Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аспорогенный штамм Bacillus thuringiensis 14 серотипа перспективный продуцент препарата против кровососущих двукрылых (семейство Culicidae)

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Аспорогенный штамм Bacillus thuringiensis 14 серотипа перспективный продуцент препарата против кровососущих двукрылых (семейство Culicidae)"

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОЕКТНО-КОНСТРУКТОРСКИИ _______________ИНСТИТУТ ПРИКЛАДНОЙ БИОХИМИИ

рППЯ*^

На правах рукописи

i а (>i ^

ЧЕКАЛИНА Лидия Ивановна

АСПОРОГЕННЫЙ ШТАММ BACILLUS THURINGIENSIS 14 СЕРОТИПА ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ПРОДУЦЕНТ ПРЕПАРАТА ПРОТИВ КРОВОСОСУЩИХ ДВУКРЫЛЫХ (СЕМЕЙСТВО CUL1C1DAE)

Специальность — 03.00.23. биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата

биологических наук

Оболенск 1994

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском-институте прикладной микробиологии (я.Шоленск)

—-----------. " . Научные -руководители :

- доктор биологических наук, профессор Виноградов-Волжинский Дмитрий Владимирович

-•кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Соколова Эльвира Ивановна

Официальные оппоненты-:-'

- доктор ветеринарных-наук,профессор Боровик Роман Владимирович

- доктор технических наук, старший научный сотрудник Строгоз . Семен Ефимович ,

\ '

Ведущая организация : Институт медицинской паразитологии и тропической медицины имени Е.И. Марциновского -

Защита- диссептаош состоя1.

<>■•:'. О

часов па заседании дйссергаийонкогс . V..---. .... следовательском псоектнс-;сс;-:с?оукта . '¿.Л-**' ,-.<

биохимии по адрес-/ : 125Е09, г. . -

•'„С): • Т

; '.л-;-

С диссертацией мояно д,

IV

».«ш «« « „»уат хато присылать по выше-

вательского проектно-кор^руктосског'к О ■■•

указанному адгесу.

Автореферат рааосдаР^ Л^^и А£_ш 9т.

Ученый секретарь диссертационного -

совета, ::акд. бпол. наук // о И Л!.Гусева

у

СВДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ_____________________

Актуальность теш. В интегрированной системе мер борьбы с. кровососущими комарами - переносчиками ряда инфекционных болезней человека и животных, исключительно важнее значение имеет разработка к широкое внедрение в практику микробиологических средств.обеспечивающих высокую эффективность и экологическую безвредность.

Изучение и применение биологических методов борьбы с вредными насекомыми составляет одно из перспективных направлений научно-технического прогресса.Уепехи мжрсбпологж и биотехнологии обеспечили в этой области получение и организацию производства ряда высокоэффективных микробных инсектицидов, широкое практическое использование которых вызвано необходимостью уменьшения ядохимикатов и природоохранными мероприятиями.

3 настоящее время получены аспорогенные кристаллообразующие штаммы Bacillus thuringlensis Н-14, продуцирувдие специфические токсины с еысокой ларвицидной активностью.

Несмотря на многолетние исследования аспорогекных штатов Bacillus thuringiensis 14 серотипа в лабораториях мира, до сих пор не получили широкого развития работы в области получения и практического применения ларзицидногс препарата.

В связи с этим представляется важным решение проблемы препаративного получения специфического токсина в комплексе биотехнологических процессов.

Цель работы. Изучение нового аспорогенного штамма' Bacillus-

-thuringiensls 14 серотша с "елью создания на его основе перспективного и экологически чистого ларзицидвого препарата для борьбы с вредоносными насекомыми отряда двукрылых ( Díptera ).

Задачи исследования:

1.«лучить биологические особенности ларь'шидного . штамма ИШ-1501 Bacillus thuringlensis Н-14 о целью выявления физиолого--биохштаескад, инсекяшвдчых и других свсйств.

2.Исследовать условия выращивания культуры и получения препа-

- - • а

para на основе перспективного штамма.

3.Исследовать влияние .внешних условий на препарат на основе аспорогенного штамма Bacillus thuringíensls Н-14. • •

- А-

4.Испытать к определить инсектицидные свойства ларвицидного препарата на основе нового перспективного аспорогенного штамма Bacillus thuringiensis Н-14, полученного в промышленных условиях.

Научная новизна. Впервые в нашей стране проведен всесторонний анализ культуры аспорогенного штамма Bacillus thuringiensis Н-14.

Штамы ИПМ-1501 Bacillus thuringiensis Н-14,синтезирует кристаллы эндотоксина, активность которых сопоставима с активностью про-мызлепных шташов Bazillus thuringiensis var.israelensis - продуцентов ларзнцидных препаратов. .

Штамм обладает устойчивостью к фагам Bacillus thuringiensis и-сам спонтанно их не выделяет.

Для шташа подобрана оптимальная питательная среда культивирования, ' на которой отмечена высо:-ая ларвицидная активность к кровососущим комарам. ' '

Исследованы режимы культивирования штамма. Полученные параметры культивирования испытан« в промышленных условиях при наработке ларвицидного аспорогенного препарата "Ларвиоль".

Установлено, что во внешней среде кристаллы эндотоксина ^аспорогенного препарата практически не подвержены влиянию солнечной ин-ссляцил, засоленности воды,рН водычпрн кислых к слабощелочных ЗНаче-

ЕИЯХ.

Исследована эффективность ларвицидного аспорогенного препарата в лабораторных и - полевых "условиях ка личинках кровососущих комаров. Установлены дозирозки, нормы расхода, резхимы .хранения препарата,позволяю щне использовать его в практических условиях.

Практическая ценность. В результате микробиологических .анализов исследована новая высоковирулентная культура Bacillus thuringiensis Н-14 штамма ИПМ-1501 для производства ларвицидного препарата "Ларвиоль". На основе комплекса микробиологических,биологических и технологических работ,совместно с завода,® ''Прогресс" и Бердского завода биопрепаратов разработаны услозия производства нового ларвицидного препарата.

Результаты проделанной работы наяцш отражение в "Лабораторной инструкции по поддержанию куль ту ры - пред у цен т а, и посевного материала в условиях производства, в "Отраслевых технологических условиях ■ ка

препарат на основе асиорогенаого 2та\£ма^Ш-1501"( ТУ 400-00001927-_______

—110-94),— приоритетной заявке на патент "Штамм Bacillus thuringiensis ШМ-1501, патогенный для кровососущих двукрылых" /Ы 83-053692(052888)/, методических указаниях по применению "Ларви-олк'-пасты для. борьбы с личинками крозососусук комаров, ЮРФ N Ш-19/iO-ll'ст 24.С2.94.Г.; введенных в действие. Этс позволит выпускать препарат' без спор длз зазшты человека и «квотных от кровососущих двукрылых - пер^ос^коз. возбудителей болезней, в частности малярии,а также других природао-очаговнх янфекцгй.

Публикации. По материалам диссертации опублякозаяо 4 работы.

Структура дпссезташш, Работа состоит кз ззедения, обзора литературы, списания материалов и методов исследования, четырех разделов ссбственшх исследований заключения, выводов, списка литературы и йражззкеией. Работа иллюстрирована 25 таблицам и 8 рисунками. >

1

^г?ер/_аш 7, методы усслелозакий

5 работа кспольас£ана езгагер«я аспорог^мчого итамма Bacillus thuringiensis i-i огрс-х-гша н даа. сравнительных оце-нол ¡шфоорга-нигш-продудевт.ч ifperгьс..rshлнгг Сяшрепаратов Bacillus thuringiensis 1,3,4,5,14 сератшсг,

едтатиазрезаггэ с 5ёйк>-шсста о? его целей проводили

на таедак взз в зудавк Ектетельных средня. Посевной материал получав ежздашии сбрнзет. Культуру бактерий выращивали на скошенннх отдашь »msrcißxns!:?- о гг^рл зре TcvreparyD'i 30° С до полного еяерзобт^.г^а-т.я 1 ллк саоровык а до молодых вегетативных

кгеток { для аспорогенной культуры ). Культуры шт&ммоэ смывали сте-рнашгм ¡базраствором и вносили в начаточные колбы.с данной питательной спелой ( чяссг?гтопннй бульон, сости'фячмальная среда. Яроав«1П'.<Ф:с-'дег>йЗйея т-,:егд 1 Культизирозание проводкой на качалке со aepocijHü вращения '¿гО oö/мив, при температур 30°с до прорастания сдср (.дая спорозгК культур) и зегетативнк:-; r...ji-oK (для аспоро-генной культура). Полученные тамз* образом культуры бактерий содержали Еегетатнвные клерки vi использовались для сравнительных анализов и з качестве посевного материала {еспорогенная культура) дли'* засева ферментационной среды. Культивирование в ферментере проводи-.

- б -

ли при работающей мешалке, дающей 240 об/мин, температуре 30°С и аэрации 0,4-0,8 л/среды в мин., в течение 40-44 часов.

Морфологи» клеток изучали с помощью световой микроскопии.За развитием микробных культур на жидких питательных средах следили пол помощи фазовоконтрастной микроскопии, с, увеличением в 900 раз.Титр клеток'в культурзльной жидкости определяли путем подсчета колоний, образующихся на твердой питательной среде.

Серотипирование штамма проводили постановкой реакции агглютинации. Фагоустойчивость определяли по методу Грациа и капельным двуслойным методом из десятикратных разведений вирулентных фагов.

• Способность бактерий усваивать углеводы, синтезировать ферменты определяли по общепринятым методикам.

Оценку инсектицидной активности культуры проводили биотестированием на личинках кровососущих комаров (. Aedes aegypti, Culex pipiens ). r .

Антибиртикочувствительносхь культуры определяли при помощи дисков с антибиотиками по общепринятому методу«' v '

Влияние температуры на вегетативные клетки штамма определяли в диапазоне значений температуры от 30° С до 80° С. ' ' , '

За изменениями давления в аппарате, скорости вращения мешалки, расхода . воздуха на аэрацию, температуры, pH в процессе ферментации бактерий на лабораторной установке типа АНКУМ-225 проводили при по-; кспш датчиков щита контроля и регулирования физических и физико-_ химических параметров процесса культивирования.

Изучение влияния дезинфектантов.(хлорамин Б, перекись еодоро-• да) на чувствительность клеток проводили при температуре 30° С $ течение 16 и 38 часов. После этого определяли жизнеспособность пу* .тем высева на твердые питательные среды.

Антагонизм между штаммами бактерий определяли капельным методом по "дорожке". После инкубирования при 30°С в течение 16*часов определяли зоны угнетения, роста культур.

Оценку биологической активности препарата,зависящую от воздействия внешних факторов ( ультрафиолетовое, инфракрасное излучения, засоленность воды, pH воды, температурных режимов хранения )' проводили на личинках кровососущих комароз. Aedes aegypti.

. Эффективность дозировки, нсрш расхода препарата- оценивали по методическим указаниям по применению "Ларансля".

Достоверность результатов исследования оценивали общепринятыми ^тодами. ■ "

Результаты исследований и их обсуждение

1.Биологические особенности культуры аспорогенного штамма ИПМ-1501 Bacillus thuringiensis 14 серотипа.

Новый аспорогеняый штамм ЖМ-1501 Bacillus thuringiensis 14 серотипа был получен в результате направленной селекции методом естественного -отбора из культуры аспорогенного штамма 346П Bacillus thuringiensis var. israelensis, полученного из института Пастера ( Франция ).

Кулътурально-морфологические признаки. Колонии на ША - кремовые, округлые,-плоские со слегка приподнятым центром, матовые, сла-бовернистые, -в среду не врастают, край колонии ровный или слегка волнистый. Оптимальная температура роста (28-30)° С. Аэроб, факультативный ачазроб.

Вегетативные клетки - палочковидные, подвижные з молодой культуре, одиночные, сдвоенные или в коротких цепочках, размером 2,0-5,0x1,0-1,3 мкм.лерктрихи. В процессе биосинтеза в вегетативных клетках культуры образуются полиморфные тельца ( кристаллы ) округлой, неправильно-округлой 'формы, от £ до 5 (в количественном отношении), размером от 0,3-O.ö до 1,1-1,3 ил/.. Особенностью итамма является отсутствие спор.

©йзиолого-биох5!ьшческне признаки. Штгмм UEM-iSOl ферментирует глюкозу, манноэу, KpaxbioJi с образованием кислот, не ферментирует сахарозу, лактозу, ыаннит, ксилозу, арабшозу, цедлобйозу, салицин, эскулин. Продуцирует 'амилазу, ' протеазу, желатиназу, лецитиназу. Слабо продуцирует уреазу, ацетилмежкарбикол, - н-э образует индол. Ори росте в ШЗ не образует пигмента, образует сззЗую муть, а затем пленку.

Отношение к антибиотикам. Устойчив к карбецпл,-тйнуГ"полшикси-ну М, бензишенициллнну, пенициллину. Чувствителен к ристамицину, рифампину, левомицнтину, ампициллину, рифамгощину, оксациллину, стрептомицину, гевтамицину, неомицину, мономицину, эритромицину, метищшгину, канайицину, тетрациклину, повебйотину.

Инсектицидные свойства. Штамм обладает ларвицидной активностью -к кровососущ»-! комэрам ( табл.- i ) ; - -.• • •'

Таблица 1-

Биологическаз активность культуры асяорогенного штамма ЙПМ-1501 на личинках комаров. '

Штамм Биологическая активность (JIK50)» мл/л.

Вид тест-насекомых, возраст

Aedes aegypti Culex plpiens

2 4 2. 4

ЙПМ-1501

0NR-60A (зталон споровый)

0,00012 ' 0,00077 0,000020 0.0С055

± 0,00001 ± С',00001 ± 0,000001 ± 0,00009

0,0001 . • . - ' 0,00002 ~ -

Производственно-технологические показатели. Продуктивность шт,амма на соевокрахмальной, дрожкеполисахаридной средах 1,5-2,0 млрд. кл/мл. Развитие , культуры до полного высыпания кристаллов' 40-44 часа.1 Полнота токсинообразоЕания 95%. Спонтанное выделение умеренных и вирулентных фагов отсутствует. Штамм сравнительно фаго-устойчив.

Штамм Bacillus thuringiensis var.lsraelensis ИШ-1501 депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетика ( ЦМПМ В-6562 ).

2. Исследование подходов к получению аспорогенного ларвйцидно-' го препарата на основе штамма ИПМ-1501.'

Проведены исследование по подбору питательных сред. Наиболее, перспективными средами культивирования штамма явились: (%).

1.. Среда СКС : соевая мука - 3,5, кукурузный крахмал - 1,2, зеленая патока - 0,9 (по редуцирующим веществам), капий фосфорнокислый двузамещенный - 0,02, марганец сернокислый - 0,003, кальций хлористый - 0,008,-магний сернокислый - 0,02. . -" «

2. Среда ДПС : дрожжи ( ЕЕ'К ) - 2,0 , кукурузная мука - 2,0. Биологическая активность (ЛК50) 0,00012-0,00035 мл/л.

Термоустойчивость шта»/„ма. Термоустойчив к температурам 30,40,50° С, термоустойчивость культуры теряется при температуре 60-80° С ( табл. 2 ).

. ' Таблипа 2

2гпяшз температуры на згкзнедеятельяоеть культуры аспорогенного

штамма ИПМ-1501.

Температура,0 С Время прогревания, мин.

1 2 3 4 5 •

~о0 л- А- - ■+ + . +

40 + "Г т +

50 'ri- + -г

60 + ■f - -

?0 - - -

80 - - - - -

Условные обозначения к -хайл. Z ■ + рост, - роста sei.

Фагоустойчизость штамма. Относительно фагоустойчив к типовым фагам промышленных штаммоз ЗасШиз 1Ьиг1п£1ёП51з, спонтанно не выделяет и вкрул«п?ныь раги I таб^. 3 у.

М'?-н:>/ооть ку;;ът>ты аспорогенного атай.-:?. с иромыиленнкм}» произьсд-..1венныж Куатура гетерогенного штамма проявляет,

чувствительность г. лрокзБОДствеяякк кулм-урам' ВасШиг Шл"1пд1опз15 в той или ивой мере, сама культура не угнетает производственные штаммы» кроме штамма ВТБ-ЗЭЗ ( Н-14 ), { табл.4,5 ).

Таблица Ъ

Фагоустойчивость и продукция фагов -аспорогенного штамма ИЛМ-1501

Ш-гамч Коллек- Среда Лигируется Продукция

тонный культи- фагами фагов

номер ' вирова-

ния И-77 11 С/П 17 22 25/16 Уме- Виру-

рен- лент-

ные ные

ШМ-1501 . 1501! мпв + + _ ■ _ + -

1 \ дпс -

69/6 46 МПВ + + + . - + + -•

(8тал- дпс -

лонный)

69/7 1148 МПБ + + + V + ' +

(инди- же -

катор-

ный) *

Условные обозначения к табл. + .визируется фагом, - не лизи-руется фагом, фагов не выделяет.

• Таблица 4

Чувствительность культуры аспорогенного штамма .ИПМ-1501 к производственным' юультурам штаммов : 08 С Н-1 ). 2-52 ( Н-3 ), 49/3 ( Н-4 ). 71 ( Н-14 ),ВТ5-393 ( Н-14 ).

Коллекционный номер Штамм ¡у Серовариант Угнетение

1415 ■ 98 Н- •1 ++ *

' 1346 2-52 Н- ■3 +

1347 49/3 н- •4 ++

1315 71 к- ■14 X

1139 \BTS-393 н- •14 +

1501 ('контроль). ^ШМ-1501 н- -14 —

Условные обозначения к табл. 4 : ++ угнетение сильное по всей дорожке и на границе, + угнетение слабое по Есей дорожке и на границе. + угнетение слабое по всей дорожке. - угнетения нет.

- и.-

Таблица Б

-Чувствительность производственных культур Bacillus thuringiensis

штаммов: 98 ( Н-1 ), 7.-52 ( Н-3 ), 49/? ( Н-4 ), 71 ( Н-14 ), BT3-393 ( Н-14 ) к культур? аспсрогенного штамма там 50:.

Коллекционный номг? Штамм Серовариант Угнетение

1346

1347 1315 1139

1501 (контроль)

Условные обозначение г. табл. 5: - утешения нет, + угнетение ckärc* пс граня«• догсл^

Температурный оеким аепорсгеняого штамма. Оп-

тпмг-ьну.м :?мг.ератур1;ь^ ртиЕкрованкя является (23-30)°С, культура бацилл, выростах в кидкой питательной среде при высоких (35-37)°С и низких (24~.?б)°С темтературвн;-; режима обладает слабой биологической актизЕосгьл (табл. -б).

Таблица 6

едкляж T9«ri-pasy?y на оиологическр) активность культуры аспорогэнного штамма ИПМ-1501.

Температурнь'" С Sxosor.K -с::ая ак:; v-остъ (ЛК50)» «2/х

Н-1

Z-52 Н-3

4S/3 Н-4

71 Н-14

BTS-393 Н-14 ИПМ-1501 Н-14

D.öÜCJVo i п,00009 о,ооаг --'. 0,00001

0,0013 ± 0;000Г'

Влияние аэрации на культуру аспорогенного штамма. Оптимальным режимом для культуры аспорогенного- штамма является аэрация при 240 oViffiH. качалки. Увеличение числа оборотов качалки до 300 в минуту пслводит к минимальной патогенкости, режим аэрации ISO об/мин. за-ь-...чет среднее положение в отношении активности бапалл ( табл. 7 ).

Таблица 7

Влияние режимов аэрации на биологическую активность культуры аспорогенного штамма ИШ-1501.

Количество оборотов в мин. Биологическая активность

. (JKso). мл/л

180 0,00025 ± 0,00001

240 0,00012 ± 0,00001

300 0,00057 ± -0,00002,

Оптимальным режимом аэрации при культивировании в 'ферменте- • рач типа АНКУМ-225.С рабочим объемом 5 л и промышленных' являлось г;оцентное насыщение среды в первые 16 часов роста ( рОг 30-40%. ), с 16 часов до 30-32 часов роста ( 40-70 % ), затем 80% в конце ферментации. Из. графика (рис. 1) видно, что при выращивании культуры аспорогенного штамма, газообмен увеличивается к началу экспоненциальной фазы роста (Х-2). Резкое увеличение потребления парциального давления' растворенного кислорода (рОг) отмечается к 12-16 часам роста и сохраняется на высоком .уровне в течение 4-5 часов (рОг составляло 15-20% от общего насыщения среды). Тенденция к снижению потребления рОг отмечается к моменту кристаллообразования (Х-3). В первые. 5 часов после завершения кристаллообразования (25-30 часов) потребление рОг составляло 50-70% от общего насыщения.

Получению хорошего роста культуры с учетом длительности ферментации способствуют значения рНг - 5,6, рНг - 6,4, рНз - 7,0. Это подтверждается графиком изменения величины рН и рОг в'процессе культивирования ( рис. 1 ). В результате утилизации субстратов и образования кислот ( пировиноградкая, молочная ) среда подкисляется в фазе экспоненциального роста до рК - 5,6. Затем по мере роста и развития культуры к фазе замедления роста и кристаллообразования

наблюдается сдвиг в щелочную сторону ( рНг - 6,4, рНз - 7,0"). Фаза замедления роста в основном зависит от значения рНа - 6,4 при этом значении рН, Фаза замедления роста ускоряется.Это хорошо наблюдается по снижению потребления микроорганизмом кислорода, не как на фазе экспоненциального роста. Значение рНз - 7,0 оказывает существенное влияние на фазу кристаллообразования, это отмечается уменьшенной потребностью культуры в кислороде, которого б этот период достаточно для утилизации энергетических субстратов кристаллообразования.

Следовательно, ка основании исследования влияния рН на динамику процесса культивирования штамма найдена зависимость ее от величины рН и предложен профиль рН, управление по которому способствует повышению количества токсина.

р02,% 100

во

оО

40

¿0

110 рН

\

3 7

6

о

4

3

1 2

30

час

Рис.

1. Влияние величины рН и- рОг на рост культуры =спорогенкого Еташа НИМ-1501:

1 - кривая изменения рОг *

2 - кривая изменения рН,

Х-1 -фаза логарифмического роста (лаг-фаза), Х--фаза экспоненциального роста, Х-3 -фаза замедления_ роста и начала кристаллообразования.

Наработка дарвицидного препарата. На основе штамма ИПМ-1501 в промышленных условиях получен аспорогенный препарат против личинок кровососущих комаров.

.Чувствительность культуру штамма к дезинфекционным средствам. Штамм чувствителен к хлорамину В, перекиси 'водорода, достаточно 0.1% концентрация раствора дезсредстБа для прекращения процессов жизнедеятельности вегетативных клеток бацилл.

Хранение культуры ( маточной ) и посевного материала в лабораторных и производственных условиях. Штамм хорошо сохраняет свои исходные характеристики ( жизнедеятельность, культураяько-морфологи-ческие, инсектицидные свойства ) в течение ряда лет при хранении з лиофшшзированном виде, в глицерине при -50° С ( табл. 8,9 ).

Культурапьная жидкость ( посевной материал ) хранится в условиях холодильника в течение 7-10 суток, сохраняя при этом исходные свойства и может быть использована для засева кидкой питательной среды.

Таблица 8

Биологическая активность культуры аслорогенного итамма

ИПМ-1501 .после■ хранения в лиофилмзировгнном виде на личинках комаров Aedes aegypti 2 возраста. .

Штамм Биологическая активность- (Ж50), мл/л

Исходная 3 мес. 6 ыэс. S ¡¿ее. 12 ыес. Более

4,5 Л5Т

ЙШ- 0,00018 0,00017 0,00024 0,00020 0,00021 0,00026 -1501 + 0,00001 + 0,00003 + 0,00001 I 0,00003 V 0,00002 + 0.0C0Û1

3. Влияние внешних факторов на препарат на основа еса^огекш-го штамма ИПМ-1501,полученного в промышленных условиях.

Воздействие на препарат У® и ИК облучения. Ларвивддаость кристаллов эндотоксина препарата практически не подвергается воздействие ультрафиолетового и инфракрасного излучения, входящего в солнечный спектр.

На рис. 2 изображены изменения биологической активности разбавленной суспензии препарата под действием ультрафиолетового излучения (в течение 60 мин.) и инфракрасного излучения ( в течение 24 часов ). Экспериментальные точки практически лежат на прямой, параллельной оси абсцисс, что свидетельствует о слабом инактивирующем действии облучения на активность эндотоксина в течение указанного времени. ■

Таблица 9

Биологическая активность культуры аспорогенкого штамма ИБМ-1501 после хранения в глицерине при -50° О на личинках комаров А?<2е5 ае^урМ 2 а^зрс- г а.

Штамм Концен- Биологическая активность (ЛК50) мл/л

трация________________________

Тлице- Исхс.чнзй С нес. е кес. 9- мес. Более рина,?, 3 лет

ИШ- 20,0. 0,00041 0,00037 0,00024 0,00021 0,00022

-1501 ± 0,00СС9 + 0,00004 + 0,00004 + 0,00004 + 0,00004

40,0 0,00051 0,00039 0,00056 0,00028

+ 0,00002 ' + 0,00005 + 0,00005 + 0,00008

'60,0 0,00043 0,000о-3 0,00031 0,00034

± 0,00006 + 0,00005 + 0,00007 + 0,00008

•Ъс

л/л

аО' /л, хЮ-Ь

42 с ъл)

аремя,. мин (УЗ)

Рис.2.Влияние ультрафиолетового и инфракрасного излу-. чения на аспорогенный препарат на основе штамма ШМ-1501:

1 - зависимость биологической активности препарата от дозы ультрафиолетового излучения, . £ - зависимость биологической -активности препарата от дозы (времени) инфракрасного излучения.

Влияние рК воды на препарат. Препарат на основе аспорогекного штамма ИПМ-1501 выдерживали в воде при различных значениях рК (4,0-12,0) (ркс.З). С увеличением значения рН воды до 12.0 точки •резко поднимаются вверх, что свидетельствует об утрате 0;,олог::чзс--кой активности препаратом через 7-21 суток выдерживания погп.^рг^ь -е воде. Значения рН воды 4,0-7,0 не оказывает существенного зллаяы на активность аспорогенного препарата. Можно сказать, что в кислой среде кристаллы эндотоксина сохраняют свои патогенные свойства по сравнению со щелочной, где'инсектицидность их снижается с повышением значения рН.

V

мл/л, хХО~°

Рис. з". Зависимость биологической активности препарата ; ка основе аспорогенного штамма ШЗМ-1501 от рН : среды при различных сроках выдерживания суспен-

зии з водной среде.

1-7 суток экспозиции, 2-14 суток, 3-21 сутки.

Влияние засоленности воды на препарат ня основе аспорогенного птамма. Ларвицидкость препарата от воздействия водных растворов хлористого натрия практически не изменяется (рис.4 .). Экспериментальные точки на графике хорошо аппроксимируются прямой зависимостью , причем линии практически параллельны оси абсцисс, подтверждающие, что при воздействии 10-30% раствора хлористого натрия на препарат в течение 7-28 суток, явных изменений ларвициднссти не наблюдалось. Примерно, ту же картину наблюдали при воздействии на препарат более высоких концентраций хлористого натрия. Так на 14 сутки в 40, 50£ растворах ее происходило незначительное снижение биологической активности препарата. На 28 сутки раствор хлористого натрия в указанных выше концентрациях дальнейших изменений ларви-цэдяости препарата не дал. ,

Следовательно,раствор хлористого натрия в высоких концентрациях- не оказывает 'существенного влияния на активность кристаллов экзотоксина з астюрогенноч препарате.

ш/л, хЮ-о к

ЬО С(конц.),$£

Рис.4, влияние хлористого натрия на биологическую активность препарата.на основе аспорогенно-го штамма ИПМ-1501 в разбавленной суспензии при различных сроках выдерживания в солевом растворе. 1- 7 суток экспозиции, 2 - -14 суток; 3 -28 суток.

Таблица 10

Влияние температурных режимов хранения на биологическую активность препарата в Форме пасты на основе аспороген-ного штамма ИПМ-1501.

Срок хранения, мес.

Биологическая активность (ЛК50), мд/л

Температура хранения, °С

+18-22

+30

-30

Переменная

0,000058 0,000038 0,000037 0,000034 « 0.ГШ071

+ 0,000007 + 0,000003 + 0,000001 + 0,000003 + С,00001

0,000076 0,000042 0,000071 0,000033 0,000057

+ 0,000006 + 0,СЮ0001 + 0,000003 + 0,000003 + 0,00002

0,000044 0,000052 0,000049 0,000032 0,000059 + 0,000007 + 0,000004 + 0,000005- + 0,000009 + 0,000009

Примечание: исходная биологическая активность (ЛК50) составляла 0,000044 + 0,000008 ЫЛ/Л. - ' - .

Хранение препарата "при разных температурных режимах. Ларвицид-ная активность прерарата после б, 12, 24 месяцев хранения при температурах' от -30 до +30® С практически сохранялась на уровне исходной. (табл. 10). ' •

Ларвидадность- препарата не снижается в течение двух лет при хранении жидкой форда препарата в указанном диапазоне температур (-30 - +30° с ).

Биологическая активность препарата. Аспорогенный препарат в форме пасты по эффективности и'скорости действия находятся на уровне промышленного спорового препарата бактоларвицида. Гибель личинок комаров наступает в течение первых- суток с момента заражения (табл. 11)*. Аспорогенный препарат является экологически чистым, так как он бесспоровый, следовательно не загрязняет Ькруяающую среду.

ч

' - Таблица 11

\ Биологическая активность препарата в фор?.:э пасты на основе гспорогенного щ-гамма ИГОМ 501 на личинках комаров.

Назва- Год

Биологическая активность (ЛК50), мл/л

препа- ботки рата Род-комаров; возраст личинок

Culex pipions Aedes aegypt'l Anopheles messeae

2 4 2 4 4

ларви- 1991 0,000012 0,000040 0,000038 0,00013 0,00039 ель + 0,000001 + 0,000002 + 0,000002 + 0,00001 ± 0,00004

бакто- 1991 0.00GC20 0,000060 ,0,000050 ларви- + 0', 000002 + 0,000001 + 0,000005 гад

0.С0082 + 0,00001

Биологическая активность препарата в практических условиях. Препарат испытан с Краснодарской краевой санэпидстанцией против разных видов кровососущих комаров родов: Culex, Anopheles. Данные представлены в табл. 12.

Аспорсгенный препарат "Ларвиоль" в форме сухого порошка б дозировке 0,1-0,2 г/м2 вызывал 100% гибель личинок комаров в течение первых суток после внесения в водоемы препарата. Такую же гибель личинок наблюдали при обработке водоемов пастой в дозировке 0,2-0,4 г/м2 . Высокая эффективность препарата (100-86%) сохранялась в течение 7 дней, на 12-15 день она снижалась до 76-30% , на 21 день численность восстанавливалась за счет вновь .отравившихся личинок. Эффективное действие препарата сохранялось в среднем 15-20 дней.

Таблица 12

Результаты полевых испытшшй препарата в форме пасти и сухого порошка на основе аспорогенного игаьз, Ш1М-1501.на личинках комаров Culex pipiens в Anopheles messeae 3-4 возраста.

Форма Год Дози-

Зффективность по дням БабазденияД

рата ботки Г/М2 1 3 5 . 7 12 ' 15 - 21

Поро- 1992 0,1 100 100 96+3 74+8 . 60+4 « 45+5 г

шок

0,2 100 100 94+4 66+6 61+7

Паста 1992 0,2 96+4 100 96+4 £4+10 56+12 £□¡¿10 -

0,4 100 100 98+2 64+8 76+17 33+6 -

ВЫЗОЛЫ '

1. Проведено исследование аспорогенного- штамма Bacillus thuringiensis var.israelensis ИПМ-1501 - продуцента ларвицидного препарата "Ларвиоль", синтезирующего кристаллы эндотоксина.

2. Представлена биологическая характеристика аспорогенного 'йтамма ïîTTM-1501 Bacillus thuringiensis, Рияглонс. что вегетативная клетка содержит ст 2 до 5 кристаллов зндото;:оина. По результатам положительной реакции агглютинации типовой сыворотки Н-антигена культуры Bacillus thuringiensis var. israelensis (14 серотипа) (0Ж-60А) с Н-антигеном из аспорогенной культуры установлена принадлежность штамма НПМ-1501 к 14 сероварианту.

3. Разработаны и оптимизированы жидкие питательные среды для глубинного культивирования ятачма ИПМ--1501 - и дрожеполисахаридная. На их основе в оромыиясшж условиях наработан новый аспорогенный, экологически чистмй .гарвицидный препарат "Ларвколь"для борьбы с личинками кровососущих комаров.

4. Проведены исследования антагонистической активности культуры аспорогенного штаз/а JC1M-1501 Bacillus thuringiensis 14 серотипа с различима серозариантгмк Bacillus thuringiensis. Установлено,что аспорогенный. штамм не является ингибитором промышленных штаммов -продуцентов средств защиты растений.

о. Исследована - термоустойчивооть культуры аспорогенного штамма ИПМ-1501 Bacillus thuringiensis 14 серотипа. Отмечено, что темпера-сура свыше 50°С приводит к прекращению жизнедеятельности бактерий.

6. Разработана технология получения биопрепарата на основе ас-гторсгенного стажа ЙШМ5С1 Bacillus thuringiensis 14 серотипа. Ус-г^"озлепо. что для оптимального роста культуры на разных стадиях ориентации необходимы следующие значения pHi - 5,6, рЧг - 6,4, эНз - 7,0, скорость перемешивания 240 об/мин и режим аэрации, обес-течивающий рОг в первые i6 часов роста 40% и 801 от насыщения среды 5 ксэде }г/гт;Т1Ш!фссгния.

7. Выявлено отрицательное влияние дезинфекционных средств на жизнедеятельность вегетативных клеток аспорогенного штамма ИПМ-1501.Установлено, что для прекращения процессов роста культуры достаточна 0,1% концентрация хлорамина Б или перекиси водорода.

8. Изучена сохраняемость культуры аспорогенного штамма ИПМ-1501 Bacillus thuringiensis 14 серотипа в лиофилизированном гиде и при криоконсервации в глицерине. Зти способы обеспечивают сохранность исходных характеристик бацилл в течение 3-5 лет.

9. Исследована биологическая активность -жидкого препарата "Ларвиоль", , наработанного на основе аспорогенного штамма ИПМ-1501, его устойчивость к факторам внешней среды. Установлено, что кристаллы эндотоксина в препарате не снижают биологическую активность под воздействием облучения (1-24 часа), засоленности воды (7 - 28 суток), pH воды в диапазоне 4,0-8,0 (7 - 21 суток). Среднелетальная концентрация (ЛК50) препарата на личинках комаров после указанных воздействий. находилась в диапазоне 0,000039-0,000078 мл/л и соответствовала уровню контроля (0,000039-0,000071 мл/л ).

10. Выявлена ларвицидность аспорогенного препарата "Ларвиоль" на личинках комаров : Aedes aegypti, Culex pipiens, Anopheles messeae. Установлено, что дозировки 0,1-0,2 г/м2 для сухого порошка и 0,2-0,4 г/м2 для пасты, вызывают 100% гибель личинок комаров в течение первых суток от момента внесения в водоемы, сохраняют эффективность в течение 15-20 суток ( 76-30% ). Ларвицидность арепа-рата Е форме пасты не уменьшается в диапазоне температур от -30 до +30° С, остается на уровне исходной после 24 месяцев хранения (ЛК5О=0,000044-0,000059 мл/л ). '

Список публикаций по теме диссертации

1. Соколова 3.я/, Дорсгойченко Н.И.. Кулиеза Н.М., Чекалина Л.И.., Сущеэич И. В.,. Зрлих В.Д. Оценка эффективности новых форм препарата Bacillus thuringiensis 14 серотипа на рисовых полях против личинок' малярийных комаров.. В cöi: "Пути совершенствования микробиологической борьбы с вредными насекой" <м и болезнями растений ". Оболенск, 1986, с. 195.

2. Соколова З.И., Волхинский Д.В., Кулиева Н.М., Чекалина Л.И., Поддубкова Т.Н., Эрлих В.Д.. Серенко В.И., Якимова В.Г., Гар-бузова К.С., . Дубицкки A.M. Результаты практических сравнительных испытаний ' отечественных, препаратов Сактоларвипяда и бактокулицида. Тезисы докладоз. Всесоюзная конференция "Проблемы совдания и применения лшкробиологических средств защиты растений" Ç 16-18 мая 1989, Велегоя ).. М., 1989,' с,. 303.

3. A.c. 171314? Российская Федерация. Препарат для борьбы с личинками кровососущих комаров. / Э.И. Соколова, Л.И. Чекалина, Н.М. Кулиева, Н.И. Дорогокченко, Д.В. Волзкипский /. 1993.

. 4. Приоритетная заявка N 93-053692(052888) на патент.

Российская федерация. Штамм Bacillus thuringiensis ИШ-1501, патогенный для. кровососущих„даукрыдых. / 3-й.- Соколова, Л.И/ Чекаяина( Н.М. Кулиева / 1994.

1