Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетическое обоснование контактной гипотезы механизма образования аберрации хромосом в клетках Crepis capillaris

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетическое обоснование контактной гипотезы механизма образования аберрации хромосом в клетках Crepis capillaris"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

УДК 575.223:576.312.3

И О НО ВА

Марина Юрьевна

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ КОНТАКТНОЙ ГИПОТЕЗЫ МЕХАНИЗМА ОБРАЗОВАНИЯ АБЕРРАЦИЙ ХРОМОСОМ В КЛЕТКАХ CREPIS CAPILLARIS

03.00.15 — Генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москза 1994

Работа выполнена в Институте химической физики РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор А. П. Акифьев, кандидат биологических наук И, Я. Беляев.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Е. Э. Ганасси, кандидат медицинских наук Г. П. Македонок.

Ведущая организация:

па заседании специализированного совета при Институте общей гинетики РАН по адресу: г. Москва, ул. Губкина, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики РАН.

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан «

. 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Г. Н. Полухина

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АНТ-УЗДЬЯРОТЬ,, flpiA^Hij. структурное мутации или аберрации хромосом (АХ) играэт за£нун роль в эволюции зукариоткчоских орга-низиов, непродуктивной Гибели клеток, канцерогенезе; они широко используются для оцеНки генетического рйска различных факторов среды. Несмотря на длительную историю изучения аберраций хромосом механизм их образования до последнего времени оставался нелепым.

В теории хромосомного мутагенеза противостоят друг другу две концепции: классическая Sax-Lea, в которой постулируется необходимость разрывов хромосом в качестве первичных событий при образовали аберраций хромосом, и обменная, утверкдавщая решающее значение предшествующих контактов месду участями одной и то? -ire или различных хромосом, за которыми следует рекомбинационныэ событий.

Репарационная Модель, предложенная Bender et al. (Bender et а].. 1974). является Иолену/ярнш вариантом классической гипотезы "рирш - воссоединение", б ¡'сторон истинному разрыву хромосомы (докатили) соответствует двунатевоП разрыв ДНК (ЯР), а форииро-mxi-з двух ЛР должно прэдшествсзать шшциэцни любого обменного процесса.

Согласно молекулярном вариантам контактных, гипотез, в частности гипотезы дуплексов, предложенной Акифьевкм и Срйферон (AKülbSü, Сойфер, .ШТб), начальным этапом Формирования обменных аберраций явчается взаимодействие повторяющихся чуклеотидных последовательностей. hhторы контактной гипотезы предполагали, что обменные АХ формируются только в том случае, если повреждения индуцируются в зоне контактов, они считали, чго в юетотаческом цикле долаш сущестьоьатЬ две критические' точки, когда обменные аберрации не должау образовываться вообще всладствие распада контактов: чо-лерш«. перед вступлением клеток з фазу синтеза Äffl и, во-вторых, перед митозом.

Некоторыми авторами была цискааана точка зрзшш. согласно которой образование аберраций хромосом осуществляется я минорной части генома (Гатсо«, 1931. Тарасов, 1975;. Существэнно, что тотальное замещение тижюа в ЛИК «а 5-бромурашл не шлеьт значения для эффектов рч/аюсенснбилизацпн, т.к. абсолютное большинство re-mm не участвует в образовании АХ (Тарасов, Сафонова, 1973. Ca-

фонова, Тарасов, 1973). Были получены предварительные данные о том, что радиосенсибилизирувдкй эффект частичного замещения танина ДНК на 5-бромурацил проявляется только в том случае, если аналог- включается в ДНК в самом раннем отрезке фазы Б (Хакимов и др., 1989).

В пользу контактной гипотезы образования АХ свидетельствует доказательство рекомбинационного механизма возникновения радиаци-онно-индуцируемых Ьбненных аберраций хромосом, полученное недавно цнтогенетическим методом (Беляев и др., 1985, 1987). Однако, оставался невыясненным вопрос является ли рекомбинационный механизм общим и в образований обменов, индуцируемых алкилирущими соединениями - химическими мутагенами с отличным спектром индуцируемых аберраций хромосом.

Цели и задачи исследования. Главной целью настоящей работы был экспериментальный анализ роли критического пункта митотичес-кого цикла: С1-Б-перехода в формировании обменных аберраций хромосом. Было также поставлено целью исследование механизма- возникновения АХ, индуцируемых апкилирущим соединением нитрозоэтилмс-■ чевиной (НЭК). В связи с этим были сформулированы следующие конкретные задачи:

1. Изучить спектр аберраций эфомосом после облучения клеток С. сар'111аг1з. синхронизированных на рубеже

2. Определить уровень радибсенсибилизирующего действия 5-бром-2'-дезоксиуридина (БУДР)'на обменными разрывные аберрации при включении его в ДНК в раннем отрезке Фазы Бив течение полной й' в клетках С. сарШаПз, синхронизированных на рубеже И-Б.

3. С помощью метода репродукции в условиях К-митоза исследовать механизм возникновения АХ. индуцированных алкилирующим агентом нитрозоэтилмочевиной (НЭМ).

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящем исследовании обнаружено явление скачкообразного изменения спектра обменных аберраций хромосом, индуцированных ионизирующим излучением в клетках С.сар111аг1з, синхронизированных на рубеже й1-3, с хромосомного типа на хроматидный. Полученные результаты указывают на то, что в момент перехода к репликации ДНК хромосомы не способны к формированию обменных аберраций. Этот факт свидетельствует о важной роли нормальных клеточных процессов в регуляции образования структурных мутаций.

Показано, что в образовании обменных АХ участвуют только те последовательности ДИК. которые реплицируются в раннем отрезке фазы синтеза ДНК в условиях синхронизации на рубеже G1-S. Большая часть генома (по полученным данным не менее 80S) в образовании АХ ае участяует.

Впервые установлено, что обменные аберрации хромосом, индуцированные НЭМ, формируются по рекомбинационному механизму. Полученные в настоящей работе результаты в сопоставлении с литературными данными позволяют сделать следующее заключзние: радтацконно и химически индуцированные обменные АХ формируются по рекомбинационному механизму в минорной фракции генома, топологически связанной с ядерным матриксок.

Данные о характере репродукции АХ. индуцированных НЗМ и ФУ ДР. необходимо учитывать при исследовании кластогенного действия факторов окружающей среда, представляющих потенциальную генетическую опасность.

Апробация работу. Основные материалы диссертационной работы были доложены на III Всесоюзной конференции "Экологическая генетика растений и животных" (Кишинев. 1987), Международном симпозиуме "Репарация ДНК, хромосомные аномалии и структура хроматина в связи с поблеиой загрязнения окружающей среды (Москва, 1988), Рабочем совещании "Механизмы хромосомного мутагенеза" (Пугрио, 1988), II Всесоюзном координационном совещании "Эколого-генети-ческнз последствия воздействия на окружающую среду антропогенных Факторов" (Сыктывкар. 1989), I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989), VIII Балканских биофизических и биохимических днях (¡{луш-Напока, Румыния. 1920), I Международном биофизическом и биотехнологичесхом конгрессе GAP (Диярбакир, Турция. 1931)..

Публикации. Основные результаты исследования, представленные в диссертационной работа, излокена в восьми публикациях: двух журнальных статьях и шести тезисах докладов.

Структура и обгем диссертации. Материал диссертации. состоящей из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, результатов, обсуждения и выводов, представлен на 140 машинописных страницах, включая 18 таблиц и 16 рисунков. Список литературы включает 59 наименований работ отечественных и 133 наименований ряб от. зарубежных авторов.

Рис.1. Схвма репродукций хрсжатадных аберраций во втором К-митозе после обработки клеток е первом ядерном цикле мутагеном

U /1

К

1. Морфология основных видов АХ. наблюдаемых в оптическом микросколе d первом к-ю?тоге Й

/ 1 11 п Л

2. Репродукция АХ во втором ядерном цикле, ожидаемая из предположения:

а) о завершенности формирования аберраций, регистрируемых в первом К-мь (модель Bender et al. (1974) образования аберраций хромосом)

I/- М

н и

I

И I)

/I Ii

:тозе

U I,

Г

У -И

б) о наличии в местах видиках в оптический микроскоп невоесозвднеакй временно декошактазгрованных храиатинозях нятей (рекомбянацаонше модели образования аберраций хромосом) (Беляев, Акифьел, 1SSS)

V

I)

и

I)

Ü

- 7 -МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования.. В экспериментах использовали семена Crépis capillarls из коллекции Ботанического сада Московского государственного университета. Клетки этого растения содержат три пары крупных хромосом, каждая из которых обладает выраженной индивидуальной морфологией (Дубинина. 1978).Это позволяет с большой точностью определять отдельные виды АХ при котафазном анализе.

Сухие семена естественно синхронизированы: асе клетки находятся з GO-фазе. По «ере роста зародыша семян клеточная популяция становится асинхронной в первый ритоз после проращивания большинство клеток вступает через 30-36 часов. Длительность, никла в пролифелирувтих клетках меристекы в средней il ч : G1 - 4.3 ч ; П - 3.6 ч ; G2 - 3.1 ч (Дубинина, 1978).

Условия проведения экспериментов. Семена проращивали на Фильтрах, смоченных ¿"сталированной водой, в чашках Петри при температуре 26°С в темноте. Для радения поставленных задач клетки синхронизировал;! проракртчиси сит в растворо ингибитора синтеза ДНК З-фгор-г'-дзэоксиурядина (ФУДР) с 10-го по 34-ый час от начала закачивания (Schvartztren et al., 1934). Применяли ФУДР з концентрации ï мкг/мл. Для устранения ккгаОирувщего действия ФУДР использовал!? тики дик f концентрации 1 или 5 ккг/мл. При добавлении тшшка подавлявшая часть клеток вступает в фазу S. При этом синтез ДКК начинается почта одновременно во всех орнадинах репликации. о зтои состоит принципиальнее отличие G1-S перехода в синхронизированных клетках от такового в асинхронной популяции. ФУДР и ттакдм в таких se концентрациях использовали в экспериментах по изучении модифицирующего действия ингибитора синтеза ДНК на образование химически индуцированных аберраций хромосом.

'Длл яналяза механизма образования аберраций хромосом бад ис-пользеваа метод репродукции {Сидоров. Соколов, 1966). Этот метол позволяет однозначно и количественно проанализировать истинку?' природу АХ. регистрируема микроскопическим методом (рис.1). Сущность метола репродукции заключается в том, что клетки, проходяще мито? в присутствии колхицина (К-митоз) и npyrw аг»нтог. ра-^руипших митотнчг-сков веретрно, и? л^итон. Р розуч'-тсте, v

Ч"}7Т-»\' Ч'^-.Г'-Л vi",i|ir;,"y ¡{ -МИТОЗУ TW Ч'''ГМП ПИК 'Р '"< 1' и'-.ре. ■-] • пп |с

е -

хромосомы подвергается удвоенно или репродукции. Если. например, регистрируемые в первом К-штсзе обкешам аберрации окончательно сформированы, то во втором ядерном цикле полные хрокатидаые обмены будут репродуцироваться в полгые обмены хромосомного типа, s неполные (с неполным слияниеи проксимальных или* дне тельных фрагментов). соответственно, - в неполные. С яругой стороны, если в местах невоссоединений в неполных обменах имеет иесто временная декомпактизация хроматина, то следует ожидать иной репродукции исканных АХ. В этом случае как полные, так и неполные хроыатидаыо обмены долены репродуцироваться только в полные обмены хромосомного типа (Беляев. Акифьев. 1988) (рис.i). Другими словами, не-воссоединенля в неполных обменах в процессе репродукции в условиях К-митоза "залечиваются".

Так как аберрантные клетки, проходящие нйтоз в присутствии колхицина, не подвергаются репродуктивной гибели, иетод репродукции дает возмоаность выявить как репродуцированные аберрации, тек и те, которые возникают во втором после воздействия-мутагена ядерном цикле. ,

Для разрушения патетического веретена и перевода кдзток s H- митоз использовали колхицин в концентрации 100 шаУмл.

Проростки облучали ^-квакташ 6"Со в дозй 3 ьли 4 Гр. В качестве источника к-квантов использовали установку ГУВЭ-1500. Суммарная погрешность определения дозы nfî превышала 55*. Обработку семян нитрозоэтилмочевиной (НЭМ) проьодкли; путем закачивания сухих семян в 0. IX иди 0.15$ растворе ЮН в течнние первых двух часов эксперимента. Использовали стандартную ь^тодику приготовления давленых ацетокарминовых препаратов в незначительной модификации (Дубинина, 1978).

Аберрации хромосом учитывала is мвта$&аз м-ггоза, используй стандартные критерии (Ненцша, 1970),

РЕЗУЛЬТАТ!.«

1Могенатц.чсскоо. депеши* у-кмнто^____на -клеш). ta épia

capillarjo. (iHii.\rniUis!!pori3Hiit^-На дуо&г» gl-я. Так как iv.au вин-тези ДНК занкмао? в н.читках оукариот несколько часов. И1Ш полагать, ЧТО MtmcHll Дли формировании оомеиов хромосомного и хрома-

'I ПДН'пГП ПИКШ ДОМНИ, С.РОТПСТ|-ТК1ШО, рнСПаДсИ'ЬСЧ (i bO.-l.'.!Ka'i'b il

ФУДР

- ФУДР +тйкшшн

фиксации ли17лсид0в

п

колхицин

а)

б)

в)

О 10 начало

прооащиЕ ния се;шя

34

рубег <31-Б

О 2 средняя 5-фаза

всемя откквки Ф'/ДР

39-41 42-44 колхицин

7 10

колхицин

7

С2-$зза

10

Рис. 2. Схема эксперимента по изучению

»■чгогонетического дейстзия ^-квзнгоз на метки Сгер1з сарП1зг1з нз рубеже (51-5

течение всеЗ 5-Фэса по г-'ере репликации составляли« их основу последовательное!ей дни.

В настоящей работе был проведен сравнительный цитогенетический анализ аберрлнкЯ хрояосом. индуцируемых иоиизируицим излучением в кягтквх С. сарШаг1з на рубеже 01-5, в середине Б-фазы и а фазе <12. Следует'г>тлетить. что существенной методической особой-иостьв работа было использование синхронизации 1 клеток С.сар11!аг1з с пожгтоЬ ФУД? (рис. ?.). Проростки облучали, соответственно, непосредственно перед снятием синхронизирующего блока ФУДР (рубеа С1-3) (рис.2а), через 2 ч после устранения блока синтеза ДНК 'средня;? Б) (рис. Г.о) н за 3 ч до фиксации в пике митозов да-Фаза) (рис.гв).

На рубеге ГП -5 %-уванты кндуиирувт обменные аберрации в 2 -3 раза менее эффективно. чем в середине £ - и <52-Фазе (табл. 1). По остаяыгык видан збсрраииП: хроиатидяук делениям. пробелам, изол-робелам й язпхроматидгам делениям этих различий не наблюдалось.

Анализ репродукции АХ а условиях К-мятоза (данные не приво • дятся) покакал, что полные и неполные хронатилнче обмечи, возни-кагааяе в кленах на рубпже (31 репродуцируй * в пег»ч*? хрокзтокксго тип?». (<(>-%\жюш рваттм о вида. « псипиш-м, к-лста-ичвлир:»» гея ко втроцу мигозу. Тчглм «¿ратм. я^ррнии

Момент Т-облучения Обменные аберрации

хроматидного типа хромосомного типа

кол-во/ЮОкл % кол-во/1ООкл Я

Рубеж 01-Б Середина 5-фазы С2-фаза 2.90 ± 0.56 95 0.17 ±'0.16 5 5.52 1.1.01 100 0 0 8.06 ± 1.20 100 0 0

Табл. 1. Спектр обменных аберраций, индуцируемых в различных интервалах митотического цикла С.сарШаПэ ^-квантами

индуцированные на рубеже И-Б. репродуцируются так же как и аберрации. индуцированный ионизирующим излучением в и Б-фазах (Беляев. 1986).

Известно, что в условиях синхронизации, использованных в нашем эксперименте, клетки способны реплицировать до 10% генома (БсПуаИгтап ег а1.. 1984). В таком случае, если верна гипотеза постепенной смены типа АХ по мере продвижения клеток в Б-фазе, то ЮХ генома должны реагировать на облучение по хроматидному типу, а ' 90Х - по хромосомному. В действительности мы получили противоположный результат. 9556 обменов в клетках, облученных на рубеже СЬЭ, относились к хроматидному типу. При" у б лучении в середине Б вместо ожидаемых 30-50% обменов хромосомного' типа, мы не обнаружили "их вообще (табл.1).

Таким образом, рубеж С1-Б в клетках С.сар111аг18 связан с качественны изменением способности хромосом отвечать на действие 'излучения. Вступление клеток в фазу репликации сопровождается скачкообразным изменением спектра радаациотю-ивдуцированных обменных аберраций с хромосомного типа на хроматиднык. Можно полагать, что если бы мы могли облучить все клетки строго на рубеже И-Б, т.е. до начала репликации. АХ обменного вила не возникали бы вообще. Этот факт может быть объяснен тем, что, по крайней мере, в условиях синхронизации на рубеже Ч1-3 в клетках С.сарШаг1з скачкообразно исчезают мишени для формирования обменных аберраций хромосом.

- И -

ФУДР

- ФУДР +тймидии

Фиксация диплоидов

л-

колхицин

О 10 начало

проращи' яия семян

34

39-41

42-44

+БУДР

■1-! (1

- БУДР +т1шидин

колхицин

10

+БУДР

0 1' 7

ранний отрезок Б-фазы

' - БУДР

мдш ^

!

шзхшппхгш

о

7

1С

время отмьвки ФУДР

полная Б-фаза

Ркс.З- Схема эксперимента по изучении»

радиосенсибилмзируищего действия БУДР в различные периоды Э-фазы клеток Сгер! з сарШаг1з

а)

б)

на ЕЫХОД аберраций -^Ш^Оо^ШтЛ^ШШШ ^^^

с целью оО-

наруаять ерша репликации (отрэзок фазы синтеза ДНК) нуклеотидньи последовательностей, специфически связанных с образованием обмен-нпых АХ было проведено исследование чувствительностей раннего отрезка фазы Б и т;олной Я при комбинированном действии 6УДР и ■к-кзантов.

Синхронизированные на рубеле 01-3 ¡слетки обрабатывали в темнота БУДР о течение 1 ч 'ранний отрезок 8) (рис.За) или 5 ч (полная 3) (ряс.ЗЬ; срезу после снятия блока ФУДР. Проростки облуча диеь непосредственно перед откыакой БУДР. После отмывки корейки росли в присутствии танидана вплоть до фиксации в пике мктозоп.

Предобработка БУДР в течение 1 ч (ранний отрезок 3) или 5 ч (полная 3) увеличивала количзотво индуцированных излучением аберраций. Цнтогепвтаческий анализ эффекта радиосенсибилизации показал, что кодифика!'" ! -подвергаются. в основном, хринатидные обмени (рис.4). Ни не н£ али радиесенпибилизирующего -^фекта по раз-

ШЗ - частота АХ при облучении К-квантами СЗ - частоты АХ при комбинированном действии БУДР и последующим облучением '¿-квантами

Рис.4. Цитогенетический эффект радиосенсибилизирувдего

действия БУДР на клетки С. сарШр^.з при включении его в раннем отрезке Б-фазы (а) и в течение полной Б--фазы (б)

1 - хроматидные обмены; 2 - хроматизме дэлеции; 3 - хроматидные обмены; 4 - хроматидные делеции.

рывным аберрациям (хроматидные делеции. пробелы, изопробелы. Ш) при включении БУДР.

Коэффициенты сенсибилизации вычисляли как отношение частот радиационно индуцированных АХ определенного вида при включении БУДР и тимидина. Для ранней Б-фазы коэффициент сенсибилизации БУДР' по обменным аберрациям составлял 2.4 ± 0.6, по разрывным аберрациям - 1.1 ± 0.2. Для полной Б эти -¿качения составляли 2.9 ± 0.7 по обменным АХ и 1.3 ± 0.2 по разрывным, соответственно (рис.4).

Ожидалось, что если бы эффект сенсибилизации возрастал пропорционально увеличению количества включаемого БУДР, то уровень его для полной Б-фазы должен был более чем б 4-5 раз превышать таковой для раннего отрезка Б. Однако, коэффициенты сенсибилизации для полной 5 и для ранней Б не отличались статистически значимо. Это означает, что пул последовательностей, включение в которые БУДР вызывает образование дополнительных обменных аберраций при действии 7-квантов, исчерпывается частью генома, реплицирующейся в начале Б-фазы в условиях синхронизации на рубеже й1-Б.

кол-во 15

аберраций на 100 кл.

9*6 3

*

лЁХ-

I—I - частоты АХ в диплоидах КЗ - частоты АХ

в тзтраплоидах

Рис.5. Цитогенетический эффект НЭМ в первой Н-иитозэ после обработки клеток С.саоШаПз в С1-ф&зе к репродукция ?.берраций хромосом в следующем ядерной цикле

1 - хрокатндные обмены к хромосонкые обмены;

2 ~ хрокатидкыэ долецин и хромосомные делецни;

3 - пробелы и изопробелц; 4 - изопробелы и удвоенные изопрсбелн; 5 - Ш и удвоенное N11; и хроичтидкне: б - обмены. 7 - делении и

8 - пробелы в тетраплоидах

Таким образом, полученные факты доказывают, что обменные аберрации хромосом образуются только в этях последовательностях. (

дущронащнх Я5М в П1-Фазе клеток С.са'рП1аг1з. Иошшрующее излучение является типичным Б-независимы* мутагеном. В этом заключается принципиальнее оудиччэ излучения от большинства химических З-зависимых мутагенов, которые обладав? задержанным действием, приуроченным к Б-фазе клеточного цикла. Чтобы установить, функционирует ли рекомбинациониьй механизм при химическом мутагенезе, мы провали анализ репродукции аберраций, вызванных в клетках ме ристемы С.сар111аг15 нитрозээтшючевиноН (НЗМ).'

Цитогенетический эффект НЭМ в первом и во второй К-митсаах представлен на рис.-§. В диплоидных клетках спектр аберрация сос -тоял из аберраций хрематадного1 типа; большинство составляли хрг, -изтиднне обмены, остальные были представлены хромэтидными делениями. пробелами, изояробелаш и изохроматидными делениями (N11).

кал бо 10 г аберраций на 100 кл. в

сумма асимметричных обменов

сумма симметричных обменов

Рис.6. Спектры хроматидных обменов в первом и хромосомных обменов во втором К-митозах ■ после обработки клеток С. сарШ; г1з НЭМ в С1-фазе первого цикла

1 - частота хроматидных обменов в диплоидах

2 - в т.ч. неполных

3 - частота хромосомных обменоз в тетраплоидах

4 - в т.ч. неполных

Сумма обменных аберраций хромосомного типа в тетраплоидных клетках бита равна тому количеству хроматидных обменов, которое было зарегистрировано в первом митозе (рис.5). Среди хроматидных обменов в диплоидных клетках около 30% были неполными. Однако, все хромосомные обмены в тетраплоидных клетках были полными (рис.6).

Количество хромосомных делеций во втором мктозе было такое же, как количество хроматидных делеций в первом, количество изоп-робелов в тетраплоидных клетках составляло треть от пробелов, зарегистрированных в диплоидных, удвоенные изопробелы и изоделеции в тетраплоидах отсутствовали.

Вместе с тем в тетраплоидных клетках присутствовали и вновь образовавшиеся во втсром ядерном цикле хроматидныэ обмены, делении и пробелы. Хроматидные обмены во втором К-интозе составляли около 2'Я% от того количества, что мы. наблюдали в первом митозе.

Таким образом, НЭМ, как и ионизирующая радиация, индуцирует только полные обменные аберрации. Другими словами, как радиацион-но индуцированные, так и химически индуцированные обменные аберрации формируются на базе рекомбинационного механизма.

Что касается разрывных аберраций, то мы так же как и при действии 'радиации наблюдали, что значительная часть разрывных аберраций, регистрируемых в первом митозе после обработки клеток, способна к полному восстановлению спустя ядерный цикл (рис.5).

Репродукция во втором ядерном цикле АХ. индуцированных НЭМ в Gl-Фазе клеток С.сар111аг1з в условиях задержки прорастания се-щц. Принципиальной особенностью S-зависимого эффекта является то, что аберрации, вызываемые химическими мутагенами и подобными по цитогенетичоскочу действию веществами, и в первом, и во втором после воздействия К-митозах относятся преимущественно к хроматид-ному тину. Это касается и тех случаев, когда влияние мутагена на хромосомы ограничено фазой G1 (Дубинин и др., 1976, Дубинина, Дубинин, 1967,-1968, Дубинина, 1987). Однако, при определенных условиях проращивания, например, в условиях задержки прорастания семян, в спектре химически индуцированных в Gl-фазе АХ появляются такие аберраций хромосомного типа (Дубинина 1970, Григорьева' и др., 1971, Preston et al., 1981).

В условиях эксперимента, где наблюдалась задержка прорастания семян, в спектре НЭМ индуцированных в Gl-фазе аберраций хромосом были зарегистрированы также обмены хромосомного типа, которые составляли до 50% всех обменных аберраций. В спектре -АХ, анализируемых в тетраплоидных клетках после воздействия НЭМ в Gl-фазе первого клеточного цикла, были обнаружены удвоенные хромосомные обмены.

Тем не менее были обнаружены те же закономерности репродукции НЭМ индуцированных аберраций хромосом. Изопробелы, изохрома-тидные делеции (NU) и часть пробелов и хроматидных делеций восстанавливались ко второму К-митозу. Все хроматидные и хромосомные обмены репродуцировались во втором ядерном цикле в полные обмены без образования новых аберраций хромосомного типа. Продленное действие химического мутагена во втором ядерном цикле было представлено, как и в предыдущем эксперименте, только аберрациями хрома тлднсго типа.

+ ФУДР фиксация

НЭМ - НЭМ колхицин диплоидов

—И_I__Ьтгпттт! а)

О а 26-28 30-32

качало . 62-фаза

проравдавания

семян - ФУДР

.+тамидин

+ ФУДР • колхицин

[НИЗ

-7 -4 0

поздняя S-фаза

- ФУДР

+ ФУДР -гтииидин колхмшн ЪхтхГ

б)

в)

-9 -7 -4 О

ранняя S-фаза

Рис.7. Схема эксперимента по изучении» модифицирую).:'го действий ингибитора синтеза ДНК ФУДР в различные периоды интеофазы клеток С. capí1lar1£ на формировании абепрациЙ хромосом, индуцированных НЭМ в Gl-фазе

Модифицирующее действие ингибитора синтеза ДНК ФУДР__е_

личные периоды интерфазы на Формирование аберраций хромосом., индуцированных НЭМ в 01-{Т>азе клеток C.captllarls. В настоящей работе для изучения механизма формирования аберраций хромосом, индуцированных S-зависимым мутагеном, был использован экспериментальный подход, связанный с ¡.дидлфишфуэди;.; действием ингибитора синтеза ДНК - ФУДР. Мы основывались на известных из литературы Фак-' тах, согласно которым индуцируемые хромосомные повреждения подвергаются качественно и количественно действию постобработки ингибиторами (Andsrsson, КШтап, 1987. Col lins, Johnson; 1931. Kihlman, Andersson, 1935, Nataraban et al., 1932, Митрофанов. Олимпиенко. 1980).

Анализ АХ, индуцированных НЭМ в Gl-фазе, проводили в метафа-аах первого митоза. Для изучения модификации образования индуцированных НЭМ аберраций хромосом в среду проращивания добавляли ингибитор синтеза ДНК 5-фтор-2'-дезоксиурихцш по следующей схеме: за 4 ч до фиксации вместе с колхицинсм вплоть до фиксации (С2-фа-за) (рис.7а). на 3 ч на период от 7 до 4 ч до фиксашш (поздняя

Э-фаза) (рис.73) а па 2 ч на период от 9 до 7 ч до фиксации (ранняя а-фаза) (рнс.7в). В двух последних вариантах после отмывки ФУДР добавляли тимидин. При такой постановке экспериментов действие ингибитора распространялось на различные периоды 5- и С2-фа-зы, во время которых, возможно, фиксируются АХ, индуцированные НЭМ в в1-Фазе.

ФУДР во всех вариантах обработки индуцировал аберрации исключительно разрывного типа: хроматиднне делецни, ГО, пробелы и изопробелы.

При комбинированном действии НЭМ в И-фазе и-ФУДР в различные периоды интерфаза мы наблюдали следующие закономерности. Количество хроматидных делеций и пробелов наиболее резко- возрастало при инкубации повреиденных НЭМ клеток с ингибитором синтеза ДНК в. С2-фазе. При воздействии ФУДР . в Б-фазе возрастание количества хрокатядных делеций и пробелов не превышало аддитивного действия НЭМ и ингибитора. НЭМ и ФУДР вызывали образование изопробелов и ни аддитивно. При совместном действии НЭМ н ингибитора были зарегистрированы ■ также клетки с мноиественными повреждениями- хромосом, в основном, вероятно, пробелами. Такие клетки отсутствовали при воздействии только одной НЭМ.

В (32-Фазе, а также в раннем и позднем отрезках Б-фазы первого митоза ФУДР не оказывал модифицирующего действия на образование обменных аберраций хромосом. Более того, ингибитор синтеза ДНК не модифицировал образование неполных обменов. Во всех вариантах обработки неполные обмены составляли 25-35% в спектре обменных аберраций. По всей видимости,- все НЭМ-индуцированные хроматиднне обмены в клетках С.сар111аг1з формируются в начале стадии репликации поврежденных участков.

Можно сделать вывод, что модифицирующий эффект ингибитора синтеза ДНК при действии в вг-фазе, а также в Б-фазе выражается в увеличении частоты химически-индуцированных в С1-фазе разрывных аберраций хромосом.

дуцировакннх НЭМ в б1-Фазе и ФУДР в Э- и (?2-Фазах первого ядерного цикла клеток С.сар11аг1з. Метод репродукции был применен, чтобы выявить, какова истинная природа АХ, появляющихся при совместном действии НЭМ и ФУДР.

кил-во 20 аберраций на 100 кл.'

1 2 з а а в

Частоты АХ в тетраплоидах, обработанных: Ш1 - НЭМ в С1-фазе и ФУДР в С2-фазе первого цикла, ШЗ - НЭМ б И-фазе и ФУДР в Б-фазе первого цикла, 1 - НЭМ в С1-фазе первого цикла

Рис.8. Спектры аберраций хромосом во втором К-митозе после обработки клеток С.сар111аг1з в первом ядерном цикле НЭМ самостоятельно и совместно с ФУДР

1 - хромосомные обмены; 2 - хооиосошш делеции; 3 - изопрсбелы; 4 - хроматидные обмены; 5 - хроматидные делеции; 6 - пробелы

В тетраплоидных клетках, обработанных НЗМ в (П-фазе л ингибитором синтеза ДНК ФУДР в С2- или Б-фазе первого цикла, обменные и разрывные аберрации были зарегистрированы в таком ке количестве, как и в опыте, где клегки подвергались только воздействию НЭМ (рис.8). Самостоятельный эффект ФУДР во втором К-нитозё не превышал контрольного уровня.

В первом ядерном цикле количество индуцируемых химическим мутагеном в С1-фазе обменных аберраций хромосом не изменялась постобработкой ингибитором синтеза ДНК в С2- или Б-фазе. Из изменялась и доля неполных обменов. Во втором митозе во всех вариантах обработки химическим мутагеном и ингибитором число" ^¡¡оиосом-ных обменов в точности соответствовало суммарному количеству хро-матидных обменов в первом митозе, причем все обмены к тетраплоидах были полными (рис.8). Таким образом, полученные в данной работе факты доказывают, что в основе образования обменных аберраций, независимо от стадии клеточного цикла и иг тина мутагена.

- 19 -

лежит рекомбинацчонный механизм.

В первом нитозе при совместном действии НЭМ и ФУДР частоты хроматидкых делеций были в 5.5 - 6 раз выше частоты хроматидных делеций, индуцированных НЭМ. Частоты хромосомных делеций во втором митозе во всех вариантах обработки были равны (рис.8). В диплоидных клетках дополнительное воздействие ингибитором в 0,2- или Б-фазе увеличивало частоту пробелов, индуцированных действием НЭМ. в 5 - 5.5 раз. В нашем'эксперименте йзопробелы в тетраплои-дах в вариантах совместной обработки составляли лишь 10 - 115% эт пробелов ■ в дишшдах в соответствующих вариантах обработки (рис.8). Удвоенные йзопробелы и изохроматидные делеции в тетрап-лоидных клетках отсутствовали. Таким образом, во втором ядерном цикле модифицирующий зффект ФУДР практически полностью исчезал. Следовательно, большая часть разрывных АХ. индуцированных комби-' нированных действием НЭМ и ФУДР, представляла собой лишь участки временной декомпактизации хроматина,

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные результаты, полученные в настоящей работе, в сопоставлении с данными других ^.зторов позволяют высказать новые соображения о механизме образования радиационно и химически индуцированных АХ. В данной работе показано, что АХ в клетках С.сар111аг1з, индуцированные НЭМ, формируются по рекомбинационно-му механизму. Характер репродукции хроматидных аберраций свидетельствует о том. что все АХ обменного типа, по-существу, представляют собой полные обмены. Таким образом, как радиационно индуцированные, так и химически индуцированные аберрации формируются на базе рекомбинационного механизма. Другими словами, разрывы в ДНК (хромосоме) воссоединяются не случайно. Очевидно, что лучше всего это заключение поддается трактовке с позиции идеи первичного контакта.

В настоящей работе получены свидетельства о важной роли регулярных клеточных процессов в формировании структур контактов. Данные о резкой смене типов обменов в спектре радиационно индуцированных обменных АХ с хромосомного типа на хроматидный в условиях синхронизации клеток на рубеже показывают, что нереплици-ровзнные участки хромосомной ДНК полностью теряют способность

. . • - 20 -участвовать в рекомбинационных процессах в момент перехода к синтезу ДНК. а может быть и несколько раныш. момента перехода. Нет оснований полагать, что спектры радиацяонно индуцированных первичных повреждений ДНК в Gl фазе и в фазе S когуг различаться. В таком случае и явление скачкообразной сиены на рубеаэ G1-S спектра радиациснно индуцированных обменных АХ полностью соответструет контактной гипотезе, согласно которой контакты у основания доменов' суперспирализации исчезают перед началом репликации ДНК в этих доменах.

Опыты с БУДР мокно рассматривать как доказательство того, что возникновение обменных АХ ограничивается малой фракцией генома - последовательностями, локализованными вблизи орняяагаз репликации. Результаты настоящей работы указывали" на то, что обмены, кроме указанной фракции генома, практически больсе нигде не образуются. Если бы было иначе, то включениэ БУДР. по крайней пере, в течение полной S-фазы приводило бы к больгеиу эффект? сенсибилизации, чем в начальном периода фазы синтеза ДНК в условиях синхронизации на рубеже G1-S.

На основании данных по модификаций Шй-какпщовашш аберраций хромосом ингибитором синтеза ДКК в различные пер:-)ода внтер-фазы можно предположить, что химически нндуцйроважгае в Gl фазе обменные АХ образуется тогда, когда клети; вступает в фазу репликации, • т.е. когда инициируется репликация ЛИК в повременных участках хромосомы. Надо учесть, что в асинхронных популйциях в S-фазу поочередно Еступаат группы отдельных решжсснов, шзтсму н такой клетке и аберрации хромосом могут возникать в течение всей S-фазы. В это время возникают S-зависиэда разргаа (SctPfsrtz,' 1989) , и поскольку они локализуются как раз в зонах, саязгайшх с раннереплицирующимися последовательностями и, слгдззатеяьна, с ДНК ядерного матрикса, то они и становятся "агрессорами" рекшбк-навди в зонах контактов, возникающих в участках вновь реплицирующихся последовательностей.

Приведенные рассувдения объединяют в егдное целое концепщш хромосомного мутагенеза. Во-первых, ндег. первичного разрыва s ее молекулярной версии, предложенной Bender et al. Без разрыва никакие последующие события не протекают. Второе - завершенность (формирования обменов на молекулярном уровне и резкая смена спектра аберраций свидетельствуют о напичик <жтт*»?««Г/С коп wo* хрои-i •

ccu. регул?фуекых клеткой-. В-третьнх, и обменная гипотеза Rqvell находят здесь удовлетворительное объяснение, поскольку первичный разрыв есть то самое повревдение, которое гасится механизмом рекомбинации. Следовательно, в основе хромосомного мутагенеза лежит цндушроэанный рекокбинационный процесс, возникающий на основе вполне определенных клеточных структур.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружена скачкообразная смена спектра 'радиационно инду вдровашшх обменных аберраций хромосом с хромосомного типа на хроматнднкй в клетках C.caplllarls. синхронизированных ФУДР на рубеже G1-S. Сделано заключение о тон, что в момент вступления скнхрошшроБанных на рубежа G1-S клеток в фазу синтеза днк обменные аберрации не образуются, поскольку в клетках для них нет молекулярных мквгеней.

2. В результате исследования радиосенсибилизирующего • действия БУДР 8-разных отрезках фазы s клеток C.caplllarls показано, что обксккнэ аберраида хромосом образуются исключительно в последовательностях ЙШ. реплицирующихся в условиях синхронизации в начальном периоде фазы стиеза ДНК.

3, С помэщьв метода репродукции в К-мигозе установлено, что хромагадада обмены (поляне и неполные), индуцированные нэм ь Gt-фазй первого йдершго цикла клеток С. caplllaris, превращаются во втором цикле з полные обмены хромосомного типа. Это- означает, что образование шгачесхи индуцированных обменных аберраций хро-ыоеем, так же как и радиационно индуцированных, происходит по ре-комбшацйонному механизму,

4, Ой<&рушм длительное последействие НЭМ. выражающееся б пой&шш вновь образованных хроматидных аберраций во втором К-Мйтезе после обработки мутагеном клеток в Gl-фазе первого цикла клеток С.capillarIs,

5: Прй дейстт ингибитора синтеза ДНК ФУДР в G2- и в S-фазе иа ¡ШУМ С. capillars, обработанные НЭМ в Gl-фазе, наблюдается резкое увеличение выхода разрывных аберраций хромосом (хроматид-üüx делеций» пробелов, нэопробелов и изоделеций) в первом митозе. Однако, ¡м ьторем К-штозе они не репродуцируются, что означает, чго они не относятся к числу истинных разрывов хромосом, а преде-

. ' - 22 -тавляют собой участи! вреиенкой декожактизацни хроматина.

.6. Показано, что что при постобработке клеток С. carinarla ингибитором синтеза ДНК ФУДР в G2-, а также в раннем и позднем отрезках S-фазы клеточного цикла не модифицируется выход обменных аберраций, индуцированных НЭМ в Gl-фазе. Полученный результат указывает на то, что НЭМ индуцированные в Gl-fase обмены образуются в самом начале репликации ДНК.

■ 7. Полученные факты полностью согласуется с гипотезой о тон, что обменные аберрации хромосом формируются на основе контактных взаимодействий последовательностей ДНК, локализованных а миноркой Фракции генома, связанной с ядерным матриксом.

Основные положения диссертации опубликованы в работа^;

1. Акифьев А.П., Беляев И.Я., Изаннщева М.Ю. Сходство реком-бинационных процессов в мейозе и при формировали обменных аберраций хромосом. В сб.: Экологическая генетика растений и животных. Тезисы докладов III Всесоюзной конференции, Кишинев. 1937, с. 52.

2. Акифьев А.П., Беляев И. Я. _ Кванищева М. Ю. Обший механизм хромосомного мутагенеза: теоретические и прикладные асгюкгы, В сб. : Репарация ДНК, хромосомные аномалии и структура хроматина в связи с проблемой загрязнения окружающей среды. Тезисы докладов Международного симпозиума. Москва, 1983.

3. Беляев И. Я., Иванищева М. Ю., Григороза Н. В., Акифьев А. ¡1. Генетические процессы в хромосомной мутагенезе: теоретические и прикладные аспекты. В сб.. Эколого-генетические последствия воздействия на окрукающую среду антропогенных факторов. Тезисы докладов II Всесоюзного координационного совещания, Сыктывкар, 1989.

' 4. Беляев И. Я., Кванищева M.D., Григорова Н. В., Еян&рал Д.И., Акифьев А.П. Радиационно-индуцировакные аберрации хромосом как метод анализа структурно функциональной организации генома эукариот. Тезисы докладов I Всесоюзного радиобиологического съезда, Москва., 1S89.

5,-Belyaev I Ya., Ivanlscíieva M. Yu., Yednerai D.I., Akiflev A. P. Radiation-Induced ■chromosome aberrations as a nethoâ for analyzing the structural functional organization of the .eutwyote genome. Abstacts of the 8-th Balkan Biochemical anñ Biophysical Oays. C.lul-Napokn. Romania, 1990.

6. Беляев И. Я., Иванкшева H.D., Еднерал Д. И., Акифьев'А.П. Репликативный фазовый переход в структуре интерфазного ядра и его роль в образовании радиашюнно-индуцированных обменных аберраций. - Генетика, 1990, 26, 5, 971-975.

7. Aklfiev А. P., Belyaev I Уа.. Ivanlscheva M:Yu. The general mechanism of chromosomal mutagenesis: basic and applied aspects. - Acta Dlologlca Hungarlca, 1990, 41(1-3), 3-7.

8. IvanlscUGva M.Yu., Belyaev I Ya., Aklfiev A.P. Radiation cytogenetics analysis of the transition In structural and functional' organization of the genome on Gl-S phases line. -Abstracts of the I International biophysics congress- and biothechnology at GAP, Diyarbaklr, Turkey, 1991.