Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние хлорида аммония и мочевины на структуру и функции лактатдегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние хлорида аммония и мочевины на структуру и функции лактатдегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы"

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

СМОВЖ СТАНІСЛАВА АНАТОЛІЇВНА

УДК 577.158.043

ВПЛИВ ХЛОРИДУ АМОНІЮ ТА СЕЧОВИНИ НА СТРУКТУРУ І ФУНКЦІЇ ЛАКТАТДЕГІДРОГЕНАЗИ ТА ГЛУТАМАТДЕГІДРОГЕНАЗИ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ-1998

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біхімії та біотехнології Національного аграрного університету

Науковий керівник доктор біологічних наук, професор, академік НАН України та УААН Мельничук Дмитро Олексійович, Національний аграрний університет, ректор Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Войцицький

Володимир Михайлович, Київський університет імені Тараса Шевченка, заступник декана біологічного факультету

доктор біологічних наук, професор Калачнюк Григорій Іванович, Науково-дослідний інститут біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівської академії ветеринарної медицини, директор

Провідна установа Національний медичний університет

ім. О. Богомольця, кафедра біологічної та біонеорганічної хімії, МОЗ України, м.Київ

Захист відбудеться “ Я.З ” червня 1998 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.08 в Національному аграрному університеті за адресою: 252041, Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, уч. корпус 3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою 252041, Київ-41, вул. Героїв Оборони, 11, уч. корпус 10

Автореферат розісланий /З ” травня 1998 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

Цвіліховський М.І.

1

ЗАГАЛЬНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ РОБОТИ

Актуальність теми. Загальноприйнятим та грунтовно доведеним є той факт, що значну роль в окисно-відновних процесах в клітині відіграють ферментні системи, локалізація яких у ланцюгу метаболічних перетворень дозволяє їм направляти реакції альтернативними шляхами, сприяючи, таким чином, більш оптимальному виконанню фізіологічних функцій організму (Березин И.В., 1979; Бохински P., 1987; Поляновский О.Л., 1975). Саме тому функційонування даних ферментних систем в живому організмі є об’єктом багаторівневої регуляції, що здійснюється або безпосередньою зміною кількості фермента, яка залежить від інтенсивності процесів транскрипції, трансляції, зборки та руйнування ферментативного білку, або модуляцією його активності. Подібні ферменті системи піддаються впливу екзо- та ендофакторів, забезпечуючи перебіг декількох сотень різних хімічних реакцій, що відбуваються в організмі і є об’єктом значної уваги біохіміків не одного покоління.

Проведеними останнім часом дослідженнями доведено, що зміни рівня азотовмісних сполук, в тому числі і аміаку в крові, залежать як від інтенсивності процесів окисно-відновного метаболізму в цілому, так і від активності ферментів, які забезпечують його функцонування. Встановлено, що порушення фізіологічних функцій, внутрішньоклітиного метаболізму та трансмембранних процесів, які спостерігаються при накопиченні високого рівня амонійного азоту в організмі тварин, обумовлені порушенням динамічної рівноваги між процесами його утворення та утилізації (Захаренко М.О., 1990, 1992; Мельничук Д.О., 1987, 1989). Підвищення рівня аміаку в крові, тканинах та клітинах організму призводить до зміни параметрів кислотно-лужної рівноваги у бік ацидозу (Мельничук Д.О., 1989), впливає на співвідношення нікотинамідних коферментів та процеси окисно-відновного фосфорилювання в тканинах (Захаренко, 1992; Мельничук Д.О., 1989), спричинює порушення структури і функцій гемоглобіну (Захаренко М.О., 1990; Цыганенко О.И., 1989), пригнічує реакції оксидоредукції та гліколізу (Гулий М.Ф., 1980; 1997; Захаренко М.О., 1992). Зокрема, працями ряда авторів було показано, що аміак, реагуючи з карбоксильними групами гідроски-, кето- і амінокислот, гальмує їхнє надходження до циклу Кребса, призводячи до пригнічення тканинного дихання (Гулий М.Ф., 1997; Диксон М., 1966; Захаренко М.О., 1992, 1993; Мельничук Д.О., 1980, 1989).

Наслідком порушення кислотно-лужного балансу в організмі є активація гліколізу, гальмування інтенсивності окисного фосфорилювання та функціонування циклу трикарбонових кислот, а також зміна гормонального статусу організму (Гулий М.Ф., 1970,1997; Захаренко М.О., 1991, Мельничук Д.О., 1980,1989).

Вказані зміни реалізуються за допомогою впливу небілкового азоту на такі ключові ферменти вуглеводного обміну, як фосфофрушжіназа, глюкокіназа та альдолаза (Батикян Г.Г., 1989; Мельничук Д.О., 1989). Відповідно, зміна активності лактатдегідрогенази, малатдегідрогенази, сукцинатдегідрогенази,

ізоцитратдегідрогенази свідчить про порушення інтенсивності функціонування циклу трикарбонових кислот та окислювального фосфорилювання (Гарькавый М.И., 1978; Гулий М.Ф., 1980; Мельничук Д.О., 1987).

Відомо, також, що сечовина та гуанидинхпорид, руйнуючи третинну структуру ферментів, знижують активність кристалічної алкогольдегідрогенази (Strambini G.B., 1987) та фосфофруктокінази з Е.соіі (Liang S.-J., 1990). Однак, існують повідомлення про те, що активності таких важливих ферментів, як малатдегідрогенази, виділеної з Halobacterium marismortui (Hecht K., 1989), лужної фосфатази (Miggiano G.A.D., 1987) та кінази фосфорилази (Paudel Н.К., 1990) мають тенденцію до збільшення під дією вказаних речовин в концентраціях, що не призводять до грубих порушень білкової структури молекули ферменту. Механізм подібного взаємовиключаючого впливу денатуруючих речовин на активність ферментів остаточно не з’ясований. За припущенням ряду авторів, його причиною може бути дисоціація нативного тетрамеру на каталітично неактивні димери та тримери (Liang S.-J., 1990); певні зміни всередині молекули ферменту (Strambini G.B., 1987); модифікація специфічної субодиниці ферменту (ß - субодиниці кінази фосфорилази), яка відповідає за утримання четвертинної структури ферменту (Paudel Н.К., 1990), зміна ступеня іонізації поліпептидної послідовності (Miggiano G.A.D., 1987) та підвищенні гнучкості білкової молекули.

Не дивлячись на актуальність вказаної проблеми, ступінь вивченності молекулярних механізмів впливу амонійного азоту на активність ферментів, що регулюють процеси оксидоредукції недостатня. В зв'язку з цим, значний інтерес являє собою вивчення впливу різних форм небілкових азотовмісних сполук на каталітичні характеристики ЫА0(Р)+-залежних дегідрогеназ, зокрема лактатдегідрогенази з м'язів свиней (L-лакгат: ЫАО+-оксидоредуктази, КФ 1.1.1.27) та глутаматдегідрогенази (L-глугамат: ЫАО(Р+)-оксидоредуктази; КФ 1.4.1.3) з печінки великої рогатої худоби, що, на нашу думку, дозволить з'ясувати механізм впливу цих речовин на регуляцію ферментативної активності, як одного з найважливіших показників у вивченні процесів обміну речовин у живому організмі, та механізмів адаптації до змін в оточуючому середовищі.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - дослідити вплив різних концентрацій небілкових азотовмісних сполук (хлориду амонію та сечовини) на каталітичні параметри №А0(Р)+-залежної глутаматдегідрогенази та НАй+-залежної лактатдегідрогенази в залежності від конценрації субстратів та значення pH інкубаційного середовища.

Для досягнення мети були поставлені слідуючі завдання:

1. Дослідити каталітичні параметри ( Km, Vmax, К, Ke, Km’) ЛДГ та ГДГ в залежності від концентрації субстратів та pH середовища, які відповідають змінам вказаних умов у клітині в нормі та при патології. ,

з

2. Вивчити особливості впливу хлориду амонію та сечовини на каталітичні властивості ЛДГ та ГДГ, і провести порівняльну характеристику отриманих результатів.

3. Дослідити можливі структурні зміни у будові молекул ЛДГ та ГДГ під дією вказаних азотовмісних речовин, використовуючи класичні кінетичні методи, а також метод ІЧ-спектроскопії.

4. Розробити загальні моделі каталітичної дії ЛДГ та ГДГ, що містили б дані стосовно особливостей функціонування даних ферментів та впливу небілкових азотовмісних сполук у концентраціях, що не призводять до порушень третинної структури білка.

Наукова новизна роботи. Вперше на очищених кристалічних препаратах ЫАО(Р),'-залежноТ глутаматдегідрогенази та МА0+-залежної лактатдегідрогенази досліджено вплив хлориду амонію та сечовини на особливості прояву каталітичних властивостей ферментів в нормі та за умов, що відповідають патологічному стану організму.

Встановлено виникнення явища субстратного гальмування ГДГ при всіх досліджуваних значеннях pH (7,5-8,8) інкубаційного середовища. Для ЛДГ явище субстратного гальмування знайдено лише при нейтральних та слабкокислих значеннях pH інкубаційного середовища (6,9-7,5), при переході ж до слаболужних значень pH (8,5) встановлено відновлення акгивністі ферменту.

На основі отриманих експериментальних даних вперше розроблені загальні моделі каталізу ЛДГ та ГДГ, які враховують вплив небілкових азотовмісних сполук на досліджувані ферменти.

Теоретичне і практичне значення. Одержані нові дані щодо особливостей функціонування ЫА0(Р)+-залежних дегідрогеназ (ЛДГ і ГДГ) під впливом різних концентрацій небілкових азотовмісних сполук розкривають один із можливих механізмів впливу амонійного азоту та сечовини на інтенсивність та напрямок процесів енергозабезпечення організму в нормі та в умовах патологічного стану, зокрема хронічного амонійного токсикозу.

Отримані результати значно поглиблюють розуміння механізмів впливу небілкових азотовмісних сполук як на ключові ферментні системи окисно-відновного метаболізму, так і на молекулярні механізми регулювання обміну речовин в організмі вцілому.

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідались на: науково-

практичній конференції «Неінфекційна патологія тварин» (м.Біла Церква, 1995 р.), науково-виробничій конференції «Актуальні питання ветеринарної медицини» (м.Київ, 1995 р.), науковій конференції професорсько-викладацького складу та аспірантів «Сучасні проблеми ветеринарної медицини» (Київ, 1997), на конференції Європейського товариства ветеринарного та порівняльного травлення» (Німеччина, Мюнхен, 1997), на \/| |-му Українському біохімічному з’їзді (Київ, НАУ, 1997).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 друкованих робіт (5 статей та 7 тез).

Структура і обсяг роботи. Дисертація викладена на 171 сторінках машинописного тексту, містить 2 таблиці, 25 малюнки, 3 системи рівнянь та 6 формул, і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів власних досліджень, заключення, висновків та списку використаної літератури з 233 джерел, серед яких 139 іноземних.

Декларація конкретного особистого внеску. Автором особисто проведені всі дослідження за методиками, описаними в дисертаційній роботі: визначення активності ЛДГ та ГДГ; визначення кінетичних параметрів, які характеризують каталітичні властивості ЛДГ та ГДГ. Автор, використовуючи методи лінійної регресії та теорії графів, експериментально обгрунтувала, сформулювала та розв’язала систему лінійних рівняннь, які враховують особливості функціонування запропонованих кінетичних схем, а саме: утворення фермент-субстратного комплексу з чітко детермінованою послідовністю приєднання субстратів ферментативної реакції, стан іонізації ферменту в залежності від pH інкубаційного середовища, утворення нежиттєздатного та проміжног комплексів, процес гальмування продуктом реакції, а також вплив небілкових азотовмісних сполук.

На основі отриманих експериментальних результатів автором дисертації запропановано загальну модель каталізу досліджуваних оксидоредуктаз, правильність якої повністю підтверджується серією контрольних експериментів.

ОБ’ЄКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Досліди було виконано на високоочищених кристалічних препаратах КА0(Р)+-залежної глутаматдегідрогенази з печінки великої рогатої худоби та NAD+-залежної лактатдегідрогенази з м'язів свиней.

В серії дослідів in vitro вивчали вплив різних концентрацій хлориду амонію та сечовини на регуляторні властивості ЛДГ та ГДГ. Було досліджено вплив хлориду амонію в концентраціях, які відповідають рівню аміаку в тканинах здорових тварин (2-10 мМ) та у концентраціях, що відповідають рівню аміаку в крові при ряді патологічних станів організму (10-25 мМ). Виходячи з того, що молекула глутаматдегідрогенази з мікроорганізмів та водорослей є стійкою до дії денатуруючих агентів, зокрема, сечовини (27, 55, 63), діапазон досліджень впливу цієї речовини на активність зазначених дегідрогеназ було розширено від 5 та 20 мМ до 40, 100 та 200 мМ. Використання методу лінійної регресії дозволило розрахувати Km, Vmax, Ks та Кі, як основні кінетичні параметри, що характеризують діяльність ферментів.

Активність ЛДГ визначали за швидкістю відновлення пірувату, яку реєстрували по зміні оптичної густини у смузі поглинання NADH при 340 нм на спектрофотометрі "Specord-40" /"Carl Zeiss"/ (Прохорова М.И., 1982). Реакцію

проводили в термостатичній кюветі при 24°С. Початкову швидкість реакції визначали по нахилу дотичної до вихідного відрізка кінетичної кривої зміни оптичної густини за одиницю часу, яку реєстрували протягом 3 хв після початку реакції. Всі вимірювання проводили в 0,05 М калій-фосфатному буфері в діапазоні pH 6,9-8,5, при концентрації NADH 9*10'3 М і фермента - 0,04 мкг/мл. Концентрацію пірувату змінювали від 0,1 *10'3 до 20*10"5 М. Реакцію розпочинали доданням ферменту до інкубаційної суміші, загальний об'єм якої становив 1 мл. Концентрацію білка в пробі визначали по Лоурі.

Ферментативну активність ГДГ в реакції окислювального дезамінування визначали за швидкістю утворення NADH (Прохорова М.И., 1982). Зміну оптичної густини реєстрували при 340 нм. Активність ферменту визначали в 0,25 М трис-НСІ буфері (pH 8,2 ), що містив 1 мМ ЕДТА , за наявності 1,8 мМ NAD*, 0,75 М глутамату. Концентрація білка становила 2 мг/мл. Дослідження проводили в термостатичній кюветі при температурі 24° С.

Активність ЛДГ та ГДГ (в мкмоль / хв мг білку) розраховували за формулою:

AEF1000 " 6.22а

де А Е - зміна оптичної густини розчину за 1 хв; V - кінцевий об’єм проби, мл; 6,22 -молярний коефіцієнт екстинкції NADH; а - кількість білка у пробі, мг/мп.

На основі отриманих експериментальних результатів була запропонована загальна модель каталізу ЛДГ та ГДГ, яка включає в себе утворення нормального фермент-субстратного комплексу, нежиттєздатного фермент-субстратного, проміжного та аддуктного комплексів, а також вплив азотовмісних сполук та pH інкубаційного середовища на утворення фермент-субстратних комплексів. Згідно з запропонованою моделлю методом Кінга-Альтмана (Корниш-Боуден Є., 1979) та за допомогою теорії графів (Волькенштейн М.В., 1966) були розраховані основні кінетичні параметри, що характеризують вище названі реакції. Для ілюстрації запропонованої моделі наведені експериментальні результати.

Використовуючи метод Кінга-Альтмана та модифікований Волькенштейном-Гольдштейном метод теорії графів, нами виведені рівняння, які описують утворення фермент-субстратного комплексу з чітко детермінованою послідовністю приєднання субстратів ферментативної реакції, та, крім того, містять інформацію про стан іонізації ферменту в залежності від pH інкубаційного середовища, утворення нежиттєздатного комплексу та процес гальмування ферменту продуктом реакції. Кінетичні параметри Кщ, Vmax, Ка та Кі визначали згідно виведеним формулам.

Для визначення кінетичних параметрів, які характеризують каталітичні властивості ЛДГ за експериментальними даними, використано метод лінійної регресії. В якості теоретичної функції була застосована відома залежність для знаходження швидкості ферментативної реакції для випадку субстратного гальмування (Кориш-Боуден Э, 1979).

ІЧ-спектри розчинів ГДГ в 020 та 020, насиченому азотовмісними сполуками, знімали в інтервалі частот 1400 - 3600 см‘1, використовуючи кювети СаР2 з 1_=0,05 мм. Досліджували вплив вказаних концентрацій хлориду амонію та сечовини , розчинених в 020, на структуру ГДГ.

Отримані експериментальні результати для визначення кінетичних параметрів оброблені за допомогою методу найменших квадратів, при цьому концентрації діючих речовин були задані точно, а експериментальні значення швидкості ферментативних реакцій та їх похибки визначалися за дослідними даними. Математична обробка отриманих результатів здійснювалась за допомогою програми МісгосаІ Огісідіп 3.5.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ДОСЛІДЖЕННЯ КІНЕТИЧНИХ ПАРАМЕТРІВ МО(Р)*-ЗАЛЕЖНИХ ДЕГІДРОГЕНАЗ

Дослідження кінетичних параметрів реакції відновлення пірувату в лактат показали, що за нейтральних та слабокислих значеннь рН інкубаційного середовища виникає явище субстратного гальмування (рис.1). Зокрема, при нейтральних та слабокислих значеннях рН максимальна ферментативна активність досягається при однакових значеннях концентрації пірувату (1,25 мМ), однак швидкість перебігу ферментативної реакції більша при рН 7,5 ніж при рН 6,9. Максимальна ж активність ЛДГ при рН 7,5 на 25 % більша, ніж при рН 6,9. Явище субстратного гальмування ЛДГ починає проявлятись коли концентрація субстрату перевищує більше 1,3 мМ і має однакову тенденцію при всіх досліджуваних значеннях рН. З наведених у табл. 1 експериментальних даних видно, що при концентрації пірувату 10 мМ максимальна швидкість реакції становить 0,529 мкмоль/хв мг білку.

Таблиця-1. Значення Кт , мколь та , мкмоль/хв*мг лактатдегідрогеназної реакції при різних значеннях рН інкубаційного середовища, М ± т, п=5.

pH Кт, мкмоль Х/тах, МКМОЛЬ/ХВ*МГ

6.9 0.194 ±0.056 0.469 ± 0.049

7.5 0.226 ± 0,053 0,540 ± 0,048

8.5 1.953 ±0,307 0,529 ±0,063

При подальшому збільшенні концентрації субстрату до 20 мМ, швидкість реакції відновлення пірувату, яка каталізується ЛДГ, не змінюється.

До того ж було встановлено, що при переході від слабокислих (pH 6,9) до слабколужних ( 8,5) значень pH величина \/тах збільшується лише в 1,4 рази, в той

час як Кп зі збільшенням рН зростає в значній мірі - приблизно в 7 разів. Причиною цього явища є зменшення спорідненості пірувату до комплексу фермент-кофермент зворотньої реакції що узгоджується з думкою ряду авторів, які пов’язують ..

Рис. 2. Залежність активності ГДГ від концентрації глутамату при різних значеннях рН інкубаційного середовища.

Рис. 1. Залежність активності ЛДГ від концентрації пірувату при різних значеннях рН інкубаційного середовища.

залежність швидкості лактатдегідрогеназної реакції із зміною рН середовища, а саме: зі зміною спорідненості пірувату до нежиттєздатного комплексу фермент— кофермент зворотньої реакції, що в першу чергу обумовлено зміною іонізаційного стану функціональних груп білку, зокрема Ніз-193 та Ніз-195. В залежності від рН середовища піруват взаємодіє як з протонованою ( Н+-Е-МАОН-піруват ), так і з депротонованою (Е-МАРН- піруват) формами ферменту, призводячи до його ізомеризації. Вирогідно, саме конформаційна ізомеризація ЛДГ має безпосереднє відношення до механізму гальмування фермента піруватом.

Протягом багатьох років у літературі активно дискутується питання стосовно природи субстратного гальмування ЛДГ, але його механізм експериментально досліджено недостатньо. При цьому, питання, яка з форм пірувату (єнольна або кето) є гальмуючою, залишається відкритим. Проведеними дослідженнями було встановлено, що оскільки при зміщенні рН у лужний бік ефект субстратного гальмування знімається, то досить ймовірно можно стверджувати, що гальмуючою є саме кетоформа пірувату, кількість якої при лужних значеннях рН інкубаційного середовища зростає за рахунох зміщення рівноваги перетворення кетоформа о єнольна форма в бік кето форми.

Дослідження рН оптимуму інкубаційного середовища для ГДГ з печінки великої рогатої худоби виявили загальну тенденцію виникнення явища субстратного гальмування при всіх досліджуваних значеннях рН (рис. 2). Однак, були встановлені особливості перебігу глутаматдегідрогеназної реакції та прояву зазначеного явища

субстратного гальмування. Так, з даних, наведених на рис. 2 видно, що явище субстратного гальмування ГДГ має найбільш інтенсивний вияв при pH 8,2. Найбільш адекватним поясненням цього явища є те, що за вказаних значеннь pH інкубаційного середовища відбувається найбільш ефективне та стереоспецифічно орієнтоване приєднання молекул субстрату у відповідних субстрат-зв’язуючих центрах на молекулі фермента. В зв’язку з цим, дані центри заповнюються в найкоротший строк, що забезпечує швидке досягнення максимальної швидкості ферментативної реакції.

Таблиця-2. Значення Кт та У^вх для ГДГ при різних значеннях pH інкубаційного середовища. Вказані значення є середніми не менше, ніж для двох незалежних вимірювань Кгт,.__________________________________________________

pH Кт, МКМОЛЬ Vmax, мкмоль/хв*мг

7.5 1.826± 0.256 1.648 ±0.174

8.2 1.827+0.221 2.042 ± 0.230

8.8 1.801 ±0.307 1.256 ±0.142

Отже, проведені досліди показали, що явище субстратного гальмування ГДГ не залежить від значення pH інкубаційного середовища, а максимальна швидкість глутаматдегідрогеназної реакції при слабколужних значеннях pH найбільша і досягається в середньому вдвічі швидше, ніж при нейтральних та лужних значеннях pH. Наведені в табл. 2 значення К™ та Vm« вказують на те, що при зміні pH інкубаційного середовища у межах від нейтральних (pH 7,5) до слаболужних (pH 8,2) значень Кт не змінюється, в той час як максимальна швидкість глутаматдегідрогеназної реакції збільшується на 82 %. Але при переході від слаболужних значень pH до лужних відбувається протилежне явище, а саме: максимальна швидкість ферментативної реакції зменшується на 62 %. Дане явище можна пояснити тим, що для досліджуваного субстрату (L-глутамату) слаболужні значення pH інкубаційного середовища прийнято вважати оптимальними для прояву глутаматдегідрогеназної активності.

Вивчення характеру залежності швидкості окислювального дезамінування глутамату від концентрації кофакторів показало, що при насиченні ГДГ кофактором (NAD*) кінетична кооперативність не проявляється, про що свідчить лінійність ділянки графіка Лайнуівера-Берка ( W від 1/[NAD*] ) в області концентрацій NAD* нижче оптимальної. Аналогічна кінетична поведінка спостерігається і при насиченні ГДГ глутаматом.

Таким чином, встановлено явище субстратного гальмування ГДГ великими концентраціями субстратів реакції окислювального дезамінування глутамату (L-глутамату та NAD*), однак розбіжностей у характері прояву цього явища при різних значеннях pH не виявлено.

ВПЛИВ НЕБІЛКОВИХ АЗОТОВМІСНИХ СПОЛУК НА АКТИВНІСТЬ ЛДГ ТА ГДГ

Для з’ясування впливу сечовини та хлориду амонію на активність ЛДГ досліджували дію вказаних речовин на каталітичні властивості даного ферменту при сталих та різних значеннях субстрату (пірувату) та на pH інкубаційного середовища. Встановлено, що різні концентрації субстрату впливають як на виникнення явища субстратного гальмування, так і на характер впливу хлористого амонію та сечовини на каталітичні властивості ЛДГ (рис. З,А). Зокрема, при ненасичуючих концентраціях субстрату в інкубаційному середовищі хлорид амонію гальмує активність ЛДГ. У разі збільшення концентрації субстрату до насичуючих та гальмуючих концентрацій пірувату (15 -20 мМ) спостерігалось протилежне явище-хлорид амонію відновлював активність ЛДГ (рис. З,Б).

Аналогічна тенденція спостерігалась також при дослідженні впливу сечовини на каталітичні властивості ЛДГ. У разі насичуючих та гальмуючих концентрацій пірувату, за яких, як було встановлено, виникає явище субстратного гальмування, сечовина відновлює активність ЛДГ. Отже, наведені на рис.З дані свідчать про те, що при нейтральних та слабокислих значеннях pH інкубаційного сердовища і при насичуючих та гальмуючих концентраціях субстрату, хлорид амонію і сечовина відновлюють каталітичні властивості ЛДГ, що має прояв у збільшенні активності ферменту в порівняннні з контролем.

Однак, слід зазначити, що здатність хлориду амонію до відновлення каталітичних властивостей ЛДГ проявляється в значно більшій мірі в порівнянні з дією сечовини, що, очевидно, пов’язано з його здатністю дисоціювати у водному розчині на іони. Не зважаючи на те, що в проведених експериментах підтримувались сталі значення pH інкубаційного середовища як за відсутності, так і за наявності хлориду амонію, його дисоціація на іони, вирогідно, спричинює зміну мікрооточення та поверхневий заряд ферменту. Наслідком цієї дисоціації є те, що хлорид амонію здатний ефективно конкурувати з субстратом за зв’язування зі специфічними субстрат-зв’язуючими центрами на поверхні ферменту, що зумовлює більш виражене зняття субстратного гальмування та відновлення каталітичних властивостей ферменту. Даний ефект відновлення каталітичних властивостей ЛДГ може підсилюватись за рахунок дії йонів СГ, які, як і йони Г, згідно з даними Сабурової Е.А. (1978), конкурують із піруватом за зв’язування в активному комплексі.

Сечовина, в свою чергу, також конкурує з субстратом за зв’язування в каталітичному центрі ферменту. Однак ефект її дії не підсилюється дією аніонів і виражений значно менше через нездатність її дисоціювати на іони. Не зважаючи на вказані розбіжності впливу хлориду амонію та сечовини на каталітичні властивості

Рис. 3. Залежність аісгивності ЛДГ від концентрації пірувату при pH 7,5. Інкубаційна суміш містила 20 мМ (А) та 200 мМ ( Б) КІННОЇ.

ЛДГ, основною рисою дії вказаних речовин є відновлення каталітичних властивостей ЛДГ шляхом конкурування з субстратом за зв’язування в каталітичному центрі ферменту, а також більш істотна вираженність прояву цього процесу при нейтральних значеннях pH , ніж при слабокислих.

Отже, отримані експериментальні дані свідчать про те, що ефект субстратного гальмування ЛДГ, який спостерігається при нейтральних або слаболужних значеннях pH, знімається при зміщенні pH в лужний бік. Додавання азотовмісних сполук (сечовини та хлориду амонію) до інкубаційного середовища при ненасичуючих концентраціях субстрату (пірувату) приводило до пригнічення ферментативної активності ЛДГ. При насичуючих концентраціях субстрату спостерігається протилежне явище. Додавання азотовмісних сполук приводить до відновлення каталітичних властивостей ферменту. Таким чином, протилежний ефект дії сечовини та хлориду амонію як денатуруючих агентів на каталіз при різних концентраціях пірувату, можна пояснити, базуючись на припущенні, що досліджувані азотовмісні сполуки витісняють піруват з нежиттєздатного третинного комплексу фермент-кофермент зворотньої реакції піруват, збільшуючи концентрацію ферменту в активній формі.

Враховуючи те, що при дослідженні явища субстратного гальмування ГДГ при різних значеннях pH інкубаційного середовища не було встановлено розбіжностей у характері перебігу цього процесу, у вивченні впливу хлориду амонію та сечовини на активність вказаного ферменту ми обмежились розглядом випадку тільки рН-оптимуму.

При дослідженні взаємодії ЫАО(Р)+-залежно'1 ГДГ з печінки великої рогатої худоби з хлоридом амонію було встановлено, що при концентраціях хлориду амонію 2-10 мМ активність ГДГ в цілому підвищується (рис.4). Зокрема, при концентрації

хлориду амонію в інкубаційному середовищі 10 мМ, активність фермента зростає на 33 % (рис. 4, Б).

Рис. 4. Залежність активності ГДГ при pH 8,2:від концентрації L-глутамату (А) та за наявності в інкубаційному середовищі 10 мМ NH4CI (Б), 20 мМ NH4CI (В), 40 мМ NH4CI (Г).

При збільшенні концентрації хлориду амонію в інкубаційному середовищі до 10-25 мМ, що відповідає рівню аміаку в крові при ряді патологічних станів організму, спостерігалось поступове гальмування ферментативної активності ГДГ. Так, збільшення концентрації хлористого амонію до 20 мМ зумовлює зниження активності ферменту на 35 % (рис.4, В). В подальших дослідах, збільшуючи концентрацію хлориду амонію до 40 мМ, ми спостерігали зниження ферментативної активності ГДГ на 70% (рис. 4,Г).

Поряд з цим, дослідження впливу різних концентрацій сечовини від 5 мМ до 200 мМ показали, що сечовина лише інактивує фермент. Так, активність ГДГ починає падати при концентрації сечовини в інкубаційному середовищі 40 мМ. Збільшення концентрації сечовини до 100 мМ викликає повну інактивацію ГДГ. Встановлений гальмуючий вплив сечовини на активність ГДГ не є характерним для даного ферменту. Зокрема, Шатілов В.P., (1977, 1984), досліджуючи ГДГ, виділену з Ankistrodesmus braunii и Chlorella pyrenoidosa Pringsheim 82T, встановив значну стійкість ферменту до дії сечовини, яка значно зростає за наявності в інкубаційному середовищі субстратів як прямої, так і зворотної глутаматдегідрогеназної реакції. Однією з причин знайденої нестійкості ГДГ з печінки великої рогатої худоби до дії сечовини є, вирогідно, видова специфічність ферменту. Іншою причиною лабільності ГДГ під дією сечовини є наявність в інкубаційному середовищі субстрату глутаматдегідрогеназної реакції, яке, на думку Шатілова та співробітників (1974, 1977, 1984) приводить до зменшення стабільності нативного ферменту до дії

сечовини, тобто до утворення нездатного до реактивації інактивованого ферменту. При цьому стійкість глутаматдегідрогенази з печінки великої рогатої худоби значно менша до дії високих концентрацій сечовини ніж стійкість ферменту, виділеного з Ankistrodesmus braunii и Chlorella pyrenoldosa Pringsheim 82T.

Ймовірно, що гальмування ГДГ хлоридом амонію пов’язане з перерозподілом водневих зв’язків в молекулі нативного білку, були записані 14 - спектри глутаматдегідрогенази у досліджуваній системі. Порівняння спектрів показало, що за наявності хлориду амонію смуга поглинання глутаматдегідрогенази при 3300 см'1 розширюється в високочастотну область. Виникнення цієї смуги поглинання обумовлено валентними коливаннями NH-груп у поліпептидному ланцюгу молекули ферментативного білку, яка має стереорегулярні валентні зв’язки (Беллами, 1971). Враховуючи відому кореляцію між силою водневого зв’язку та зміщенням частоти Душ (Душ =Уш ’іпьні -уш 3“”3aMi ) (Чиргадзе, 1964), розширення смуги 3300см-1 у високочастотну область спектра можна пояснити перерозподілом водневих зв’язків або ж виникненням слабкіших зв’язків.

Таким чином, встановлено, що при оптимальних значеннях pH інкубаційного середовища та концентрації іонів амонію, що відповідають його концентрації у крові в нормі, спостерігається незначна активація ГДГ, а за умов, що відповідають концентраціям іонів амонію при ряді патологічних станів організму, хлорид амонію гальмує ферментативну активність білка. Отримані ІЧ-спекгри ГДГ під впливом 20 мМ хлориду амонію свідчать про зменшення ферментативної активності ГДГ внаслідок часткового руйнування або перерозподілу стереорегулярних водневих зв’язків в молекулі фермента.

Результати цієї серії експериментів свідчать про активуючо-гапьмуючу дію іонів NH/ на активність глутаматдегідрогенази, що можно пояснити слідуючим чином. Очевидно, іони NH/ виступають як алостеричні ефектори, які при ненасиченості специфічних алостеричних центрів зв’язування на молекулі глутаматдегідрогенази активують фермент, тобто спостерігається явище позитивної кооперативності. Коли ж центри зв’язування насичуються даним апостеричним ефектором, це призводить до перерозподілу стереорегулярних водневих зв’язків в молекулі глутаматдегідрогенази і зміні позитивної кооперативності на негативну, що має прояв у поступовому гальмуванні активності ферменту. Поряд з цим, гальмуюча дія іонів амонію може являти собою приклад гальмування продуктом реакції, тобто ретрогальмування.

ЗАГАЛЬНІ МОДЕЛІ КАТАЛІТИЧНОЇ ДІЇ ЛДГ ТА ГДГ

Аналіз одержаних результатів досліджень та літературні дані (Березин И.В., 1976, 1978; Burgner J., 1973, 1984; Holbrook J.J.A., 1973) дають можливість запропонувати загальну модель каталізу ЛДГ, яка включає в себе утворення нормального фермент-субстратного комплекса, двох непродуктивних комплексів, а

також вплив азотовмісних сполук (хлориду амонію та сечовини) на каталітичні властивості ЛДГ. Для початкового моменту часу ( t=0 ), коли продует та кофермент зворотньої реакції вже почали утворюватись, але їх концентрація у розчині дуже мала, запропонована схема в загальному вигляді має такий вигляд (рис.5).

к-7 к*'а .т-» kt8S . EAS”

EM »Е -■ - ■ -»ЕА —

к-s

_ k+js

к+бМ

k+5i

EBS <---------ЕВ <----------------EAS

—,—" к„ EBP

Рис. 5. Загальна схема каталізу лактатдегідрогеназної реакції, Е - фермент, А -кофермент прямої реакції ( NADH ), В - кофермент зворотньої реакції ( NAD*), S" - субстрат ( піруват ) при нейтральних або слаболужних значеннях pH, S -субстрат при кислих значеннях pH, Р - продукт ( лактат ), М - досліджувані азотовмісні сполуки.

За допомогою маленьких літер а та s позначено концентрації коферменту прямої реакції ( NADH ) та субстрату ( пірувату ), а за домогою маленьких літер Єї, Єг, е3, е4, е5 та е6 позначено концентрації відповідних комплексів Е, ЕА, EAS, ЕВ, EBS та ЕМ. Зворотні реакції К.3 і К* не виписані, так як у початковий момент часу кофермент зворотньої реакції та продукт містяться в інкубаційній суміші в дуже незначній кількості.

Згідно з роботами Холбрук (1973, 1973), в залежності від pH середовища молекула ЛДГ може існувати в двох конформаційних станах. Піруват, в свою чергу, індукує конформаційний перехід ЛДГ, який пов’язаний із протонуванням каталітично важливої групи залишку гістидину в активному центрі. Тому, виходячи з того, що значення pH інкубаційного середовища є суттєвим для прояву каталітичної активності ЛДГ, на схемі зображено два конформери ЛДГ.

Згідно з роботами Бюргнера і Рея (1973 1984), пригнічення активності ЛДГ пов’язане або з формуванням здатного до зворотнього перетворення гальмуючого комплексу з кетоформою пірувату, або з формуванням комплексу між ЛДГ та енольною формою пірувату. На нашу думку, в залежності від значення pH інкубаційного середовища, гальмуючими є різні форми пірувату. Так, при кислих значеннях pH, коли рівновага між формами пірувату кетоформа о енольна форма зміщено у бік утворення енольної форми, саме вона і є гальмуючою для ЛДГ і призводить до формування гальмуючого комплексу EAS. Гальмування при нейтральних або слаболужних значеннях pH, коли рівновага перетворення кетоформа о енольна форма зміщено у бік утворення кетоформи, пов’язане з утворенням гальмуючого комплексу з активною кетоформою пірувату EBS*.

З метою спрощення розрахунків, ми пропонуємо розділити загальну схему реакції на дві спрощені, відповідно до двох форм існування субстрату прямої лактатдегідрогеназної реакції в залежності від нейтральних та кислих значеннь рН, та лужних значень рН інкубаційного середовища. Представляючи всі реакції як реакції першого порядку і виходячи з принципу стаціонарності, було знайдено швидкість лактатдегідрогеназної реакції для обох значень рН інкубаційного середовища:

Наведена вище спрощена формула описує сукупність отриманих експериментальних даних. Так, кут нахилу початкової ділянки графіка залежності швидкості реакції від концентрації субстрату дорівнює

що є характерним для конкурентного гальмування, яке спостерігалось у наших дослідах при ненасичуючих концентраціях пірувату. Вираз описує субстратне гальмування та його зняття при великих концентраціях пірувату, що було зареєстровано при зміні pH інкубаційного середовища в лужний бік. Для ілюстрації запропанованої моделі наведені експериментальні результати.

Узагальнюючи отримані результати про вплив pH інкубаційного середовища на швидкість лактатдегідрогеназної реакції, слід зазначити, що як за нейтральних та слабокислих значеннях pH інкубаційного середовища, так і при слаболужних значеннях, вплив небілкових азотовмісних сполук виявляється у конкурентному гальмуванні активності ферменту, хоча при слаболужних значеннях pH гальмування тяжіє до змішаного типу. Представлені експериментальні результати мають особливе значення, якщо враховувати той факт, що, завдяки своєму місцю в організації метаболічних шляхів, ЛДГ, ймовірно, має здатність до саморегуляції. Це давало б змогу регулювати потоки пірувату у відповідь на зміни зовнішніх умов (наприклад, переключення аеробного гліколізу на анаеробний при напруженій роботі м’язів).

Загальна схема каталізу ГДГ була запропанована нами, виходячи з робіт Фішера та співробітників (Fischer H.F. et al, 1962, 1965, 1969, 1970, 1985) та аналізу власних експериментальних даних (рис.6). Вона враховує утворення фермент-субстратного комплексу, особливості взаємодії ГДГ з субстратом прямої глутаматдегідрогеназної реакції, а також взаємодію з небілковими азотовмісними речовинами.

v

шах

ЕАБ

Н,0

Ч

N11/

ЕВР

ЕБ

її

ЕА

ЕВБ

Б, В

А /1 М ЕМ

Рис. 6. Загальна схема каталізу глутаматдегідрогеназної реакції, Е - фермент, А - кофермент прямої реакції ( МОР* ), В - кофермент зворотньої реакції ( МАОРН), б - субстрат (глутамат), Р - продукт ( а-кетоглутарат ), М -досліджувані азотовмісні сполуки.

Базуючись на принципі стаціонарності, складаючи і розв’язуючи систему лінійних рівнянь, було знайдено швидкість реакції, яка після відповідних спрощень і замін має такий вигляд:

кя +s+Y

Спрощена формула описує сукупність отриманих експериментальних даних. Так, кут нахилу початкової ділянки графіку залежності швидкості реакції від концентрації субстрату дорівнює

КЛ 1 +

М ' К,

що є характерним для конкурентного гальмування, яке спостерігалось у наших дослідах за ненасичуючих концентрацій глутамату.

Дана формула є аналогічною до раніше отриманої формули для ЛДГ. Отже, на основі одержаних експериментальних результатів та аналізу кінетичних схем ми можемо ствержувати, що вплив азотовмісних сполук на каталіз досліджуваних МАО(Р)*-залежних дегідрогеназ якісно не відрізняється.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено явище субстратного гальмування ЛДГ з м’язів свиней при нейтральних та слабокислих значеннях pH інкубаційного середовища, обумовленого утворенням гальмуючого комплексу фермент-МОН-піруват, в якому піруват представлений у вигляді кетоформи.

2. Показано, що явище субстратного гальмування ЛДГ майже повністю знімається при переході від нейтральних до слаболужних значень pH, що пов’язують із зниженням інтенсивності утворення потрійного гальмуючого комплексу фермент-МАРН-піруват внаслідок зменшення спорідненості пірувату до цього комплексу.

3. Досліджено каталітичну активність ГДГ з печінки великої рогатої худоби за різних рначень рН інкубаційного середовища. Виявлено явище субстратного гальмування в діапазоні досліджуваних значень рН (від 7,5 до 8,8). Знайдено, що максимальна швидкість реакції спостерігалась при слаболужних значеннях рН, причому вона досягалась в середньому вдвічі швидше, ніж при нейтральних та лужних значеннях рН.

4. Показано, що при ненасичуючих концентраціях субстрату хлорид амонію та сечовина гальмують ферментативну активність ЛДГ у реакції відновлення пірувату; гальмування йде по конкурентному типу. При насичуючих концентраціях субстрату спостерігається протилежне явище, а саме: додавання азотовмісних сполук приводить до відновлення каталітичних властивостей ферменту.

5. Встановлено, що при оптимальних значеннях рН інкубаційного середовища ( рН 8,2) та значеннях йонів амонію, що відповідають його концентрації в крові в нормі, спостерігається збільшення активаності глутаматдегідрогенази - на 33 %. При збільшенні концентрації іонів амонію до значень, які спостерігаються при деяких патологічних станах організму, хлорид амонію гальмує активність ферменту.

6. Отримані ІЧ-спектри глутаматдегідрогенази під впливом 20 мМ хлориду амонію підтвердили припущення про перерозподіл або часткове руйнування стереорегулярних водневих зв’язків в молекулі глутаматдегідрогенази під дією хлориду амонію в концентраціях, що не призводять до денатурації молекули ферменту.

7. Встановлено, що активність ГДГ з печінки великої рогатої худоби гальмується незначними концентраціями сечовини, на відміну від відомих даних стосовно впливу сечовини на активність ГДГ, виділеної з мікроорганізмів. Це обумовлено наявністтю в інкубаційному середовищі субстрату глутаматдегідрогеназної реакції, наслідком чого є зменшення стабільності нативного ферменту до дії сечовини.

8. Розроблено загальні кінетичні моделі каталізу ЛДГ та ГДГ. Моделі каталітичної дії ЛДГ та ГДГ включають в себе утворення нормального фермент-субстратного комплекса, двох непродуктивних та проміжного комплексів, вплив різних значень рН інкубаційного середовища на активність ферментів, а також вплив хлориду амонію та сечовини на каталітичні властивості зазначених оксидоредуктаз. Отримані на основі математичних розрахунків формули швидкостей лактатдегідрогеназної та глутаматдегідрогеназної реакцій підтверджують знайдений попередніми кінетичними дослідженнями факт, що гальмування активності ферментів під дією сечовини та хлориду амонію відбувається за конкурентним типом.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Смовж С.А., Захаренко М.О., Тупицька О.М. Особливості впливу хлориду амонію на NAD( Р)+-залежну глутаматдегідрогеназу з печінки великої рогатої худоби. // Укр.биохим.журн. - 1997. - Т.69, № 3. - С. 112-115.

2. Тупицька О.М., Захаренко М.О., Мельничук Д.О., Засєкін Д.А., Смовж САДеякі аспекти взаємозв’язку обміну речовин у вагітних тварин та їх плодів. //Укр.биохим.журн. -1997. - Т.69, №2. - С. 35-40.

3. Смовж С.А. Вплив небілкових азотовмісних сполук на активність лактатдегідрогенази. Загальна модель каталітичної дії ЛДГ // Укр.биохим.журн. -1998.-Т.70, № 1. - С. 41-48.

4. Смовж С.А. Вивчення активності лактатдегідрогінази під впливом небілкових азотовмісних сполук.// Наук. Вісн. Нац.аграр.ун-ту. - Київ. -1997. - №2. - С.17-25.

5. Смовж С.А., Захаренко М.О. Перспективи використання 31Р ЯІУІР дослідження крові в тваринництві. // Наук. Вісн. Нац.Аграр.Ун-ту. - Київ. -1997. - №2. - С.39-44.

6. Smovzh S.A., Zakharenko М.О. Study of Influence Mechanism of Nonprotein Nitratecontaining Substances on NAD(P)+-Dependent Glutamate Dehydrogenase from Bovine Liver. // Conference of European Society of Veterinär and Comperetive Nutrition/- Munich (Germany). -1997. -P. 19.

7. Смовж С.А. Вивчення функціональних властивостей NAD+-зaneжниx дегідрогеназ під впливом небілкових азотовмісних сполук. II Тези доповідей УП Укр. біохім.з»їзду. - 4.1. - Київ. -1997. - С. 71-72.

8. Захаренко М.О., Мельничук Д.О., Смовж С.А. Вплив амонійного азоту на активність лактатдегідрогенази з м”язів свиней // Мат. науково-практичної конф. «Неінфекційна патологія тварин», - м.Б. Церква. -1995. - С. 195-196.

9. Смовж С.А.Дослідження впливу амонійного азоту на ферментативну активність глугаматдегідрогенази з печінки великої рогатої худоби. Н Мат. Науково-виробничої конф. «Актуальні питання ветеринарної медицини»», - Київ, НАУ. -1995.-С. 123.

Ю.Смовж С.А, Мельничук Д.А., Захаренко H.A. Влияние аммонийного азота на активность лакгатдегидрогеназы из мышц свиньи. // Труды 2-й Междунар.конф. «Актуальные проблемы билогии животноводства». - Боровск, (Россия). -1995. - С. 96.

11.Смовж С.А., Мельничук Д.О., Захаренко М.О. Особливості впливу амонійного азоту на активність глутаматдегідрогенази з печінки великої рогатої худоби. // Мат. наукової конф. професорсько-викладацького складу та аспірантів «Сучасні проблеми ветеринарної медицини». - Київ, НАУ. -1997. - С. 12-13.

12.Смовж С.А., Мельничук Д.О., Захаренко М.О. Дослідження механізму впливу небілкових азотовмісних сполук на каталітичні властивості лактатдегідрогенази з м”язів свиней. // Мат. наукової конф. професорсько-викладацького складу та

аспірантів «Сучасні проблеми ветеринарної медицини». - Київ, НАУ. - 1997. - С. 13-14.

Смовж С.А. Вплив хлориду амонію та сечовини на структуру і функції лактатдегідрогенази та глутаматдегідрогенази. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Національний аграрний університет, Київ, 1998.

В дисертації на моделі in vitro досліджено вплив різних концентрацій небілкових азотовмісних сполук (хлориду амонію та сечовини) на каталітичні властивості №АО+-залежної лактатдегідрогенази з м’язів свиней та МАО(Р)+-залежної глутаматдегідрогенази з печінки великої рогатої худоби за умов, що відповідають нормальним та патологічним станам організму. Вивчаючи каталітичні параметри вказаних оксидоредукгаз, автором досліджено вплив різних концентрацій субстратів реакцій, значень pH інкубаційного середовища та небілкових азотовмісних сполук на основні каталітичні константи, що характеризують функційонування лактатдегідрогенази та глутаматдегідрогенази. На основі отриманих експериментальних результатів запропановані загальні моделі каталізу лактатдегідрогенази та глутаматдегідрогенази, які містять інформацію про утворення нормальних фермент-субстратних комплексів, проміжних та нежиттєздатних комплексів, вплив різних значень pH інкубаційного середовища та концентрацій субстратів, а також вплив хлориду амонію та сечовини на каталітичні властивості досліджуваних оксидоредуктаз. Проведені дослідження дають змогу запропонувати один з можливих механізмів негативного впливу високих концентрацій аміаку на окисно-відновний метаболізм та встановити особливості цього впливу в залежності від умов оточуючого середовища та концентрації небілкових азотовмісних сполук у ньому.

Ключові слова: лактатдегідрогеназа, глутаматдегідрогеназа, хлорид амонію, сечовина, модель каталізу лактатдегідрогенази, модель каталізу глутаматдегідрогенази.

Смовж С.А. Влияние хлорида аммония и мочевины на структуру и функции лактатдегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Национальный аграрный университет, Киев, 1998.

В диссертации на модели in vitro исследовано влияние различных концентраций небелковых азотосодержащих соединений (хлорида аммония и мочевины) на каталитические свойства ЫАО*-зависимой лактатдегидрогеназы и ЫАО(Р)+-зависимой глутаматдегидрогеназы в условиях, которые соответсвуют нормальным и патологическим состояниям организма. Изучая каталитические

параметры указанных оксидоредуктаз, автором было исследовано влияние различных концентраций субстратов реакций, значений pH инкубационной среды и небелковых азотосодержащих соединений на основные каталитические константы, которые характеризуют функционирование лактатдегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы. На основе полученных экспериментальных результатов предложены общие модели катализа лактатдегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы, которые содержат информацию об образовании нормальных фермент-субстратных комплексов, промежуточных и нежизнеспособных комплексов, влияние различных значений pH инкубационной среды и концентрации субстратов, а также хлорида аммония и мочевины на каталитические свойства исследуемых оксидоредуктаз. Проведенные исследования дают основания предложить один из возможных механизмов негативного влияния высоких концентраций аммиака на окислительно-восстановительный метаболизм и установить особенности этого влияния в зависимости от условий окружающей среды и концентрации азотосодержащих соединений в ней.

Ключевые слова: лактатдегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа, хлорид аммония, мочевина, модель катализа лактатдегидрогеназы, модель катализа глутаматдегидрогеназы.

Smovzh S.A. Influence of ammonium chloride and urea on the srtucture and function of lactate dehydrogenase and glutamate dehydrogenase. - Manuscript.

Thesis for candidate’s degree by speciality 03.00.04 - biochemistry. - National Agrarien Uiversity, Kyiv, 1998.

Influence of ammonim chloride and urea on structure and kinetic properties of NAD*-dependent lactate dehydrogenase from pig muscle and NAD(P)+-dependent glutamate dehydrogenase from bovine liver has been studed in vitro under the conditions corresponding both the normal and pathological states of organism. The effect of different concentrations of substrates, quantity of pH and nonprotein nitratecontaining substances (ammonim chloride and urea) on the main catalytic constants which characterize catalytic ability of lactate dehydrogenase and glutamate dehydrogenase was studied. On the base of experimental data the general models of catalytic action of lactate dehydrogenase and glutamate dehydrogenase have been proposed. These models include the information about normal enzyme-substrate complexes, intermediate and abortive ones, influence of different pH quantities and several concentrations of ammonim chloride and urea. This study gives an explanation regarding one of the possible mechanisms of nonprotein nitratecontaining substances different concentration action on the activity of oxidation-reduce metabolism.

Key words: lactate dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, ammonim chloride, urea, model of catalyses of lactate dehydrogenase, model of catalyses of glutamate dehydrogenase.