Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние кристаллообразующей бактерии Bacillus Thurunguensus подвида israelensis на инверсионно-полиморфные популяции малярийного комараAnopheles messeae Fall. (Diptera: Culicidae)

ВАК РФ 03.00.09, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Влияние кристаллообразующей бактерии Bacillus Thurunguensus подвида israelensis на инверсионно-полиморфные популяции малярийного комараAnopheles messeae Fall. (Diptera: Culicidae)"

ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И СИСТЕМАТИКИ ШОТШ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ АКАДЕМИИ НАУК РОССИИ

На правах рукописи

О

БУРЛАК ВЛАДИМИР АЛЕКСАНДРОВИЧ W^fy

УДК 576.895.771

Влияние кристаллообразущей бактерии Bacillus Lhurlnglensls подвила lsraelensls на инверсионно-полиморфные популяции малярийного комара Anopheles messeae Fall. (Díptera: Cullcldae)

03.00.09 - энтомология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1996

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Института Систематики и Экологии Животных СЮ РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук Г. П. Островерхова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

М. р. Штерншис

кандидат биологических наук С. А. Бахвалов

Ведущая организация - Институт Цитологии и Генетики СО РАН

Зашита диссертации состоится 19 марта 1996 г. в 10 часов на заседании специализированного совета К 003.14.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Институте Систематики и Экологии Животных СО РАН.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах просим направлять по адресу: 630091, г. Новосибирск, ул. Фрунзе, 11, Специализированному совету Института Систематики и Экологии животных.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Систематики и Экологии животных СО РАН по адресу: 630091, г. Новосибирск, ул. Фрунзе. 11.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Харитонов

0БИ1АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТА

Актуальность проблеш. Межвидовые отношения организмов - одна из главных проблем биологии. Отношения насекомых с другими организмами особенно разнообразны, в неодинаковой степени напряженны и зволюционно продвинуты. Насекомые в системе "патоген (паразит) - хозяин" выступают или в роли паразитов (кровососы, пухоеды и т.д.), или в качестве хозяев многих паразитов (патогенов). В том и другом случае зто устойчивая коадаптивная система, сложившаяся в ходе эволюции. Компоненты этой системы взамно влияют друг на друга, причем это влияние может быть на уровне особи или на уровне популяции, что вырабатывает и соответствующие адаптации.

В изучаемой нами системе в роли хозяина выступают сапротроф-ныэ личинки кровососущего комара Anopheles messeae Fall. (Díptera: Cullcldae), а в роли патогена - кристаллообразушая бактерия Bacillus thurlnglensis israelensls (Btl). Несмотря на то, что эта система находится в центре внимания исследователей и многий стороны их взаимоотношений изучены, имеют место факты, которые трудно объяснимы. Так отмечено (Fuxa, 1987), что контроль природных популяций насекомых при помощи кристаллообразущих бактерий довольно редко приносит желаемый успех. Общеизвестная способность насекомых многократно увеличивать свою резистентность к патогенам в процессе селекции (Gill et al., 1992:- Tabashnlk, 1994) свидетельствует о наличии не только адаптации хозяина к патогену, но и гомеостатических систем организма и особенно популяции, сложившихся в процессе эволюции. Через популяцию осуществляется регуляция биологически важных свойств и, в частности, устойчивость к возбудителям заболеваний.

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования было изучение популяционно-генетических аспектов патоген-хозяин-ных отношений малярийного комара A. messeae Fall, и знтомопато-генной бактерии Btl. Это требовало решения следущих задач:

1) изучения чувствительности особей с разными инверсионными генотипами и корреляции между устойчивостью особей и элиминацией инверсий из популяции под действием патогена:

2) исследования проявления специфичности факторов патогена по отношению к особям с разными кариотипами:

3) установления влияния группы и типа питания на чувствительность особей с разными кариотипами. «

Благодарности. Автор признателен М.И. Гордееву за помсшь в

определении кариотипов, Н.В. Николаевой, оказавшей неоценимую моральную и профессиональнию подержу в работе, Л. И Бурцевой, способствовавшей основательному изучению автором кристаллообразую-щих бактерий, а также М.П. Мошкину,, М. Г. Сергееву, Л. В. Петрожиц-кой и В.В.Глупову за ценные замечания и конструктивную критику работы, Ю.М. Новикову за предоставление личиночных культур.

Научная новизна. В работе впервые подробно рассматриваются взаимоотношения инверсионно-полиморфных личиночных популяций А. шезБеае и знтомопатогенной бактерии ВН. Показана дифференциальная чувствительность личинок А. теББеае с разными инверсионными генотипами к ВН. дозовая зависимость дифференциальной восприимчивости, влияние скорости развития патогенного 'процесса и клоновых характеристик ВЦ на чувствительность личинок малярийного комара А. тезгеае. Исследовано влияние группового и индивидуального инфицирования, а также способа питания личинок на чувствительность к ВО особей с разными инверсионными генотипами.

Практическое значение. Анализ взаимоотношений популяций малярийных комаров и знтомопатогенных бактерий имеет практическое значение в связи с необходимостью разработки стратегии борьбы с комарами - переносчиками заболеваний, мер по предотвращению развития устойчивости к патогенам, а также увеличению эффективности применения биологических препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на X съезде ВЭО (Ленинград, 1989), Чтениях памяти проф. Рузского, (Томск. 1990), Чтениях памяти В.Н. Беклемишева (Пермь. 1990), V Всесоюзном диптерологическом симпозиуме (Новосибирск, 1990), I Всесоюзной коференции по генетике насекомых (Москва, 1991), Всесоюзной конференции "Устойчивость биологических систем" (Севастополь, 1991), • 1У Совещании энтомологов Урала (Пермь, 1992), I Все-россиГ"жом съезде ВОГиС (Саратов, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем робота. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной часта (8 глав), воючаюшей Материалы и методы, собственные исследования и выводы. Работа изложена на 1?0 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами и 26 рисунками. Список литературы включает 302 наименования, в том числе 165 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

ГЛАВА 1. ПАТОГЕН И ХОЗЯИН С обзор литературы).

R первой части обзора литературы проанализирован механизм действия Bti, во второй части обзора рассматривается взаимодействие Bti и личинок комаров. Анализируется влияние пищевого поведения, экологических и биологических особенностей хозяина на его чувствительность к ВН. В третьей части приведен краткий обзор работ по инверсионнму полиморфизму малярийного комара А. messeae.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Цасшшцыа. Все эксперименты проводились на личинках 4 возраста А. messeae. Личинок отлавливали в пята природных водоемах: два из них находились в окрестностях пос. Коларово Томской области, ДЕй - в окрестностях г. Томска, один водоем - в окрестностях пос. Тегульдет Томской области. Одна популяция выращена в лаборатории С Лабораторная) к- предоставлена для работы Ю. М. Новиковым.

Патпгрн. В экспериментах использовали клоны Р(7), К17), PC 36) и MC 35) Bti из коллекции лаборатории микробиологии ИСиЭЖ.

Для проведения экспериментов культуры выращивали в чашках Петри на СПА С г. Махачкала) при 28°С в течение 6 суток.- Газон смывали Физраствором, отмывали два раза центрифугированием, ресус-пендировали из расчета газон с одной чашки на 2 мл физраствора и хранили в холодильнике при -10°С. Для разведения исходной суспензии применяли варио- и унипипетки объемом от 10 до 1000 мкл.

плотных агаризованных средах по Герхард и др. (1989). Ферментативную активность характеризовали как отношение площади лизиса или преципитации субстрата к площади колонии, в относительных единицах (o.e.).

Бшыесты. Первый эксперимент (глава 3) провели в кюветах 26*14 см^, 0.5 л дехлорированной воды на повторность. В дальнейшем эксперименты проводили в кюветах 21*10 см~, в 200 мл дехлорированной води. Индивидуальную восприимчивость особей определяли в биохимических планшетах, по 2 мл воды на лунку.

Вес_ли!Ш1Ш измеряли на торсионных весах после предварительного обсушивания, взвешивая по 10 или больше особей. В таблицах приводится средний вес одной личинки.

Идентификация кариптиппи. Выживших в контроле и вариантах эксперимента личинок Фиксировали этанол-уксусной смэсью (3:1). Препараты из слюннык желез готовили по лактоацеторсеиновому методу. Локализация инверсий и их обозначения приведены раньше (Стег-ний, 1991). Стандартными последовательностями считали ХЬо, 2Яо, ЗЯо, ЗЬо, инвертированными ХЦ, ХЬ2, 2Й1, ЗЙ1, ЗЦ. Всего исследовано 3584 кариотипа А. шезгеае.

Пйра^птка результатов. Инверсии в гомо- и гетерозиготной Формах использовали в качестве маркеров. В качесгве критериев оценки достоверности результатов использовали I- у критерии (Рокицкий, 1973: Лакин, 1990). Пятидесятипроцентную летальную дозу 11)50 ВИ вычисляли методом Спирмена-Кербера (Лакин. 1990).

ГЛАВА 3. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЛИЧИНОК А. МЕ55ЕАЕ С РАЗНЫМИ КАРИОТИПАМИ К ВТК

Определяли влияние В11 на хромосомный состав личинок А. шезБеае из Коларовской популяции.

В опыте 1 (табл.1) изменения в хромосомном составе личинок не отмечено. Гибель части особей в опыте 2 привела к изменению хромосомного состава личинок А. шезБеае. В кариотипах самцов и самок по сравнению с контролем уменьшилась доля половый хромосом с инверсией ХЬ2 (ХМ.75: с!Г=1; р<0.05). В условиях эксперимента произошло снижение доли гомо- и гетерозигот по инверсии 2Р11

Таблица 1

Условия эксперимента и смертность личинок А. теББеае

I— 1 1 Популяция, ва-|Личи- 1 1 Доза, 1 ¡Смертность, 1 1 1 Ш50, 1

1 риант опыта 1 нок 1 1 спор/лич. | 1 М ± Бт, % | 1спор/лич.1 1 1

1Коларовская

1 опыт 1 75 264 18.7±4.5 1188 1

1 опыт 2 300 1320 55.3±2.9

1 контроль 150 0 0.7±0.7

1 Лабораторная

I "южные" 203 660 56.6±3.4 583 1

1 контроль 69 0 0

1 "северные" 180 660 72.2±3.3 487 1

1 контроль 1 72 0 0 |

(Х^Э.65: с£Г=2: р< 0.01), а также уменьшилась доля особей с ауто-сомами ЗЦ1 и 31-01 (Х^б.44: й?=2: р<0.05).

В связи с повышенной смертностью особей с хромосомами ХЦ2. 21301 и ЗЦ)1 произошло уменьшение гетерозиготности у инфицированных личинок. В контроле гетерозиготность на особь составила 0.54 у самцов и 1.17 у самок, в опыте - 0.42 и 0.92, соответственно. У личинок обоих полов снизилась доля ди-, три- и тетрагетерозигот от 23.8% в контроле до 10.9% в опыте СХ^6.89: с1Г=1: р<0.01).

Чувствительность личинок к ВЦ оказалась ассоциирована, в основном, с хромосомой 213. Для проверки этого предположения сравнивали восприимчивость потомства от самок с хромосомными вариантами 21311(01) ("северными") и 21300 ("южными"). Потомство самок с хромосомой 21300 оказалось в 1.28 раза устойчивее потомства самок с хромосомами 2Яц(01) (табл.1). В результате инфицирования ВЦ произошло уменьшение доли частоты гомозигот 213ц среди потомства самок с "северными" кариотипами (Х^6.26; йГ=2: р<0.05). Таким образом, инверсия 2131 повышала чувствительность личинок с "северными" Кариотипами к ВН.

ГЛАВА 4. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЛИЧИНОК А.

МББЕАЕ С РАЗНЫМИ КАРИОТИПАМИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДОЗУ ВТ1.

В природных популяциях при обработках В11 смертность личинок может изменяться в широких пределах - от 0 до 100%. Смертность особей при этом зависит от дозы патогена. Поэтому актуальным является вопрос: в одинаковой ли мере будут изменяться частоты инверсий в популяции при разной дозе ВЦ и, соответственно, разной смертности?

Для ответа на этот вопрос анализировали кариотипический состав личинок, А. ше£5еае из популяции Томска(2). смертность которых составила 41.1 и 71.9%% при инфицировании клоном К17) В11.

При инфицировании личинок дозой 2.5 мкл/мг веса хозяина личинки А. Ьек1еш15Ьеу1 оказались менее восприимчивыми, чем особи А. шеБгеае. При дозе 5 мкл/мг - чувствительность видов к ВЫ достоверно не различалась (табл.2).

При гибели 41.1% личинок частоты хромосомных последовательностей в популяции А. теБзеае не изменились. При смертности 71.9% в опыте по сравнению с контролем возросла доля вариантов ХЬо- СХ^6.03:£1Г=1: р<0.05). 2130 (Х&25.98: ЬГ=1: р<0.001), 3130 (Х'М.06: йМ: р<0.05) и ЗЮ (Х'^6.87: с!Г=1: р<0.01: рис.1).

Рис.1. Изменение частоты хромосомный последовательностей личинок A. messeae при двук уровнях смертности. Цифрами обозначены варианты хромосом: 1 - XL0, 2 - 2RO, 3 - 3R0, 4 - 3L0. К - кон-торль: А - смертность 41.1%: Б - смертность 71.9%.

Таблица 2

Смертность личинок малярийных комаров при инфицировании Btl

I-1-1-1-1

¡Вариант экс- [Личи- IДоза,кI Смертность,% I

I перимента | нок |Мкл/мг!-1--1

I III mln-max I в среднем!

1 Контроль (К) 200 0 2 - 5 3.2 ± 1.11

1 Старшие (А) 300 2.5 24 - 33 29.9 ± 2.61

1 из них: 1

IA. messeae 270** 2.5 41.1 ± 3.01

|А.beklemlshevi 30** 2.5 3.3 ± 3.31

1 Младшие (Б) 300 5.0 64 - 77 69.5 ± 2.71

1 из них: 1

IA. messeae 270** 5.0 71.9 ± 2.71

IA.beklemlshevl 30** 5.0 56.7 ± 9.11

i

Примечание", я - в мкл/мг веса хозяина: ** - расчетные величины.

6

Состав половый хромосом и аутосом после отмирания 41.1% личинок не отличался от контрольного. При этом обнаружилась тенденция к возрастанию гетерозигот 2R01 и 3R01. После отмирания 71.9% личинок в популяции обнаружился целый ряд расхождений в частотах хромосом по сравнению с контролем. Это выразилось в увеличении доли самцов XLi, самок XLoi, аутосом 2R00 и 3Loo, а также уменьшении доли самок XLll. аутосом 2Ru и 3L01. В опыте снизилась доля самцов (Х^б.7: df=l; р<0.01). Аналогичные различия наблюдались между составом хромосом при гибели личинок 41.1%- и 71.9%. Частота гетерозигот 2R01 и 3R01 при этом различалась значимо ()С<М.75: df=l: р<0.05).

При смертности 41.1% личинок в эксперименте отмечено некоторое увеличение разнообразия инверсионных генотипов, при смертности 71.9% - уменьшение (рис.2D.

ГЛАВА 5. КЛОНОВЫЕ ОСОБЕННОСТИ BTI И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЛИЧИНОК A. MESSEAE С РАЗНЫМИ КАРИОТИПАМИ.

Гетерогенность характерна не только для природных популяций хозяина - в данном случае, малярийного комара A. -rcesseae, но и для микробных популяций кристаллообразущей бактерии Btl. Эта гетерогенность присуща не только морфофизиологическим свойствам бактерии - строению колоний, экспрессии и активности ферментов (Chllcott et al.. 1983; Sandler et al.. 1985: Jle Тьек Фыонг, 1987; Меликсетян, 1989: Осадчая и др.. 1990; Бурлак и др., 1995). но и характеристикам кристаллов дельта-эндотоксина (Yamamoto et al., 1983а).

Клоны различались морфологией колонии, лецитиназной и про-тсазной активностью, размерами кристаллов и ларвицидной активностью для Ае. aeeyptl (табл.3). Данные по смертности личинок А. messeae в эксперименте приведены в табл.4. На изменение генетической структуры популяции существенное влияние оказывает доза, поэтому анализировали не только суммарные показатели по действию клонов, но и дифференциально, при высокой и низкой смертности.

Цитогенетический анализ личинок A. messeae, выживших в эксперимента и контроле, показал, что клоны PC 36) и М(35) имели некоторое различие в действии на инверсионный полиморфизм популяции при низкой смертности. Эти различия были скорее количественными, чем качественны).«!. При смертности 36.2% от клона PC 36) изменения в частотах 'инверсий по сравнению с контролем не произош-

Таблица 3 Характеристики трех клонов ВЦ

Параметр

Названия клонов

К17)

РС36)

I КС 35)

ЛА, о.е* ПА, ">.е.кн Рост, мм/ч 11)50, сп/лич**« Длина:

кристалла, мкм споры, мкм

5.9 1.9 0.375

90

1.14 ± 0.211 1.86 ± 0.171

7.6 2.0 0.427 96

1.12 + 0.188 1.96 + 0.205

11.2 4.2 . 0.292 317

1.07 + 0.255 1.83 ± 0.196

Примечание: * - лецитиназная активность (ЛА): ** - протеиназная активность (ПА): *** - для Ае. аейури

ло. При смертности 24.5% от клона МС35) увеличилась доля последовательностей 2Й0 СХ^Ь. 48: с1Г=1; р<0.05) по сравнению с контролем. Различия по 2Я имелись между вариантами с низкой смертностью от клонов Р(36) и М(35) ОС-М.ЗЭ: с1Ы: р<0.05). Клон МС35) измененял в генетическую структуру популяции уже при низкой смертности, чего не наблюдалось в действии других клонов ВН.

При высокой смертности действие клонов оказалось сходным. Так при смертности 73.6% от клона РС36) увеличилась доля хромо-

Таблииа 4

Смертность личинок 4-го возраста А. тегзеае в эксперименте

1 1 Личинки, 1 группа 1 1 1 Масса, 1 ..„и и клон Р( 36) 1 клон МС35) 1

мгк г 1 1 1 ! 1 1 погибло,% 1 больных,%| 1 1 пнн 1 I погибло,%| п** 1 I 1

Г —....... 1 Старшие 4.34 36.2+5.8 10.1±3.6 69 26.8+5.3 71 1

1 средние 3.30 56.9±5.8 9.7±3.5 72 22.2+4.8 72 I

1 младшие 2.00 90.3±3.5 2.8±1.9 72 70.4+5.4 71 1

1в среднем 3.21 61.1+3.3 7.4±1.8 213 39.7±3.3 214 1 1

Примечание: * - средняя масса особи! ** - особей в повторности.

8

Рис.2. Изменение частота хромосомным вариантов личинок A. messeae из популяции Томска (2) при инфицировании их двумя клонами Btl. Цифрами по оси абсцисс обозначены варианты хромосом: 1 - XL0, 2 -2Ro. 3 - 3Ro, 4 - 3Lo: цифрами легенды: 1 - контроль! 2 - клон МС35), смертность 24.5%: 3 - клон PC 36), смертность 36.2%: 4 -клон МС35), смертность 70.4%: 5 - клон PC36), смертность 73.6%.

сомных последовательностей XLo (Х"«М. 14: df=l: р<0.05) и 2Ro (Х&=17.0: df=l; tx 0.001) по сравнению с контролем. Частота вариантов 3R0 и 3Lo имела тенденцию к увеличению. Эти изменения были такими же, как и в случае применил клона PC 17) при сходной смертности личинок. При смертности 70.4% от клона МС35) возросла частота варианта 2Ro СХ^5.32: df=l: р<0.05), а доли последовательностей XLO, 3Ro, 3Lo имели к этому тенденцию С рис.2).

ГЛАВА 6. ТЕМПОРАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЛИЧИНОК A. MESSEAE К BTL

Эксперимент проводили на личинках 4 возраста популяции из пос. Коларово в трех вариантах, при трех дозах клона PC36) Btl. В первом варианте личинок Фиксировали в виде трех фракций, руководствуясь временем гибели особей. Во втором варианте выделено две фракции. Это было вызвано более синхронной гибелью личинок. В

Таблица 5 Условия эксперимента и смертность личинок А. messeae

1 1 1 Номер 1 Доза, 1 1 1 Личинок 1 Время, 1 " ■ .....— ~i (Смертность, 1

1 опыта |мл/повт. 1 1 |в опыте 1 1 час. i 1 М ± sm, % 1 1 i

1 Коларово

1 1 4.8 150 2.5 41.0±4.1 !

3.0 63.9±4.0 1

1 2 1.2 150 4.5 61.0±4.1 I

1 3 0.175 500 24.0 78.2+1.9 1

1 К 0 200 24.0 0.6±0.6 I

1 Тегульдет

1 4 4.8 170 2.0 26.5±3.4 1

2.5 48.2±3.8 I

1 3.0 76.5±3.3 I 1

третьем варианте поэтапное фиксирование личинок было невозможно, поэтому их кариотипический состав сравнивали с контролем. Аналогичный эксперимент был проведен на личинках Тегульдетской популяции (табл.5).

Проведенные эксперименты показали, что последствия инфицирования Bti личинок А. messeae различались в кратковременном (время экспозиции 3.0 и 4.5 часа) и долговременном (24 часа) вариантах эксперимента. Через 2.5 часа экспозиции, при гибели личинок 41.0±4.1% в эксперименте 1, смертность личинок с каждым из карио-типов не различалась между собой и от общей смертности особей в опыте. Однако, элиминация инверсий 2Ri превышала таковую последовательностей 2R0 (рис.За). Через 3 часа экспозиции, при смертное-, ти личинок 63.9±4.0% в эксперименте 1, наиболее устойчивыми оказались самки XIjOO. При этом смертность самок XLoo и XLii. а так-ке особей с хромосомами 2R00 и 2R0K11) различалась. Элиминация инверсий 2Ri превышала таковую 2Ro, а инверсий XLi - последовательностей XLo (Х^5.85; df=l; р<0.05; рис.36). Общее направление изменений в экспериментах 1 и 2 совпадало.

В эксперименте 3 смертность самок XLoi оказалась ниже, чем личинок с другими генотипами (ХМО. 3: df=l: р<0.001). Гибель самок XL00 превышала таковую самок XLoi (Х^5.61; df=l: р<0.05), а

90 ВО-703 60'

§ 50-

а 40-я

Й 302010-

О-"................................

12345678 12346078 вариант инверсии

Рис.3. Элиминация инверсий А. messeae в эксперименте 1 при инфицировании Bti: а) смертность 41.0+4.1%: б) смертность 63.9±4.0%: Цифрами обозначены инверсии: 1 - 2R0, 2 - 2R1, 3 - 3R0, 4 - 3Ri, 5- 3Lo, 6- 3Ll, 7- XLo, 8- XLl. Указан 95% доверительный интервал.

личинок с генотипами 3L0K11) - ЗЮО СХ^б.19: df=l; р<0.05). В этом эксперименте погибло больше самцов, чем самок СХ5г=4.16: df=l; р<0.05), а гомозиготным самок XL1KOO) - больше, чем гетерозиготных XL01C12) СХ^б.25: df=l; р<0.05).

В эксперименте 4, проведенном на личинкам из популяции пос. Тегульдет, значимые различия зафиксированы между фракциями 1 и 2. Фракция 1 содержала больше самок с хромосомой XLll (Х<М. 56: df=l: р<0.05). Частота инверсиии XLl в этой фракции таже оказалась выше, чем во фракции 2 СХ^З.92: df=l: р<0.05) и во фракциях 2-4 (ХМ.05: df=l: р<0.05), а последовательностей 3Lo - ниже (Х"<М.23: df=l: р<0.05).

ГЛАВА 7. ГРУППОВОЙ ЭФФЕКТ У ЛИЧИНОК А. MESSEAE ПРИ ИНФИЦИРОВАНИИ ИХ BTI.

При инфицировании личинок комаров знтомопатогенной бактерией Bti обнаружен эффект группы у личинок р. Culex, который выражался в уменьшении гибели особей в группе (положительное влияние группы). Такой эффект не был .обнаружен у личинок рр. Aedes и

1 2 3 4 6 вариант инверсии

Anopheles (Aly et al., 1988). Эффект группы при инфицировании Btl, выявленный нами у A. messeae, оказывался противоположным ( в группе погибало больше или, на момент прекращения эксперимента, оказывалось больше больных особей) таковому у Сх. quinquefasclatus и проявлялся, в основном, при низкой смертности.

Второй вопрос нашего изучения ставился следующим образом: влияет ли группа на хромосомный состав выживших личинок? Цитоге-нетический анализ показал, что группа также оказывала "отрицательное" влияние. В групповом варианте заражения личинок изменения частот хромосом проявлялись значимее, чем в индивидуальном. Так в популяции Томска(1) в группе возросла частота самок XLoi по сравнению с индивидуальным вариантом эксперимента (Х^З. 86: df=i: р<0.05). Доля генотипов XL00C01.0) увеличилась' СХ<М.61: df=l: р<0.05), а генотипов XLll(l) уменьшилась CXi5=4.17: df=l; р<0.05) в группе по сравнению с контролем. Направления изменений по ауто-сомам при индивидуальном и групповом инфицировании оказались сходными. Групповой эффект оказался аналогичным в популяциях Том-ска(1) и Тегульдета, хотя их исходный хромосмный состав существенно различался.

Каждой из исследованных популяций были присущи специфические черты реакции на патоген. Анализ изменения частот инверсий показал, что в популяции Томска при групповом инфицировании личинок возросла доля хромосомных вариантов XLo (Х^Ю.86: df=l: р<0.01), 2Ro (Х^З. 87: df=l: р<0.05) и 3Lo (ХМ.О; df=i: р<0.05), снизилась - XLl (Х*=9.4: df=l: р<0.01). В индивидуальном варианте опыта изменения частот инверсий были аналогичны, однако, как и в случае хромосом, слабее выражены.- В популяции из пос. Tgгульдет в группе по сравнению с контролем возросла доля инверсий XLl (Х-М.87; df=l: р<0.05). Доля других инверсий не изменилась. В индивидуальном варианте эксперимента - по сравнению с контролем увеличилась концентрация инверсий XLl СХ^б.бЭ: df=l: р<0.05) и 3Li ()С<М.73: df=l: р<0.05).

ГЛАВА 8. ВЛИЯНИЕ ПЛОТНОСТИ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ВТ1 ЛИЧИНОК МАЛЯРИЙНЫХ КОМАРОВ С РАЗНЫМИ КАРИОТИПАМИ.

В настоящем разделе мы изучали реакции личинок малярийных комаров с разными инверсионными генотипами на инфицирование Btl при двух значениях плотности. Влияние плотности также можно рассматривать как одно из проявлений эффекта группы.

12

Популяция пос. Тегульдет относится к периферийным. Инверсионный полиморфизм А. шеБгеае в тагах популяциях снижается ввиду достижения видом крайних значений адаптивных зон (Стегний, 1991). В отсутствие наиболее устойчивых к ВИ особей с вариантами хромосом 2(300(01) чувствительность личинок коррелировала, в основном, с половой хромосомой.

Таблица 6

Соотношение видов и полов личинок малярийных комаров младшей группы, инфицированных ВЦ при двух уровнях плотности

1 Вид Частота, ) % 1

Контроль Р1 1 Р2 I 1 |

Оба пола

|А. теэзеае 75.8+3.1 71.2±3.7 51.2+3.4 1

|А. Ьек1еш15Ьеу1 24.2+3.1 28.8+3.7 48.8±3.4 !

Самцы

|А. иеггеае 28.4+3.8 39.4+4.8 45.4+4.8 1

|А. Ьек1ет15Ьеу1 55.6+7.4 40.5+7.6 58.3±4.9 1

1 ... Личинок 186 146 211 ' 1 1

После инфицирования личинок ВЦ соотношение полов у А. шеБзеае изменилось в пользу самцов при плотности 1.43 экз./см*5 и осталось таким же как в контроле у младшей возрастной при плотности 0.24 экз./см*5 (табл.6). У старших личинок соотношение полов не различалось при обоих значениях плотности.

Различий в хромосомном составе между контролем и вариантом опыта при плотности 0.24 экз./см*5 не зарегистрировано. Направление изменений при плотности 1.43 экз. /см*5, в основном, совпадало с таковым при плотности 0.24 экз./см*5, но было отчетливее выражено. Это могло обуславливаться более высокой смертностью младших личинок при плотности 1.43 экз./см*5. В этом случае зафиксировано увеличение доли самцов ХЦ (Х*5=12.99; с1Г=1: р<0.001). Среди старших и младших личинок при плотности 1.43 экз./см*5 снизилась доля комбинаций аутосом 2Пи-ЗЯ01-31Х)0 с 43.0±3.1% в контроле до 32.7±3.2 % в эксперименте (ХМ.53: с!Г=1: р<0.05), а также доля генотипов Ш2С22.2) С ХМ. 77! 6Г=1: р<0.05). В изменении частот

13

хромосом между возрастными группами при одинаковой плотности часто наблюдались противоположные тенденции, что могло оказаться проявлением механизмов поддержания популяционно-генетического го-меостаза.

ГЛАВА 9. СПОСОБ ДОБЫВАНИЯ ПИШИ ЛИЧИНОК A. ME5SEAE С РАЗНЫМИ КАРИОТИПАМИ И ИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К BTI.

Восприимчивость к Btl личинок комаров в значительной мере зависит от скорости поглощения патогена (А1у, 1988: А1у et al., 1988). Другие авторы связывают чувствительность личинок р. Anopheles с их способом питания (Расницын и др., 1991). В настоящих экспериментах изучалась связь способов питания личинок А. messeae с их кариотипами и устойчивостью к Btl.

Проведенные опыты показали, что способ питания личинок зависел от плотности личинок, продолжительности голодания и уровня воды. Так более Ексокая плотность личинок активировала обскребы-вание. Чаще обскребывачи личинки при продолжительном голодании и низком уровне воды в кювете.

В популяции Томска С1) обскребывать предпочитали личинки с генотипами 3ROO СХ*= 5.11: df=l: р<0.05) и. 3ROO-3LOO СХ^?.89: df=l: р<0.01). Полученные результаты показывают, что пищевое поведение личинок A. messeae определяется взаимодействием хромосом в большей степени, чем какой-либо хромосомой в отдельности. Наиболее сильным оказалось взаимодействие плеч XL и 3R. Самки XLOO-3ROO предпочитали обскребывать, тогда как самки XLoo-3Roi -фильтровать (ХМ.19: df=l: р<0.05). Обскребывателями также оказались самцы XLi-2Roo( OD-3ROO, Фильтраторами - XL1-2ROO(OD-3R01C11) (Х*М.65: df=l: р<0.05). Другие взаимодействия хромосом в этой популяции не проявлялись значимо. Способ добывания пищи коррелировал с частотой кариотипа в популяции: особи с редкими генотипами предпочитали Фильтровать. Среди особей с доминирующими в популяции кариотипами не было только фильтруших или только обскребывакщих. Это показывает, что генетически детерминировано не столько пищевое поведение, сколько способность к переключению с одного вида добывания пищи на другой.

Влияние хромосомы 2R на пищевое поведение личинок оказалось менее выраженным. Это показал эксперимент, проведенный на личинках из пос. Тегульдет, где практически отсутствовали хромосомные варианты XLOOCOI) и 2ROOC01). Наиболее активными обскребывателя-

14

во

л

л

¿1

л

л

1ф

1о 2ф 2о сф

Вариант эксперимента

Рис.4. Смертность обскребывателей и фильтраторов после однократного отбора. Буквами обозначены: о - обскребкватели, ф - фильтра-торы, с - сумма двух экспериментов; 1 - группа, 2 - индивидуально: указан 95% доверительный интервал. Популяция ТомскаС!).

о

ми здесь оказались самки ХЦК12) (Х^З.95: с1Г=1; р<0.05). а также особи с кариотмпами У111С12.1)-ЗР.00(01) (Х^3.87: с!Г= 1: р<0.05), ХЬЦ( 12)-ЗЬоо СХ^8.96: С1Г=1: р<0.01) и ЗШ1-ЗЬ00 (Х^5.31: (1Г=1: р<0.05). Личинки с аутосомами гЯн-ЗЯоо-ЗЬоо СХМ.32: с1Г=1; р<0.05), в т.ч. самцы ХЦ-2Й11-ЗР!оо-ЗЦю СХ^5.44; (±Г= 1: р<0.05) предпочитали Фильтровать. Сравнительный анализ показал, что хромосма 2Иц переключала тип питания особи на противоположный по сравнению с вариантом 2Й00С01).

Способ добывания пищи оказался совсем по иному связан с устойчивостью личинок к ВН. Косвенные сопоставления показали, что особи с аутосомами ЗР!00-ЗЦ)0 и самцы ХЦ-3[?00 из популяции ТомскаС!), предпочитающие обскребывать СХ*;=4.24: =1: р<0.05 и №=?.86: (±Г=1: р<0.01, соответственно), имели повышенную устойчивость к ВИ С ХМ. 09: (1Г=1:р<0.05 и Х^5.58; с!Г=1: р<0.05, соо-р-ветственно). Обскребыватели из Тегульдетской популяции, например, самки ХШ-ЗЬоо. также оказались менее чувствительными к патогену СХ^5.64: с1Г=1: р<0.05). Эксперименты по непосредственному определению устойчивости особей с различными способами добывающего поведения показывают, что фильтраторы обычно несколько чувствительнее обскребывателей С рис. 4). .

Выводы.

1. Парацентрические инверсии способны изменять восприимчивость личинок малярийного комара A. messeae к кристаллообразукь щей бактерии Bti. Наиболее существенное влияние на устойчивость оказывали хромосомные последовательности 2R1 и XL2.

2. Чувствительность личинок с разными кариотипами имеет лозовую зависимость. При действии малых доз частота инверсий в популяции не изменялась а разнообразие генотипов возрастало. При действии больших доз Bti в популяции увеличивалась частота хромосомных последовательностей XLo, 2Ro, 3Ro, 3Lo и снижалось карио-типическое разнообразие.

3. Клоновые особенности культур Bti существенно модифицировали действие патогена на генетическую структуру природных популяций A. messeae.

4. Селективное действие Bti зависело от времени экспозиции особей хозяина. Это было связано с увеличением роли кристаллического гемолизина CvtA в краткосрочных экспериментах.

5. У A. messeae группа отрицательно влияла на выживаемость личинок и сохранение инверсий в популяции при инфицировании.

6. При инфицировании Bti личинок из "северной" популяции в условиях высокой плотности, преимущество получали самцы А. messeae с половой хромосомой XLl. При этом особи с генотипами XLl2(22.2) и аутосомной комбинацией 2Rll-3Roi-3Loo оказались более чувствительными к патогену, чем при низкой плотности.

7. Способ добывания пищи и скорость ее поглощения являются самостоятельными актами поведения у особей A. messeae. Тип питания оказался связан с хромосомой 3R и, в меньшей степени, с хромосомами XL и 2R, а также с их взаимодействием. Темпы поглощения патогена коррелировали с хромосомой 3L.

8. Корреляция между способом питания и чувствительностью особей оказалась слабо выраженной. Их восприимчивость, наряду с другими причинами, определялась скоростью поглощения пищи.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Бурлак В.А., Гордеев М.И. Методические подходы к анализу устойчивости Anopheles к дельта-эндотоксинам кристаллообразуюцей бактерии Bacillus thuringiensls // Методические и методологические вопросы генетики.- Томск: Изд-во Томск, мед. ин-та, 1990. с. 196-205.

2. Гордеев М.И., Бурлак В. А. Инверсионный полиморфизм маля-

16

рийного комара Anopheles messeae. Сообщ. X. Устойчивость личинок с различными генотипами к токсинам кристаллообразущей бактерии Bacillus thurlnglensls subsp. lsraelensls (серовар H 14) // Генетика, 1991, т. 27, N.2. с. 238-246.

3. Бурлак В.А., Гордеев М.И. Изменения в генетическом составе личинок малярийного комара в зависимости от смертности, вызванной кристаллообразущей бактерией В. thurlnglensls subsp. lsraelensls// Тез докл. I Всесоюзн. конф. по генетике насекомых, Москва, 19-21 ноября 1991 г. с. 23.

4. Гордеев М.И., Бурлак В.А. Инверсионный полиморфизм малярийного комара Anopheles messeae. Сообщ. XI. Групповой эффект при инфицировании личинок бактерией Bacillus thurlnglensls subsp. lsraelensls // Генетика. 1992. т. 28. N.7. с. 82-83.

5. Гордеев М. И., Бурлак В. А. Структура популяции и устойчивость личинок малярийного комара Anopheles messeae (Dlptera; Cullcldae) к кристаллообразущей бактерии Bacillus thurlnglensls subsp., lsraelensls // Зоол. журн. 1992. т.71. вып. 12. с. 69-76.

6. Гордеев М.И., Бурлак В. А. Влияние личинок комаров рода Culex на чувствительность комаров рода Anopheles с различными ка-риотипами к энтомопатогенной бактерии Bacillus thurlnglensls subsp. lsraelensls // Генетика. 1994. т. 30. N.3. с. 367-372.

7. Бурлак В. А. Связь пищевого поведения и хромосомного полиморфизма у личинок Anopheles messeae Fall.// Генетика.- 1994. т.30 (приложение), с.20.

8. Gordeev M.I., Burlak V.A. Population strukture and resistance of larvae of Anopheles messeae (Dlptera, Cullcldae) to the crystal-forming bacterium Bacillus thurlnglensls subsp. lsraelensls // Entomological Review, 1995. v. 74. N.5. pp. 94-102.

9. Бурлак В.А., Гордеев M.И. Клоновые особенности действия Bacillus thurlnglensls подвида lsraelensls на личинок малярийного комара Anopheles messeae Fall с разными кариотипами // Сибирский экологический журн. 1995. N.5

Типография СО РАН г Новосибирск, пр К Маркса, 2. э 33, т. 100