Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ингибиторов топоизомеразы и на переход клеток из метафазы в анафазу митоза

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шатрова, Алла Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 1.2. 1. Дискриминация клеток по фазам клеточного цикла 8 2. 2. Выявление митотических клеток и фаз митоза с использованием проточной цитометрии

2. 3. Митотическая клетка. Агрегаты хромосом

2. 3. 1. Порядок расположения хромосом в митотической клетке 13 2. 3. 2. Какие структуры обеспечивают порядок расположения хромосом в митотической клетке?

2. 4. Роль топоизомеразы II в митозе

2. 4. 1. Общая характеристика фермента

2. 4. 2. Изоформы фермента

2. 4. 3. Доменная структура фермента

2. 4. 4. Механизм действия фермента

2. 4. 5. Основные этапы каталитического цикла топоизомеразы II 21 2. 5. Ингибиторы фермента как инструмент при изучении прохождения клетками митоза

2. 5. 1. Некоторые сведения об ингибиторах топоизомеразы II 23 2. 6. Влияние ингибиторов топо II с различными механизмами взаимодействия с ферментом на прохождение клетками митоза 26 2. 7. Ингибиторы протеинкиназ как инструмент для изучения последствий, вызванных действием ингибиторов топо II

2. 8. Механизмы, контролирующие прохождение фаз вг-М

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 35 3. 1. Культивирование клеток 35 3. 1. 1. Клеточные культуры 35 3. 2. Получение суспензии митотических клеток 35 3. 2. 1. Снятие митотического блока 36 3. 3. Обработка клеток ингибиторами топоизомеразы II 36 3. 3. 1. Ингибиторы, стабилизирующие ковалентный комплекс

ДНК- топо 11 УР-16 и т-АМЭА

3. 3. 2. Каталитический ингибитор топо II1С1ЧР

3. 3. 2. 1. Обработка клеток кофеином

3. 4. Гипотоническая обработка и пермеабилизация клеток

3. 5. Обработка клеток химопсином

3. 6. Окрашивание ДНК клеток

3. 7. Получение хромосом из суспензии митотических клеток (механическая обработка)

3. 8. Цитометрия в потоке

3. 9. Обработка результатов (дифференциальный анализ)

3. 9. 1. Оценка распределения агрегатов хромосом

4. РЕЗУЛЬТАТЫ 43 4. 1. Характер межхромосомных взаимодействий в агрегатах хромосом аналогичен внутрихромосомному 43 4. 2. Агрегаты хромосом существуют в клетке до перехода из метафазы в анафазу 44 4. 3. Агрегаты хромосом имеют специфический профиль распределения, а характер связей хромосом в агрегатах является случайным и равновероятным 45 4. 4. Ингибиторы, стабилизирующие комплекс ДНК-топоизомераза II, вызывают блокирование клеток в фазе вг, а также нарушения в прохождении клетками митоза с выходом в псевдо

4. 5. Каталитический ингибитор, не стабилизирующий комплекс ДНК -топоизомераза II, вызывает блокирование клеток на границе вг/М, нарушения в прохождении клетками митоза с образованием псевдо-С1 клеток с содержанием ДНК равным 4С

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

6. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние ингибиторов топоизомеразы и на переход клеток из метафазы в анафазу митоза"

Митоз является одним из наиболее важных процессов жизнедеятельности клетки, так как от правильного и своевременного выполнения всех условий, необходимых для его протекания и завершения, зависит дальнейшая судьба клеток: следовать далее по клеточному циклу или подвергнуться апоптозу (Ciarke, Gimenez-Abiän, 2000). Образование двух одинаковых дочерних клеток в результате митотического деления обеспечивается скоординированной работой механизмов, отслеживающих и исправляющих повреждения, возникающие как перед вступлением клетки в митоз, так и во время митоза (Smits, Medema, 2001). При работе с такой сложноорганизованной структурой, как митотическая клетка, исследователи нередко сталкиваются с проблемами, осложняющими интерпретацию полученных результатов. Так, практически всегда наблюдается наложение хромосом друг на друга при приготовлении фиксированных препаратов митотических пластинок, а также наличие агрегатов хромосом при приготовлении суспензии митотических хромосом, как из клеток млекопитающих, так и из растительных клеток (van den Engh, 1984; Lee et at., 2000). В большинстве случаев результаты таких наблюдений считаются методическим артефактом. Тем не менее, существует ряд работ, посвященных ассоциациям хромосом, возникающим в результате нерасхождения хромосом в клетке. Показано, что частота ассоциаций увеличивается в процессе инкубации клеток с колцемидом, вероятно, за счет слияния хромосомных доменов в предшествующей интерфазе (Куницкая и др., 1998). Авторы полагают, что предпочтительное участие ядрышкообразующих (ЯО) хромосом в образовании хромосомных ассоциаций в метафазных клетках отражает их взаимное расположение и функциональную активность в интефазном ядре. Это было подтверждено и другими авторами, которые показали неслучайное расположение ЯО хромосом в двух гаплоидных наборах метафазной клетки (Klein et al., 1998). Нами при проточном кариотипировании (flow karyotype) также было показано наличие большого количества агрегатов хромосом (Zenin et al, 1997). При проведении поклеточного анализа хромосомных наборов клеток человека мы подтвердили, что практически каждая (до 99%) анализируемая митотическая клетка содержит агрегаты хромосом (1еш'п й а1., 1998; Зенин и др., 1998; Зенин и др., 1999). Следует отметить, что цитометрический анализ обычно проводится в условиях более физиологических, чем традиционное кариотипирование с жесткой фиксацией на стекле, уменьшая вероятность случайного слипания хромосом. (Зенин и др., 1999). Таким образом, существует точка зрения, в соответствии с которой возникновение хромосомных ассоциаций является естественным процессом, в ходе нормальной жизнедеятельности клетки, однако природа образования агрегатов хромосом остается неясной.

Данные, полученные группой исследователей, подтвердили ранее существующее предположение об участии ДНК в обеспечении связи между хромосомами (непрерывность генома) и, соответственно, порядка расположения хромосом в метафазной пластинке (Мапюйз е! а!., 1997).

Известно также, что в процессах транскрипции, репликации и репарации ДНК возникает множество топологических проблем, связанных с образованием узлов и сцеплений и перелутыванием сверхдлинных нитей ДНК. Разрешением этих проблем занимается отдельная группа ферментов, называемая топоизомеразами (Якубовская, Габибов, 1999). Среди них особое место занимает топоизомераза тип II (топо II), которая является не только структурным компонентом интерфазного ядра и митотических хромосом, но и принимает участие в таких процессах, как конденсация и сегрегация хромосом (1зЫс!а е* а!., 1994; N¡1153, 1998). Именно ДНК-овые переплетения, возникающие как в процессе репликации, так и в процессе индивидуализации хромосом в дискретные единицы, являются мишенью для работы фермента (гесЫесЗпсИ, ОзИегоА1, 1990; 61тепег-АЬа1ап е1 а1., 2000). Считается, что во время конденсации и при сегрегации хромосом фермент распутывает разного рода сцепления. Агрегаты хромосом, наблюдаемые в метафазных клетках, по-видимому, содержат связанные хромосомы, предсуществующие к моменту приготовления препарата и которые необходимо распутать для нормального завершения митоза. Ранее было показано, что топо II обладает чувствительностью к сцеплениям нитей ДНК (гесЫесИсИ,

ОзИего1Т, 1990). Это дало основание предположить, что сигналом к проявлению распутывающей активности топо II является натяжение, возникающее в месте сцеплений нитей ДНК. ^¡тепег-АЬагёп et а1., 2000). Так ли это и что происходит с агрегатами хромосом при нормальном прохождении и завершении клетками митоза, представляет несомненный интерес с точки зрения расширения наших представлений о процессах, связанных с метаболизмом ДНК. Использование ингибиторов топо II, подавляющих активность фермента на разных стадиях каталитического цикла, даёт возможность выяснить, что происходит с клеткой при нарушении нормального прохождения митоза и, соответственно, сделать заключение о возможном вовлечении фермента в разрешение топологических проблем на завершающих этапах митоза.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2. 1. Дискриминация клеток по фазам клеточного цикла.

Некоторые исследователи называют митоз одним из драматических этапов клеточного цикла (Widrow, Laird, 2000). И это справедливо, так как от успешного выполнения всей последовательности событий, в норме приводящих к образованию двух новых полноценных дочерних клеток, зависит дальнейшая судьба не только клеток, но и организма в целом (Diffley, Evan, 2000). Для того чтобы клетка могла справиться с теми или иными спонтанными или индуцированными дефектами (ионизирующая радиация, облучение, химическое или тепловое воздействие), возникающими по мере продвижения ее по клеточному циклу, в ней существуют механизмы (checkpoint control), ответственные за выявление и исправление этих дефектов (Clarke, Gimenez-Abian, 2000). Если дефектов слишком много, чтобы их можно было исправить за отведенное клетке время, клетка подвергается апоптозу. Однако зачастую гены, ответственные за экспрессию белков, участвующих в осуществлении контроля, либо оказываются функционально неактивными (мутантными), либо вовсе отсутствуют, что и является причиной генетической нестабильности (Erenpreisa, Cragg, 2001). В таком случае поврежденная клетка бесконтрольно продвигается по циклу и накапливает дефекты (одноцепочечные и двуцепочечные разрывы ДНК, перепутанные или не разошедшиеся в анафазе хромосомы). Следствием дефектов является анеуплоидия, которая в конечном итоге приводит к злокачественной трансформации клеток (Diffley, Evan, 2000). При исследовании влияния различных веществ (в том числе противоопухолевых препаратов) на прохождение клетками митоза, наиболее важным моментом является идентификация не только клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, но и клеток, проходящих через разные фазы митоза.

Традиционно используемые микроскопические методы позволяют различать отдельные фазы митоза, однако, в результате действия препаратов происходят такие изменения в митотической клетке, которые не всегда позволяют корректно определить фазу митоза. Например, при изучении с помощью световой микроскопии прохождения фаз митоза в присутствии ингибиторов топоизомеразы II (топо II), авторы отличали митотическую клетку от клетки не митотической исключительно по отсутствию ядерной оболочки и наличию конденсированного хроматина (Iwai et al., 1997). Однако известно, что в суммарной популяции клеток млекопитающих G2+M при действии некоторых препаратов нарушается хромосомная динамика, которая сопровождается в некоторых случаях образованием оболочки вокруг не полностью деконденсированных хромосом. Такие клетки с содержанием ДНК, равным 4С и различной степенью конденсации хроматина сложно отличить от клеток G2+M только при помощи световой микроскопии или микроденситометрического метода (Sumner, 1995). Иммунофлуоресцентный метод с использованием антител к митоз специфичным белкам (антитела к ламину В, к фосорилированной форме гистона НЗ, к фосфорилированным эпитопам других белков), дает более полную картину клеточного ответа, однако следует учитывать некоторые ограничения при использовании конкретных антител. Так, в настоящее время для выявления митотических клеток широко используются антитела к фосфорилированной форме гистона НЗ (Sramkoski et al., 1999; Juan et ai., 2001). Рядом исследователей было показано, что в гипотонической среде происходит его дефосфорилирование (Van Hooser et al., 1998). И, хотя клетка при этом остается митотической с конденсированным хроматином, флуоресцентный сигнал будет негативным. Этот пример важен для понимания того, что при действии различных препаратов и соответствующих обработок отличить митотическую клетку от не митотической клетки с одинаковым содержанием ДНК трудно. Это ограничение в определенной степени справедливо при цитометрическом анализе с использованием антител к фосфорилированному гистону НЗ при использовании гипотонической обработки клеток для выделения хромосом.

2. 2. Выявление митотических клеток и фаз митоза с использованием проточной цитометрии.

Проточная цитометрия вот уже в течение нескольких десятилетий является бесценным методом при анализе распределения клеток по клеточному циклу (Anderson et al., 1998) и широко применяется в клинической диагностике, а также при проведении фундаментальных научных исследований (Jaroszeski, Radcliff, 1999). Обращаясь к истокам разработки методов для выявления клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла можно увидеть, что большинство методических приемов, связанных с цитометрией в потоке позволяло первоначально различать клетки только в фазах G0/G1, S или G2+M клеточного цикла (Dolbear et al., 1983). Затем исследователи использовали изменения оптических характеристик клеток (прямое, боковое светорассеяние и флуоресценция) в зависимости от способов их обработки и состояния хроматина, которые в некоторых случаях позволяли различать клетки в фазах G2 и М. Было показано, что в митотических клетках, обработанных формальдегидом и окрашенных ДНК флуорохромами, флуоресценция подавляется в меньшей степени по сравнению с интерфазными G2 клетками (Larsen et al., 1986). Другие авторы использовали сочетание двух флуорохромов флуоресцеинизотиоционата (FITC) для окрашивания белков и иодистого пропидия (PI) для окрашивания нуклеиновых кислот и обработку клеток не ионным детергентом NP-40 (Zucker et al., 1988). Полученные в результате анализа цитограммы сравнивали по характеру светорассеяния под углом 90° против флуоресценции PI и FITC флуоресценции против PI флуоресценции. Однако при таком способе обработки, в отличие от предыдущего, митотические клетки были недостаточно прокрашены и, поэтому занимали положение S/G2 на однопараметрической гистограмме. Позднее был опубликован метод, который уже сочетал в себе измерение светорассеяния, определение включения бромдезоксиуридина (BrdU) с помощью флуоресцентных антител и количественную оценку содержания ДНК по PI флуоресценции. Такое сочетание позволило авторам различать не только клетки в фазах

G0/G1, S, G2+M (G2 и M по светорассеянию), но и также субпопуляции Gi клеток - ранние постмитотические (GiA) и зрелые постмитотические (GiB), готовые к инициации синтеза ДНК. Этот способ включает в себя использование фиксации 70% спиртом, экстракцию гистонов с помощью соляной кислоты и тепловую денатурацию ДНК (Giaretti et al., 1989; Nüsse et al., 1989). Такие условия обработки клеток усиливали различия в структуре хроматина и позволяли отличать их на основе светорассеяния под прямым углом. Так, светорассеяние митотических клеток было ниже ранних постмитотических GiA клеток, а светорассеяние GiA ниже такового GiB клеток. Изменение светорассеивания коррелировало со степенью конденсации хроматина, что было подтверждено и микроскопическими исследованиями. Другие авторы использовали технику пульс мечения клеток Brdlird в фазе S и общего количества ДНК, где неокрашенные G2 и М клетки были измерены как два отдельных пика в соответствии с флуоресценцией PI, которая в М-кпетках была значительно ниже, чем в Сг-клетках (Nüsse et al., 1989). Аналогичные исследования базировались на измерении бокового светорассеяния и содержания ДНК по флуоресценции бромистого этидия. Метафазные и ранние Gi-клетки отличались низким значением бокового светорассеяния по сравнению с интерфазными клетками (Nüsse et al., 1990).

В дальнейшем для дискриминации митотических клеток с использованием проточной цитометрии исследователи все больше обращаются к использованию антител, специфичных к митотическим белкам. Так, одновременное использование антител к циклинам А и В, которые экспрессируются и деградируют в разных фазах клеточного цикла, позволило исследователям различать клетки в фазах G2 и М (Gong et al., 1995). Использование антител TG-3, выявляющих митоз специфический антиген нуклеолин, в сочетании с измерением содержания ДНК и технологией включения BrdUrd, дало возможность отличать клетки в фазах G0/G1, S, G2 и М, а при использовании световой микроскопии также и отдельные фазы митоза (Anderson et al., 1998). Одновременное использование антител к циклину В, ДНК специфических флуорохромов, а также клеточной модели с нарушенной динамикой прохождения митоза использование амсакрина и стауроспорина) позволило различать «родительские» (б2+М)-клетки и Gi-клетки с содержанием ДНК, равным 4С (Gong et ai., 1993). Кроме того, рядом авторов была предложена методика с использованием антител к еще одному митоз специфическому белку р105 и антител к циклину В (Sramkoski et al., 1999). При анализе в потоке опухолевых линий такой подход позволяет различать не только клетки, находящиеся в фазах G2 и М клеточного цикла, но и клетки, способные к эндоредупликации. Еще одним подходом, имеющим ряд преимуществ по сравнению с вышеописанными методами, является дифференциальный анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла, основанный на использовании проточной цитометрии (Зенин и др., 2001). Анализ позволяет оценивать митотический индекс и различать клетки не только в фазах G0/G1, S, G2, М клеточного цикла, но и отдельно в метафазе и анафазе митоза, а также выход клеток из митоза в псевдо-Gi динамики с содержанием ДНК, равным 4С при нарушении хромосомной динамики (Шатрова и др., 2001).

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Шатрова, Алла Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Механическая прочность межхромосомных связей в агрегатах соизмерима с прочностью индивидуальных хромосом.

2. Агрегаты хромосом возникают в митотической клетке до перехода из метафазы в анафазу, что подтверждается уменьшением относительного количества агрегатов с уменьшением количества хромосом при анализе кинетики прохождения фаз митоза.

3. Агрегаты хромосом не являются методическим артефактом, имеют специфический профиль распределения, а характер связей хромосом в агрегатах является случайным и равновероятным.

4. Ингибиторы топоизомеразы II этопозид и амсакрин, стабилизирующие комплекс ДНК-фермент, вызывают нарушения нормального прохождения клетками митоза и индуцируют их переход в псевдо-б1 с содержанием ДНК, равным 4С, из метафазы митоза, что подтверждается полным отсутствием анафазных клеток в обработанных ингибиторами образцах.

5. Каталитический ингибитор топо II 1СРР-193 вызывает переход клеток в псевдо^ с содержанием ДНК, равным 4С, не из метафазы, а из анафазы митоза, что подтверждается наличием фракции анафазных клеток в анализируемых образцах.

6. В присутствии кофеина и 1СРР-193 клетки входят в митоз и, минуя анафазу, выходят псевдо-С1 с содержанием ДНК, равным 4С. а задержанные на границе вг-М действием 101^-193, минуя митоз, переходят в псевдо-С1 из фазы ■

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шатрова, Алла Николаевна, Санкт-Петербург

1. Зенин В.В., Аксенов Н.Д, Шатрова А.Н., Клопов Н.В., Крам Л.С., Полетаев А.И. 1999. Устройство для предобработки образца при анализе методом проточной цитометрии. Биофизика. 44 (вып.2):303-312.

2. Зенин В.В., Аксенов Н.Д, Шатрова А.Н., Клопов Н.В., Полетаев А.И. 1998. Флуориметрический анализ в потоке хромосомных наборов клеток человека. Материалы восьмой всесоюзной итоговой конференции «Геном человека 98». Москва, Черноголовка, с. 37.

3. Зенин В.В., Клопов Н.В., Дробченко Е.А., Аксенов Н.Д., Шатрова А.Н., Полетаев А.И. 2001. Анализ митоза с помощью однопараметрической цитофлуориметрии в потоке. Биологические мембраны. 18(3):207-215.

4. Зыбина Е.В., Зыбина Т.Г., Исакова Г.К., Кикнадзе И.И. 1994. Полиплоидные митозы в клетках трофобласта норки. Цитология. 36(8):869-873.

5. Куницкая Е.Л., Сухих Т.П., Мамаева С.Е. 1998. Изменение характера и частоты хромосомных ассоциаций в лимфоцитах периферической крови человека при действии колцемида. Цитология. 40(7):682-685.

6. Лихачева Е.В., Богачев С.С. 2000. Белки ламины и их функции в динамике клеточного цикла. Биологические мембраны. 17(5):453-463.

7. Фогель Ф., Мотульски А. 1989. Генетика человека. М.:Мир. 1:308 с.

8. Шатрова А.Н., Аксенов Н.Д., Зенин В.В. 2001. Изучение влияния ICRF-193 на прохождение клетками митоза методом цитометрии в потоке. Международный симпозиум «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург, Цитология. 43:902-903.

9. Шатрова А.Н., Аксёнов Н.Д., Зенин В.В., Полетаев А.И. 1996. Использование лизолецитина для получения хромосом. Цитология. 38(1 ):95-101.

10. Шатрова А.Н., Аксёнов Н.Д., Тесленко J1.В., Зенин В.В. 1994. Фракционирование хромосом в градиенте плотности сахарозы для последующей проточной сортировки. Цитология. 36(7):708-712.

11. Якубовская Е.А., Габибов А. Г. 1999. Топоизомеразы. Механизмы изменения топологии ДНК. Молекулярная биология. 33 (3):368-384.

12. Anderson H.J., de Jong G., Vincent I., Roberge M. 1998. Flow cytometry of mitotic cells. Exp. Cell Res. 238:498-502.

13. Andoh Т., Ishida R. 1998. Catalytic inhibitors of DNA topoisomerase II. Biochem. biophys. acta. 1400:155-171.

14. Andreassen P.R., Margolis R.L. 1991. Induction of partial mitosis in BHK cells by 2-aminopurine. J. Cell Sci. 100:299-310.

15. Andreassen P.R., Margolis R.L. 1992. 2-aminopurine overrides multiple cell cycle checkpoints in BHK cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2272-2276.

16. Andreassen P.R., Martineau S.N., Margolis R.L. 1996. Chemical induction of mitotic checkpoint override in mammalian cells results in aneuploidy following a transient tetraploid state. Mutat. Res. 372:181-194.

17. Ardito G., Lamberti L., Brogger A. 1978. Satellite associations of human acrocentric chromosomes identified by treatment at metaphase. Ann. Hum. Genet. 41:455-462.

18. Ashley T. 1979. Specific end to end attachment of chromosomes in Ornithogalum virens. J. Cell. Sci. 38:357-367.

19. Austin C.A., Marsh K.L. 1998. Eukaryotic DNA topoisomerase II p. BioEssays. 20:215-226.

20. Barbiero G., Duranti F., Bonelli G., Amenta J.S., Baccino F.M. 1995. Intracellular ionic variations in the apoptotic death of L cells by inhibitors of cell cycle progression. Exp. Cell Res. 217:410-418.

21. Berger J.M. 1998. Structure of DNA topoisomerases. Biochem. Biophys. acta. 1400:3-18.

22. Blasina A., Price B.D., Turenne G.A. 1999. Caffeine inhibits the checkpoint kinase ATM. Curr. Biol. 9:1135-1138.

23. Bojanowski K., Maniotis A.J., Plisov S., Larsen A.K., Ingber D.E. 1998. DNA Topoisomerase II can drive changes in higher order chromosome architecture without enzymatically modifying DNA. J.Cell.Biochem. 69:127-142.

24. Burden D.N., Osheroff N. 1998. Mechanism of action of eukaryotic topoisomerase II and drugs targeted to the enzyme. Biochem. Biophys. acta. 1400:139-154.

25. Burke B. 1990. On the cell-free association of lamins A and C with metaphase chromosomes. Exp.Cell Res. 186:169-76.

26. Charron M., Hancock R. 1991. Chromosome recombination and defective genome segregation induced in Chinese hamster cells by the topoisomerase II inhibitor VM-26. Chromosoma. 100:97-102.

27. Chen M, Beck W.T. 1995. Differences in inhibition of chromosome separation and G2 arrest by DNA topoisomerase II inhibitors merbarone and VM-26. Cancer Res. 55:1509-1516.

28. Christensen M.O., Larsen M.K., Barthelmes H.U., Hock R., Andersen C.L., Kjeldsen E., Knudsen B.R., Westergaard O., Boege F., Mielke C. 2002. Dynamics of human DNA topoisomerases II a and II |3 in living cells. J. Cell Biol. 157:31-44.

29. Cimini D., Antoccia A., Tanzarella C., Degrassi F. 1997. Topoisomerase II inhibition in mitosis produces numerical and structural chromosomal aberrations in human fibroblasts. Cytogenet. Cell Genet. 76:61-67.

30. Clarke D.J., Gimenez-Abaian J.F. 2000. Checkpoints controlling mitosis. BioEssays. 22:351-363.

31. Clarke D.J., Johnson R.T., Downes C.S. 1993. Topoisomerase II inhibition prevents anaphase chromatid segregation in mammalian cells independently of the generation of DNA strand breaks. J. Cell Sci. 105:563-569.

32. Deming P.B., Cistulli C.A., Zhao H., Graves P.R., Piwnica-Worms H., Paules R.S., Downes C.S., Laufmann W.K. 2001. The human decatenation checkpoint. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:12044-12049.

33. Deplanque G., Vincent F., Mah-Becherel M.C.M., Cazenave J-P, Bergerat J-P., Klein-Soyer C. 2000. Caffeine does not cause override of the G2/M blockinduced by UV or gamma radiation in normal human skin fibroblasts. British J. of Cancer. 83:346-353.

34. Diffley J.F.X., Evan G. 2000. Oncogenes and cell proliferation. Cell cycle, genome integrity and cancer-a millennial view. Curr. Opin. Genet. Dev. 10:1316.

35. Dolbeare F., Gratzner H., Pallavinci M.G., Gray J.W. 1983. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:5573-5577.

36. Downes C.S., Clarke D.J., Mullinger A.M., Gimenez-Abian J.F., Creighton A.M., Johnson R.T. 1994. A topoisomerase ll-dependent G2 cycle checkpoint in mammalian cells. Nature. 372:467-470.

37. Downes C.S., Mullinger A.M., Jonson R.T. 1991. Inhibitors of topoisomerase II prevent chromatid separation in mammalian cells, but do not prevent exit from mitosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8895-8899.

38. DuPraw E.J. 1966. Evidence for a "folded-fiber" organization in human chromosomes. Nature (Lond.) 209:577-581.

39. Earnshaw W.C., Halligan B, Cooke C.A., Heck M.M.S., Lin L.F. 1985. Topoisomerase II is a structural component of mitotic chromosome scaffold. J. Cell Biol. 100:1706-1715.

40. Earnshaw W.C., Heck M.M.S. 1985. Localisation of topoisomerase II in mitotic chromosomes. J.Cell Biol. 100:1716-1725.

41. Edgar B.A., Orr-Weaver T.L. 2001. Endoreplication Cell Cycles: More for Less. Cell. 105:297-306.van den Engh G., Trask B., Cram S., Bartholdi M. 1984. Preparation of chromosome suspensions for flow cytometry. Cytometry. 5:108-117.

42. Erenpreisa J., Cragg M.S., 2001. Mitotic death: a mechanism of survival? Cancer Cell Int. 1:1 (http://www.cancerci.c0m/c0ntent/l/l/l).

43. Giaretti W., Nusse M., Bruno S., Di Vinci A., Giedo E. 1989. A new method to discriminate Gi, S, G2, M, and Gi postmitotic cells. Exp. Cell Res. 182:290295.

44. Gimenez-Abian J.F., Clarke D.J, Devlin J., Gimenez-Abian M.I., De la Torre C., Johnson R.T., Mullinger A.M., Downes C.S. 2000. Premitotic chromosome individualization in mammalian cells depends on topoisomerase II activity. Chromosoma. 109:235-244.

45. Gong J., Traganos F., Darzynkiewicz Z. 1993. Simultaneous analysis of cell cycle kinetics at two different DNA ploidy levels based on DNA content and cyclin B measurements. Cancer Res. 53:5096-5099.

46. Gong J., Traganos F., Darzynkiewicz Z. 1995. Discrimination of G2 and mitotic cells by flow cytometry based on different expression of cyclins A and B1. Exp. Ceil Res. 220:226-231.

47. Grue P., GralSer A., Sehested M., Jensen P.B., Uhse A., Straub T., Ness W., Boege F. 1998. Essential mitotic functions of DNA topoisomerase Hot are not adopted by topoisomerase lip in human H69 cells. J.Biol.Chem. 273:3366033666.

48. Hallowes R.C., West D.G., Hellmann K. 1974. Cumulative cytostatic effect of ICRF-159. Nature. 247:487-491.

49. Hande K.R. 1998. Clinical applications of anticancer drugs targeted to topoisomerase II. Biochem. biophys. acta. 1400:173-184.

50. Hens I., Kirsch-Volders M., Verschaeve L., Susanne C. 1982 The central localization of the small and early replicating chromosomes in human diploid metaphase figures. Hum. Genet. 60:249-256.

51. Hernandez-Verdun D., Gautier T. 1994. The Chromosome Periphery. BioEssays. 16:179-185.

52. Hossain M.S., Akimitsu N., Takaki T„ Hirai H., Sekimizu K. 2002. ICRF-193, a catalytic inhibitor of DNA topoisomerase II, inhibits re-entry into the cell division cycle from quiescent state in mammalian cells. Genes Cells. 7:285-294.

53. Jensen L.H., Nitiss K.C., Rose A., Dong J., Zhou J., Hu T., Osheroff N., Jensen P.B., Sehested M., and Nitiss J.L. 2000. A novel mechanism of cell killing by anti-topoisomerase II bisdioxopiperazines. J. Biol. Chem. 275:21372146.

54. Jaroszeski M.J., Radcliff G. 1999. Fudamentals of flow cytometry. Mol. Biotechnol. 11:37-53.

55. Juan G., Traganos F., Darzynkiewiez Z. 2001. Methods to identify mitotic cells by flow cytometry. Methods Cell Biol. 63:343-354.

56. Kaufmann S.H. 1998. Cell death induced by topoisomerase-targeted drugs: more questions than answers. Biochem. biophys. acta. 1400:195-211.

57. Kaufmann W.K., Kies P.E. 1998. DNA signals for G2 checkpoint response in diploid human fibroblasts. Mutat. Res. 400:153-167.

58. Kingma P.S., Osheroff N., 1998. Apurinic sites are position-specific topoisomerase ll-poisons. J. Biol. Chem. 272:1148-1155.

59. Kingma P.S., Osheroff N., 1998. Spontaneous DNA damage stimulates topoisomerase ll-mediated DNA cleavage. J. Biol. Chem. 272:7488-7493.

60. Kirsch-Volders M., Cundari E., Verdoodt B. 1998. Towards a unifying model for the metaphase/anaphase transition. Mutagenesis. 13:321-335.

61. Korf B.R., Diacumakos E.G. 1977. Random arrangement of mitotic chromosomes in radial metaphases of Indian muntjac. Cytogenet. Cell Genet. 19:335-343.

62. Korf B.R., Diacumakos E.G. 1978. Microsurgically-extracted metaphase chromosomes of the Indian muntjac examined with phase contrast and scanning electron microscopy. Exp. Cell Res. 111:83-93.

63. Maniotis A.J., Bojanowski K, Ingber D.E. 1997. Mechanical continuity and reversible chromosome disassembly within intact genomes removed from living cells. J. Cell. Biochem. 65:114-130.

64. Molinari M. 2000. Cell cycle checkpoints and their inactivation in human cancer. Cell prolif. 33:261-274.

65. Morrist S.K., Baird C.L., Lindsley J. 2000. Steady state and rapid kinetic analysis of topoisomerase II trapped as the closed-clamp intermediate by ICRF-193. J. Biol. Chem. 275:2613-2618.

66. Mosgoller W., Leitch A.R., Brown J.K., Heslop-Harrison J.S. 1991. Chromosome arrangements in human fibroblasts at mitosis. Hum. Genet. 88:27-33.

67. Munoz P., Baus F., Piette J. 2001. Ku antigen is required to relieve G2 arrest caused by inhibition of DNA topoisomerase II activity by the bisdioxopiperazine ICRF-193. Oncogene. 20:1990-1999.

68. Myhra S, Brogger A. 1975. Interchromosomal DNA-containing fibers in human cells. Humangenetik. 29:183-189.

69. Nagele R., Freeman T., Fazekas J., Lee K.M., Thomson Z., Lee H.Y. 1998. Chromosome spatial order in human cells: evidence foe early origin and faithful propagation. Chromosoma. 107:330-338.

70. Nagele R., Freeman T., McMorrow L., lee H.Y. 1995. Precise spatial positioning of chromosomes during prometaphase: evidence for chromosomal order. Science. 270:1831-1835.

71. Nasmyth K., Peters J.M., Uhlmann F. 2000. Splitting the chromosome: cutting the ties that bind sister chromatids. Science. 288:1379-1384.

72. Nitiss J.L. 1998. Investigating the biological functions of DNA topoisomerases in eukaryotic cells. Biochem. biophys. acta. 1400:63-81.

73. Nitiss J.L., Lin Y.X., Harbury P., Jannatipour M., Wasserman R., Wang J.C. 1992. Amsacrine and etoposide hypersensitivity of yeast cells overexpressing DNA topoisomerase II. Cancer Res. 52:4467-4472.

74. Nusse M, Julch M., Geido E., Bruno S., Di Vinci A., Giaretti W., Ruoss K. 1989. Flow cytometric detection of mitotic cells using the bromodeoxyuridine/DNA technique in combination with 90 degrees and forward scatter measurements. Cytometry. 10: 312-319.

75. Nusse M., Beisker W., Hoffman C., Tamok A. 1990. Flow cytometric analysis of Gi- and G2/M-phase subpopulations in mammalian cell nuclei using side scatter and DNA content measurements. Cytometry 11:813-821.

76. Parry D.H., O'Farrell P.H., 2001. The shedule of destruction of three mitotic cyclins can dictate the timing of events during exit from mitosis. Curr. Biol. 11:671-683.

77. Patel S., Jazrawi E., Creighton A.M., Austin C.A., Fisher L.M. 2000. probing the interaction of the cytoxic bisdioxopiperazine ICRF-193 with the closed clamp of human topoisomerase II a. Mol. Pharmacol. 58:560-568.

78. Pérez C., Pelayo F., Vilaboa N.E., Aller P. 1994. Caffeine attenuates the action of amsacrine and etoposide in U-937 cells by mechanisms which involve inhibition of RNA synthesis. Int. J. Cancer. 57:889-893.

79. Pines J., Rieder C.L. 2001. Re-staging mitosis: a contemporary view of mitotic progression. Nature Cell Biol. 3:E3-E6 (http://cellbio.nature.com).

80. Poljak L., Kás E. 1995. Resolving the role of topoisomerase II in chromatin structure and function. Trends Cell Biol. 5:348-354.

81. Powell S.N., DeFrank J.S., Connel P., Eogan M., Preffer F., Dombkowski D., Tang W., Friend S. 1995. Differential sensitivity of p53H and p53(+) cells to caffeine-induced radiosensitization and override of G2 delay. Cancer Res. 55:1643-1648.

82. Rieder C.L., Cole R.W. 1998. Entry into mitosis in vertebrate somatic cells is guarded by a chromosome damage checkpoint that reverses the cell cycle when triggered during early but not late prophase. J. Cell Biol. 142:1013-1022.

83. Runder A.D., Murray A.W. 1996. The spindle assembly checkpoint. Curr. Opin. Cell Biol. 8:773-780.

84. Sarkaria J.N., Eshleman J.S. 2001. ATM as a target for novel radiosensitizers. Semin. Radiat. Onkol. 11:316-327.

85. Sato M„ Ishida R„ Ohsumi K„ Narita T„ Andoh T. 1997. DNA topoisomerase II as the cellular target of a novel antitumor agent ICRF-193, abisdioxopiperazine derivative, in Xenopus egg exstract. Biochem. Biophys. Res. Commun. 235:571-575.

86. Sharp H.B.A., Field E.O., Hellmann K. 1970. Mode of action of the cytostatic effect of 'ICRF-159'. Nature. 226:524-526.

87. Simili M., Pellerano P., Pigullo S., Tavosanis G., Ottaggio L., de Saint-Georges L., Bonatti S. 1997. 6DMAP inhibition of early cell cycle events and induction of mitotic abnormalities. Mutagenesis. 12:313-319.

88. Smits V.A.J., Medema R.H. 2001. Checking out the G2/M transition. Biochim. biophys. acta. 1519:1-12.

89. Sramkoski R.M., Wormsley S.W., Bolton W.E., Crumpler D.C., Jacobberger J.W. 1999. Simultaneous detection of cyclin B1, p105, and DNA content provides complete cell cycle phase fraction analysis of cells that endoreduplicate. Cytometry. 35:274-283.

90. Sugimoto K., Yamada K., Egashira M., Yazaki Y., Hirai H., Kikuchi A., Oshimi K. 1998. Temporal and spatial distribution of DNA topoisomerase II alters during proliferation, differentiation, and apoptosis in HL-60 cells. Blood. 91:1407-1417.

91. Sumner A.T. 1992. Inhibitors of topoisomerases do not block the passage of human lymphocyte chromosomes through mitosis. J. Cell Sci. 103:105-115.

92. Sumner A.T. 1995. Inhibitors of topoisomerase II progress through mitosis and induce a doubling of the DNA content in CHO cells. Exp. Cell Res. 217:440-447.

93. Sumner A.T. 1996. The distribution of topoisomerase II on mammalian chromosomes. Chromosoma Res. 4:5-14.

94. Sumner A.T. 1998. Induction of diplochromosomes in mammalian cells by inhibitors of topoisomerase II. Chromosoma 107:486-490.

95. Sun H.B, Yokota H. 1999. Correlated positioning of homologous chromosomes in daughter fibroblast cells. Chromosome. Res. 7:603-610.

96. Takahashi M. 1996. A Fractal-like Geometry of the Nucleus and its reproduction: A Hypothesis. A Genomic Theory of the Tumor Cell Cycle. Ube. Japan. 1:265 p.

97. Tanabe K., Ishida R., Andoh T. 1991. Inhibition of topoisomerase II by antitumor agents bis(2,6-dioxopiperazine) derivatives. Cancer Res. 51: 49034908.

98. Van Hooser A., Goodrich D.W., Allis C.D., Brinkley B.R., Mancini M.A. 1998. Histone H3 phosphorylation is required for the initiation, but not maintenance, of mammalian chromosome condensation. J. Cell Sci. 111:3497-3506.

99. Verdoodt B., Decordier I., Geleyns K., Cunha M., Cundari E., Kirsch-Volders M. 1999. Induction of polyploidy and apoptosis after exposure to high concentrations of the spindle poison nocodazole. Mutagenesis. 14:513-520.

100. Wang S., Norbury C., Harris A.L., Toda T. 1999. Caffeine can override the S-M checkpoint in fission yeast. J. Cell Sci. 112:927-937.

101. Webb C D., Latham M.D., Lock R.B., Sullivan D.M. 1991. Attenuated topoisomerase II content directly correlated with a low level of drug resistance in a Chinese hamster ovary cell line. Cancer Res. 51 -.6543-6549.

102. Widrow R.J., Laird C.D. 2000. Enrichment for submitotic cell populations using flow cytometry. Cytometry. 39:126-130.

103. Wollenberg C., Kiefaber M.P., Zang K.D. 1982. Quantitative studies on the arragement of human metaphase chromosomes. IX. Arrangement of chromosomes with and without spindle apparatus. Hum. Genet. 62:310-315.

104. Zechiedrich EL, Osheroff N. 1990. Eukaryotic topoisomerases recognize nucleic acid topology by preferentially interacting with DNA crossovers. EMBO J. 9:4555-62.

105. Zieve G.W, Turnbull D., Mullins J.M., Mcintosh J.R. Z. 1980. Production of large numbers of mitotic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Exp. Cell Res. 126:397-405.

106. Zucker R.M., Elstein K.H., Easterling R.A., Massaro E.J. 1988. Flow cytometric discrimination of mitotic nuclei by right-angle scatter. Cytometry. 9:226-231.