Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние материнских вирусспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов на патологию беременности и потомства при экспериментальной врожденной гриппозной инфекции у мышей

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Влияние материнских вирусспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов на патологию беременности и потомства при экспериментальной врожденной гриппозной инфекции у мышей"

РГО Oü - 1 mar 1ss3

.РОССИЙСКАЯ ЛКАДШИЯ ВДЩШСКИХ Шд ИНСТИТУТ Л0Ж(Ш2Ш1ТА И ВИРУСНЫХ ЭЩВШИШВ

На правах рукописи НЕВДОВА Нататая Борисовна

УДК 616.98:573.832.1-092.9-036.15

ВЛИЯНИЕ МАТЕРИНСКИХ ЕИРУССЖЩ<Ж1ЕСШХ .HKIUTOKCMECMX Т-ШГ,ШИТОВ НА ПАТОЛОГИЮ БЕРЖЗНШСЖ И ПОТОМСТВА ПРИ ЭКСПШМНТАЖЛОЙ ВРОЭДЕННОЙ ГРИППОЗНОЙ IffiSEKLÇlH У ШЛЕЙ

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертация на соискание ученой степекл кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Научно~ес сд едователь ском кнституте эппдешологяа и макробаологид шенд почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Каучакй руководитель: действительный член Академии естественных наук РСФСР, доктор медшдаокжх наук, профессор В.А.ЗУЕВ

Научный консультант: кандидат биологических наук М.С.ГОРДЕЕВА

0й2Ц£га.'1ьныэ ошюненаи: доктор иедицшсках наук Ё.В.Варгин

доктор медицинских наук К.В.Логинова

Ведущая организация - Московский научно-исследовательский

институт вакцин и сывороток ки. И.И.Мечьккова

Защита состоится " rggj года в /^часог

ка заседании сшциализкрОЕашогс' совета Д.COI.£7.01 яри Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАШ (142782,' Московская область, п/о Институт поли».?яе.-шта к вирусных энцефалитов)

С диссертацией можно ознакомиться s библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов Российской АШ.

130 слан года.

Ученый,секретарь здециадизят)011аякого соз&та О.А.»&два,\г.»»н:1

Актуальность пройдет. Широкая хщркуляцая вирусов гриппа среда населения и разноречивый характер данных, об их возмогшем влиянии ка течение и исход беременности у человека определяют актуальность дальнейшего изучения рола гриппозной инфекция в патологии плода к новорожденного. Вирус гриппа занимает особое место среда возбудителей врожденных инфекций, с одноЗ стороны, в связи о его убдквзтарностыо, с другой - в связи с постоянным накоплением весьма противоречивых клинических и эксперименталь- ' мнх данных о роет этого вируса в патологии потомства (ЕуковскиЗ A.M., 1972; larsen John, 1982; Дорошенко Е.'Л., 1984; Prober С.G., 1987). К этому следует добавить и далеко не вдасяеннкй вопрос о механизмах возникновения различных форм патологии при врожденной гриппозной инфекции.

Хорошо известно, что нарушение нормальных взаимоотношений в системе мадь-шкщеята-шгед является ведущак звеном патогенеза различных $орм патологии оеременЕоста, плода и новорожденного а в значительной степени определяет течение перинатального периода (Говалло В.И., 1987; Шабалов H.a., 1987; Sfcùes D.î. et al., 1979; Chaoiist G., 1987).

Б 1986 г. М.С.Гордеевой было внсказано предположение о проницаемости плаценты для материнских лиыфоцатов при гриппозной инфекции, что моаат явиться оддсй из причин развития патологии у потомства. Высказанное мнение послуяало основой для развертывания экспериментальных исследований, результаты которых представлены в настоящей работе.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось выяснение рели даготоксячеснвх лиифоцатов (ЦТ!), зараженных вирусом гриппа беременных самок милей, а развиты« патолога. б ере-

менпсста, плодов а потомства.

Б соответствия о поставленной цель» в задачи исследования входило:

- изучение форшрования вирусопецдфическшс ЦТ! при гриппозной инфекции у беременных тавотных;

- изучение нарушения проницаемости плацентарного барьера дал материнских лимфоцитов, содержащих вирусспецафические ЦТЛ, е зависимости ст заражения на различных сроках беременности;

- исследование вирусной пгрсистенцЕи в органах плодов и новорожденных в результате -гриппозной инфекции и адаптивного переноса Еирусспецафичзсхих ЦТЛ беременным самкам;

- выяснение роли вирусспецифических ЦТЛ при адаптивном перенос э сингенным беременным самкам в развитии патологии беременности, плода а новоровдакного;

- изучение влияния: прохождения материнских лимфоцитов, содержащих ЦТЛ. на внзаваемосгь потомства;

- изучение морфологических нарушений кроветворных и димфо-Едакх органов плодов и новорожденных в результате гриппозной ии фекгдаз. к адаптивного переноса суспензии лимфощтов, обогащенной здруссцецЕфотескшга ЦТЛ, беременным салкам.

Научная ковкзна и практическая ценность. Впервые экспериментально рассмотрен один из возможных иммунологических кеханиЗ' мов формирования зроздевной гриппозной патологии. При этом пока заяо, что ко время, тришкиной инфекции.у беременных газетных ип дуцпруются клетка, обладатели б свойствами вирусспецафичбсках ЦТЛ Прохонденчэ чераз плаценту вслед за вирусом гриппа значительнсг числа материнских ¿шмфопитов, содеряздм вирусспецифпчестае ЦТЛ уке в тканях плода вызывает развитая цитолиза, которш в дальнейшем праве да? к кектшексируемви поракзниям б лшмйощщнх и

- з -

кроветворных органах плода и в конце концов к формированию т-злунодефкцияного состояния в гибели потомства s ранний период

НЕЗНИ.

Работа имеет з основном теоретический характер. Тем не менее, полученные результаты служат экспериментальным обоснованием пзученил механизмов патологии беременности, повреждающего действия на плод и новорожденного, развньаюдося в результате заражения вирусом гриппа беременных.

Основные поло7.еикя. выносимые на защиту : ■ '

1. При гриппозной инфекц?я у беременных милей нарушается плацентарный барьер для материнских лш.'фоцитов, вк • -гая зпрус-спэцифачостае Д'Ш,

2. Введение зараяэнаш вирусом гряппа беременным мышам суспензии лимфоцитов, обогащенной вирусспецЕфически® ЦТЛ, сникает у них концентрацию зшфекцкошшго гаруса гршша е легких и

в крови, а такие подавляет вирусную репродукцию в -тканях плацента, плодов а потомства.

3. Наряду с выполнением своей оснозной функцеи - освойозде-ше организма от возбудителя - ЦТЛ в повышению: концентрациях

■огут явиться причиной развития татологичесглзс-чзменеянй з органах шодов а потомства с формированием пммунодефацатного СОСТОЯЛСЯ и смертельным исходом.

Ащюбашя забеги. Матераалн диссертации докладнвштсъ на

п

юнкурсе молодик учешос EDISM км. К.Ф.Гамалеи РАМН (1987 г.), -га каучэоЯ юпферйнцаг отдела ивдащшсЕОЙ :.сщюбиолохаи ШИЗМ м. Я.Ф.Гамнлеп РАМН (1983 г.), на оЗьедаьекнем Д-тснумв Проб-гсдант: комяссай "Шдздшской мпкрзбяолзгял" а "Теорегач.окой и риклалпоК ифетщаоняоП и^унолопш." Научного Совета по шкре— пологи», сосввяенноЗ возраст« серслстспцы! к смеагшзым пкйег-

цаям (Ленинград, 1990 г.). .

Публикации. По теме дассертацгп опубликовано 5 пачатних работ.

Объем и структура работы. Работа изложена на 106 страницах машинописного текста, шлпстрироЕана 10 рисунками а 5 таблицами.. ЕаблиографичоскнЙ указатель вклтавт 107 наименований работ отечественных я 90 зарубезных. авторов. ■

Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав обзора литературы, 4 глав собственник экспериментальных исследований, обсуздеяия полученных' результатов, екводоб к списка датирован- •

ь»

ной литературы. .

.Настоящая работа проведена в рамках програжк ГКЗТ 059706 , и. внутриянстатутской: программы "Персистенцая микроорганизмов и патологии"...

; СОБСТВШЕЫЕ ИССШДОВАШЯ ШЕРИШ И ИЕТСДД

Взрхса. В работе использовала препарата вируса гриппа А (шзгх), шташ адаптированные к легким мышей инбрадных ланий С57БГ./6 и СВА'(после б-б-кратного пассирования через их легкие) Штат тан получек из музея 1ЖК вирусология РАШ им. Д.И.Квзное-ского. Мышиные препараты вируса поддергивали ннтраназальнш 1 (под легши эдэщшш наркозом) заражение» мышей лияян 057ВТ1/6 з лйнта СШ. (весом 10-12 г). йшей с клиническими признакам габолевания 1ршвгазно£ инфекцией забивали, извлекали леютз. Из лэгкюс готовили 10-3£$ суспензии, центрифугировата 15 минут при 3000 об/шн и использовали в качестве ьируссодержащего материала

Инфекционную активность полученных: препаратов (в йВДпд/мл) определили путем 'заражения -послодоватедьЕтш. 10-кратньш разве-

денпяма (по ОД »и) 9-и дневных куриных эмбрионов.

В работе использовала препарат вируса со следующими характеристиками:

йкфзкциснюй татр - I08'5 ЗИД50/мл ж ТО5,0 йД^/шг,

титр гешгг.сотишюв - 1:256 - 1:512.

Инфекционный титр вычисляли ПО методу Reed Ъ. and Kucnch И.A. (I974-).

Ьивотнке. Б экспериментах использовали мкпеЗ линии зь?вь/6, СБА, полученных из питомника "Светлне гЛн" и ."Столбовая" РАМН, и полученное от ншг потомство.

Реакция гемагглютинаш-.и (РГА) и тормояеквя гемагглигакстсип [PTI'A). Реакцшэ гемагг. • нациа проводили по общепринятой кето-щнэ в объеме 0,2 ;дл и капельным методой, иепояьг.уя микротнтра-гар "Такачи" (Венгрия).

Определение одкашкл накопления ин&екциснаого вируса, гриппа • внутренних органах милей. ливотнкх, эарагекнш: интраназально, сбивали в разные cpoica иифзкцга, асептически извлекали внутрен-шо органы, из которых в .присутствии электрокорунда готовили 30% :успйнзш! на стерильном 0,85% растворе хлорида натрия. Полученные успензм осветляли центрифугированием в точени",- 15 минут лрз Ш S' Надосадочную кадкостъ отсасывали и для определения в иен аруса гриппа вводили по 0,02 wi различных разведений в алланто-скуэ полость Э-дневкых куриных эмбрионов. Через 48 часов поело икубагагл при 37°С вараяатаие эибрнсни охлаждали, у них отсасы-ала аллактоиспую падкость, в которой с пежцыо РТА определяла piicyicT?j:e вируса.

В случай нзделенгя перси схируящс-го вируса из внутренних [л-.'чнов его вта/мезу» пршадлзззостъ идентифицировали и РТГА с различных нротавонирусных сывороток.

Ст осень патогеякос-ти вирусов определяет путем интраназаль-ного или интрацеребралъного еараяения шлей массой 10-12 г 10-кратннкн иоследовательпяш. разведениями вирусссдержащвх штериа-лоб, с шследущьм вшшсленаем 50$ летальной дозы (ЛД-д).

Получение клеточкюс суспензий. Для постановки ш,апологических реакций у животных забирали селезенку и лимфатическке узлы. Органы гомогенизировали. Гомогекат фильтровали и затем тривдк прошвали в среде для денгрифугарозания (СЦ), состоящей из среды 199 с 5% ¡жбриональЕОй телячьей сквороткоЁ производства КИКЗМ :ш. Н.Ф.Гамаяеи РАМН ж 50 шсг/ш: тенташирша. Суспензии центри-' фугировали при. 4°С в течение 10 шн при 400 е- Количество клеток подсчитывали в камере Торяева. Жизнеспособность клеток определяли с еомсщьэ 0,1% трлпанового синего в ^экологическом растворе.

Для получения клеток перитонеалыюго эксудата кивояшм предварителъно вводили раствор пептона в забуференяом физиологическом растворе (5 шг) и через ?рое суток брюшную полость промнвалз. СЦ о 10-25 ед/мл хепарика (10 кл/шшь).

При получении суспензия, обогащенной Еируссиецифичесшд! ЦТЛр сингенных доноров пнтрапазальяо зарагаяк сод легким эфирным наркозом вирусом гриппа в дозе 3,5 ЗИДи-0- Через 5-7 дней у еззотных извлекать лшфиические узлн, • готовили клеточную суспензию, §ильгров<гля, ироьсшали 3 раза центрифугированием, очшца-ли от прглипающих клеток а В-клеток пропусканием через колошсу с Ккллояовой ватой. Концентрацию клеток подсчитывали в камере Горяева. Для контроля определяли процент швшс клеток с помощью 0,1% раствора трипэновой сини.

чт

Аспользозанке метода нечения изотопом С.т лишюгатов для изучения шградии лга-Лоцатов 1а у^ул. Ддк изучения венозного нрехондеотя катерщюкгх лглдсоцатов в глэдекту .и плод при рззви-

ткл гриппозной инфекции у беременных самок была использована

ст

изотопная метка лимфоцитов сг по методу, предложенному Beinbxiüge et al. (IS66) п модифицированному Tsub . и lance (ISSfí) и Hodriqtzu (1975). Дет меченая клеток применяла хромат натрия (tía2 ^СгО^) о удельной радиоактивность® 350 даи/ш? (Мед-радиопрепарат, СССР). Органы радасметрироваяа на гамма-счетчике фир:гн Pechera (США). Результаты радиометрии рассчитывали в процентах от радиоактивности дозы Еведекшх клеток (3• 1С4 - 4-10" тот/ник), вычислявшихся для каядого исследуемого органа з виде средних величин и среднеквадратичного отклонения (М - а).

Определения нитотокаяческого эффекта лимйопатоъ. Реакции

оценивала по способности ЦТЛ вызывать in vibro освобождение

51

изотопа пз клеток-мишекей, мзчечнх Сг, с использованием гамма-счотчика Иаг/к-11 (Нидерланды) при участка д.б.н. А.В.Пронина (НШЗМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН)'.

Гистологический анализ. Извлеченные органы после взвешивания фиксировали зидкостыз Карнуа или раствором формалина по Леют. Для получения полутонках срезов (0,5 мк) плаценты фиксировали 2,5% глютаральдогадом. Срезы ократптага. гематоксилин-эозином, азур-1 I-эозином, мзтиловвк зелехши-шротяшом, а полугонки э срезы - толуидЕНОВш синим-пдропяном. Гистологический авалю проводился совместно с к.б.н. М.С.1Ърдеево2. Показатели ipoui газзат бшш щгскдогулвдврешанн к.м.н. Г.В.ПлаксилоД [МОНша^им. Д.К.Еладгодирского).

Статистическую обработку получанних результатов осуществля-гя согласно руководству Н.А.Нясхиисксгэ (1979) с сценкой статп-¡тачэской значимости ко критерия Стъюдента.

- s -

РЕЗУЛЬТАТ СОБСТВЕННЫХ ИССЛВДОБАШЙ '

I. Влияние грациозной инфекции на цзтотоксическую активность ЕаууссреццфачэскЕХ ЦТЛ беременных самок милей

При исследовании яшй&овдачх. клеток зараз<1еашх мышей било устялоЕлеко (табл. I), что яра гринлоздои инфекции как у нзбере-менных, так и у беременных казютнкх индуцируются клетки, способные лизирсвать сак.г-8НШ1& макрофаги от переболевших мыией, обработанные антигеном вируса грялпа, т.е. такие, клетка обладали свойствами зирусоЕевдфических щтотоксическах Т-ламфоцатоз. Однако, у зароненных беременных самок этот цитотоксичесюш эффект оникадся но сравнению с неоеремекнида животными, зараженными вирусом гриппа. >

Таблица I

Цйтотоксичэсеов действие ламфоадкых клеток беремвнншс самок, 'зараженных вирусом гриппа, в отношении спнгенных затактных шш инфицированных шрусок гриппа макрофагов

; Клетки--мидани

Зффекгорнме клетка лимфатических узлов, полученипа от :

аграненных непеременных оачик

заюагенних' берег-тонких салок

нзгараяекшп. небврсмонаих сзаск

! '\ж Г

i Интакгаые ,

i макрофаги j

j j

j ___i

831,5*60 1095,5^75 I3IC-V5

Макрофага пэребо-леБшьх г.кшей, обработанные антигенов впгуса гшшга

.Г/ОГ^ОЗ

" 1913,5^4 1458±7э

Прклгчаюе. Б гао.шце представлен ращюактиышй счет надосадха

f-.-^ic.-r-îi.oc культур. выход DjCr из

гу :"_:■.„.j. î:-:l:.-; i-;:jxopz>.&< кдзто к ; г.: ч:/; (.'.! — &0.

2. Динашка накопления вируса гриппа в организме, беременных самок при введении ил суспензии лимфоцитов,-обогащенной ЦТЛ

После заражения беременно: самок вирус гриппа уне через 24 часа'обнаруживался з легких в титре I03'5 ЭВД50/мл. Через 48 чаоов его концентрация увеличивалась до 10®'® ЭЦДкц/мл, а к 5 суткам достигала максимума - 10''® ЭЙД^/кл.

В крови у зараженных беременных сеток вирус гриппа обнаруживался на 2-е сутки после заражения в титре Ю*'^ ЪЩ^Али, Затем его содержите быстро увеличивалось и достигало максима -I04'5 ЭВД50/ил на 5-2 день от ыоглента инфицирования.

Введение обогащенной ЦТЛ суспензии лпмйгадаов беременным зараженным самкам практически на следующий se день приводило к снижению в легких и в крови концентрации инфекционного вируса гриппа с последующим прекращением вирусемии..

3. Изучение возможности трансплацзнтарного прохождения материнских лшЬоцитов при гриппозной инфекции ьалвей

Трансплацентарноо. прохождение меченых лимфоцитов у иезар.*-ленных контрольных беременных: мышей а первой половине беременности (вплоть до 12 суток) практически отсутствовало (рис. I),

■Тг

поскольку отмечался лишь незначительный уровень радиоактивности в плодах, достигавший в среднем 0,002,1 от активности общей дозы введенных меченых клеток. Этот уровень метки в плодах (0,0025Я), обозначенный нами как уровень фона, возпояно, был обусловлен незначительным попаданием изотопа о кровью иатери при вскрытии матки и1 извлечении плодов. Позднее, перед родэш (на 20-е сутки беременности) уровень миграции лям&огдаов у подавляющее большинства ыяодое был увеличен в 3-4 раза по сравнению с фоком, хотя в отдельных случат: (у 2 из 40 плодов) отмечался зн&чатель-

0,15

г

о

-О

г

од

0,05

0,01

ХЗ-% рацкоакиазности г плацентах д- ^радиоактивности в плодах

12

16

тЬа-

20

суткк

сроки беременности Ргс.1.Уровень миграции 51 ^ меченых лшфзцгаов ох интшсгнкх

доноров в плаценты к плоды незараяеяных самок /контроль/.

•Ч

Р,1

о *

ч>

5С £

а

„% радиоактивности в плацентах

-% радиоактивности в плодах

хн

5

сутки

' 13 16

срока беременности Рис.2.Уровень миграция меченых лимфзцатов от зарахевных

■ вирусом гршша доноров з плоды и плаценты зараженных самок. Примечание: 1.Мш?ражя меченых лвмйовдтов в дяод и плаценту ззражец& уровнем ракиоагггизкости в этах органах, вычислении! в процентах по отношению к радиоактязЕостп обьдей дозы вводимых меченых лим^огхятов.Й.Ная колонками указано количество плодов ихя плацент в у которых выявлен соотзехстзутадий уровень радиоактивно сгли

но более высокий уровень миграция, что могло быть следствием развития местных патологических процессов г плацентах этих плодов, особо нарушающих целостность плацентарного барьера и сло-собствущих прохождении повышенного количества материнских лимфоцитов в плод.

При внутривенном (в/в) введении беременным самкам, зараженным вирусом гриппа, суспензии меченых лимфоцитов, обогащенной зирусспецифичесаами ЦП в пергой половина беременности, вплоть до 11-12-х суток заметного возрастания уровня миграции лш^оци-1'ов в плод цракгаческа не отмечено (рис. 2). На. 16-е сутки беременности у зараженных самок была: увеличены уровии миграции в плаценты и весьма значительно - в плода. При этйм у 7С# шгсдов уровень миграции превышал уровень фона (в контроле, см. рис. 3) Золев чем в 6-3 раз, а у 30% - более чем в 20 раз.. Еще более высокие уровни миграции в плоды отмечены перед родами, на 20-е , гули.

В контрольных исследованиях при ввэдэшш незараЕевннм беременным самоа/л в тех пе дозах лимфоцитов, содераалщх ЦТЛ от зараженных вирусом гриппа доноров, и зарежзннш вирусом гришщ беременным самкам лимфоцихоь от интактных доноров,,, получены сход-ше результаты: у 90& 18-20-суточнах плодов не отмечено совыгае-шя уровня метка и лишь у 7-10$ плодов зарегистрировано 6-7-сратное повышение уровня радиоактивности по сравнений с фоном. ' Грохождрние- меченых убитых нагреванием в течение I часа при ¡6°С клеток но иг,«ело аеста.

4. Частота выделения вируса из тканей плацент й плодов у беременных сагяок тж гриппозной инфекция и зведении. ид суспензии лимфоцитов

Трансзлацентаркак передача вируса гриппа в результате Ектравазалького заражения беременных самок а введении им суспензии лимфоцитов, обогащенной ЦТ! на 5-е сутки от момента заражения, подтверкдалась прямы выделением вируса из тканей: плацент г плодов на 6-2 день- после заражения. При этом в контрольной группе, то есть у ¡газетных без введении лиодоцитов, инфекционный вирус гриппа в плацентах обнаруживался в 642, а в плодах в 44.4% случаев. Б то яе время введение суспензии лгсасцитов, обогащенной вЕрусспецафическима ЦТЛ, беременным самкам на 5-й день после их заражения вирусом сопровождалось- достоверны;.! снккеньем частоты выделения нкбекциозпого вируса гриппа из ткане/ плацент и плодов. Так, из тканей плацент в подобных случаях вирус на 6-й день от момента заражения склок выделяла лашь в.28,6$, а из тканей пясдов - в 14,6$ случаев. Характерно, что в результате ВЕеденкя беременным самкам лимфоцитов значительно снижалась не только частота выделения вируса из плацент и плодов, ко к скава-лись (особенно в тканях плодов) титры определяемого там инфекционного вируса.

5. Действие различных доз вводимых лимфоцитов на патологию беременности цра гриппозной инфекции

' 8

Пра увеличения дозы вводила лимфоцитов до 10 берекешпы

■з г; .

самкам, зараженным вирусом гриппа в дозе 10 ' ЭДД.-дДы, отличалась их гибель в 20% случаев уке на 7-е супа от моглекта заражения. Следует отметать, что в этой группе кабтад&лись лрекдэвре-меняне роды с розденпой иертвнх кыиат. На 1-1-е сутки гибель салок достигала 50/?. Полученное от остав'дихся в гизгз. са:.:ок псто;.т-

;тво (Зело, пересажено к интактным коржлицам, тем не менее обычно i течение 5-6 дней глыиата погибали. Выделение вируса из срх'анов ¡тих ммпат было затруднено. Вирус выделялся из лепих после трет. :лепых nacnasefl на куриных э;.;бргонах. Б контрольной группе без ¡ведения лимфоцитов гибель самок наблюдалась лияь в Юр случаев : ,14-м суткам после заражения.

к к .

При увеличении эараяающей дозы вируса до IQ ' ЭДД-д/гдя 1ри дозе вводимых лимфоцитов 10® клеток наблюдалась 100л гибель 5еременкых сакок к 20-м суткам от момента' заражения. В то еэ зрегдя в контрольной группе без введения лгиФоцптсз, зараяенных цсзой 10 ЭДДцп/нл, гибель самок достигала лись 30.% случаев.

. 6. Влияние материнских лимфоцитов ьа яизнеспособзость плодов в зависимости от сроков беременности

При изучении этого вопроса утатызали полученные дзкныо о гон, что в ранние сроки беременности отсутствует прохоадекие .чиг/гуоцитоБ з плод. Поэтому для заражения вирусом и введения лид<-£сцвтов в дозе I07 кл./0,5 мл были, выбраны два срока беременности: заражение на 6-й с введением ламлоцитов через 5 дней, то есть на 11-й день беременности. Зтот период соответствует периоду активного органогенеза (закладка органов пищеварения, нервной системы, органов' кровообращения, зачатков глазных пузкоей, закладка печени s почек), второй срок - заражение на 12-й день беременности и введение'лимфоцитов на 17-5 день беременности, что соответствует периоду дафференцпровхя тканей и органов.

При анализе пот,-ученных данных гибель плодов в контрольной группе пнтактных беременных мыаей составляла 2,15?; у интактккх беременных кыпеЗ с введением лз^йоцк^оз, обогащенных впрусснэци-<?ическп.\ет ЦТЛ на 11-е сутки беременности, - 2,15$ (рис. 3). При введении клеток самкам, зарагвннкм "¿а 6-о сутки беременности,

Влияние вирусспецфических ЦТЛ ня гибель плодов в здвисимоги« .

от ctowob заражения беременных' сямок

□ - % гибепи плодов у икгр.ктных керьменныч самок

03 ггсели плодре а иктлктних езеремеиных сяиа с. кжзрым еввш ЦТЛ от зяячжешыхденсгое:i-нр, 11? елки беременности; •

2.-чд 17£ол><и беременности

ЕЗ-% гибели плодов а сяяпжек^х басменных сямсж без введения

ЦТЛ,которых заряжали: ö.-ня 6£ су тки беременности;

4.-ня. j26 сутки беременности . ш - % ги5ели паэдов а зярлкшных сергмегнкых сямок, с введением ЦТЛ от гзярлжннйых доюроя: а-с здряжением ня 6-су тки

ЕУВО-ЧЮСТИ у\ введением ЦТЛ нд 11 £ - сутки fepemehhccth.

6. -с элг-яженнем на \2- СУТКИ бз?ен£нк.«ли ЗА введением ЦТЛ ня 17-& Сэтки бЬТ^.сННООИ.

гибель плодов достигала 86,8)2 (рис. 3). Существенно, что в этой группе в 4,3% случаев бит обнаружены признаки аномалий развития у плодов головного мозга и з 2,1% атрофии глазного яблока. Среда беременнш: самок, зараженных вирусом хрипла, но без введения ли!,йоцзтоз, наблюдал! гибель в 64,случаев. Заражение животных ка 12-е сутки беременности с введением лимфоцитов на 5-е сутки, от момента зара&екая не приводило к статистически достоверному повышению гибели плодов (11,1$).

о

7. Влияние различных количеств перенесениях беременной самке мышей лкиродпгоз на продолжительность яиз.та потомства

При изучении действия избытка лшбоцзгов в циркуляции у бэ-рьменних, зарагенннх вирусом гриппа мышей, Еа выживаемость потом-» стза использовала метод адаптивного переноса. Первоначально сус- " пензиа лимфоцитов использовали в трех различных концентрациях -

П ' {1 С Í

10 , 10 и 10 клеток в 0,5 мл (объем введения}. Оказалось, что з результате введения клеток з концентрации 10 /0,о мя наступала 100-процентная гибель потомства, которая включала в себя как. внутриутробную смерть, так и кертзсрондение или гибель в первые ш кезни потомства. При введении язифооиов в концентрации .;

fT

[0°/0,5 ¿ос, напротив, не бале обнаружено ей внутриутробной гибе-щ плодов, кп преждевременной табели коворовдвннкх. Использова- . ке в опытах средней кенцэптрэцпа лтафэпитов 10^/0,5 мл поззоли-;о обнаружить оависшгостз продолжительности жизни потомства от ведения лигл^гаелтов па различных сроках беременности.

Так, введение клеток самкам ка 12-й день берэмеености црп-одпяс к гибели потомства на протяжении 3-4-й недели их лизни. ■ олее позднее введекяе .ш4о£шез, а именно: ка 16-е сутки бере-енностк приводило к гибели потомства в.более ранние сроки ах

низни (с 10-го по 21-й день). Наконец, введение лщйоцитов перед родами (на I8-1S-S день беременности) приводило к гибели потомства в первую же неделю их казна. Выявленная закономерность объясняется неодинаковой эффективностью прохождения лимфоцитов через плаценту в плод в зависимости от сроков беременности, так как было выявлено, что на поздних сроках беременности процент прохондення клеток был наивысшим (70«).

Наблюдение' за лотомствои в контрольных группах показало отсутствие гибели среда мыкат, родившихся как от незаряженных самок, получивших внутривенно лимфоциты, так и от зараженных беременных самок, получивших яаьфэцаты от здороЕых доноров. Среди пометов обеих групп нивотннх наблюдали лишь единичные случаи отставания в массе тела к росте.

Ышага, погябаэдие на поздних срокам яазка. спустя 2-3 недела после рокдения, характеризовались развитием ряда клинических признаков: мыгата еялкс, малолодвишше, походка медленная, перевалавададалоя. Развивается нарушение координации движения -из ГШ026НЕЯ на боку поворачиваются плохо, медленно. При боле-30?.; раздражения. реагирует достаточно. Фунмда п^вакня к глотания сохранены. Лрох'ресспрутщзе стстгханее в росте и массе тела, редкий волосяной покров." .

8. Роль материнских Егдусепецяфичеекпх цитотоксичесжих ошфоцатов в ограничении персистонцна Елруса гриппа е организма мышат с зроздгакой гриппозной инфекцией

Формирована е и поддержание у потомства врокдекной гриппозной инфэкцан годтьерадзлась прятал выделением инфекционного вируса из крота и внутренних органов зопютных - легких, мозга, селезенки и печень. Как видчс из данных табл. 2, у мнзат, родкв-щ~хся от утерей, которш пе ввозила .вд^коцитк, титр кафекццон-

to

Eí

чо C-lbH ~f II

о o

í о СЧ? So ÍÍH

П 1! O ■o

ю h-î ¡ tío E-<M tí !l O

M lo a M

- - O II <a •o

l-l 1-4 m r-í li o

ó n

« c-lO ям ОТ |¡ ' lb ■о

t=¡í.C< Hh Я il

г> о

СО t=¡ мсо

ОТ 11 0) о ------ I---ÍO 1 Ин 1 П-1 il !

cv 1 M '•> 1 i«!

1____ j 1

Pf tj V. £

с ; E.

-i

о о о о 1 ! о 1 о

+ 1 м V-O od ■И M со о оо о о 1 1 о 1 1 ÍH M

о о о о 1 1 о 1 ы

41 м юо 4! 14 <00 к tí 1 +|Н ! LOO ГО со

о'о оо и od i i M Е?

+ + о о О 1 1 к

tu +1 со со о ■и Ы ¡>o *tbo +|Н 1

l-ío оо" о*о üo od i К ! :

со о оо +[ СП сЪо оо со со о о'о" 41 СО coo od i 1 <Г> О оо 1 5 1 н

-нп 100 и +LS1 Л о .+1 со coq 1 1 ■ч» о

НО но мо оо" и о M

щ lío" UM ого МО +1 соо о"о 41 C-! ODO do* 1 •as ; Г—! Ô 1 ■rt я

Ó I-i •d vi оо ■У ОС 1 -н i LOW

wo" МО мо* МО 1 я

Л 55

hO , О

г. i а

о ! f.

,-i сЗ

! О

Ен

r-í

1 ^ »

С? О

Pj

а.

1 Í

X

я

q

C4

о

e-i

Ц

à

«

g

3

a

о

о

ö

s

a>

ti

о

«

CD

P.

E-l

CD

О

О

«

S tí

w о

w

о Pi

n

i) . Й

d <ь

о

ч

X 03

1

Si

w 1

~4-

О

R Hî

о

■S-

ного вируса в органах и крови вше и определяете^ значительно долъпе по сравнении с мышатами, полученных от самок, зараженных вирусом гриппа с дополнительным введением лимфоцитов, обогащенных вирусспецифическими ЮТ. 'Гак, если у шпат с внутриутробным инфицированием без введения ляг.фоцатов инфекционный вирус выделялся из легки?; и из крови вплоть до 20-30-х суток, то у мышат, родичЕихся от зараженных самок с введением лимфоцитов, при исследовании в ети сроки вирус не выделялся, и в более ранние сро-' ки (10-12 сутки) исследование на выделение вируса было.затруднено: он выделялся иг легких а из крова только поело 3 слелкх пас-сакей на куриных эмбрионах. По-видамс:*», в данном случае дополнительно введенные ла?.фоциты, обладающие колерной активностью, играет роль в злашшации гаруса из организма мшат.

9. Гястологичвокао исследования

Ь результате проведенного гистологического исследования плацент, гаракенннх вирусом гриппа беременных шага на пико развития ¡ш$ехцаспного процесса <4-5—й день), выявлены нарушения, овязакЕШ глатаая образом с расстройст^ш грозообраденая. Изменения вкяая&са гапэраш», отек, трекбоз отдельных кровеносных сосудов, отмечено слушдванйе .эндотелия и яарузапие целостности их стенок. К числу деструктивных пзлсенеклй относилась габолъ больпого числа клеток трсфоелазга, кх сначктолйная кисуолизацая, особенно во внелабирантилк части, в ог.тогиацентарпом конусе. Группы дегвкериругащх юйкгок и трог-коз стдол^шк сосудов кайих-далисг. ъ дздадуачт>ноЙ часта плаценты.

При пастологдческсгл изучении орг&кез кшат (роггашхоя от

. ' й зараженных самок, иояучЕмгис во вреда С<?р2?генноста 10' .аиТювд-

тов, содэраацих ЦТЛ, которые шчжбелл ¿е-чешш 1-го месяца ах

жизни) выявлена различная степонь атрофии лиьфоадной ткани. У таких животных редуцированы участии белой'пульпы селезенки, опустошены пернарторзальнке участка - Т-зош, в опустсссшшх ¡пелликулах часто наблюдалось разрастание фиброзной ткана вокруг центральных артериол. Во всех этих участках, особенно у мшат первых даеЗ казни, отмечено большой количество шмотжчннх лиьфоси-тов и макрофагов, переполненных платочным детритом з цитоплазме. В более редких случаях (5 из 23) отмечена сигсеномегзлия наряду со значительным увеличением числа пролийерирутацих клеток типа бластов, образующих большие скопления и. группы интенсивно ппро-кинойалъвдх ретикулярных клеток. Лимфатические узлы истощенных, • отставших в росте мышей, имели спустошоннув от лаифоцатоз корковую зону, особенно её тимусзазисимыо (паракортикалыше) участки

В отнесении других органов отпечено истончение покровных •тканей, в частности, "згшдермиса коза с ortpeделанно^ атрофией зз придатков: сальных желе? и волосяных фолликулов. В печени - признаке дистрофических изменений клеток паренхимы, в почках - в ряде случаев выявлены пиелонефрит, в.лелих - бронхопневмония кли иктерстициашькая подострая паевменгя.

При исследовании изменений показателей крови у мышат 2-3-авдельного возраста, родившихся от самок, заражениях вирусом грлхгяа в конце беременности, которкм 6шз& введены лкфядан че~ эез о дней после заражения, выявлены лейкопения (3,52-0,'1л-1С?/л) 5 лшфопекия (21,Sj-I, 74% з I км3).

1Ьстологичвскае данные, получашше при исследовании мышат. ; вроЕденной гриппозной инфекцией, матерям которых введши сус-гензпа лияротдатов, свидетельствуют з первую огередь о развитии. г такого иотомстза выраненного ижунодефпттного состояния. Тагам образом, полученные результаты могут указывать на

важную роль материнских лимфоцитов, содержащих вирусспецифичес-кие ЦТЛ, ь патогенезе врозданной гриппозной инфекции. Проховде-нио через •плацгзларлый барьер вслед за вирусом гриппа значительного числа мгтерьчских лтайоцитоз уже в тканях плода способствует развитии цитолиза. Ногно полагать, что гибель значительного числа клеток и в первую очередь в ликфоидаых и кроветворных-органах плода к новорожденного, возникновение некомпенскруемкх поражений в последних, приводит к разними ашуяодефицитных состояний и гибели потомства в раннем возрасте.

Б Ы Б О Д Ы

I. Установлено, что при гриппозной икйекцаа у беременных ¿квотных формируется метки, обладающие свойствами впрусспецифп-чеокпх ДТД, но характеризующиеся скидекнш цатотоксичеонш эффектом.

Показало, что при гриппозной инфекции вследствие пов-реэдения плаценты возмокен трздспдацевтарный переход материн-стах даиу&одвтов, содеркащах вдпуссЕбцкфл ческае ЦТ2, з плод.

о. Показгио, что введена«» ¿¡гафодагог, содерг-лес: варусспв-цкфичесгаэ и*ГЛ, инбредкш беременным самки мышей снижает в легких и в крови животных кеадектрплив инфекционного вируса хрипла, подгуляет вгруонуэ рвпродуида в плацентах а плодах.

4. Заракение инбредннх Ойрешкннх гшЗ ьврусом группа на ранних сроках беременно с™ а т^яводат к коаазенкв процента гибели шгозов. Обнарукенпе у кйодов аи'л:зл,а! рашггяя в группе береиен-1шх саракежн? самок с едатавнна переносом ли\фоцитов позволяет вксказать цроддадогэнм об участия этих клеток в мехатаз-де формирования постграшзозшзс ансггалай у потокства.

5. Ловжсше количества шрусскевд&ческах ЦТ.1 в одрхулл-

дай у самок, заражениях вирусом хрипла в конце беременности, приводит к прерыванию беременности и повшйнею числа мертво-5оаденкй.

6. Показано, что прохождение через плацентарный барьер зслед за вирусом гриппа материнских лилфоцитоз, содеркащах вирус-зпепдфические Ц'Ш, приводит к формирования) патологического процесса, характеризующегося прогрессивным отставанием в массе те-ta и росте, нарушением координации движения, кахексией, иммуно-цефатдатным состоягиегл и гибелью потомстЕа'з раннем возрасте.

СПИСОК ОПУШКОВАШЖ РАБОТ ПО ТЕЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние материнских цптотоксических .тштбоцитов на пври-1атальнуэ патологии при гриппозной инфекции у лабораторных еивот-jhx / Нефедова Н.Б., Гордеега !,1.С. // ХП Всесоюзный съезд детских , грачей. Тез. докл. - IS88. - С. сСЭ.

2. Роль материнских вирусстатдафическнх цитотоксичесьлх Т--ш!.®одагов в пкмуногатслсгяа при зроздоняой гриппозной внфокцаи Г мкшей / Гордеэва Гл.С., Нефедова К.5., Зуев В.А, // Вопроси зарусологиа. - 1390. - !:г2. - С. 103-112.

- 3. Влияние материнских вирусспещ^глеских Т-дгафодатов на формирование патологии беременности и плодов цри'скспэрженталь-той вроадешсй гриппозной инфекции / Нефедова Н.Б., Гордзева'

, Зуев В.А. // Вопросы ¡шруоологаи. - 1990. - И 6. -456-453.

4. Пгрсиетьшшя вируса геппла у детей с врожденной патологией ДНУ / Зуаэ В.А. г Тенцов Ю.О., Шевченко A.M., Ргшшноза A.A., Нефедова Н.Б., Игнатова К.Г., Букрикская А: Т. // Вопросы вирусов -гагаи. - IS50. - £ 6, - С. 452-46G.

6. Genütic sequences с£ influenza virus in children vii;h

congenital central nervous siistem / Tentsov Yu.. Yu.

о- '

Schevchenko A.M., Ezhnninova A.A., Nefedova N.B., Ignetova N.G. // Psychiatry ana blologicel feofcors. Bd. by E.Kursfcak. "Plenua iisdical. U.J." - locdon, I991, p. 6?-76.

Подписано h .гичята IS декабря_Sanaa '¿m Tuaья ¿0 охз.

ШШМ им. II.ф, рл;®