Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КОНТРАСТНЫХ ПО РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ СОРТОВ ГЕКСАПЛОИДНОЙ ПШЕНИЦЫ

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КОНТРАСТНЫХ ПО РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ СОРТОВ ГЕКСАПЛОИДНОЙ ПШЕНИЦЫ"



Государственная комиссия Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам

Всесоюзный научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии

На правах рукописи

СЕЛЕЗНЕВА Елена Михайловна

УДК 577.391 ;581.5631.531Л

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КОНТРАСТНЫХ ПО РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ СОРТОВ ГЕКСАПЛОИДНОЙ ПШЕНИЦЫ

03.00.01 — радиобиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Обнинск — 1990

г.

Работа выполнена во Всесоюзном научно-неследоиатель-ском институте сельскохозяйственной радиологии Главагро-биопрома СССР.

Научные руководители:

— доктор биологических наук, профессор, академик ВАСХНИЛ Р. М. Алексахин

— доктор биологических наук, старший научный сотрудник Б. И. Сарапульцев

Официальные оппоненты:

— доктор биологических наук, профессор И. Н. Гудков;

— кандидат биологических наук С. И, Заичкина.

Ведущая организация — Институт ботаники ЛЕЇ Литовской ССР.

Защита диссертации состоится « ¿О ■%. ___1990 г.

в часо» на засе.тг і:ч< Специализированного совета

Д 120.81.01 при Всесоїч.;. . - научно-исследовательском институте се,т-''к(іїозяйствс;;і,, іі радиологии Главагробпопрома СССР 1К> -«л,- г. Москва, Волков пер. 4.

С дщтер оіеїі можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной радиологии.

Отзывы просьба чявлять но адресу: 249020, г, Обнинск, Калужской обл., "НИИСХР. Специализированный совет Д 120,81.01.

Авторефер-- V ;.. ^¿ифіисі^ 1990 года

Ученый секретер,, специализированного совета кандидат Апологических наук

Н, И. Саижарова

ОБЩАЯ ХАРАКГЁЙЮША РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из основных проблем радиобиологии является изучение сравнительной радиоусго Йчи вое та растительных организмов. Многочислекнгс научные данные по этому вопросу свидетельствуют о том, что растения являются чрезвычайно полиморфными по уровню естественной радиорезистентности. Наибольшие различия по этому признаку обнаруживаются между крупными таксономическими группами, менее значительные - дайке между отдельными сортами и растительными организмами. Известно также, что различные «йазы онтогенеза обладают специфической устойчивостью к действию ионизирующих излучений. Выяснение причин широкой вариабельности уровня естественной устойчивости к действию ионизирующей радиации имеет как теоретическое значение для понимания общих механизмов биологического действия радиации, так и практическое, направленное на повышение радиоустойчивости растений.

Радиорезистентность является комплексным явлением, детерминированным разнообразными факторами. К их числу относятся объем ядра и хромосом, число хромосом, плоидность,-т.е. факторы, отражающие различия в структурной организации генома, а также содержание в клетках сульфгидрильных соединений, антиокеидантов и физиологически активных веществ. Сйкой из составляющих, играющих важную роль в формировании устойчивости к действию ионизирующей радиации является способность клеток к пострадиационному восстановлению.

Необходимыми компонентами пострадиационного восстановления и генетической стабильности клетки являются репарация ДНК и хромосом. Репарация ДНК играет важную роль в реализации цитогенетического повреждения, которое является одним из наиболее выраженных проявлений биологического действия излучения на клетки и служит причиной репродуктивной гибели соматических клеток, определяющей поражение критических систем организма. Учитывая важность процессов репарации ДНК в формировании устойчивости клеток к действию ионизирующей радиации, в последние годы проявляется значительный интерес к изучению этого феномена. Изучение механизмов репарации ДНК, а также ее роли в мутационном процессе и обеспечении надежности генетического .аппарата живых организмов вышло далеко за пределы радиобиологии и стало одним из центральных разделов молекулярной генетики. Генетический контроль и молекулярные механизмы

центральная

НАУЧНАЯ 6;-.'5Л' .ОТЕКА Моск. сельс! юхоз. академии

им Н, А. Тимирязева Инв. №______________

- э -

различных репарационных путей в настоящее время детально изучены у бактерий. С помощью большого набора радиочувствительных мутантов произведены идентификация, клонирование и секвенирование генов репарации ДНК. Изучение механизмов репарации ДНК у эукариот исследовано существенно менее полно. Наибольшее число данных о репарации ДНК в клетках высших организмов получено при работе с мутантами, дефектными по эксциэионной репарации, в основном, на линиях грызунов. Некоторые из мутантных клеточных линий были использованы для идентификации и картирования генов человека, комплементарных дефектным по репарации ДНК генам грызунов.

Принимая во внимание, что для эукариот не существует такого хорошо идентифкцированного и обширного набора генетически измененных штаммов, который позволил бы изучитьучастие индивидуальных генов в функционировании отдельных этапов репарации ДНК, основной акцент делается на исследования с использованием различных метаболических ядов, блокирующих определенные ферментативные системы в клетке. Набор таких ингибиторов репарации достаточно разнообразен, но дня многих из них строго не идентифицирован молекулярный механизм действия. В целом же следует отметить, что роль различных путей репарации в формировании феномена радиоуетойчивости высших организмов, а равно в реализации цитогенетического повреждения исследована далеко недостаточно.

Удобным объектом для изучения механизмов радиоустойчивости высших растений является модель контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы, с помощью которой на основе мор-фометрического и биохимического анализов установлена генетическая природа внутривидового полиморфизма /Корнеев и др., 1905, Сара-пульцев и др., 1989/. Изучение действия ингибиторов пострадиационного восстановления у контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы открывает возможность определить вклад отдельны^ ^апов репарации в формирование их дифференциальной реак-щй^^из лучения.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключает^-ся в изучении действия ингибиторов репарации на пострадиационные процессы у контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы. Для достижения указанной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

I. Провести радиобиологическую характеристику б контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы на основе радиационной депрессии ростовых процессов и ци тогене тиче ского повреждения хромосом в корневой меристеме прорастающих семян.

2. С помощью ингибитора пострадиационного восстановления кофеина оценить активность репарационных процессов в прорастающих семенах радиоустойчивых и радиочувствительных сортов.

3. Провести сравнительный анализ действия ингибиторов синтеза ДНК оксимочевины и афидиколина на образование цитогенетическо-го повреждения в первом пострадиационном митозе у радиорезистентного сорта Янус и радиочувствительного сорта Московская 35.

4. Исследовать вклад репарационных процессов, связанных с функционированием ДНК-топоизомеразы П, в реализацию радиационного поражения хромосом у контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы Янус и Московская 35.

5. Изучить роль поли-АДФ-рибоэилирования в формировании структурных повревдений хромосом у контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы.

Научная новизна работы. Впервые с использованием модели контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы проведено исследование действия ингибиторов различных этапов репарации ДК на эффективность восстановления после действия ^излучения.

На модели контрастных по устойчивости к действию ¿^излучения сортов гексаплоидной пшеницы с помощью ингибитора пострадиационного восстановления кофеина установлено, что их дифференциальная реакция обусловлена повышенной активностью репарационных процессов у радиореэпатентных генотипов.

При исследовании комбинированного действия оксимочевины и афи-диколина показано, что частота клеток с аберрациями хромосом в корневой меристеме З^-облученных семян после обработки ингибиторами синтеза ДНК возрастает в большей степени у радиорез и с тенгного сорта Янус по сравнению с радиочувствительным сортом Московская 35,

Впервые на растительных объектах проведено изучение влияния ингибитора ДНК-толоиэомеразы П (налидиксовой кислоты) на образование аберраций хромосом. Установлено, что налидиксовая кислота не влияет на выход клеток с а'беррациями хромосом у радиорезистентного сорта Янус после ^-облучения семян в дозах 25 и 50 Гр в от-

личие от радиочувствительного сорта Московская 35, в корневой меристеме которого обработка налидиксовой кислотой ослабляет радиационное поражение хромосом после ^облучения семян в дозе 25 Гр и усиливает его после облучения в дозе 50 Гр.

При исследовании роли поли-АДО-рибозилирования в процессах, приводящих к фиксации аберраций хромосом« показано, что ингибировакие никотинамидом приводит к ослаблению цитогенетического повреждения, индуцированного ^"-облучением, как у радиочувствительного, так и у радиорезистентного сорта гексаплоидной пшеницы. Действие няко-тикамида зависит от уровня радиационного повреждения меристемы и наблюдается при облучении семян радиочувствительного сорта Московская 35 в дозе 25 Гр, а семян ¡радиорезистентного сорта Яцус - в дозе 50 Гр.

Теоретическая и практическая ценность работы. Представленные в диссертации экспериментальные данные по анализу действия ингибиторов репарации ДНК и сопряженных с ней процессов - кофеина, ок-симочевины и а^идиколина, налидиксовой кислоты и нинотинамида -на ростовые процессы и формирование структурных поврелщений хромосом в клетках корневой меристемы ^-облученных семян контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы свидетельствуют о важной роли репарации при формировании радиобиологических реакций растений. Изучение действия широкого набора ингибиторов репарации ДНК на модели контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы открывает принципиально новую возможность исследования роли различных ферментов и путей- репарации в реализации цитогенетического повреждения и, следовательно, в формировании феномена радиорезистентности. В целом, при отсутствии для растительных организмов необходимого набора дефектных по репарации мутантов, единственным способом изучения участия отдельных ферментов и путей репарации в процессе реализации цитогенетичес-ких нарушений является ингибиторный анализ, применение которого весьма перспективно. Исследованные в работе соединения - оксимо-чевина, а$идиколин, налидиксовая кислота и никотанамид - могут быть использованы как для усиления, так и для ослабления радиационного поражения хромосом, что может найти применение в практике для целенаправленного воздействия на радиоустойчивость организмов в целях радиационного мутагенеза и радиостимуляции.

Апробация работы. ..toторчали 'cc^prair.u:l долгами на Зыгссж-ном дауч но-координационном сог.счзнж " i г [е г,; !:о - 6;; о .с■:: с м1.;; ;дс~ ' пекты pam:cyov?"4;iEOOT:i культурных расгоний" (Обилие::, 1985), на Бессоюзном совещании "Применение физического и :;:к.1ичосг.^го -г/.га-гснеза и ссдьскэм хэзяЗство" 'Кншинов, 1987^, :;о:-г:урсо нау-тнмх работ, пойвящзнчом памяти Г..;.!. Клыкове кого (Одинок, 19371, I Всесоюзном радиобиологическом съоздэ (Мсжва, 1939).

¡Тубликацпи. По теме диссертации опубликовано 5 научных раОот.

Структура и объем работы. Диссертационная работа эклкызот в себя введение, аналитический обзор, материал и методы исследования, экспериментальную часть и обсуждение результатов, заключение, выводы и список цитируемой литератур, ^ссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 7 рисунков. Список литературы включает 236 наименований, в т.ч. 164 иностранных.

материал и метода ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проведена на полученной в лаборатории радиационной генетики Беесоюзного НИИ сельскохозяйственной радиологии модели контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы. Использованы радиорезистентные сорта Янус, Лира, Журавка и радиочувствительные сорта Московская 35, Новосибирская 67, Ленинградская 2.

Воздушно-сухие семена подвергали J^-o блуче кию на установке "Ga-mmacell-200 " в дозах 50, 100, 150 и 200 Гр (®Со, модность дозы 0,07 Гр/с). Характеристику радиорезистентности семян проводили по радиационной депрессии длины главного корешка 5-суточшх этиолированных проростков и уровню цитогенетического повревдения клеток корневой меристемы прорастающих семян. Показатель радиационной депрессии признака (РД1 определяли по снижению длины главного корешка в варианте^облучением, отнесенное к значению этого показателя в норме.

Для цитогенетического анализа фиксировали зародышевые корешки в фиксаторе Кларка (3 части этилового спирта и I часть ледяной уксусной кислоты) в течение 2 ч, затем промывали 1-2 ч в 60£-ном этиловом спирте и готовили временные давленые препараты при окрашивании ацетоорсеином. Анализ повреждения хромосом в клетках

корневой меристемы проводили в ана- и телоЛ ai ах на 120-й час после замачивадая семян. Критериями генетического повреждения являлись частота клеток с аберрациями хромосом и число перестроек (мосты и Фрагменты) на одну клетку.

Для изучения модифицирующего действия ингибитора репарации кодеина на рост проростков воздушно-сухие семена облучали в дозах ЪО, 100, 150 Гр и через 24 ч помещали на 5 ч в 5x10"^ И раствор кофеина. Затем семена промывали в течение 12 ч в проточной воде и проращивали в течение 120 ч для определения радиационной депрессии длины главного кореша. Все операции проводили в термостат те при температуре 22 °С.

При инги6иторном анализе функционирования различных репарационных путей по реализаций структурных повреждений хромосом были использованы два сорта гексаллоидной пшеницы - радиорезистентный сорт Янус и радиочувствительный сорт Московская 35.

Воэдушно-сухие семена указанных сортов подвергали ^-облучению на установке "Г7Р-І20" мощность дозы 0,08 Гр/с) в дозах 25 и 50 Гр (в одном эксперименте - в дозе 100 Гр). Анализ по-врелщения хромосом проводили в ана- и телофазах первого митоза на пике митошческой активности. Критериями генетического повреждения являлись частота клеток с аберрациями хромосом и число перестроек (мосты и фрагменты) на одну клетку. В калщом варианте опыта фиксировали по 10 корешков и анализировали в среднем по 50 ана-и телойаз. Эксперименты повторяли 3 раза.

При изучении комбинированного действия окоимочевины и афиди-колина на цитогенетическое повреждение часть облученных семян замачивали в течение 2 ив 2x10 М оксимочевине и затем переносили на 3 ч в 3x10"® раствор афидиколина. Далее семена промывали в проточной воде и проращивали. Все операции проводили в термостате при температуре 24 °С. Для исследования влияния налидиксовой кислоты на выход клеток с аберрациями хромосом в корневой меристеме после облучения часть семян в течение 3 ч замачивали в 2,2x10"^ М растворе налидиксовой кислоты, промывали и проращивали при 24 °С. Для анализа вклада процессов поли-АДО-рибозшшрования в формирование повреждений хромосом семена в течение 5 ч замачивали в ЗхЮ-^ М растворе никотинамида (ингибитора поли(АДО-рибозо)-полимераэы), затем промывали и проращивали в термостате при 24 °С. В серии экспериментов по действии ингибиторов на реализацию цитогенетичес-

кого повреждения использовали следующие варианты опытов:' контроль -неоСлученные семена; ингибитор - семена, обработанные ингибитором; облучение - семена, облученные в дозах 25 и 50 Гр; облучение + ингибитор - семена, облученные в дозах 25 и 50 Гр с обработкой ингибитором.

В другой серии экспериментов исследовали действие кикотинамида (3x10 М) на частоту клеток с аберрациями хромосом при его внесении через 16 ч после начала проращивания облученных семян. Обработка никотинамидом а этом случае проводилась в течение 5 ч с последующей промывкой и проращиванием семян в термостате при 24 °С.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I, Исследование контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы

Исследование подавления роста корней 5-тиеуточных этиолированных проростков после ¡^-облучения семян 6 контрастных по радиорезистентности сортов в дозах 50, 100, 150 и 200 Гр показало, что средние величины радиационной депрессии (РД, %) для группы радиорезистентных сортов составили 2,9+0,1; 17,5+0,3; 26,3+1,0 и 48,5+; 1,5, а для радиочувствительных сортов 37,4+0,8; 67,3+1,7; 79,3^,8 и ^Ю,0+2,0 соответственно (рис Л).

Рис.1. Дозовые зависимости радиационной депрессии главного корешка при действии ^излучения на семена контрастных по радиорезистентности сортов пшеницы.

Радиочувствительные сорта: Московская 35 (I), Ленинградская 2 (2), Ное»сибирская 67 (3). Радноретиетент ные сорта: Янус (4), Журавка (5), Лира (о).

По оси абсцисс - доза ^облучения сенян, Г^р;

По оси ошинат - радиационная депрессия,

Таким образом, средние значения величин РД между группами контрастных по радиорезистентности сортов различаются в 12,9; 3,9; 3,0 и 2,1 раза соответственно. Средние величины эффективных доз, приводящих к 50^-ному подавлению роста главного корешка равнялись

74.6+3,8 и 203,6+4,4 Гр ддя чувствительной и устойчивой группы соответственно, т.е. различие по этому показателю между контрастными сортами достигало 3-хкратных величин.

Значительные различия между группами контрастных по радиорезистентности сортов обнаружены и по показателю частоты клеток с аберрациями хромосом 5-суточных проростков при (í-обдучении семян в дозах 50, 100 и 200 Гр {рис.2). Средние значения частоты клеток с аберрациями хромосом (%) для группы радиореэистентных сортов составили 39,2+1,3; 65,2+1,0 и 75,6+1,8, а для радиочувствительных сортов - 59.2+Í.2; 73,6¡>2,0 и 90,2+1,36? соответственно, т.е. в 1,5, 1,1 и 1,2 раза выше по сравнению с аналогичными величинами у рздиореэистентных сортов. Средние величины эффективных доз, приводящих к 50%-ному повреждению клеток корневой меристемы, равнялись 38,2+3,3 и 85,7+4,9 Гр, т.е. различались у контрастных групп более чем в 2 раза. Сходные результаты получены при определении количества аберраций хромосом в расчете на одну клетку. Средние значения этого показателя для двух групп сортов при облучении в дозах 50, 100 и 200 Гр отличаются в 1,6, 1,3 и 1,4 раза соответственно.

Рис.2. Дозовыз зависимости частоты клеток с аберрациями хромосом в корневой меристеме при действии ¡^излучения на семена контрастных по радиорезистентности сортов* гексаплоидной пшеницы.

По оси абсцисс - доза {(^-облучения семян, Гр;

По оси ординат - частота клеток с аберрациями хромосом, %.

Обозначения, как на рисЛ.

Таким образом, исследованные группы сортов значительно отличаются по уровню радиорезистентности как при тестировании по радиационной депрессии роста корней, так и по критериям цитогенетического повреждения. Для дальнейших цитогенетических исследований в качестве типичных представителей каждой из групп были отобраны радиорезистентный сорт Янус и радиочувствительный сорт Московская 35,

2. Валяние кодеина на рост корней у-оСлуженных семян контрастных по радиорезистентности сортуз гокоаатючдной пшгняцы

Дня исследования активности репарационных ■ процессов в проростках гексаплоидной пшеницы после ^-облучения в допах 50, 100 и 100 Гр семена обрабатывали ингибитором репарации кодеином, полученные результаты (табл.Г свидетельствуют о значительном различии с уровнях ингибирущего вл'лягыя кодеина на рост :;эрнгй у контрактных та радиорезистентности сортов гексаплоидной лшониг^.

Таблица I

Радиационная депрессия длины главного кореша прорастающих семян (а) контрастных по радиорезистентности сортов генсаплоидной пшениц

t ...... Варианты обработки семян

Сорт ! 50 Гр ! 50 Гр + !100 Гр 1100 Гр+1 150 Гр !150 Гр+ _Г_f кофеин ! _fкофеин ?_?кофеин

Радиочувствительные сорта

Московская Г4.4+ 17,5+ 36,7+ 37,0+ -38,3+ 48,3+7,6 35 1,5" 1,27 1„Т 1,4-

Новосибирс- 14,6+ 16,5+ 30,6+ 34,3+ 48,4+ 49,3+2,1 кая 67 1,4" 2,СГ 1,7" 2,СГ 1,4"

Ленинграде- 7,6+ 9,4+ 22,0+ 40,9+хюс31,7+ 50,4+1,4ХХХ кая 2 1,3" 1,5" 1,6" 2,0" 1,6"

В среднем по 12,2+ 14,5+ 29,8+ ■ 37,4+ххх42,8+ 49,3+2,7* группе 0,8" 1,СГ 0,9" 1,1" 0,8"

Радиорезистентные сорта

■Лира 5,1+ Ю,7+х 7,4+ 16,3+ххх19,8+ 33,3+1,8

1,6~ IIST I*5~ lie" lis" v

Журавка 2,1+ 13,St*** 8,2+ 33,6+*** 7,8+ 48,0+2,2 1,9- 2,СР x.ff- I.ST 2,4- ~ ж

Янус 2,7+ I3,2+*K 4,3+ 31,6+*** 5,9+ 41,0+2,4

2'Г 2'Ь"ххх 11£Г г'Г«.1,Г " ***

В среднем по 3,3+ 12,6+ 6,6+ 27,2+11,2+ 40,8+1,2 группе 1,Г" 1,3" 1,СГ 1,2" 1,1"

н - различие с вариантом без воздействия кофеином

достоверно при р<0,05;хх - p^O.OI;*** - pCO.OOI.

Так для группы радиорезистентных сортов после обработки кофеином облученных в дозах 50, 100 и 150 Гр семян показатели радиационной депрессии главного корешка увеличились в среднем в 4,5, 4,5 и 4,9 раза соответственно, в то время как для группы радиочувствительных сортов, облученных в тех же дозах, показатели радиационной

XXX

яепросогії узеличиг>ались зс.:гс л::і:іь в среднем в 1,2, 1,3 и 1,2 рала

'ССОТРТГСЛЗ'їННО,

3. Действие ингибиторов репарации ДНК на кэширование цито генетических на руде ний ^-облученных семян

Результати проведенных наследований покаэали, что комбинированное действие оксимочевины и афидиколина значительно больше влияет на число клеток с аберрациями хромосом в корневой меристеме радиорезистентного сорта Янус по сравнению с радиочувствительным

Рис.3. Изменение частоты хромосомных аберраций в клетках корневой меристемы у радиочувствительного сорта Московская 35 (I) и радиорезистентного сорта Янус (2) без обработки (-) и после обработки (+) семян оксимочевиной и афидиколином.

По оси абсцисс - доза ¡¿-излучения,

Гр;

По оси ординат - клетки с аберрациями хромосом, %,

(за вычетом спонтанного фона и фона, обусловленного действием ингибиторов на необлученные семена)

Так, после у-облучения радиоустойчивых семян в дозе 25 Гр количество клеток саберрациями хромосом увеличилось на 12,9+2,7$ (р<0,001), а в дозе £0 Гр - на 12,5+3,4$ (р<0,001), а после обдучения в тех же дозах радиочувствительных семян число клеток с аберрациями хромосом возросло лишь на 8,2+3,ЗЙ (р<0,05) и 7,7+2,7% (р<0,01) соответственно. Иными словами, после обработки оксимочевиной и асЕи-диколином семян, облученных в дозах 25 и 50 Гр, частота клеток с аберрациями хромосом у радиорезистентного сорта Янус оказывается в 1,6 раза выше по сравнению с радиочувствительным сортом Московская 35. Аналогичные результаты получены по критерия числа перестроек на одну клетку.

Для изучения роли процессов репарации ДНК, связанных с функционированием ДНК-толоизомераэы П, в реализации структурных повреждений хромосом использовался ингибитор этого фермента - налидиксо-вая кислота. Предаварительные эксперименты показали, что концентра-

сортом Московская 35 (рис.3).

10 Гр

—З

щи налидиксовой кислоты от 1,3 до 3,1x10 М ни по критерию числа клеток с аберрациями хромосом, ни по количеству перестроек на одну клетку не приводят к достоверному повышению уровня цитогенетических повреждений. В дальнейших экспериментах использовали растворы налидиксовой кислоты с концентрацией 2,2x10"^ М, при которой оптимально проявляется модификация радиационного поражения. •

При исследовании действия налидиксовой кислоты на выход хромосомных аберраций в клетках корневой меристемы после ¡¡^-облучения семян радиорезистентного сорта Янус моди<|ицирующего эффекта этого препарата обнаружено не было (рис.4).

Рис.4. Изменение частоты хромосомных аберраций в клетках корневой меристемы у радиочувствительного сорта Московская 35 (I) и радиоре-эистентного сорта Янус (2) без обработки (-) и после обработки (+) 'семян налидиксовой кислотой.

Полоса абсцисс - доза ^-излучения,

По оси ординат- клетки с аберрациями хромосом, %.

(за вычетом спонтанного фона и фона, обусловленного действием налидиксовой кислоты на необлученные семена)

Совершенно другая картина характерна для радиочувствительного сорта Московская 35, у которого после воздействия налидиксовой кислоты на семена после облучения в дозе 25 Гр число клеток со структурными повреждениями хромосом снизилось на 18,6+3,2%, а после облучения в дозе 50 Гр, напротив, возросло на 12,9+2,3$ (рис.4).

Для изучения репарационных путей, связанных с функционированием процессов АДФ-рибозилирования, в реализацию цитогенетического повреедения, индуцированного ^облучением, анализировали частоту структурных повреждений хромосом после действия ингибитора поли(АДФ-рибозо)-полимеразы - никотинамида. В предварительных опытах бьпо показано, что возрастающие концентрации никотинамида ( от 5хЮ~3 до ЗОхЮ"3 М) не увеличивают число спонтанных повреждений хромосом и даже приводят к снижению их'количества. В экспериментах по изучению модифицирующего действия никотинамида на выход клеток с аберрациями хромосом после ^облучения применяли никотинамид в концентрации 30x1О"3 М, которая являлась оп-

тимальной для модификации радиационного повреждения,

Никотинамид уменьшает на 8,6+2,4$ (р-і-0,001) количество клеток о аберрациями хромосом в корневой меристеме радиорезистентного сорта Янус после облучения семян в дозе 50 Гр, тогда как при -облучении семян этого сорта в дозе £5 Гр модифицирующий эффект не наблюдается (рис.5).

Рис.5. Изменение частоты, хромосомных аберраций в клетках корневой меристемы у радиочувствительного сорта Московская 35" (I) и радиорезистентного сорта Янус (2) без обработки С-) и после обработки (+) семян никоти-намидом.

По оси абсцисс - доза ¿^излучения, Гр;

По оси ординат - клетки с аберрациями хромосом, %.

(за вычетом спонтанного фона и фона, обусловленного действием никотинами-да на необлученные семена)

После облучения семян радиочувствительного сорта Московская 35 в дозе 25 никотинамид снижает частоту клеток с аберрациями на 13,9+ 3,6% (р^0,001), а при облучении семян в дозе 50 Гр число клеток с цитогенетическими повреждениями достоверно (р <0,01) возрастает на 7.7+2.6Й (рис.5).

Полученные данные по действию никотинамида на выход клеток с аберрациями хромосом свидетельствуют о том, что проявление модифицирующего эффекта никотинамида и его снятие обусловлено определенным уровнем цитогенетического повреждения. Действительно, ослабление радиационного поражения хромосом никотинамидом наблюдается лри облучении в дозе 25 Гр семян радиочувствительного сорта Московская 35 и в дозе 50 Гр - радиореэистентного сорта "Янус, т.е. при дозах, приводящих к эквивалентному выходу клеток с аберрациями хромосом у обоих сортов.

Логично предположить, что при увеличении дозы ¿"^облучения семян радиорезистентного сорта Янус радиозащитный эффект никотин-амида наблюдаться не должен. Дяя проверки этого предположения семена сорта Янус облучали в дозе 100 Гр и подвергали обработке нп-

- 14 - •

/

ко тинами дом. При этом модифицирующий эйЛэкт ни коти нами да, как и следовало ожидать, не наблюдался ни по количеству клеток с аберрациями, ни по выходу перестроек на одну клетку (табл.2).

Таблица 2

Действие никотинамида на реализацию повреждения хромосом после обдучения семян радиореэпатентного сорта Янус

Вариант ппыта ! 10187X11 с а*еРРа; ¡Средний выход аберраций г т и11И1а ! циями хромосом,% !на одну клетку

Контроль 3,2+0,7 . 0,04+0,02

Никотинамид 1,3+0,3 0,010+0,002

100 Гр 80,6+1,4 2,324р.10

100 + никотина- 82,4+1,5 2,36+0,10

МИД

Хорошо известно, что при прорастании семян в клеточном метаболизме происходит ряд закономерных изменений, сопровотдающихся увеличением синтеза ДНК, РНК и белков. В ходе протекания этих матричных процессов хроматин претерпевает ряд обратимых'конформационных изменений, которые могут быть обусловлены поли-ДДФ-рибозилировашем ядерных белков /Заварэин, Харазова, 1982/. Представляется вероятным, что в ,семенах с разной физиологической активностью в зависимости от степени прорастания интенсивность процессов АДФ--рибоэилирования будет отличаться и, как следствие, никотинамид будет оказывать неодинаковое действие на Нормирование повреяде-. ний хромосом. Для проверки этого предположения семена, облученные в дозе 50 Гр, обрабатывали никотинамидом (ЗхЮ-^ М) в разные сроки после начала проращивания. Результаты исследований показали, что разная степень физиологической активности семян не влияет на эффект никотинамида в отношении реализации цитогенети-ческих повреядекий у радиореэистентного сорта Янус (табл.3). Напротив, обработка никотинамидом семян радиочувствительного сорта Московская 35 через 16 ч после начала проращивания семян снижает число клеток с аберрациями хромосом на 26,6+2,1$ по сравнению с облученным вариантом (р-^0,001), тогда как введение никотинамида сразу после начала проращивания семян увеличивает уровень цитоге-

Таблица З

ііяііянііз іілкоуіікашда на ц<і то генетическое повреждение в клетках корневой шр и с темы семян гексагтлоидной пше-; діцн с разной й'И з йоло ги ческой активностью

Вариант опыта

Сопт Янус

I

Сорт Московская 35

¡клетки с абер-! средний вы'клетки с (средний вы-I рациями хромо-! код аберра,. аберрациями'ход аберра-!сом, % !ций на од-!хромосои, %!ций на одну !_!ну клетку !_¡клетку_

Контроль

Добавление никотинамида сразу после начала проращивания

Добавление никотинамида через 15 ч после начала проращивания

Облучение семян в дозе 50 Гр

Облучение семян в дозе 50 Гр + нико-тинамид сразу после начала проращивания

Облучение семян в дозе 50 Гр + нико-тинамид через 16 ч после начала проращивания

3,9+0,8 0,03+0,01 2,5+0,9 0,03+0,01 3,9+0,8 0,010+0,002 2,0+0,5 0,030+0,008

2,3+0,5 0,030+0,017 2,0+0,5 0,030+0,009

42,8+1,8 0,77+0,10 62,8+1,8 1,51+0,11

31,2+1,4 0,60+0,06 70,0+1,7 1,69+0,11

28,8+2,3 0,6&+0,03 35,7+0,3 0,98+0,21

нетического повреждения.

Таким образом, совокупность результатов ингибиторного анализа основных этапов репарации в реализации цитогенетического повреждения контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы позволяет сделать вывод о том, что одной из вероятных причин дифференциальной чувствительности семян к действию ^из-лученияв является разная эффективность репарационных процессов, выявляемая при действии ингибитора эксцизионкой и пострепликатив-ной репарации кофеина и ингибиторов синтеза ДНК - оксимочевины и

асЕидаколина. ДЖ-топоиэомераэа П играет определенную роль при формировании повреждений хромосом только у радиочувствительного сорта Московская 35. По-видимому, э этом случае на фиксацию цитогенети-ческого повреждения влияют топологические переходы ДНК. Ослабление радиационного поражения хромосом никотинаыидом как у радиочувствительного, так и у радиорезистентного сортов, по-видимому, свидетельствуют о критической роли падения внутриклеточного пула НАД в формировании повреэдения хромосом и репродуктивной гибели клеток.

ВЫВОДИ

I. Экспериментальные данные по действию ингибиторов репарации ДНК и сопряженных с ней процессов - кофеина, оксимочевины и афи-даколина, налидиксовой кислоты, никотинамида - на ростовые реакции и реализацию цитогенетических повреждений в клетках корневой меристемы свидетельствуют о важной роли восстановительнеос процессов в формировании дифференциальной реакции контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы на действие ^-излучения . '

2. Радиационная депрессия длины корней 5-суточяьм этиолированных проростков после ^-облучения семян в дозах 50, 100, 150 и 200 Гр различались у 6.контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы в 2-13 раз. Ци тогенетическое повреждение в клетках корневой меристемы прорастающих семян, облученных в дозах 50, 100 к 200 Гр, у радиочувствительных сортов выше по сравнению с радиорезистентными в 1,1 - 1,5 раза.

3. Ингибирование пострадиационного восстановления кофеином достоверно (р-^0,01) подавляло рост корней после ¿^облучения семян в дозах 50, 100 и 150 Гр у радиорезистентных сортов в среднем в 4,6 раза тогда как у радиочувстввтелькых сортов в среднем лишь в 1,2 раза.

4. Число клеток с аберрациями хромосом в первом пострадиационном митозе после обработки ингибиторами синтеза ДОС оксимочевиной и афтдинолином семян, облученных в дозах 25 и 50 Гр, возрастало как у радиорезистентного сорта Янус, так и у радиочувствительного сорта Московская 35, однако у радиорезистентного сорта частота клеток с аберрациями хромосом была в 1,6 раза выше по сравнению

с радиочувствительным сортом.

5. Ингибирование ДНК-топоизомеразы П налидиксовой кислотой не влипло на реализацию цитогенетического поврездения после ^облучения в дозах 25 и 50 Гр семян радиорезистентного сорта Янус, тогда как у радиочувствительного сорта Московская 35 после воздействия налидиксовой кислоты на облученные в дозе 25 Гр семена число клеток с аберрациями хромосом снизилось на 18,6+3,2^, а после обработки облученных в дозе 50 Гр семян частота клеток с аберрациями возросла на 12,9+2,

б, Ингибирование поли(АДФ-рибозо) -по лиме раз ы никотинамидом-приводило к ослаблению радиационного поражения хромосом у радиочувствительного сорта Московская 35 при облучении в дозе 25 Гр, а у радиорезистентного сорта Янус - в дозе 50 Гр. С возрастанием дозы ¿^облучения происходило ослабление действия никотинамцда на выход клеток с аберрациями хромосом у радиорезистентного сорта Янус и усиление радиационного поражения хромосом в клетках корневой меристемы радиочувствительного сорта Московская 35. Доя радиочувствительного сорта Московская 35 действие никотинамида на реализацию цитогенетического повреждения после ¿^облучения в дозе 50 Гр зависело от физиологической активности семян.

7. Совокупность результатов ингибиторного анализа основных этапов репарации в реализации цитогенетического повреждения у контрастных по радиорезистентности сортов позволяет сделать вывод о высокой информативности этой экспериментальной системы для исследования механизмов формирования дифференциальной радиорезистентности высших растений»

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

I. Селезнёва Е.М. Эффективность кофеин-зависимой репарации у контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы // Теа.совещ. "Применение физического и химического мутагенеза в сельском хозяйстве". Кишинев, 1987. С.100.

2. Селезнёва Е.М., Сарапульцев В.И. Соотношение эффектов репарации и репопуляции в пострадиационном восстановлении контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы // Радиобиология. 198а Т. 28. №1. С. 91-95.

3. Селезнева И. М. Эффекты ингибиторов репарации на выход клеток с аберрациям» хромосом у контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы 11 Тез.: докл. I Всесоюз, раднобнол, съезда, Москва. 1989г. Т. 2. С. 308—309.

4. Селезнева Ц. М., Сарапульцев Б. И. Влияние налидик-совой кислоты и илкотинамида на реализацию цитогенети-ческого повреждения у контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы 11 Радиобиология. 1990. Т. 30, Л*в 3, принято в печать.

5. Селезнева Е. М., Алексахии Р. М. Влияние афпдпколи-на и оксимочевииы на реализацию цитогенетического повреждения у контрастных по радиорезистентности сортов гексаплоидной пшеницы " Радиобиология. 1990. Т. 30, в печати.

ТБ 03037 Подписано в печать 27.02.90 г.

Заказ 1074 Объем 1 п. л. Тираж 100

Обнинская городская типография г, Обнинск, ул. Комарова. 6.