Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние микрохирургических манипуляций на цитогенетические особенности оплодотворения и доимлантационного развития in vitro у крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние микрохирургических манипуляций на цитогенетические особенности оплодотворения и доимлантационного развития in vitro у крупного рогатого скота"

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК ІНСТИТУТ РОЗВЕДЕННЯ І ГЕНЕТИКИ ТВАРИН

■ і і и. і

-і "'22с:

БАСОВСЬКИЙ Дмитро Миколайович

УДК 638.2:591.391/.398:578.083

ВПЛИВ МІКРОХІРУРГІЧНИХ МАНІПУЛЯЦІЙ НА ЦИТОГЕНЕТИЧШ ОСОБЛИВОСТІ ЗАПЛІДНЕННЯ ТА ДОІМПЛАНТАЦІЙНОГО РОЗВИТКУ IN VITRO У ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

с. Чубинське, Київської області 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії клітинної інженерії Інституту розведення і генетики тварин Української академії аграрних наук.

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Кузнецов Валерій Євгенович, Інститут розведення і генетики тварин УААН, с.Чубинське Київської обл., заступник директора з наукової роботи

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Коновалов В’ячеслав Сергійович, Інститут розведення і генетики тварин УААН, с.Чубинське Київської обл., головний науковий співробітник лабораторії генетичних основ селекції

кандидат біологічних наук Бердичевський Микола Степанович,

Інститут землеробства і біології тварин УААН, м.Львів, завідувач лабораторії генетики, розведення і селекції великої рогатої худоби

Провідна установа:

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка Кабінету міністрів України, м.Київ, кафедра загальної та молекулярної генетики

о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 27.355.01 Інституту розведення і генетики тварин УААН за адресою: 08321, Київська область, Бориспільський р-н, с. Чубинське, вул. Погребняка, 1. З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту розведення і генетики тварин УААН.

Автореферат розісланий 2000 року.

Захист дисертації відбудеться

року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат сільськогосподарських наук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед методів, що використовуються у репродуктивній біотехнології ссавців, центральне місце займає запліднення in vitro (IVF - in vitro fertilization). У відтворенні великої рогатої худоби при застосуванні даного методу, використовуючи прижиттєве вилучення ооцитів, можна одержувати значно більшу кількість ембріонів від корови-донора, ніж при використанні класичних методів індукції суперовуляції і ембріотрансплантації (multiple ovulation and embryo transfer - MOET) (Kruip T.A.M., Boni R., 1994; Smorag Z. e.a., 1998; Кузнецов B.E. и др., 1998). Однак не завжди IVF є ефективним. Так, у деякіх випадках неплідності, обумовленої чоловічім фактором, IVF не дає бажаного результату (Iritani А., 1991; Tarin J.J., 1995). У тих випадках, коли за допомогою IVF неможливо досягти запліднення яйцеклітин, або з метою підвищення ефективності даної технології використовують мікрозапліднення.

Аналіз літературних джерел свідчить, що вплив мікрохірургичних методів на запліднення in vitro ооцитів (Goto К. е.а., 1991; Зубец М.В. и др., 1993; Kuznetsov V.E., Yelizarova І.В., 1994; Pavasuthipaisit К. е.а., 1994; Rho G. е.а., 1998) та доімплантаційний розвиток як цілих ембріонів, так і половинок (Schmidt М. е.а., 1990,1992; Мадіч А.В. та ін., 1997), четвертинок (Rho G. е.а., 1998) та ізольованих бластомерів (Loskutoff N.M. е.а., 1992,1993) зародків недостатньо досліджено у великої рогатої худоби. В літературі немає даних щодо доімплантаційного розвитку ембріонів великої рогатої худоби, одержаних за допомогою мікрозапліднення in vitro шляхом порушення цілісності прозорої оболонки, до стадії бластоцисти. Дуже мало повідомлень про вплив мікрохірургічного поділу зародків великої рогатої худоби, одержаних in vitro, на розвиток поза організмом половинок, четвертинок та ізольованих бластомерів ембріонів (Peura Т., 1991; Loskutoff N.M. е.а., 1992,1993; Tominada К. е.а., 1996; Riedi J. е.а., 1996; Skrzyszowska М. е.а., 1997; Rho G. е.а., 1998), і ці питання залишаються майже не вивченими.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відповідності з науково-технічними програмами Інституту розведення і генетики тварин УААН по завданнях: “Розробити нові біотехнологічні методи прискореного розмноження високоцінних сільськогосподарських тварин” 1991-1995 pp. (№ держреєстрації UA01001476Р); “Вдосконалити і впровадити системи застосування молекулярно-генетичних, біохімічних, фізіологічних і біотехнологічних методів у селекції сільськогосподарських тварин” 1996-2000 pp. (№ держреєстрації 0196U016325), а також була підтримана грантом

Міністерства України у справах науки і технологій (№ держреєстрації 0198U002131, 1997-1998 pp.).

Мета і завдання досліджень. Метою роботи було виявлення цитогенетичних особливостей запліднення in vitro ооцитів корів з частково розсіченою прозорою оболонкою та яйцеклітин, позбавлених прозорої оболонки, доімплантаційного розвитку поза організмом ембріонів, одержаних таким шляхом, а також визначення закономірностей раннього ембріонального розвитку поза організмом ізольованих бластомерів, половинок і четвертинок зародків, одержаних in vitro та in vivo.

Згідно з метою досліджень були поставлені наступні завдання:

1. Розробити метод часткового розсічення прозорої оболонки ооцитів корів, який не потребує застосування мікроманіпуляторів.

2. Визначити частоту партеногенетичної активації яйцеклітин корів під впливом мікрохірургічних маніпуляцій з прозорою оболонкою.

3. Вивчити цитогенетичні особливості формування пронуклеусів у зиготах після запліднення ооцитів корів з частково розсіченою прозорою оболонкою та яйцеклітин, звільнених від zona pellucida.

4. Виявити цитогенетичні та морфологічні закономірності доімплантаційного розвитку зародків, одержаних після запліднення ооцитів з частково розсіченою прозорою оболонкою та яйцеклітин, позбавлених zona pellucida.

5. Удосконалити методи мікрохірургічного поділу зародків з урахуванням стадії розвитку доімплантаційних ембріонів, одержаних in vitro.

6. Провести порівняльне дослідження доімплантаційного розвитку половинок і четвертинок ембріонів, одержаних in vitro та in vivo.

7. З’ясувати закономірності розвитку in vitro ізольованих бластомерів зародків, одержаних поза організмом.

Наукова новизна роботи. Продовжувалось вивчення впливу часткового розсічення прозорої оболонки на запліднення in vitro ооцитів корів і доімплантаційний розвиток ембріонів поза організмом. Розроблена методика часткового розсічення прозорої оболонки (PZD-partial zona dissection) ооцитів корів без використання мікроманіпулятора.

Вперше проведено детальний аналіз цитогенетичних особливостей поліспермного запліднення ооцитів корів та формування пронуклеусів у поліспермних зиготах.

Вперше доведено можливість розвитку ембріонів, одержаних після запліднення in vitro ооцитів корів з частково розсіченою прозорою оболонкою, до стадії бластоцисти та виявлено особливості цього розвитку.

Удосконалено методику культивування ізольованих бластомерів з використанням половинок прозорих оболонок та проведено порівняльний

з

аналіз здатності до розвитку ізольованих бластомерів ембріонів великої рогатої худоби, що одержані in vitro, у різних системах культивування.

Вперше проведений порівняльний аналіз розвитку половинок і четвертинок морул-бластоцист, одержаних in vitro та in vivo.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблена методика запліднення in vitro ооцитів корів з частково розсіченою прозорою оболонкою може бути використана на племпідприємствах України при використанні сперми генетично цінних бугаїв, які вибраковуються в зв’язку з низькою концентрацією або зниженою рухливістю сперматозоїдів. Визначення життєздатності половинок і четвертинок ембріонів великої рогатої худоби, одержаних in vitro та in vivo, методом їх культивування поза організмом на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводу корів може бути використано в практиці трансплантації половинок зародків, що значно збільшить кількість телят як від донорів ембріонів у схемах МОЕТ, так і при використанні IVF-зародків.

Особистий внесок здобувача. Участь автора в одержанні наукових результатів, викладених у дисертації, становить близько 87%. Автором особисто проведено аналіз першоджерел літератури; здійснені мікрохірургічні маніпуляції та дослідження по культивуванню in vitro половинок, четвертинок та інтактних ембріонів; експериментальні дослідження документовані мікрофотографіями; виконано статистичний аналіз отриманих даних. Дослідження по отриманню половинок і четвертинок ембріонів, одержаних in vivo у схемах МОЕТ, проводились спільно із співробітниками лабораторії трансплантації ембріонів МП “Біосервіс” (м. Харків).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались та обговорювались на Всеукраїнській ювілейній науково-практичній конференції “Генетика продуктивності тварин” (Київ, 1994), на міжнародній науково-практичній конференції “Теория и практика племенного дела в животноводстве” (Харків, 1996), на ювілейній міжнародній конференції “Проблеми індивідуального розвитку сільськогосподарських тварин” (Київ, 1997), на міжнародній науково-практичній конференції “Конкурентноспособное производство продукции животноводства в Республике Беларусь” (Жодіно, 1998), на II (Одеса, 1998) та III (Одеса, 1999) міжнародних конференціях “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях”, на міжнародній науково-виробничій конференції “Селекційно-генетичні та біотехнологічні методи консолідації новостворених порід і типів сільськогосподарських тварин” (Київ, 1999).

Публікації. Результати досліджень опубліковано в 3 статтях у

наукових журналах, 4 збірниках наукових праць та в 3 матеріалах і тезах конференцій. Всього 11 друкованих праць, в тому числі у фахових виданнях опубліковано 8 друкованих робіт.

Структура і обсяг роботи. Дисертація викладена на 159 сторінках і містить 32 ілюстрації і 11 таблиць. Дисертація складається з вступу, З розділів, висновків та практичних пропозицій, списку літератури, який включає 278 джерел, в тому числі 229 іноземних.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Ооцити корів і телиць одержували з яєчників забитих тварин та культивували in vitro на протязі 22-24 годин при 38,5°С. Дозрілі in vitro ооцити співкультивували з заморожено-відтанутими капацитованими поза організмом сперматозоїдами бугая у модифікованому середовищі Тироде -Fert-TALP на протязі 18 годин. Сперматозоїди попередньо обробляли за модифікованою методикою (swim-up) Паріша (Parrish J.J. е.а., 1986). Капацитацію сперматозоїдів викликали за допомогою гепарину (1,8 Од/мл) та інкубації в середовищі TALP, яке не містило іонів Са2+.

Дозрілі in vitro ооцити корів звільняли від клітин кумулюсу за допомогою обробки 0,02-0,04%-ним розчином гіалуронідази та піпетування, після чого скляною мікроголкою (без використання мікроманіпулятора) у 0,5 М розчину сахарози частково розсікали zona pellucida. В інших дослідах денудовані ооцити звільняли від zona pellucida перетравленням у 0,1%-ному розчині пронази. Ооцити з частково розсіченою (PZD-ооцити) та повністю перетравленою прозорою оболонкою (ZF-ооцити - від англ. zona free oocytes) співкультивували з заморожено-відтанутими капацитованими in vitro сперматозоїдами бугая як описано вище для інтактних яйцеклітин.

Мікрохірургічний поділ морул і бластоцист на половинки і четвертинки здійснювали скляною мікроголкою без допомоги мікроманіпулятора. Ізольовані бластомери 4-8-клітинних зародків одержували шляхом лізису zona pellucida 0,1%-ним розчином пронази та наступним піпетуванням клітин у середовищі, що не містило іонів Саі+. Ембріони, половинки та четвертинки зародків, ізольовані бластомери 4-8-клітинних ембріонів великої рогатої худоби культивували у модифікованому середовищі 199 на моношарі епітеліальних клітин яйцепроводів корів (ЕКЯК) або у модифікованому середовищі 199 кондиційованому на моношарі ЕКЯК.

Яйцеклітини та ембріони фіксували за модифікованим нами методом Тарковського (Tarkowski А.К., 1966). Цитогенетичний аналіз

сухоповітряних препаратів, пофарбованих 2%-ним розчином барвника

Гімза, проводили під світловим мікроскопом МБД-15. Статистичну обробку одержаних даних проводили з використанням критеріїв Ст'юдента та у} (Рокицкий П.Ф., 1967). Матеріал документували мікрофотографіями.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ Цитогенетичні особливості впливу порушення цілісності прозорої оболонки на частоту активації до партеногенезу, запліднення ооцитів корів in vitro та подальший доімплантаційний розвиток ембріонів поза організмом

Розробка і використання нових мікрохірургічних методів при заплідненні in vitro відкриває додаткові можливості для одержання зародків. Нами досліджувався вплив часткового розсічення та повного ензиматичного перетравлення прозорої оболонки ооцитів корів на частоту активації до партеногенезу та рівень моноспермного і поліспермного запліднення ооцитів корів in vitro і подальший розвиток зародків поза організмом.

Нами встановлено, іцо порушення цілісності прозорої оболонки ооцитів корів шляхом часткового розсічення або повного ензиматичного перетравлення не впливає на частоту активації до партеногенезу порівняно із спонтанним партеногенезом інтактних ооцитів (6,7%,7/104 і 6,9%, 7/102 проти 6,3%, 7/110 відповідно, Р> 0,05). Серед активованих ооцитів в усіх групах досліду найчисельнішою була група яйцеклітин з одним пронуклеусом (4,5% - для інтактних, 2,9% - для PZD- і 4,9% - для ZF-ооцитів). Також в наших дослідах зустрічалися активовані яйцеклітини, що містили два пронуклеуси, які утворювалися, скоріше за все, внаслідок блокади екваційного ділення і формування другого полярного тільця після активації (0,9% - для інтактних, 1,9% - для PZD- і 1,0% - для ZF-ооцитів). Крім того, у невеликої кількості активованих до партеногенезу ооцитів ми спостерігали дроблення до 2-4-клітинної стадії після 24-годинного культивування на моношарі ЕКЯК (0,9% - для інтактних, 1,9% - для PZD-і 1,0%-для ZF-ооцитів).

Дослідження показали, що часткове розсічення прозорої оболонки ооцитів не сприяє підвищенню рівня запліднення та дроблення яйцеклеток (Р>0,05) при використанні сперматозоїдів у концентрації 1,55х105/мл (Табл. 1). При використанні меншої концентрації сперматозоїдів (5,4x105/мл) статистично вірогідної різниці за рівнем дроблення між дослідною та контрольною групами також не було виявлено, хоча різниця за рівнем запліднення PZD-ооцитів та інтактних яйцеклітин наближалась до вірогідної. Однак при подальшому зниженні концентрації сперматозоїдів (до 1,8х105/мл) частота запліднення і дроблення

Таблиця 1

Вплив концентрації сперматозоїдів на запліднення та дроблення in vitro

інтактних та з частково розсіченою прозорою оболонкою ооцитів корів

Групи Концентрація Кількість Кількість, п (%) Частота Частота

досліду сперматозоїдів, млн/мл, М+т осіменених ооцитів зигот з 2 пронуклеусами зигот з 3-4 пронуклеусами дроблення, n (%) запліднення, n (%) *

PZD- 107 21d(19,6) 5® (4,7) 50h(46,7) 76'(71,0)

ооцити Інтактні 1,55±0,15а 112 11' (9,8) 26(1,8) 55» (49,1) 68' (60,7)

ооцити PZD- 112 14de(12,5) Н (0,9) 36432,1) 51m(45,5)

ооцити Інтактні 0,54±0,01ь 109 8' (7,3) lg(0,9) 28* (25,7) 37mn(33,9)

ооцити PZD- 100 10de(10,0) l8 (1,0) 18J (18,0) 29" (29,0)

ооцити Інтактні 0,І8±0,015С 113 4* (3,5) 544,4) 9° (7,9)

ооцити____________________________________________________________________

* - обчислювали як співвідношення кількості зигот з 2 і більше пронуклеусів та ембріонів до кількості осіменених ооцитів; а:Ь, Ь:с -Р < 0,001 (критерій Ст’юдента); d:f - Р < 0,05, d:e, j:k - Р < 0,01, l:m, l:n, 1:о, n:o - Р < 0,001 (критерій х2); в цій та наступних таблицях різні суперскрипти в межах однієї колонки вказують на вірогідну різницю між показниками (Р не більше 0,05).

PZD-ооцитів була вірогідно вище, ніж у контролі. Таким чином, розсічення zona pellucida впливає на рівень запліднення і дроблення яйцеклітин корів у залежності від концентрації сперматозоїдів, при цьому зниження концентрації сперматозоїдів меншою мірою впливає на рівень запліднення і дроблення ооцитів з частково розсіченою zona pellucida порівняно з інтактними яйцеклітинами. За рівнем поліспермного запліднення між усіма групами досліду статистично вірогідної різниці не встановлено.

В наступних експериментах ми вивчали вплив часткового розсічення та повного ензиматичного перетравлення прозорої оболонки ооцитів корів на подальший доімплантаційний розвиток ембріонів, одержаних з використанням таких ооцитів. Нами встановлено, що часткове розсічення прозорої оболонки ооцитів корів не впливає на частоту дроблення при

Таблиця 2

Вплив часткового розсічення прозорої оболонки ооцитів корів на їх заплщнюваиість in vitro та подальший доімплантаційний розвиток ембріонів _____________________________поза організмом ____________________________

Групи досліду Кількість осіменених ооцитів Кількість, п (%) Частота дроблення, п (%) Частота заплід- нення, П(%) Морул Блас- тоцист

зигот з 2 пронуклеусами зигот з 34 пронуклеусами

Інтактні 114 947,9) 1ь (0,9) 72а (63,1) 82е (71,9) 208 645,3)

ооцити (17,5)

PZD- 107 11а (10,3) Зь (2,8) 75d (70,1) 89е І Її 140,9)

ооцити (83,2) (10,3)

концентрації сперматозоїдів 2х106/мл, хоча і спостерігалась більш висока частота їх запліднення (різниця наближалась до вірогідної) (Табл.2). При подальшому культивуванні на моношарі ЕКЯК спостерігалась тенденція до більш високої життєздатності зародків у групі інтактних ооцитів. Так, через 90 годин культивування після запліднення більша кількість життєздатних зародків (8-16-клітинні ембріони) спостерігалась в групі інтактних ооцитів, однак вірогідної різниці за цим показником між групами інтактних та PZD-ооцитів не спостерігалось (40,3%, 29/72 проти 30,7%, 23/75 відповідно). Рівень розвитку до стадії морули після 139-162-годинного культивування був більшим в групі інтактних ооцитів, але вірогідної різниці за цим показником між групами інтактних та PZD-ооцитів також не спостерігалось (22,2%, 16/72 проти 14,7%, 11/75 відповідно). Після 139-162-годинного культивування бластоцисти виявлялися лише в контрольній групі (Рис.1). Утворення бластоцелю у ембріонів з групи PZD-ооцитів спостерігалося лише після 185 годин культивування, при цьому часткове розсічення прозорої оболонки ооцитів корів не перешкоджало вилупленню одержаних із них бластоцист. Загальний рівень розвитку до стадії морули хоча і був вищим у контрольній групі, але ця різниця не була вірогідною. За рівнем розвитку осіменених ооцитів до стадії бластоцисти статистично значимої різниці між дослідною та контрольною групами також не було виявлено. Отже, отримані після запліднення PZD-ооцитів зародки великої рогатої худоби були здатні до розвитку in vitro до стадії бластоцисти.

Після осіменення ZF- та інтактних яйцеклітин було встановлено, що навіть при застосуванні концентрації сперматозоїдів, меншої на порядок (2х105/мл проти 2х106/мл відповідно), частота запліднення була вищою в

s

'v, —7 ~ ”■ групі ZF-ооцитів (86,4%, 95/110

I ' - " * ' ‘ проти 78,8%, 160/203, різниця

„*л- • , наближалась до вірогідної). При

. ' цьому рівень поліспермного запліднення в дослідній групі був ' ’ значно вищим ніж в контролі 5 (3,6%, 4/110 проти 0,5%, 1/203, ^ , Р < 0,05, критерій х2)- За рівнем frbmrtZfiL. дроблення не було встановлено Рис. 1. Одержана in vitro вірогідної різниці між ZF- та бластоциста, яка вилуплюється з інтактними ооцитами при прозорої оболонки. Прижиттєва за ванІ!І оптимальної w

мікрофотографія (об. х 9, ок. х 10). . __ ...

v ^ Г -г V > / кожного типу ооцитів концентрації

сперматозоїдів (2х107мл та 2х106/мл відповідно). При подальшому культивуванні ембріонів на моношарі ЕКЯК зародки, одержані з інтактних яйцеклітин, мали більш високу життєздатність ніж ембріони, отримані з ZF-ооцитів. Так, через 90 годин культивування після запліднення значно більша кількість 8-16-клітинних ембріонів спостерігалась у групі інтактних ооцитів, ніж у групі ZF-ооцитів (54,2%, 77/142 проти 25,9%, 21/81, Р<0,001). Рівень розвитку до стадії морули після 139-годинного культивування в групі ZF-ооцитів був значно нижчим, ніж в групі інтактних яйцеклітин (2,5%, 2/81 проти 24,6%, 35/142, Р<0,001). Подальшого розвитку ZF-ембріонів не спостерігалось. Таким чином, дозрілі ооцити корів, позбавлені прозорої оболонки, здатні до запліднення in vitro та подальшого розвитку поза організмом, принаймні, до стадії морули.

Цитогенетичний аналіз сухоповітряних препаратів PZD- і ZF-зародків показав наявність морфологічно нормальних ядер у кількості, відповідній стадії розвитку інтактних ембріонів.

Вивчення впливу порушення цілісності zona pellucida на рівень поліспермії (ооцити фіксували через 18 годин після осіменення) показало, що відсоток моно- та поліспермного запліднення і частота появи зигот з одним пронуклеусом, а також рівень запліднення значно не відрізнялись у контрольній групі та групі ооцитів з частково розсіченою прозорою оболонкою (Табл.З). Однак для ZF-ооцитів рівень поліспермії та загальна частота запліднення, на відміну від інших показників, були значно вищими ніж в контрольній групі чи в групі PZD-ооцитів. Отримані дані вказують на те, що блок поліспермії у великої рогатої худоби головним чином здійснюється на рівні прозорої оболонки, однак на рівні плазматичної мембрани у цих тварин також існує незначний блок поліспермії, що

Таблиця З

Вплив порушення цілісності прозорої оболонки ооцнтів корів на частоту __________'____________запліднення та поліспермії_________________________

Групи Кількість Кількість зигот, п (%) Частота

досліду осіменених 3 1 з 2 з більш ніж 2 запліднення,

ооцитів пронук- клеусом пронук- леусами пронуклеусами п (%)

Інтактні 97 242,1) 63ь (64,9) 343,1) 66« (68,0)

ооцити

PZD- 96 Iа(1,0) 64ь (66,7) 747,3) 718(74,0)

оцити

ZF- 103 1*(1-0) 22е (21,4) 69467,0) 91488,4)

ооцити

b:c, e:d - Р < 0,001, g:f — Р < 0,01 (критерій х2)-

доводиться наявністю моноспермного запліднення при застосуванні більш низької концентрації сперматозоїдів (2х105/мл).

Нами було проаналізовано співвідношення кількості розбухлих головок сперматозоїдів, ранніх та пізніх пронуклеусів у поліспермних зиготах, одержаних після спільної 18-годинної інкубації сперматозоїдів у концентрації 2х106/мл з інтактними, PZD- та ZF-ооцитами корів (Табл.4). Дослідження показали, що в поліспермних зиготах, одержаних після запліднення інтактних ооцитів, спостерігається максимальна частота формування пізніх чоловічих пронуклеусів, значно більша, ніж в інших групах досліду. Мінімальна частота формування пізніх чоловічих пронуклеусів спостерігалася в групі ZF-ооцитів. З іншого боку, середня кількість пізніх чоловічих пронуклеусів у одній поліспермній зиготі була максимальною в групі ооцитів, позбавлених прозорої оболонки. Ранні пронуклеуси спостерігалися тільки в групі ZF-ооцитів. Найбільший відсоток деконденсованих головок сперматозоїдів спостерігався в групі ZF-ооцитів. Середня кількість деконденсованих головок сперматозоїдів у одній поліспермній зиготі була значно більшою в групі ZF-ооцитів, ніж в інших групах досліду. Нами було встановлено, що дозрілі in vitro ооцити корів, звільнені перед заплідненням від прозорої оболонки, здатні деконденсувати в середньому 6,3+0,45 головок сперматозоїдів. Максимальна кількість пронуклеусів і деконденсованих головок сперматозоїдів, що спостерігалась нами у таких яйцеклітинах дорівнювала 13. З дослідів, проведених на мишах, відомо, що фактор формування чоловічого пронуклеуса утворюється в яйцеклітинах ссавців у обмеженій

Таблиця 4

Особливості формування чоловічих пронуклеусів в поліспермшіх зиготах, одержаних після запліднення інтактних, 7Л'- та PZD-ooцитiв корів

Групи досліду Всього дослід- Кількість чоловічих пронуклеусів та деконденсованих головок сперматозоїдів

жено п у одній Головок Ранніх Пізніх

полі- зиготі, сперматозоїдів пронуклеусів пронуклеусів

сперм- М±т п у одній п у одній п у одній

них (%) зиготі, (%) ЗИГОТІ, Є/о) зиготі,

зигот М±т М±т М±т

Інтактні 17 36 2,12+0,08» 2е 2,00±0,00г - - 34* 2,00±0,091щ

ооцити (5,6) (94,4)

рго- 17 44 2,59±0,31а П* 2,75±0,73е - - ЗЗі 1,94±0,14т

ооцити (25,0) г (75,0)

гр- 69 426 6,30±0,45ь 170' 4,47±0,№ 175 4,07±0,18 81* 2,3110,03і

ооцити (39,9) (41,1) (19,0)

<3:с, іу - Р < 0,05, е.с, і:к, j:k - Р < 0,001 (критерій %2).

д:Ь, 1:т - Р < 0,05; Ь:а, ПЬ - Р < 0,001 (критерій Ст’юдента).

кількості і зберігається протягом обмеженого часу та швидко витрачається, якщо в ооцит потрапляють декілька сперматозоїдів (\Vitkowska А., 1981; Дьібан А.П., 1988). Подібне явище також спостерігалось нами в ооцитах корів при поліспермному заплідненні - в поліпронуклеарних зиготах, одержаних після запліднення гр-ооцитів. Фактора формування чоловічого пронуклеуса вистачало, в середньому, на утворення 2,31±0,03 пізніх пронуклеусів, а максимальна кількість пізніх пронуклеусів дорівнювала 5. В результаті недостатньої кількості в яйцеклітинах фактора формування чоловічого пронуклеуса з великої кількості деконденсованих головок сперматозоїдів не утворювались повноцінні пізні пронуклеуси, формування пронуклеусів зупинялося на стадії раннього пронуклеуса або взагалі не спостерігалось.

Таким чином, кількість фактора деконденсації хроматину головки сперматозоїда в поліспермних зиготах великої рогатої худоби є достатньою для деконденсації, в середньому, 6,3 головок сперматозоїдів, що значно менше, ніж для інших видів ссавців. Формування повноцінних пізніх пронуклеусів із деконденсованих головок сперматозоїдів в поліспермних зиготах у більшості випадків порушено.

Одержання ембріопальних клонів методом мікрохірургічного поділу зародків великої рогатої худоби

Вплив бісекції зародків, одержаних in vivo, на подальший розвиток напівембріонів був описаний рядом дослідників (Schmidt М. е.а., 1990, 1992; Loskutoff N.M. е.а., 1993; Мадіч А.В. та ін., 1997). У наших дослідженнях проводилось вивчення розвитку in vitro частин морул-бластоцист великої рогатої худоби, одержаних поза організмом (IVF-половинок та IVF-четвертинок), у порівнянні з половинками та четвертинками морул-бластоцист, одержаних in vivo, та проведено порівняльний аналіз розвитку in vitro половинок морул та половинок бластоцист, отриманих поза організмом. Як показали результати експериментів, половинки та четвертинки ембріонів, отриманих in vivo, починали компактизуватись раніше, ніж частини ембріонів, одержаних in vitro\ третина напівембріонів, отриманих in vivo, округлялась вже через ЗО секунд культивування (Рис.2), і вже через ЗО хвилин частота компактизації цих частин зародків досягала свого максимуму (Рис.За). Через 24 години культивування найменша частота округлення спостерігалася для IVF-чегвертинок (66,7%, 20/30), причому цей показник у даній групі був вірогідно нижчим (Р<0,05) порівняно з половинками зародків, одержаних in vivo (91,7%, 22/24). Різниця за цим показником між IVF-половинками (77,8%, 49/60) та IVF-четвертинками наближалась до вірогідної. Однак між іншими групами досліду вірогідної різниці за даним показником не було. Хоча процес компактизації у більшості випадків відбувався подібним чином у різних групах досліду, за здатністю до формування бластоцист між усіма дослідними групами спостерігалась відмінність. Так, у більшості половинок ембріонів, отриманих in vivo, формування бластоцелю спостерігалось вже через 2-3 години культивування, що свідчить про їх високу життєздатність. Однак лише половина четвертинок зародків, отриманих in vivo, менш ніж 25% половинок і лише 3,3% четвертинок IVF-ембріонів формували бластоцель через 10 годин культивування (Рис.ЗЬ). При подальшому культивуванні половинки зародків, отриманих in vivo, зберігали свою найкращу життєздатність і формували бластоцель вірогідно частіше порівняно з IVF-половинками і четвертинками будь-якого походження (87,5%, 21/24; 38,3%, 23/60; 50,0%, 5/10 і 16,7%, 5/30, Р<0,05).

При порівнянні розвитку поза організмом половинок морул та бластоцист, одержаних in vitro, було встановлено, що половинки IVF-бластоцист починали округлятися раніше, вже через ЗО хвилин культивування, а максимальний рівень їх компактизації спостерігався через 2 години культивування, тоді як максимальний рівень округлення

половинок IVF-морул досягався тільки через 24 години культивування (Рис.Зс). Однак після 24-годинного культивування кількість компактизованих

напівембріонів, що походили від морул та бластоцист, одержаних in vitro, значно не відрізнялась між цими групами (74,5%, 35/44 та 87,5%, 14/16 відповідно) і порівняно з половинками бластоцист,

одержаних ш vivo (88,9%, 16/18). Поряд з цим, нами було показано, що половинки бластоцист та морул, одержаних in vitro, мають різні потенції до розвитку поза організмом. Так, за здатністю до формування бластоцелю через 24 години культивування половинки пізніх морул значно відрізнялись від половинок бластоцист (27,7%, 13/44 проти 62,5%, 10/16, Р<0,05) (Рис.ЗсІ). Цікавим є те, що при порівнянні половинок IVF-бластоцист з половинками 7-денних бластоцист, одержаних in vivo (88,9%, 16/18), не спостерігалося вірогідної різниці за здатністю до формування бластоцелю через 24 години культивування. Цитогенетичні дослідження сухоповітряних препаратів показали наявність у половинок та четвертинок усіх дослідних груп відповідної кількості морфологічно нормальних непікнотичних ядер. Отже, рівень формування бластоцелю у половинок та четвертинок у значній мірі залежить від походження частин зародків (in vivo або in vitro), кількості в них клітин порівняно з інтактним ембріоном та стадії розвитку, на якій проводиться бісекція.

В інших дослідженнях нами проводилось вивчення потенції ізольованих бластомерів 4-8-клітинних ембріонів великої рогатої худоби до розвитку in vitro у різних системах культивування: у порожніх сурогатних zonae pellucidae (група І), на половинках zonae pellucidae (група II) або без zona pellucida (група III); ізольовані бластомери усіх трьох груп культивували на моношарі ЕКЯК. Ізольовані бластомери без zona pellucida культивували також в середовищі, кондиційованому на моношарі ЕКЯК (група IV). В наших експериментах не спостерігалося статистично вірогідної різниці між числом контрольних ембріонів, що розвивалися до 16-32-клітинної стадії, і кількістю ізольованих бластомерів І-ІІІ групи, що роздробилися до 2-10-клітинної стадії (31,3%, 62/198; 31,9%, 43/135; 33,3%,

Рис. 2. Половинки пізньої морули великої рогатої худоби, одержаної ш vivo. Прижиттєва мікрофотографія (об. х 9, ок. х 10).

Тривалість культивування in vitro

я

§

Л

v§

ВС

>>

z

a

0 •в* g

1

CS

Еґ

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Тривалість культивування in vitro в годинах

Половинки зародків, отриманих in vivo 33 Четвертинки зародків, отриманих in vivo

Половинки зародків, отриманих in vitro

Четвертинки зародків, отриманих in vitro

,9

7.5

4.5

100

w

Іії «О

£ о

Щ I 60

a* 5

я s t °40 s 1

й іо 20

oS

о

Тривалість культивування in vitro

Тривалість культивування in vitro в годинах

:Н=ПОЛОвинки бластоцист, отриманих in vivo

“ П оловинки бластоцист, отриманих in vitro

“Половинки морул, отриманих in vitro

Рис. 3. а) Здатність до компактизації половинок та четвертинок зародків, одержаних in vivo та in vitro, b) Здатність половинок та четвертинок зародків, одержаних in vivo та in vitro, до формування бластоцелто. с) Здатність до компактизації половинок морул та бластоцист, одержаних in vitro та in vivo, d) Здатність половинок морул та бластоцист, одержаних in vitro та in vivo, до формування бластоцелю.

38/114 і 35,0%, 36/103 відповідно). У даному випадку загальна кількість ділень контрольних та дослідних ембріонів була подібною - 1-3 ділення. В окремих випадках у І дослідній групі спостерігали розвиток ізольованих

бластомерів до стадії компактизованої морули, але компактизація починалася вже на 10-клітинній стадії. Подальшого розвитку зародків, одержаних з ізольованих бластомерів, не спостерігалось. У групі IV не відбувалось розвитку бластомерів внаслідок прилипання ізольованих бластомерів до дна культурального посуду. Цитогенетичний аналіз сухоповітряних препаратів зародків продемонстрував наявність морфологічно нормальних непікнотичних ядер у кількості, відповідної стадії розвитку ембріонів. Таким чином, ізольовані бластомери 4-8-клітинних зародків, отриманих поза організмом, здатні до наступного розвитку (дроблення) в умовах in vitro.

ВИСНОВКИ

1. Порушення цілісності прозорої оболонки ооцитів корів методом часткового розсічення або повного ензиматичного перетравлення не впливає на частоту активації до партеногенезу порівняно із спонтанним партеногенезом інтактних ооцитів.

2. Часткове розсічення прозорої оболонки значно підвищує запліднюваність ооцитів корів in vitro і збільшує вихід ембріонів при використанні низької концентрації сперматозоїдів (1,8x103 /мл) у порівнянні з інтактними ооцитами.

3. Зниження концентрації сперматозоїдів меншою мірою впливає на запліднення in vitro і дроблення ооцитів з розсіченою zona pellucida порівняно з інтактними ооцитами.

4. Ембріони великої рогатої худоби, одержані методом запліднення поза організмом ZF-ооцитів і PZD-ооцитів, можуть розвиватися in vitro до стадії ранньої морули або бластоцисти відповідно.

5. Основний блок поліспермії у ооцитів корів здійснюється на рівні прозорої оболонки, однак на рівні оолеми у цих тварин також існує блок поліспермії, що доводиться наявністю нормального моноспермного запліднення ZF-ооцитів не тільки при низькій (2х105/мл), але і при більш високій концентрації сперматозоїдів (2х106/мл).

6. Кількість фактора деконденсації хроматину головки сперматозоїда у поліспермних зиготах великої рогатої худоби є достатньою для деконденсації у середньому 6,3 головок сперматозоїдів. Формування повноцінних пізніх пронуклеусів із деконденсованих головок сперматозоїдів в поліспермних зиготах у більшості випадків порушено внаслідок недостатньої кількості фактора формування чоловічого пронуклеуса.

7. Рівень формування бластоцелю у половинок та четвертинок у значній мірі залежить від походження частин зародків (от vivo або in vitro) та

кількості в них клітин порівняно з інтактним ембріоном. Показано, що половинки та четвертинки IVF-ембріонів значно запізнюються у своєму розвитку in vitro і є менш життєздатними порівняно з половинками та четвертинками ембріонів, одержаних in vivo.

8. Половинки бластоцист, одержаних in vitro, є більш життєздатними, ніж половинки морул, отриманих поза організмом, та не відрізняються за здатністю до розвитку від половинок бластоцист, одержаних in vivo, і тому є більш придатними для нехірургічної трансплантації та одержання з них четвертинок.

9. Ізольовані бластомери 4-8-клітшших зародків великої рогатої худоби, одержаних in vitro, мають таку саму здатність до розвитку in vitro, що й інтактні ембріони, тобто кількість ділень у дослідних і контрольних зародків була подібною.

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

1. Методика часткового розсічення прозорої оболонки ооцитів корів може бути застосована для використання сперми від генетично цінних бугаїв, яких вибракувано з селекційних програм внаслідок низької концентрації життєздатних сперматозоїдів в їх еякулятах.

2. Виявлені нами особливості розвитку поза організмом половинок та четвертинок ембріонів, одержаних in vivo та in vitro, необхідно враховувати при їх нехірургічній трансплантації реципієнтам. Для оцінки якості половинок і четвертинок зародків, отриманих in vivo, цілком достатнім є 30-хвилинне культивування. Однак половинки і четвертинки зародків, отриманих in vitro, потребують більш тривалого проміжку часу (1-2 години) для визначення їх потенційної життєздатності.

3.Для одержання монозиготних близнюків з половинок або четвертинок пізніх морул і бластоцист, отриманих in vitro, краще використовувати бластоцисти ніж морули.

4. Отримані дані щодо утворення пронуклеусів у нормальних та поліспермних зиготах, розвитку in vitro інтактних зародків та їх частин можуть бути використані в учбових курсах університетів з генетики та біології розвитку ссавців.

Список основних праць, опублікованих за темою дисертації:

1.Басовський Д.М. Ефективність запліднення і дроблення in vitro інтактних та PZD-ооцитів корів в залежності від концентрації сперматозоїдів II Аграр. Вісн. Причорномор’я: 36. наук, праць. - 1998. - №4. - С. 7-12.

2.Кузнєцов B.C., Кузнєцова І.Б., Басовський Д.М., Шеховцов С.Ю.

Дослідження життєздатності половинок і четвертинок морул-бластоцист великої рогатої худоби, отриманих in vivo та in vitro, методом культивування поза організмом // Вісн.агр.науки. - 1999. - № 7. - с.37-40.

3.Басовський Д.М. Вплив умов культивування на розвиток бластомерів 4-8-клітинних ембріонів, одержаних in vitro II Вісн.агр.науки. - 1999. - № 10.

-С.81.

4. Басовский Д.Н. Влияние частичного рассечения прозрачной оболочки на оплодотворение ооцитов коров in vitro и последующее развитие эмбрионов вне организма // Цитология и генетика. - 1999. - 33, № 5. - с. 58-64.

5. Басовський Д.М. Одержання та культивування ізольованих бластомерів 4-8-клітинних ембріонів великої рогатої худоби, отриманих поза організмом // Збір. мат. II Міжнар. конф. “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях”, Одеса, 1998. - К.: “Аграрна наука”, 1998. - С. 79-81.

Басовський Д.М. Вплив мікрохірургічних маніпуляцій на цитогенетичні особливості запліднення та доімплантаційного розвитку in vitro у великої рогатої худоби. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Інститут розведення і генетики тварин УААН, с.Чубинське, Київськая обл., 2000.

Досліджено вплив порушення цілісності прозорої оболонки ооцитів корів шляхом часткового розсічення або повного ферментативного видалення на активацію до партеногенезу, моно- та поліспермне запліднення яйцеклітин і доімплантаційний розвиток зародків поза організмом. Вивчено морфологічні і цитогенетичні особливості формування пронуклеусів у поліспермних зиготах великої рогатої худоби. Розроблено методику часткового розсічення прозорої оболонки ооцитів корів, яка не потребує використання мікроманіпулятора. Проведено порівняльний аналіз розвитку поза організмом половинок і четвертинок морул і бластоцист, одержаних in vitro та in vivo. Досліджено здатність до розвитку in vitro ізольованих бластомерів 4-8-клітинних зародків, отриманих поза організмом.

Ключові слова: запліднення in vitro (IVF), часткове розсічення zona pellucida (PZD), ооцити без zona pellucida, цигогенетичний аналіз, напівембріони, четверть-ембріони, ізольовані бластомери, велика рогата худоба.

Басовский Д.Н. Влияние микрохирургических манипуляций на цитогенетические особенности оплодотворения и доимлантационного развития in vitro у крупного рогатого скота. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Институт разведения и генетики животных УААН, с.Чубинское, Киевская обл., 2000.

Исследовано влияние нарушения целостности прозрачной оболочки ооцитов коров путем ее частичного рассечения или полного ферментативного удаления на активацию к партеногенезу, моно- и полиспермное оплодотворение яйцеклеток и доимплантационное развитие зародышей вне организма. Изучены морфологические и цитогенетические особенности формирования пронуклеусов в полиспермных зиготах крупного рогатого скота. Разработана методика частичного рассечения прозрачной оболочки ооцитов коров без использования микроманипуляторов. Проведен сравнительный анализ развития вне организма половинок и четвертинок морул и бластоцист, полученных in vitro и in vivo. Исследована способность к развитию in vitro изолированных бластомеров 4-8-клеточных зародышей, полученных вне организма. Ключевые слова: оплодотворение in vitro (IVF), частичное рассечение zona pellucida (PZD), ооциты без zona pellucida, цитогенетический анализ, полуэмбрионы, четверть-эмбрионы, изолированные бластомеры.

Basovsky D.N. Influence of microsurgica! manipulations on in vitro fertilization and preimplantation development in cattle (cytogenetic research). - Manuscript. Thesis for a candidate’s degree of biological sciences on a speciality 03.00.15 -genetics. - Institute of animal breeding and genetics UAAS, v. Chubinsoye, Kiev Region, 2000.

Influence of partial zona dissection (PZD) or enzymatic zona removal (EZR) on activation to parthenogenetic development and mono- or polyspermic fertilization of cow oocytes and preimplantation development of bovine embryos had been studied. It had been determined that PZD and EZR hadn’t increased the rate of cow oocyte parthenogenetic activation in comparison with zona-intact oocytes. Influence of PZD on the rate of cow oocyte fertilization and following cleavage depended on concentration of spermatozoa. There was no significant difference in fertilization and cleavage rate of oocytes with partial zona dissection (PZD-oocytes) and zona-intact oocytes after their insemination with l,55xl06 or 0,54xl06 spermatozoa/ml. However, after decrease of sperm concentration (to 1,8x10s spermatozoa /ml) fertilization and cleavage rate were significantly higher for PZD-oocytes in comparison with zona-intact oocytes. Morphological and cytogenetic analysis of preimplantation embryo

development in vitro had demonstrated the existence of some differences in developmental pattern of embryos obtained after in vitro fertilization of PZD-oocytes, zona-free oocytes and zona-intact oocytes. It had been also observed the developmental abnomalities of zona-free embryos cultured in vitro. Nevertheless, it had been shown that embryos derived from PZD- and zona-free cow oocytes could develop in vitro at least to blastocyst or morula stage, respectively. EZR significantly increased the rate of polyspermic fertilization of bovine oocytes. PZD hadn’t significantly increased the rate of polyspermic penetration of cow oocytes. The main block of a polyspermic penetration of bovine oocytes exists on the level of zona pellucida (ZP). Cow oocytes have also another (less essential) block of polyspermic penetration on the level of oolemma. Normal monospermic fertilization of zona-free oocytes after their insemination with sperm suspension with low and higher concentration of spermatozoa (2xl05/ml and 2xl06/ml, respectively) had proved the existance of such another block of polyspermy. It had been established that quantity of the sperm nucleus decondensing factor (SNDF) in polyspermic cow zygotes was enough for decondensation of chromatin of about 6,3 sperm nuclei. The formation of normal late pronuclei from decondensing sperm heads was often disordered in polyspermic zygotes owing to insufficient quantity of male pronuclear growth factor (MPGF).

It had been studied the in vitro developmental ability of halves and quarters of bovine morulae and blastocysts obtained in vitro and in vivo. Obtained data indicated that development of halves and quarters of embryos obtained in vitro significantly retarded in comparison with the halves and quarters of embryos obtained in vivo. Furthermore, the rate of blastocel formation after 24 h of culture in vitro of halves of morulae obtained in vitro was significantly lower in comparison with halves of blastocysts obtained in vitro and in vivo.

The developmental ability of isolated blastomeres derived from 4-8-cell bovine embryos obtained in vitro had been studied in different cultural systems. It had been shown that isolated blastomeres cultured in hemizonae or surrogate ZP or without ZP on monolayer of bovine oviductal epithelial cells (BOEC) had the same developmental ability as intact embryos at least during the second and the third cell cycles.

Key words: in vitro fertilization (IVF), partial zona dissection (PZD), zona-free oocytes, cytogenetic analysis, half-embryo, quarter-embryo, isolated blastomeres.