караваева. A.B. Сравнительное изучение распределения и длительности пребывания некоторых дрожжевых полисахаридов в организме мышей //Микология и фитопатология. -1986. -20. -№4. -С. 288-290 j '

3. Караваева A.B., Кашкйна т.к.. Огурцов Р.П., Блинов Н.П. Реакция лимфоцитов на грибные экзогликаны //Микология и фитопа-. 'толстая.-1990.-24.-JH.-С.57-61. .

4. Караваева-A.B., Кашкина М.А., Ёлинов Н.П., Огурцов Р.П. Иммуномодулирующее действие некоторых дрожжевых гликанов //Ммму-номодуляторы природного происхождения: Тез.докл. Раб.совещания '9-10 октября 1990.-Владивосток.-1990.-С.41.

Выражаем благодарность за консультативную помощь ст.н.с,,. к.б.н. Кашкиной М.А. t