Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние кристаллообразующей бактерии Bacillus Ihurinfilensls подвида Israelensls на инверсионно-полиморфные популяции малярийного комара Anopheles messeae Fall. (Dlptera: Cullcldae)

ВАК РФ 03.00.09, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Влияние кристаллообразующей бактерии Bacillus Ihurinfilensls подвида Israelensls на инверсионно-полиморфные популяции малярийного комара Anopheles messeae Fall. (Dlptera: Cullcldae)"

ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И СИСТЕМАТИКИ животных СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ АКАДЕМИИ НАУК РОССИИ

>

На правах рукописи

БУРЛАК ВЛАДИМИР АЛЕКСАНДРОВИЧ

УДК 576.895.771

Влияние кристаллообразуюшей бактерии Bacillus thuringlensls подвида lsraelensis на инверсионно-полиморфные популяции малярийного комара Anopheles messeae Fall. CDlptera: Cullcldae)

03.00.09 - энтомология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1936

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Института Систематики и Экологии Животных СО РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук Г.П.Островерхова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

М. В. Штерншис

кандидат биологических наук С.А. Бахвалов

Ведущая организация - Институт Цитологии и Генетики СО РАН

Зашита диссертации Состоится 19 марта 1996 г. в 10 часов на заседании специализированного совета К 003.14.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Институте Систематики и Экологии Животных СО РАН.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах просим направлять по адресу: 630091, г. Новосибирск, ул. Фрунзе, 11, Специализированному совету Института Систематики и Экологии животных.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Систематики и Экологии животных СО РАН по адресу: 630091, г. Новосибирск, ул. Фрунзе, 11.

Автореферат разослан ' & ' 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук

А. Ю. Харитонов

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Межвидовые отношения организмов - одна из главных проблем биологии. Отношения насекомых с другими организмами особенно разнообразны, в неодинаковой степени напряженны и зволюционно продвинуты. Насекомые в системе "патоген (паразит) - хозяин" выступают или в роли паразитов С кровососы, пухоеды и т.д.), или в качестве хозяев многих паразитов С патогенов). В том и другом случае зто устойчивая коадаптивная система, сложившаяся в ходе эволюции. Компоненты этой системы взамно влияют друг на друга, причем зто влияние может быть на уровне особи или на уровне популяции, что вырабатывает и соответствуйте адаптации.

В изучаемой нами системе в роли хозяина выступают сапротроф-ные личинки кровососущего комара Anopheles messeae Fall. (Díptera: Culicldae), а в роли патогена - кристаллообразущая бактерия Bacillus thuringlensis lsraelensls (Btl). Несмотря на то, что эта система находится в центре внимания исследователей и многий стороны их взаимоотношений изучены, имеют место факты, которые трудно объяснимы. Так отмечено (Fuxa, 1987), что контроль природных популяций насекомых при помощи кристаллообразуших бактерии довольно редко приносит желаемый успех. Общеизвестная способность насекомых многократно увеличивать свою резистентность к патогенам в процессе селекции (Gill et al., 1992: • Tabashnlk, 1994) свидетельствует о наличии не только адаптации хозяина к патогену, но и гомеостатических систем организма и особенно популяции, сложившихся в процессе эволюции. Через популяцию осуществляется регуляция биологически важных свойств к, в частности, устойчивость к возбудителям заболеваний.

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования было изучение популяпионно-генетических аспектов патоген-хозяин-ных отношений малярийного комара A. messeae Fall, и знтомопато-генной бактерии Btl. Это требовало решения следующих задач:

1) изучения чувствительности особей с разными инверсионными генотипами и корреляции между устойчивостью особей и элиминацией инверсий из популяции под действием патогена:

2) исследования проявления специфичности факторов патогеы по отношению к особям с разными кариотипами:

3) установления влияния группы и типа питания на чувствительность особей с разными кариотипами.

Благодарности. Автор признателен М.И.Гордееву за пометь в

определении кармотипов. Н.В.Николаевой, оказавшей неоценимую моральную и профессиональною подержку в работе, Л. И Бурцевой, способствовавшей основательному изучению автором кристаллообразую-щих бактерий, а также М.П. Мошкину, М.Г. Сергееву, Л. В. Петрожиц-кой и В.В.Глупову за ценные замечания и конструктивную критику работы, Ю.М. Новикову за предоставление личиночных культур.

Научная новизна. В работе впервые подробно рассматриваются взаимоотношения инверсионно-полиморфных личиночных популяций А. шезгеав и знтомопатогенной бактерии ВН. Показана дифференциальная чувствительность личинок А. шеггеае с разными инверсионными генотипами к ВН. дозовая зависимость дифференциальной восприимчивости, влияние скорости развития патогенного 'процесса и клоновых характеристик Ви на чувствительность личинок малярийного комара А. гоеББеае. Исследовано влияние группового и индивидуального инфицирования, а также способа питания личинок на чувствительность к ВИ особей с разными инверсионными генотипами.

Практическое значение. Анализ'взаимоотношений популяций малярийных комаров и знтомопатогенных бактерий имеет практическое значение в связи с необходимостью разработки стратегии борьбы с комарами - переносчиками заболеваний, мер по предотвращению развития устойчивости к патогенам, а также увеличению эффективности применения биологических препаратов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на X съезде ВЭО (Ленинград, 1989), Чтениях памяти проф. Рузского, (Томск, 1990), Чтениях памяти В.Н. Беклемишева (Перш, 1990), V Всесоюзном диптерологическом симпозиуме (Новосибирск, 1990), I Всесоюзной коференции по генетике насекомых (Москва, 1991), Всесоюзной конференции "Устойчивость биологических систем" (Севастополь, 1991),■1У Совещании энтомологов Урала (Пермь, 1992), I Все-россиГ'оком съезде ВОГиС (Саратов, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной часта С8 глав), включающей Материалы и методы, собственные исследования и выводы. Работа изложена на 1?0 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами и 26 рисунками. Список литературы включает 302 наименования, в том числе 165 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

ГЛАВА 1. ПАТОГЕН И ХОЗЯИН (обзор литературы).

R первой части обзора литературы проанализирован механизм действия Bti, во второй части обзора рассматривается взаимодействие bti и личинок комаров. Анализируется влияние пищевого поведения, экологических и биологических особенностей хозяина на его чувствительность к ВН. В третьей части приведен краткий обзор работ по инверсионно полиморфизму малярийного комара A. messeae.

Г MBA 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Насекомые. Все эксперимента проводились на личинках 4 возраста A. messeae. Личинок отлавливали в пята природных водоемах: два из них находились в окрестностях пос. Коларово Томской области, деа - в окрестностях г. Томска, один водоем - в окрестностях пос. [Гегульдет Томской области. Одна популяция выращена в лаборатории^ С Лабораторная) И'предоставлена для работа Ю.М. Новиковым.

fWnreH- В экспериментах использовали клоны PC7), PC 17), Р(36) и MC35) Bti из коллекции лаборатории микробиологии ИСиВХ.

Для проведения экспериментов культуры выращивали в чашках Петри на СПА С г. Махачкала) при 28°С в течение 6 суток.- Газон смывали Физраствором, отмывали два раза центрифугированием, ресус-пендировали из расчета газон с одной чашки на 2 мл Физраствора и хранили в холодильнике при -10°С. Для разведения исходной суспензии применяли варио- и унипипетки объемом от 10 до 1000 мкл.

Лрпнтиндзнуш и пттяаянущ активность клонов определяли на плотных агаризованных средах по Герхард и др. С1989). Яермента-тивную активность характеризовали как отношение площади лизиса или преципитации субстрата к площади колонии, в относительных единицах (o.e.).

Биптесты. Первый эксперимент С глава 3) провели в кюветах 26*14 см-. 0.5 л дехлорированной воды на повторность. В дальнейшем эксперименты проводили в кюветах 21*10 см~, в-200 мл дехлорированной воды. Индивидуальную восприимчивость особей определяли в биохимических планшетах, по 2 мл воды на лунку.

Вес.лшшиок. измеряли на торсионных весах после предварительного обсушивания, взвешивая по 10 или больше особей. В таблицах приводится средний вес одной личинки.

Идентификация кариптаппв. Выжившик в контроле и вариантах эксперимента личинок Фиксировали этанол-уксусной смэсыо (3:1). Препараты из слюнный желез готовили по лактоацеторсеиновому методу. Локализация инверсий и их обозначения приведены раньше (Стег-ний, 1991). Стандартными последовательностями считали ХЮ, 2Яо, ЗЙ), ЗЬо, инвертированными ХЫ, ХЬ2, 2Й1, ЗР,1, ЗЫ. Всего исследовано 3584 кариотипа А. теэзеае.

Обработка результатов. Инверсии в гомо- и гетерозиготной Формах использовали в качестве маркеров. В качесгвег критериев оценки достоверности результатов использовали I- у УУ- критерии (Рокицкий, 1973; Лакин, 1990). Пятидесятипроцентную летальную дозу Ибо Ш вычисляли методом Спирмена-Кербера (Лакин, 1990).

ГЛАВА 3. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЛИЧИНОК А. МБ5ЕАЕ С РАЗНЫМИ КАРИОТИПАМИ К ВП.

Определяли влияние ВЦ на хромосомный состав личинок А. шеззеае из Коларовской популяции.

В опыте 1 (табл.1) изменения в хромосомном составе личинок не отмечено. Гибель части особей в опыте 2 привела к изменению хромосомного состава личинок А. тезБеае. В кариотипах самцов и самок по сравнению с контролем уменьшилась доля половых хромосом с инверсией ХЬ2 СХ5г=4.75: с!Г = 1: р<0.05). В условиях эксперимента произошло снижение доли гомо- и гетерозигот по инверсии 2Я1

Таблица 1

Условия эксперимента и смертность личинок А. теБзеае

I-1-1-1-1-1

IПопуляция, ва-1Личи- I Доза, ¡Смертность, I 1Л50, I I риант опыта I нок |спор/лич. I М ± Бт. % |спор/лич. I

Коларовская

опыт 1 75 264 опыт 2 300 1320 контроль 150 О

18.7*4.5 1188 55.3±2.9 0.7±0.7

Лабораторная

"южные" 203 660

контроль 69 О

"северные" 180 660

контроль 72 О

56.6±3.4 583 О

72.2±3.3 487 О

СХ^9.65: df=2: р< 0.01), а также уменьшилась доля особей с ауто-сомами 3Lu и 3Loi (Х^6.44: df=2: р<0.05).

В связи с повышенной смертностью особей с хромосомами XL12, 2R01 и 3L01 произошло уменьшение гетерозиготности у инфицирован-ник личинок. В контроле гетерозиготность на особь составила 0.54 у самцов и 1.17 у санок, в опыте - 0.42 и 0.92, соответственно. У личинок обоих полов снизилась доля ли-, три- и тетрагетерозигот от 23.8% в контроле до 10.9% в опыте (Х'^6.89: df=l: р<0.01).

Чувствительность личинок к BL1 оказалась ассоциирована, в основном, с хромосомой 2R. Для проверки зтого предположения сравнивали восприимчивость потомства от самок с хромосомными вариантами 2R11C01) ("северными") и 2R00 ("южными"). Потомство самок с хромосомой 2R00 оказалось в 1.28 раза устойчивее потомства салак с хромосомами 2Ril(01) (табл.1). В результате инфицирования Btl произошло уменьшение доли частоты гомозигот 2Rn среди потомства самок с "северными" кариотипами (Х^б. 26: df=2: р<0.05). Таким образом, инверсия 2Ri повышала чувствительность личинок с "северными" Кариотипами к Btl.

ГЛАВА 4. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЛИЧИНОК А.

MEIJSEAE С РАЗНЫМИ КАРИОТИПАМИ 8 ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДОЗЫ BTI.

В природных популяциях при обработках Btl смертность личинок может изменяться в широких пределах - от 0 до 100%. Смертность особей при этом зависит от дозы патогена. Поэтому актуальным является вопрос: в одинаковой ли мере будут изменяться частоты инверсий в популяции при разной дозе Btl и, соответственно, разной смертности?

Для ответа на этот вопрос анализировали кариотипический состав личинок A. messeae иэ популяции Томска(2), смертность которых составила 41.1 и 71.9%% при инфицировании клоном P(l?) Btl.

При инфицировании личинок дозой 2.5 мкл/мг веса хозяина личинки A. beklemishevi оказались менее восприимчивыми, чем особи A. raesseae. При дозе 5 мкл/мг - чувствительность видов к Bt-1 достоверно не различалась (табл.2).

При гибели 41.1% личинок частоты хромосомных последовательностей в популяции A. messeae не изменились. При смертности 71.9% в опыте по сравнению с контролем возросла доля вариантов XLo (X&6.03:df=i: P<0.05), 2Ro (>04*25.98: df=l: PfO.OOl), 3RO (XM.U6: df=i: p<0.05) и 3Lo (Х^б.87: df=i: p<0.01: рис.1).

12 3 4

вариант хромосомы

Рис.1. Изменение частоты хромосомных последовательностей личинок A. messeae при двух уровнях смертности. Цифрами обозначены варианты хромосом: 1 - XLO, .2 - 2R0, 3 - 3Ro, 4 - 3Lo. К - кон-торль: А - смертность 41.1%: Б - смертность 71.9%.

Таблица 2

Смертность личинок малярийных комаров при инфицировании Btl

|-1-1-1-;-:—I

I Вариант экс- |Личи- 1Доза,*| Смертность, % I

I перимента | нок 1мкл/мг|--1-1

I III mln-max I в среднем!

1 Контроль (К) 200 0 2-5 3.2 ± 1.11

1 Старшие (А) 300 2.5 24 - 33 29.9 ± 2.61

|из них: 1

|А. messeae 270*" 2.5 41.1 ± 3.01

IA. beklemlshevi 30** 2.5 3.3 ± 3.31

1 Младшие (Б) 300 5.0 64 - 77 69.5 ± 2.71

1 из них: 1

lA. messeae 270** 5.0 71.9 ± 2.71

1 A.beklemlshevi 30** 5.0 56.7 ± 9.11

I_-—i

Примечание: к - в мкл/мг веса хозяина: ** - расчетные величины.

• 6 •

Состав половым хромосом и аутосом после отмирания 41.1% личинок не отличался от контрольного. При этом обнаружилась тенденция к возрастанию гетерозигот 2R01 и 3Roi. После отмирания 71.9% личинок в популяции обнаружился целый ряд расхождений в частотах хромосом по сравнению с контролем. Это выразилось в увеличении доли самцов ХЦ. самок XLoi. аутосом 2R00 и 3LOO, а также уменьшении доли самок XLn, аутосом 2Rn и 3L01. В опыте снизилась доля самцов СХ^б.7; df=l: d<0.01). Аналогичные различия наблюдались между составом хромосом при гибели личинок 41.1%- и 71.9%. Частота гетерозигот 2R01 и 3R01 при этом различалась значимо (Х*М.75: df=i; р<0.05).

При смертности 41.1% личинок в эксперименте отмечено некоторое увеличение разнообразия инверсионных генотипов, при смертности 71.9% - уменьшение (рис.2).

ГЛАВА 5. КЛОЮВЫЕ ОСОБЕННОСТИ BTI И ЛИФФЕРЕЩИАЛЬНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЛИЧИНОК A. MESSEAE С РАЗНЫМИ КАРИОТИПАМИ.

Гетерогенность характерна не только для природных популяций хозяина - в данном случае, малярийного комара A. messeae, но и для микробных популяций кристаллообразущей бактерии Btl. Эта гетерогенность присуща не только морфофизиологическим свойствам бактерии - строению колоний, экспрессии и активности Ферментов (Chi 1 cott el al.. 1983; Sandler et al., 1985; Ла Тьен Фыонг, 1987; Меликсетян, 1989; Осадчая и др., 1990; Бурлак и др., 1995), но и характеристикам кристаллов дельта-эндотоксина (Yajnanato et al., 1983а).

Клоны различались морфологией колонии, лецитиназной и про-теазной активностью, размерами кристаллов и ларвицидной активностью для Ае. aegypti С табл. 3). Данные по смертности личинок А. messeae в эксперименте приведены в табл.4. На изменение генетической структуры популяции существенное влияние оказывает доза, поэтому анализировали не только суммарные показатели по действию клонов, но и дифференциально, при высокой и низкой смертности.

Цитогенетический анализ личинок A. messeae. выживших в эксперименте и контроле, показал, что клоны PC 36) и М(35) имели некоторое различие в действии на инверсионный полиморфизм популяции при низкой смертности. Эти различия были скорее количественными, чем качественными. При смертности 36. TL от клона Р(36) изменения в частотах инверсий по сравнению с контролем не произош-

Таблица 3 Характеристики трек клонов Btl

Параметр

Названия клонов

PC 17)

PC 36)

КС 35)

I ЛА, о.е* I ПА, o.e.** I Рост, мм/ч ILD50,сп/лич*** I Длина: I кристалла, мкм I споры, мкм

5.9 1.9 0.375 90

1.14 ± 0.211 1.86 + 0.171

7.6 2.0 0.427 96

1.12 + 0.188 1.96 ± 0.205

11.2 4.2 . 0.292 517

1.07 ± 0.255 1.83 ± 0.196

Примечание: * - лецитиназная активность CJIA): ** -активность (ПА); *** - для Ае. aegypti

протеиназная

ло. При смертности 24.5% от клона М(35) увеличилась доля последовательностей 2RO СХ^б. 48: df=i: Р<0.05) по сравнению с контролем. Различия по 2R имелись между вариантами с низкой смертностью от клонов Р(36) и MC35) (ХМ.39: df-l: рс0.05). Клон МС35) измененял в генетическую структуру популяции уже при низкой смертности, ■ чего не наблюдалось в действий других клонов Btl.

При высокой смертности действие клонов оказалось сходным. Так при смертности 73.6% от клона Р(36) увеличилась доля хромо-

Таблица 4

Смертность личинок 4-го возраста А. raesseae в эксперименте

1 1 Личинки. 1 группа 1 ■ i— ■ i ¡Масса,1 1 L клон Р( 36) —1 клон MC 35) 1 1 1

1 мг* г 1 1 1 i i погибло,% |больных.%| п** 1 1 погибло,%| п** 1

Г" 1 Старшие 4.34 36.2±5.8 10.1±3.6 69 26.8+5.3 71 1

1 средние 3.30 56.9±5.8 9.7±3.5 72 22.2±4.8 72 1

1 младшие 2.00 90.3±3.5 2.8±1.9 72 70.4±5.4 71 1

|в среднем 1 3.21 61.1+3.3 7.4±1.8 213 39.7±3.3 214 1 1

Примечание: * - средняя масса особи: ** - особей в повторности.

Рис.2. Изменение частоты хромосомный вариантов личинок A. messeae из популяции Томска (2) при инфицировании их двумя клонами Btl. Цифрами по оси абсцисс обозначены варианты хромосом: 1 - XLo. 2 -2Ro. 3 - 3Ro, 4 - 3Lo: цифрами легенды: 1 - контроль.' 2 - клон MC 35), смертность 24.5%: 3 - клон РС36), смертность 36.2%: 4 -клон MC 35), смертность 70.4%: 5 - клон PC 36), смертность 73.6%.

сомных последовательностей XLo (Х<М.14: df=i: d<0.05) и 2Ro СX"^ 17.0: df=l: p<0.001) по сравнению с контролем. Частота вариантов 3Ro и 3Lo имела тенденцию к увеличению. Эти изменения были такими же, как и в случае применил клона PC 17) при сходной смертности личинок. При смертности 70.4% от клона MC 35) возросла частота варианта 2Ro СХ&=5.32: df=i: р<0.05), а доли последовательностей XLo, 3Ro, 3Lo имели к этому тенденцию С рис. 2).

ГЛАВА 6. ТЕМПОРАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ ДИФФЕРЕЩИАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЛИЧИНОК A. MESSEAE К BTI.

Эксперимент проводили на личинках 4 возраста популяции из пос. Коларово в трех вариантах, при трех дозах клона РС36) ВН. В первом варианте личинок Фиксировали в виде трех Фракций, руководствуясь временем гибели особей. Во втором варианте выделено две фракции. Это было вызвано более синхронной гибелью личинок. В

Таблица 5 Условия эксперимента и смертность личинок А. messeae

1 1 1 Номер | Доза, 1 1 1 Личинок 1 Время. 1 1 ¡Смертность. 1

1 опыта |мл/повт. 1 |в опыте I 1 час. I 1 М ± Sm, % 1 I |

1 Коларово

1 1 4.8 150 2.5 41.0±4.1 1

3.0 63.9±4.0 1

1 2 1.2 150 4.5 6i.0±4.1 1

1 3 0.175 500 24.0 78.2±1.9 1

1 К 0 200 24.0 0.6±0.6 1

1 Тегульдет

1 4 4.8 . 170 2.0 26.5±3.4 1

2.5 48.2±3.8 1

1 , ............. 3.0 76.5±3.3 1 1

третьем варианте поэтапное фиксирование личинок было невозможно, поэтому их кариотипический состав сравнивали с контролем. Аналогичный эксперимент был проведен на личинках Тегульдетской популяции С табл.5).

Проведенные эксперименты показали, что последствия инфицирования Bti личинок А. messeae различались в кратковременном (время экспозиции 3.0 и 4.5 часа) и долговременном (24 часа) вариантах эксперимента. Через 2.5 часа экспозиции, при гибели личинок 41.0±4.1% в эксперименте 1, смертность личинок с каждым из карио-типов не различалась между собой и от общей смертности особей в опыте. Однако, элиминация инверсий 2Ri превышала таковую последовательностей 2R0 (рис.За). Через 3 часа экспозиции, при смертности личинок 63.9±4.0% в эксперименте 1, наиболее устойчивыми оказались самки XLOO. При этом смертность самок XLOO и XLn, а также особей с хромосомами 2R00 и 2R0K11) различалась. Элиминация инверсий 2Ri превышала таковую 2R0, а инверсий XLi - последовательностей XL0 (#¿=5.85: df=i: р<0.05; рис.36). Общее направление изменений в экспериментах 1 и 2 совпадало.

В эксперименте 3 смертность самок XLoi оказалась ниже, чем личинок с другими генотипами (Х&=10.3: df=l: р<0.001). Гибель самок XL00 превышала таковую самок XLoi (Х^5.61: df=i: р<0.05). а

90.80-м та-

5 90' в 50-

I 40'

8 зо-яо-

Ю-

0-1................................

12345078 1234&678 вариант инверсии

Рис.3. Элиминация инверсий А. messeae в эксперименте 1 при инфицировании Bti: а) смертность 41.0+4.1%: б) смертность 63.9±4.0Х: Цифрами обозначены инверсии: 1 - 2Ro, 2 - 2Rl, 3 - 3Ro, 4 - 3Rl, 5- 3Lo. 6- 3Ll, 7- XLo, 8- XLi. Указан 95% доверительный интервал.

личинок с генотипами 3L0K11) - 3L00 СХ^б.19: df=l: р<0.05). В этом эксперименте погибло больше самцов, чем самок (ХМ. 16: df=l: р<0.05), а гомозиготных самок XLll(OO) - больше, чем гетерозиготных XL01C12) СХ^б.25: df=l: р<0.05).

В эксперименте 4, проведенном на личинках из популяции пос. Тегульдет, значимые различия зафиксированы между фракциями 1 и 2. Фракция 1 содержала больше самок с хромосомой XLli (ХМ. 56: df=l: р<0.05). Частота инверсиии XLl в этой фракции таже оказалась выше, чем во фракции 2 (Х^З.92: df=l: р<0.05) и во фракциях 2-4 С ХМ. 05: df=l: р<0.05), а последовательностей 3Lo - ниже (ХМ. 23: df=i: р<0.05).

ГЛАВА 7. ГРУППОВОЙ ЭФФЕКТ У ЛИЧИНОК А. MESSEAE ПРИ ИНФИЦИРОВАНИИ ИХ BTI.

При инфицировании личинок комаров знтомопатогенной бактерией Btl обнаружен эффект группы у личинок р. Culex, который выражался в уменьшении гибели особей в группе (положительное влияние группы). Такой эффект не был.обнаружен у личинок рр. Aedes и

. . I*I'I.......

2 3 4 5 6 7 6

1 2 3 4 5 8 * вариант инверсии

Anopheles СAly et al., 1988). Эффект группы при инфицировании Btl, выявленный наш у A. messeae, оказывался противоположным С в группе погибало больше или, на момент прекращения эксперимента, оказывалось больше больных особей) таковому у Сх. quinquefasclatus и проявлялся, в основном, при низкой смертности.

Второй вопрос нашего изучения ставился следуюдим образом.' влияет ли группа на хромосомный состав выживших личинок? Онтогенетический анализ показал, что группа также оказывала "отрицательное" влияние. В групповом варианте заражения личинок изменения частот хромосом проявлялись значимее, чем в индивидуальном. Так в популяции Томска(1) в группе возросла частота самок XLoi по сравнению с индивидуальным вариантом эксперимента (Х^З.86: df=l; р<0.05). Доля генотипов XLOOCOI.O) увеличилась' (Х-М.6Г, df=l: р<0.05), а генотипов XLliCl) уменьшилась С ХМ. 17: df=l: р<0.05) в группе по сравнению с контролем. Направления изменений по ауто-сомам при индивидуальном и групповом инфицировании оказались сходными. Групповой эффект оказался аналогичным в популяциях Том-скаС1) и Тегульдета, хотя их исходный хромосмный состав существенно различался.

Каждой из исследованных популяций были присущи специфические черты реакции на патоген. Анализ изменения частот инверсий показал, что в популяции Томска при групповом инфицировании личинок возросла доля хромосомных вариантов XLo (Х^Ю.86: df=l: р<0.01), 2RO (Х^3.87: df=i: р<0.05) и 3Lo СХМ.О: df=l: р<0.05), снизилась - XLi (Х^9.4: df=l; р<0.01). В индивидуальном варианте опыта изменения частот инверсий были аналогичны, однако, как и в случае хромосом, слабее выражены.- В популяции из пос. Тэгульдет в группе по сравнению с контролем возросла доля инверсий XLl (ХМ. 87: df=l: р<0.05). Доля других инверсий не изменилась. В индивидуальном варианте эксперимента - по сравнению с контролем увеличилась концентрация инверсий XLl СХ^б.бЭ: df=i: р<0.05) и 3Li (ХМ.73: df-l: р<0.05).

ГЛАВА 8. ВЛИЯНИЕ ПЛОТНОСТИ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К BTI ЛИЧИНОК МАЛЯРИЙНЫХ КОМАРОВ С РАЗНЫМИ КАРИОТИЛАМИ.

В настоящем разделе мы изучали реакции личинок малярийных комаров с разными инверсионными генотипами на инфицирование Btl при двух значениях плотности. Влияние плотности также можно рассматривать как одно из проявлений эффекта группы.

12

Популяция пос. Тегульдет относится к периферийным. Инверсионный полиморфизм А. теззеае в таких популяциях снижается ввиду достижения видом крайних значений адаптивных зон (Стегний, 1991). В отсутствие наиболее устойчивых к В11 особей с вариантами хромосом 2Я0(ХО1) чувствительность личинок коррелировала, в основном, с половой хромосомой.

Таблица 6

Соотношение видов и полов личинок малярийных комаров младшей группы, инфицированных ВИ при двух уровнях плотности

1 Вид Частота, 1 % 1

Контроль Р1 1 Р2 1 | |

Оба пола

|А. тегзеае 75.8±3.1 71.2±3.7 51.2+3.4 1

|А. ЬеМепйБЬеу! 24.2+3.1 28.8+3.7 48.8±3.4 1

Самцы

|А. твзвеае 28.4±3.8 39.4±4.8 45.4±4.8 1

1 А. Ьек1ет1вЬеу1 55.6+7.4 40.5+7.6 58.3+4.9 1

1 Личинок 186 146 211 " 1 1

После инфицирования личинок ВЦ соотношение полов у А. шезБеае изменилось в пользу самцов при плотности 1.43 экз./см,,г и осталось таким же как в контроле у младшей возрастной при плотности 0.24 экз./см^ (табл.6). У старших личинок соотношение полов не различалось при обоих значениях плотности.

Различий в хромосомном составе между контролем и вариантом опыта при плотности 0.24 экз. /см^ не зарегистрировано. Направление изменений при плотности 1.43 экз./см^, в основном, совпадало с таковым при плотности 0.24 экз./см^, но было отчетливее выражено. Это могло обуславливаться более высокой смертностью младших личинок при плотности 1.43 зкз./смй. В этом случае зафиксировано увеличение доли самцов ХЦ (Х"^=12.99: ЙГ=1: р<0.001). Среди старших и младших личинок при плотности 1.43 экз./см^ снизилась доля комбинаций аутосом 2Яи-ЗЙ01-ЗЦ)0 с 43.0±3.1% в контроле до 32.?±3.2 % в эксперименте (ХМ.53', с!Г=1: р<0.05), а также доля генотипов Х1А2С22.2) (ХМ.77; ЙГ=1: р<0.05). В изменении частот

13

хромосом между возрастными группами при одинаковой плотности часто наблюдались противоположные тенденции, что могло оказаться проявлением механизмов поддержания популяционно-генетического го-меостаза.

ГЛАВА 9. СПОСОБ ДОБЫВАНИЯ ПЩИ ЛИЧИНОК A. MESSEAE С РАЗНЫМИ КАРИОТИПАМИ И ИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К BTI.

Восприимчивость к Btl личинок комаров в значительной мере зависит от скорости поглощения патогена (А1у, 1988; А1у et al., 1988). Другие авторы связывают чувствительность личинок р. Anopheles с их способом питания (Расницын и др.. 1991). В настоящих экспериментах изучалась связь способов питания личинок А. messeae с их кариотипами и устойчивостью к ВН.

Проведенные опыты показали, что способ питания личинок зависел от плотности личинок, продолжительности голодания и уровня воды. Так более высокая плотность личинок активировала обскребы-вание. Чаще обскребывали личинки при продолжительном голодании и низком уровне воды в кювете.

В популяции Томска (1) обскребывать предпочитали личинки с генотипами 3ROO 0(2=5.11; df=l; р<0.05) .и 3ROO-3LOO СХ;г=7.89: df=l: pcO.Ol). Полученные результаты показывают, что пищевое поведение личинок A. messeae определяется взаимодействием хромосом в большей степени, чем какой-либо хромосомой в отдельности. Наиболее сильным оказалось взаимодействие плеч XL и 3R. Самки XLOO-3ROO предпочитали обскребывать, тогда как самки XL00-3R01 -Фильтровать (Х-М. 19; df-l: р<0.05). Обскребывателями также оказались самцы XL1-2R00C01)-3R00, Фильтраторамм - XLi-2R00(01)-3R01C1D С ХМ. 65: df=l: р<0.05). Другие взаимодействия хромосом в этой популяции не проявлялись значимо. Способ добывания пищи коррелировал с частотой кариотипа в популяции: особи с редкими генотипами предпочитали Фильтровать. Среди особей с доминирущи-ми в популяции кариотипами не было только Фильтрующих или только обскребываюдих. Это показывает, что генетически детерминировано не столько падевое поведение, сколько способность к переключению с одного вида добывания пищи на другой.

Влияние хромосомы 2R на пищевое поведение личинок оказалось менее выраженным. Это показал эксперимент, проведенный на личинках из пос. Тегульдет, где практически отсутствовали хромосомные варианты XLOCXOI) и 2ROOCOD. Наиболее активными сбскребывателя-

14

во

70

Н00

¿50

I 40

§•30

Я

и30 10 о

Рис.4. Смертность обскребывателей и фильтраторов после однократного отбора. Буквами обозначены: о - обскребыватели, ф - фильтра-торы, с - сумма двух экспериментов: 1 - группа, 2 - индивидуально; указан 95% доверительный интервал. Популяция Томска(1).

ми здесь оказались самки ХЬШШ С Х^3.95: с1Г=1: р<0.05), а также особи с кариотапами Х111С12.1)-ЗР.00(01) СХ^3.87: й£=1; р<0.05), ХШагьЗШо (Х*=8.96: р<0.01) и Зйл-ЗЬсю

(Х^5.31: ЙГ=1; р<0.05). Личинки с аутосомами гРи-ЗЯоО-ЗЬоо (ХМ.32: <1М: р<0.05). в т.ч. самцы ХЦ-2[?11-ЗР!оО-31оо (Х*^=5.44: с!Г= 1: р<0.05) предпочитали фильтровать. Сравнительный анализ показал, что хромосма 2Яц переключала тип питания особи на противоположный по сравнению с вариантом 2Й00С01).

Способ добывания пищи оказался совсем по иному связан с устойчивостью личинок к ВН. Косвенные сопоставления показали, что особи с аутосомами ЗЯоо-ЗЬоо и самцы ХЫ-ЗР.ОО из популяции Том-ска(1), предпочитающие обскребывать (Х"М.24: с1Г=1; р<0.05 и Х^У-БО: с!Г=1: р<0.01, соответственно), имели повышенную устойчивость к ви (Х^4.09: с1Г=1:р<0.05 и Х^5.58: (1Г=1: р<0.05, соответственно). Обскребыватели из Тегульдетской популяции, например, самки ХШ-ЗЬоо, также оказались менее чувствительными к патогену (Х^5.64: й?=1: р<0.05). Эксперименты по непосредственному определению устойчивости особей с различными способами добыващего поведения показывают, что фильтраторь! обычно несколько чувствительнее обскребывателей (рис.4). .

А

гЬ

1ф

1о 2ф 2о сф

Вариант эксперимента

Выводы.

1. Парацентрические инверсии способны изменять восприимчивость личинок малярийного комара A. messeae к кристаллообразую-щей бактерии Bti. Наиболее существенное влияние на устойчивость оказывали хромосомные последовательности 2Rl и XL2.

2. Чувствительность личинок с разными кариотипами имеет лозовую зависимость. При действии малый доз частота инверсий в популяции не изменялась а разнообразие генотипов возрастало. При действии больших доз Bti в популяции увеличивалась частота хромосомных последовательностей XLo, 2Ro, 3R0, 3Lo и снижалось карио-типическое разнообразие.

3. Клоновые особенности культур Bti существенно модифицировали действие патогена на генетическую структуру природных популяций A. messeae.

4. Селективное действие Bti зависело от времени экспозиции особей хозяина. Это было связано с увеличением роли кристаллического гемолизина CytA в краткосрочных экспериментах.

5. У A. messeae группа отрицательно влияла на выживаемость личинок и сохранение инверсий в популяции при инфицировании.

6. При инфицировании Bti личинок из "северной" популяции в условиях высокой плотности, преимущество получали самцы А. messeae с половой хромосомой XLl. При этом особи с генотипами XL12C22.2) и аутосомной комбинацией 2Rli-3R0l-3L00 оказались более чувствительными к патогену, чем при низкой плотности.

?. Способ добывания пищи и скорость ее поглощения являются самостоятельными актами поведения у особей A. messeae. Тип питания оказался связан с хромосомой 3R и. в меньшей степени, с хромосомами XL и 2R, а таюке с их взаимодействием. Темпы поглощения патогена коррелировали с хромосомой 3L.

8. Корреляция между способом питания и чувствительностью особей оказалась слабо выраженной. Их восприимчивость, наряду с другими причинами, определялась скоростью поглощения пищи.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Бурлак В.А., Гордеев М.И. Методические подходы к анализу устойчивости Anopheles к дельта-эндотоксинам кристаллообразушей бактерии Bacillus thuringiensis // Методические и методологические вопросы генетики.- Томск: Изд-во Томск, мед. ин-та. 1990. с. 196-205.

2. Гордеев М. И., Бурлак В. А. Инверсионный полиморфизм маля-

16

рийного комара Anopheles messeae. Сообщ. X. Устойчивость личинок с различными генотипами к токсинам кристаллообразущей бактерии Bacillus thurlnglensls subsp. lsraelensls Ссеровар H 14) // Генетика, 1991, т. 27, N. 2. с. 238-246.

3. Бурлак В.А., Гордеев М.И. Изменения в генетическом составе личинок малярийного комара в зависимости от смертности, вызванной кристаллообразущей бактерией В. thurlnglensls subsp. lsraelensls// Тез докл. I Всесоюзн. конф. по генетике насекомым, Москва, 19-21 ноября 1991 г. с. 23.

4. Гордеев М.И., Бурлак В.А. Инверсионный полиморфизм малярийного комара Anopheles messeae. Сообщ. XI. Групповой эффект при инфицировании личинок бактерией Bacillus thurlnglensls subsp. lsraelensls // Генетика. 1992. т.28. N.7. с.82-83.

5. Гордеев М. И., Бурлак В. А. Структура популяции и устойчивость личинок малярийного комара Anopheles messeae (Díptera; Cullcldae) к кристаллообразущей бактерии Bacillus thurlnglensls subsp., israelensls // Зоол. журн. 1992. т.71. вып. 12. с.69-76.

6. Гордеев М. И., Бурлак В. А. Влияние личинок комаров рода Culex на чувствительность комаров рода Anopheles с различными ка-риотипами к знтомопатогенной бактерии Bacillus thurlnglensls subsp. lsraelensls // Генетика. 1994. т.30. N.3. с.367-372.

7. Бурлак В. А. Связь пищевого поведения и хромосомного полиморфизма у личинок Anopheles messeae Fall.// Генетика.- 1994. т.30 (приложение), с.20.

8. Gordeev М. I., Burlak V.A. Population strukture and resistance of larvae of Anopheles messeae (Díptera, Cullcldae) to the crystal-forming bacterium Bacillus thurlnglensls subsp. Israelensls // Entomological Review, 1995. v.74. N.5. pp.94-102.

9. Бурлак В. A., Гордеев M. И. Клоновые особенности действия Bacillus thurlnglensls подвида lsraelensls на личинок малярийного комара Anopheles messeae Fall с разными кариотапами // Сибирский экологический журн. 1995. N. 5

Типография СО РАН г Новосибирск, пр К Маркса, 2. з 33, т 100