Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетический анализ динамики реализации структурных аберраций хромосом в митозе

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетический анализ динамики реализации структурных аберраций хромосом в митозе"

Р г & од

О 5 Ш 1393

^^ На правах рукописи

УДК 576.316:576.353.25:599.323.4.

АХМАМЕТЬЕВА Елена Михайловна

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДИНАМИКИ РЕАЛИЗАЦИИ СТРУКТУРНЫХ АБЕРРАЦИЙ ХРОМОСОМ В МИТОЗЕ

Генетика - 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1997

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Лебедева Л.И. Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, профессор

Жимулев И.Ф. Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Акифьев А.П. Институт химической

физики им. H.H. Семенова РАН, г. Москва

Ведущее учреждение: Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова

РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится "2/" АМ&АЛ 1991 года на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан " * 0£/иг&1А 199? г.

Ученый секретарь

диссертационного совета __

доктор биологических наук А.Д.Груздев

Актуальность темы. В современных условиях нарастания генотоксиче-ских факторов среды возрастает актуальность проблем мутагенеза. Одним из последствий воздействия таких факторов на клетки являются аберрации (структурные мутации или перестройки) хромосом. Они играют важную роль в эволюции эукариотических организмов и репродуктивной гибели клеток, могут быть одной из причин наследственных болезней и канцерогенеза у человека. Аберрации хромосом широко используются для оценки генетического риска различных мутагенных факторов среды (Бочков, Чеботарев, 1989; Шевченко, 1995). Вместе с тем механизмы их возникновения изучены недостаточно.

Общепризнано, что мутагены вызывают потенциальные повреждения (ПП), которые в условиях активного метаболизма превращаются в структурные аберрации. Важную роль при этом играют процессы репликации и репарации ДНК (Дубинин, 1994; Kimball et all, 1959; Bender et al., 1974; Akifyev, 1995). Однако неясно, влияют ли репликация и репарация на промежуточные превращения ПП или на окончательную реализацию их в мутации. Одно из решений этого вопроса связано с установлением периода необратимой реализации (фиксации) аберраций в митотическом цикле.

В работах Л.И.Лебедевой и В.Л.Чубыкина (1975, 1983) было показано, что существуют два механизма фиксации аберраций, один из которых действует в интерфазе (он характерен для спонтанного мутагенеза), а другой -при митозе (он характерен для индуцированного мутагенеза). В частности, реализация подавляющего числа радиационно-индуцированных аберраций происходит в митозе.

Представление о важной роли митоза в реализации радиационно-индуцированных аберраций является новым. Имея в виду дальнейшую разработку экспериментально-теоретической модели хромосомного мутагенеза, мы продолжили изучение динамики необратимого образования перестроек хромосом в митотическом цикле.

Цель и задачи исследования. Основой для постановки исследования явилась гипотеза Л.И.Лебедевой и В.Л.Чубыкина (1975) о существовании двух классов перестроек хромосом, различающихся стадией реализации в клеточном цикле. Целью данной работы было дальнейшее изучение закономерностей реализации двух классов перестроек хромосом при спонтанном и индуцированном мутагенезе. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Изучить динамику реализации радиационно-индуцированных ПП в аберрации хромосом во время митоза и выяснить, с какими специфическими процессами митоза сопряжена реализация аберраций.

2) Выяснить, влияет ли применяемая в цитогенетической практике колхицино-во-гипотоническая обработка на реализацию аберраций в митозе.

3) Используя представления о реализации ПП в аберрации хромосом во время митоза, изучить динамику репарации радиационно-индуцированных ПП в зависимости от дозы и времени после облучения.

4) Изучить влияние клеточного осциллятора на реализацию аберраций в митозе и в интерфазе.

5) Изучить кластогенный эффект применяемых в микрохирургии глаза импульсных УФ-эксимерных лазерных излучений с длинами волн 248 нм, 223 нм и 193 нм.

Научная новизна. Впервые показано увеличение частоты радиационно-индуцированных перестроек хромосом по мере разъединения сестринских хроматид в митозе.

Впервые изучено влияние ингибиторов топоизомеразы II: кофеина (в больших концентрациях) и налидиксовой кислоты, - на реализацию структурных аберраций хромосом в митозе. Высказано предположение об участии топоизомеразы II в реализации структурных аберраций.

Впервые показано, что колхициново-гипотоническая обработка клеток в метафазе приводит к изменению спектра аберраций: увеличению частоты разрывов и уменьшению частоты обменов хромосом.

Впервые цитогенетическими методами изучена динамика репарации ПП в. зависимости от дозы и времени после облучения. Показано, что ионизирующие излучения вызывают два типа ПП, различающиеся скоростью репарации. Определено соотношение между частотами двух типов ПП в зависимости от дозы и времени после облучения. Полученные данные использованы для возможного объяснения немонотонной зависимости частоты аберраций от дозы облучения.

Впервые показано, что при радиационно-индуцированном мутагенезе возникновение разрывов хромосом в интерфазе сопряжено с активацией ос-цилляторного процесса блокирования клеток в Эг периоде. Поскольку разрывы хромосом в интерфазе характерны для спонтанного мутагенеза, высказано

предположение, что их возникновение тоже связано с функционированием клеточного осциллятора.

Впервые изучены цитогенетические эффекты УФ-эксимерных лазерных излучений на роговицу глаза млекопитающих (мыши). Показано кратковременное и относительно небольшое увеличение частоты разрывов хромосом в интерфазе в роговице облученного глаза, не выходящее за пределы индивидуальных колебаний частоты спонтанных разрывов хромосом.

Практическая ценность. На примере эффектов ионизирующих и лазерных УФ-излучений с длинами волн 248, 223 и 193 нм показано, что дифференциальный анализ двух классов структурных аберраций хромосом увеличивает разрешающую способность цитогенетических методов при генетическом мониторинге и скрининге факторов среды на мутагенную активность. Результаты исследования были использованы при клинических испытаниях разработанной в Институте теплофизики СО РАН офтальмологической установки на основе эксимерного лазера. Методы исследования могут быть рекомендованы для изучения мутагенной активности также других факторов.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Всесоюзном рабочем совещании "Механизмы радиационного мутагенеза", Москва, 1988; на 1 Всесоюзном радиобиологическом съезде, Москва, 1989; представлены тезисами на научной конференции "Актуальные проблемы радиационной биологии и радиационной генетики", Обнинск, 1990; на 2 Международном симпозиуме "Механизмы действия сверхмалых доз", Москва, 1995. Материалы диссертации докладывались на отчетных научных сессиях ИЦиГ, Новосибирск, 1986, 1991, 1996.

Публикации. Приведенные в диссертации результаты изложены в десяти публикациях; шести научных статьях, трех тезисах докладов и одном препринте.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, пяти глав, включающих результаты и обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 19 рисунков.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на клетках костного мозга и роговице 1,5-2-месячных самцов и самок мышей линии BALB и беспородных.

Рентгеновское облучение проводили на РУП 150/300 при мощности дозы 0,1 Гр/мин; 180 кВ; 1,5 мА; Змм AL. Гамма-облучение проводили на установках ГУБЭ 4000 и ИГУР-1 (Е(,з7 cs=0,7 Мэв) при мощности дозы 1,8 Гр/мин. Лазерные облучения проводили на разработанной в ИТ СО РАН установке, основным элементом которой является импульсный газоразрядный УФ экси-мерный лазер, обеспечивающий эффективную генерацию на молекулах ArF (А. = 193 нм), KrCI (223 нм) и KrF (248 нм). Длительность импульса 5 не. Мощность в зависимости от длины волны составляла 5-10 МВт. Плотность энергии излучения на поверхности роговицы в ходе экспериментов меняли в пределах 0,015-1,5 Дж (см2 имп)"1 для длины волны 248 нм, 0,027-0,04 Дж (см2 имп)'1 для 223 нм и 0,3-0,9 Дж (см2 имп)'1 для 193 нм. Площадь пятна с максимальной плотностью энергии 0,001 см2. Дозу воздействия определяли как произведение плотности энергии в одном импульсе на число импульсов.

Перестройки хромосом анализировали тремя методами. В к-метафазе учитывали обмены хромосом и разрывы, сопровождавшиеся удаленными, сдвинутыми или перевернутыми ацентриками. В метафазе без применения колхициново-гипотонической обработки учитывали ацентрики, располагавшиеся вне экваториальной пластинки (внеэкваториальные ацентрики); считали, что они образуются при разрывах хромосом в интерфазе (Лебедева, Чу-быкин, 1Э75). В постметафазной стадии (анафазе) учитывали транслокационные мосты и ацентрические фрагменты хромосом.

Учет структурных аберраций в роговице глаза. К-метафазный метод приготовления хромосомных препаратов оказался непригодным для роговицы, поэтому учитывали внеэкваториальные ацентрики в метафазе и аберрации в анафазе.

Экспериментальные данные обрабатывали статистически по методу Стьюдента и Фишера с ср-преобразованием. При сравнении частот аберраций в к-метафазе и анафазе использовали критерий Кохрена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

С целью выяснить, с какими специфическими процессами митоза связана необратимая реализация аберраций, на клетках костного мозга самцов BALB была изучена частота структурных аберраций на разных стадиях разъединения сестринских хроматид в митозе.

В к-метафазе различали три стадии разъединения сестринских хроматид: 1) стадия неразъединенных сестринских хроматид (прометафаза), 2) стадия частичного разъединения сестринских хроматид (разъединение не во всех хромосомах или не по всей длине хромосом) и 3) стадия полного разъединения сестринских хроматид.

При обеих изученных дозах 50 и 150 сГр частота аберрантных клеток достоверно увеличивалась по мере разъединения сестринских хроматид от 14,1 до 23,0% при 50 сГр (Р>0,95), от 40,5 до 58,5% при 150 сГр (Р>0,99) (табл. 1).

Таблица 1.

Сравнительная динамика разъединения сестринских хроматид и реализации аберраций хромосом в к-метафазе

Разъединение сеет ринских хооматид Аберрантные клетки. %

Просмотрено клеток 1 2 3 Просмотрено клеток 1 г 3 1-3

Контроль 827 12,4 (10,214.6) 19,4 (16,7 -22,1) 68,2 (65,0 -. 71,4) 374 0 1.4 (0,01 -5,4) 1,1 (0,22,7) 1,1 (0,32,4)

Контроль + Кф 1409 32,3 (29,9 -34,7) 32,1 (29,7 -34,5) 35,7 (33,2 -38,2) 584 1,5 (0,3 -3.7) 1.1 (0,1 -3,1) 1,1 (0,1 -3,0) 1,2 (0,52,3)

Контроль + нк 73 15,1 (7.823,3) 20,8 (12,3 -30,1) 64,1 (53,1 -75,1) 73 0 0 2.2 (0,01 -8,3) 1,4 (0,01 -7,8)

50 сГр 1022 32,0 (29,2 -34,8) 25,1 (22,5 -27,7) 42,9 (39,9 -45,9) 230 14,1 (7,022,2) 22,0 (12,432,6) 29,0 (20,5 -37,8) 23,0 (17,6 -28,4)

50 сГр + Кф 485 36,7 (32,4 -41,0) 36,3"** (33,0 -40,6) 27,0*** (23,0 -31,0) 219 14,7 (7.323,1) 29,5 (18,840,9) 43,3* (33,1 -53,5) 30,6 (24,5 -36,7)

150 сГр 404 30,9 (26,4 -35,4) 37.4 (32,742,1) 31,7 (27,2 -36,2) 299 40,5 (30,0 -51,0) 49,1 (39,9 -58,3) 83,5 (76,4 -90,6) 58,5 (52,9 -64,1)

150 сГр + НК 201 53,7'** (46,8 -60,6) 32,8 (26.3 -39,3) 13,4*** (9,1 -18,1) 337 20,9*** (15,2 -27,0) 46,0 (37,3 -54,7) 79,5 (66,9 -92,1) 37,1*** (31,9 -42,3)

Примечание. Кф - кофеин, НК - налидиксовая кислота. В скобках указан 95% доверительный интервал. Символами * обозначена достоверность различий с вариантом облучения в

соответствующей дозе. * Р> 0,95, ** Р> 0,99. *** Р> 0,999.

Чтобы выяснить, связаны ли между собой процессы разъединения сестринских хроматид и реализации аберраций причинно или они только совпадают по времени, была использована модифицированная динамика разъединения сестринских хроматид.

Из литературы известно, что разъединение сестринских хроматид катализируется топоизомеразой II (Downess etal., 1994; Ishida et al., 1994), и что налидиксовая кислота и кофеин в больших концентрациях подавляют топо-изомеразу II (Suciu, 1990; Shin Cha-Gyun et al., 1990). Эти воздействия были применены нами во время митоза для модификации динамики разъединения сестринских хроматид. Из таблицы видно, что кофеин частично подавлял разъединение сестринских хроматид (вносил помехи в этот процесс) - это сопровождалось достоверным (Р> 0,95) увеличением числа аберрантных клеток на третьей стадии разъединения сестринских хроматид с 29,0 до 43,3% и качественным увеличением общей частоты аберрантных клеток с 23,0 до 30,6%. Налидиксовая кислота полностью блокировала разъединение хроматид. Одновременно достоверно уменьшалась частота аберрантных клеток от 58,5 до 37,1% (Р>0,999). Иными словами, в условиях неразъединения сестринских хроматид аберрации не возникали. Таким образом, опыты показали, что с изменением динамики разъединения сестринских хроматид изменяется и динамика образования радиационно-индуцированных структурных аберраций хромосом. Эти данные позволили сделать вывод о причинно-следственной связи между процессами разъединения сестринских хроматид и реализации радиационно-индуцированных аберраций хромосом. По-видимому, эта связь опосредуется через каталитическую активность топоизомеразы II. Налидиксовая кислота и кофеин не влияли на частоту спонтанных аберраций хромосом.

Сам факт возможности модифицирования во время митоза частоты радиационно-индуцированных аберраций поставил задачу выяснить, не влияет ли применяемая в цитогенетике колхицмново-гипотоническая обработка (КГ-обработка) на реализацию аберраций в митозе. Известно, что колхицин вызывает суперспирализацию хромосом, а гипотония нарушает межхромосомные и межхроматидные связи и таким образом способствует обособлению хромосом и хроматид. Вместе с тем, межхромосомные и межхроматидные контакты

необходимы для образования обменов, а по некоторым схемам, и для разрывов хромосом (Chadwick, Leenhouts, 1.981; Savage, Harvey, 1991; Akifyev, 1995).

Мы изучили влияние КГ-обработки на частоту межхромосомных контактов и перестроек хромосом в клетках костного мозга самок BALB. Различали клетки, в которых все хромосомы плотно контактировали между собой, клетки, в которых одни хромосомы лежали обособленно, а другие контактировали, и клетки, в которых все хромосомы лежали обособленно. В подавляющем числе клеток, не подвергавшихся КГ-обработке, обособленных хромосом не было. После КГ-обработки их число составляло около 80%. Параллельно с изменениями в межхромосомных контактах менялся спектр радиационно-индуциро-ванных перестроек хромосом. После КГ-обработки уменьшалась частота клеток с дицентриками и увеличивалась частота клеток с разрывами хромосом (рис. 1 и 2). Мы обратили внимание, что при отсутствии КГ-обработки число клеток с дицентриками резко возрастало при дозах 75 сГр и выше, то есть при

Рис. 1. Зависимость частоты клеток со структурными аберрациями (левая ордината, %, кривые 2-4) и числа ацентриков, приходящихся на клетку с ацентриками (правая ордината, кривая 1) от дозы излучения. По оси абсцисс - доза облучения, Гр. 2 - мосты с ацентриками при отсутствии КГ-обработки (К~Г~), 3 - все типы обменов при КГ-обработке (К*Г*), 4 - дицентрики при К*Г*. А - анализ в анафазе (при К' Г'), М - в метафазе (при К*Г*). Чертой около соответствующих значков обозначена достоверность различий между вариантами К'Г~ и К* Г*: одна черта - Р> 0,95, две - Р > 0,99, три - Р > 0,999.

025 aso a?s ш us 150 Доза, Гр

Д о за, Г р

Рис. 2. Влияние КГ-обработки (К*Г*) на частоту ацентрических фрагментов хромосом в клетках костного мозга Х-облученных мышей ВА1В.

дозах, при которых в вариантах с КГ-обработкой в клетке в среднем было не менее двух разрывов. Иными словами, с появлением второго разрыва в клетке в условиях КГ-обработки возрастала вероятность образования обмена при отсутствии колхицина и гипотонии. Расчеты, результаты которых приведены в таблице 2, свидетельствовали о том, что практически каждые два разрыва, учтенные при КГ-обработке, по-видимому, взаимодействовали между собой и приводили к образованию обмена в условиях без колхицина и гипотонии. Это позволило предположить, что районы межхромосомных контактов, имеющих место в период митоза, являются наиболее радиочувствительными участками хромосом, преимущественно вовлекаемыми в перестройки при ионизирующих облучениях. По-видимому, в условиях межхромосомного контактирования появляется возможность для рекомбинационного репарирования ПП (двуните-вых разрывов ДНК). Существующие схемы рекомбинационной репарации (например, ВеБгнск, 1976) предполагают, что репарация разрывов ДНК происходит в условиях межхромосомного контактирования и образования временного

гетеродуплекса. Мы полагаем, что обособление хромосом и хроматид в митозе нарушает рекомбинационную репарацию на ее промежуточных этапах. Следствием нарушения репарации является возникновение аберраций.

Таблица 2

Экспериментальные и ожидаемые частоты клеток с мостами с ацентриками при К'Г

Частота клеток с мостами с ацентриками, %

Доза, Гр ожидаемая в вариантах

экспериментальная 1 2а 26 3

0 0 0 0 0 0,2

0,25 3,1 (1,5-5,2) 1,4 2,4 4,6 2,3

0,50 5,7 (3,4-8,5) 1,8 3,9 6,7 4,4

0,75 15,0 (10,7-19,8) 8,1 11,1 17,5 10,1

1,00 24,1 (17,5-31,3) 11,1 18,6 21,8 16,1

1,50 43,6 (36,0-51,2) 23,3 40,4 43,4 35,2

Дисперсия 155,50 11,89 2,97 32,19

Примечание. В скобках указан 95%-ный доверительный интервал. Вариант 1 - любой разрыв изохроматидного типа считали за один. 2 - каждый хромосомный разрыв считали за один, а изохроматидный за два. О природе разрывов судили по типам других перестроек в клетке (хромосомного или хроматидного типа). При наличии одного изохроматидного разрыва в клетке в варианте 2а все они отнесены к хромосомным, а в варианте 26 - к хроматидным.

Во всех вариантах отличие разности от нуля по критерию Стьюдента недостоверно. Вместе с тем различие между дисперсиями по критерию Кохрена значимо при Р>0,99. С экспериментальными данными наилучшим образом согласуется вариант 26. Варианты 3 и 1, достоверно отличающиеся от него по критерию Фишера (соответственно Рг0,95, Р>0,99), маловероятны.

Поскольку реализация значительного числа радиационно-индуцирован-ных аберраций осуществляется в митозе, то можно предположить, что репарация ПП в интерфазе является практически безаберрантным процессом. Исходя из этого можно ожидать, что пролонгирование интерфазы в послелуче-вой период будет способствовать увеличению массы безошибочной репарации ДНК, и, соответственно, уменьшению числа структурных аберраций. Увеличение объема репарированной ДНК имело место в опытах по исследованию клеточного осциллятора (Marx, 1994; Smith et al., 1994) при так называемом вг-блоке - явлении индуцированного увеличения продолжительности G2 периода.

Протекторная роль вг-блока проявилась и в наших исследованиях по критерию перестроек хромосом. В послелучевой период частота аберраций хромосом в клетках костного мозга облученных самок ВА1.В сначала нарастала, а затем примерно через 1-2 ч после облучения начинала снижаться (рис. 3, кривая 2). В это время в деление вступали клетки, претерпевшие йг-блок.

Рис. 3. Динамика цитогенетических изменений в костном мозге мышей после тотального рентгеновского облучения в дозе 50 сГр. а, 1 - внеэкваториальные ацен-трики; а, 2 - структурные аберрации хромосом, учтенные в к-метафазе (светлые значки) и анафазе (темные значки); б - среднее число аберрантных хромосом на клетку с аберрациями; в - митотический индекс в контроле (темные значки) и после облучения (светлые значки). Около значков точками обозначена достоверность различий с контролем (О ч), чертой - с максимумом (1 ч). Одна черта (точка) -Р> 0,95, две - й 0,99, три - > 0,999. По оси абсцисс - продолжительность времени от начала облучения до фиксации, ч; по оси ординат: а - клетки с аберрациями, %, б - число аберрантных хромосом в клетке, в - делящиеся клетки, %0

Показано (Marx, 1994., Smith et al., 1994), что чувствительной мишенью, ответственной за С2-блок, являются повреждения ДНК. По нашим оценкам (Лебедева, Ахмаметьева, 1996), индукторами С2-блока являются ПП - двуни-тевые разрывы ДНК. Поэтому по числу клеток, претерпевавших йг-блок, определяли число клеток, в которых при облучении возникали ПП.

Зависимость частоты клеток с ПП от дозы облучения описывается кривой, приближавшейся к 100% уже при дозе 50 сГр (рис. 4). При всех дозах частота аберрантных клеток была ниже частоты клеток с ПП (ср. рис. 4 с рис. 5).

loo

10

6В.

25 50 75 /50

Рис. 4. Зависимость частоты клеток с ПП от дозы гамма-излучения. Темные символы - экспериментальные данные, светлые - получены путем экстраполяции данных из области доз 24-75 сГо по уравнению у = 7 - е°?По оси ординат - клетки с ПП, %; по оси абсцисс - доза излучения, сГо.

25 50 ?5 35 SO 75 tes 'So ¡,5 sa 75 t0(t /-5 ,5а г 5 so 7S юо /ЗГ ¡S0

Рис. 5. Зависимость частоты клеток со структурными аберрациями хромосом от дозы излучения. А-В - самцы, гамма-излучение; Г - самки, Х-излучение. А - фиксация через 70 мин после облучения, Б - 120 мин, В - 240 мин, Г - 640 мин. По оси абсцисс - доза излучения, сГо; по оси ординат - клетки с аберрациями, %'.

Следовательно, за время между облучением и фиксацией некоторое число клеток освобождалось от ПП вследствие репарации последних.

Вероятность освобождения клеток от ПП постепенно снижалась в после-лучевой период (табл. 3). Это свидетельствовало о снижении скорости репарации ПП.

По скорости репарации можно выделить два типа ПП: быстрорепарируемые (короткоживущие) и медленнорепарируемые (долгоживущие). При дозах 2475 сГр возникали преимущественно короткоживущие ПП и имела место их репарация. При дозах 125 и 150 сГр не выявлено репарации короткоживущих

ПП, и имела место только репарация долгоживущих ПП. При дозе 99 сГр возникали оба типа ПП и имели место два репарационных процесса - репарация короткоживущих ПП и репарация долгоживущих ПП (см. табл. 3). Активацией двух типов репарации объяснена повышенная толерантность клеток к облучению в области дозы 99 сГр (рис. 5).

Таблица 3.

Вероятность освобождения клеток от ПП за 1 ч

Тип излучения, пол \д т 24 51 75 99 126 150

у-лучи, самцы 70 0,396 0,276 0,218 0,294 0,127 0,04

„ * 120 0,256 0,200 0,131 0,085 0,102 -

" » 180 - - - - - 0,164

» - 240 0,085 0,111 0,016 0,192 0,216 -

Х-лучи, самки 640 0,061 0,087 0,051 0 - 0,023

И 1, 60 - 0,287 - - - -

„ 70 - 0,816 - - - -

„ „ 120 - 0,682 - - - -

» „ 160 - 0,114 - - - -

" » 240 - 0,108 - - - -

„ . 280 - 0,084 - - -

и „ 360 - 0 - - - -

» » 400 - 0,154 - - - -

» . 640 - 0 - - - -

Примечание. Т - продолжительность времени после облучения до фиксации, мин . Д - доза, сГр. По уравнению ч = (Га1 - ?а2>/ 1а\ 1 определена вероятность (ч) освобождения клеток от ПП за время 1 ч в разные интервалы времени, где 1ц и - частоты аберрантных клеток, цифрами 1 и 2 обозначена последовательность двух смежных фиксаций, в промежутке времени между которыми 0) определяли величину Ч. Для первой фиксации = <пп-

Следует отметить, что в наших экспериментах при вг-блоке имели место два противоположных процесса: с одной стороны, снижение частоты аберраций (рис. 3, кривая 2), реализующихся в митозе, и, с другой стороны, увеличение разрывов хромосом в интерфазе (рис. 3, кривая 1). Блокирование клеток в вг периоде, снижение частоты радиационно-индуцированных аберраций

хромосом, реализующихся в митозе, и увеличение частоты разрывов хромосом в интерфазе проявились как сопряженные процессы в описанных выше опытах (см. рис. 3) и в опытах с комбинированными воздействиями на клетки биологически активными веществами (брадикинин, гистамин) и излучениями. По результатам этих исследований сделан вывод, что разрывы хромосом, возникающие в интерфазе, являются одним из последствий действия протекторной системы, обеспечивающей через торможение митоза более полную репарацию тех ПП, которые могут инициировать перестройки хромосом в митозе.

D. «■/с.а

D, Д*/™2

Рис. 6. Зависимость частоты клеток со структурными аберрациями от дозы лазерного излучения, а) - при длине волны 248 нм, б) - 223 нм, в) - 193 нм. Плотность энергии излучения возрастала от 0,015 до 0,04 Дж/(сг/имп) при дозах до 1,5 Дж/см2, от 0,04 до 1,5 Дж/(см2имп) при дозах 3-18 Дж/см2. Светлые значки • анализ в анафазе, темные - в ыетафазе. Достоверность различий с общим контролем обозначена черточками: одна - Р > 0,95, две - Р > 0,99, тр и - Р > 0,999.

Поскольку спонтанные аберрации хромосом - это преимущественно разрывы хромосом в интерфазе, высказано предположение, что они тоже являются одним из следствий активации осцилляторного механизма блокирования клеток в точках контроля. Разрывы хромосом в интерфазе (и практически

только такие аберрации) наблюдались в роговице беспородных мышей через 10 ч после воздействия применяемых в офтальмологии УФ-эксимерных лазерных излучений (рис. 6), в связи с чем было высказано предположение, что УФ-эксимерные лазерные излучения инициируют процесс разрывов хромосом, сходный со спонтанным. Для высоких доз, приближающихся к используемым в микрохирургии глаза, характерно снижение мутагенного эффекта, связанное с фотоиспарением клеток, подвергшихся непосредственному воздействию лазерного луча. За пределами зоны испарения имел место лишь косвенный эффект. Он не зависел от длины волны и сопровождался незначительным увеличением частоты разрывов хромосом в интерфазе.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

На клетках костного мозга и роговице мыши изучены закономерности необратимой реализации структурных аберраций хромосом при спонтанном и индуцированном ионизирующими (Х- и гамма-) и УФ-эксимерными лазерными излучениями с длинами волн 248 нм, 223 нм и 193 нм мутагенезе.

По результатам исследования сделаны следующие выводы:

1. Получены новые данные, свидетельствующие о существовании двух классов структурных аберраций хромосом, реализующихся соответственно в интерфазе и в митозе. Первый класс аберраций (разрывы хромосом) характерен для спонтанного мутагенеза и индуцированного УФ-эксимерными лазерными излучениями, с относительно невысокой частотой он возникает при ионизирующих облучениях. Второй класс аберраций (разрывы и обмены) характерен для индуцированного ионизирующими излучениями мутагенеза.

2. Образование разрывов хромосом в интерфазе сопряжено с активацией механизма задержки митоза на точках контроля.

3. Реализация аберраций в митозе сопряжена с разъединением сестринских хроматид. Примененные в митозе ингибиторы топоизомеразы II (кофеин и налидиксовая кислота) влияют на частоту аберраций, в связи с чем высказано предположение, что реализация аберраций в митозе происходит с участием топоизомеразы II.

4. Радиация индуцирует два типа потенциальных повреждений хромосом, различающихся между собой скоростью репарации: быстрорепарируемые (короткоживущие) и медленнорепарируемые (долгоживущие). Соотношение между их частотами меняется в зависимости от дозы. Эти изменения использованы для объяснения немонотонного характера дозовой зависимости частоты аберрантных клеток,

5. Активация механизма задержки митоза на точках контроля способствует уменьшению частоты аберрантных хромосом, реализующихся в митозе.

6. Колхициново-гипотоническая обработка клеток костного мозга в метафазе влияет на реализацию радиационно-индуцированных потенциальных повреждений хромосом: увеличивает частоту разрывов и уменьшает частоту обменов хромосом. На частоту спонтанных аберраций хромосом колхициново-гипотоническая обработка не влияет.

7. Показано, что через 10 ч после воздействия на роговицу мыши УФ-экси-мерными лазерными излучениями происходит относительно небольшое (не выходящее за пределы индивидуальных колебаний в контроле) увеличение частоты разрывов хромосом в интерфазе, в связи с чем высказано предположение, что УФ-эксимерные лазерные излучения инициируют процесс разрывов хромосом, сходный со спонтанным. Зависимость частоты аберрантных клеток от дозы излучения описывается немонотонной кривой: при дозах менее 1,5 Дж/см2 частота клеток с разрывами возрастает линейно с ростом дозы и в расчете на 1 Дж/см2 составляет около 11,7% при длине волны 248 нм, 5,5% при 223 нм, 2,6% при 193 нм. При увеличении дозы облучения до 3 Дж/см2 число клеток с ацентриками уменьшается до 2-3% и остается на этом уровне без изменений при дозах 3-18 Дж/см2. Через 72 ч после облучения частота аберрантных клеток возвращается к норме.

Список работ1, опубликованных по теме диссертации

1. Лебедева Л.И., Ахмаметьева Е.М., Салганик Р.И., Лантух В.В., Пятин М.М., Михайловская И.Е., Ищенко В.Н., Кочубей С.А., Ражев A.M., Рыданных О.В., Субботин В.М., Чеботаев В.П. Хромосомные мутации и регенерация тканей в роговице глаза после УФ лазерного воздействия. Препринт 164-87. 1987. АН СССР, СО. Институт теплофизики. 21 с.

2. Лебедева Л.И., Ахмаметьева Е.М., Ражев A.M., Кочубей С.А., Рыданных 0.8. Цитогенетические эффекты УФ лазерных излучений с длинами волн 248, 223 и 193 нм на клетки млекопитающих // Радиобиология. 1990. Т.ЗО. В.6. С.821-826.

3. Лебедева Л.И., Ахмаметьева Е.М. Новые данные в пользу контактной гипотезы образования радиационно-индуцированных разрывов хромосом // Информационный бюллетень "Радиобиология" . 1990. В.36. С.54-56.

4. Лебедева Л.И., Ахмаметьева Е.М. Возможные механизмы возникновения перестроек хромосом. Сообщение V. Межхромосомные контакты в мета-фазе и их роль в перестройках хромосом // Генетика. 1991. Т.27. № 1. С.70-76.

5. Лебедева Л.И., Ахмаметьева Е.М. Роль митоза в осуществлении радиационно-индуцированных перестроек хромосом в соматических клетках млекопитающих//Информационный бюллетень "Радиобиология" . 1991. В.37. С.1С2-104.

6. Лебедева Л.И., Скорова C.B., Ахмаметьева Е.М. Возможные механизмы возникновения перестроек хромосом. Сообщение VI. Задержка митоза как протекторный механизм. Происхождение спонтанных разрывов хромосом // Генетика. 1993. Т.29. №11. С.1826-1831.

7. Лебедева Л.И., Ахмаметьева Е.М. Возможные механизмы возникновения перестроек хромосом. Сообщение VII. Сравнительная динамика разъединения сестринских хроматид и реализации радиационно-индуцированных перестроек хромосом при митозе // Генетика. 1994. Т.ЗО. № 5. С.644-648.

8. Лебедева Л.И., Ахмаметьева Е.М. Динамическая модель образования ра-диационно-индуцированных структурных аберраций хромосом в клетках млекопитающих // Тез. докл. 2 Международного симпозиума "Механизмы действия сверхмалых доз". Москва, 1995. С.41.

9. Лебедева Л.И., Ахмаметьева Е.М. Возможные механизмы возникновения перестроек хромосом. Сообщение VIII. Цитогенетический анализ динамики репарации и реализации потенциальных повреждений хромосом в клетках костного мозга гамма-облученных мышей // Генетика. 1996. Т.32. Na 6. С.804-809.

Ю.Лебедева Л.И.., Ахмаметьева Е.М. Возможные механизмы возникновения перестроек хромосом. Сообщение IX. Сравнительная динамика освобождения клеток костного мозга мыши от потенциальных повреждений хромосом при малых и умеренных дозах радиации // Генетика. 1997. (в печати).