Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние глубокого замораживания на плазмалемму культивируемых клеток растений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние глубокого замораживания на плазмалемму культивируемых клеток растений"

" РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ КМ. К.А.ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

«ВДОРОШШЙ ДютриЗ Кгколаэнот

ВЛИЯНИЕ ГЛУБОКОГО ЗАЫОРШВШЯ НА ОШШШ

о

КУЛЬТИВИРШЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИИ, (стадиальность CQ.00.I2 - физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

UOÇRBâ - 1992

Работа выполнена в отделе биологии клетки и биотехнологии Института филологии растений им. К.А.Тимирязева Российской академии наук. . ..

Научный руководитель

. кандидат биологических наук А.С.Попов

Официальные оппоненты

- доктор биологических наук Н.И.Шевякова

- доктор биологических наук В.А. Веселовский

Ведущая организация

- Институт почвоведения и фотосинтеза РАН.г.Пущино

Защита диссертации состоится " № " 1992 г.

в № часов на .заседании Специализированного совета К 002.45.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Институте физиологиирастений им. К.А.Тимирязева РАН по адресу: 127276, г.Мооша, ул. Ботаническая, 35.

С диссертацивй ионю ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им.К.А.Тшорязева РАН. '

АвтореСерат разослан " %'

£ • ' еьт^

1992 Г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Л.И.Сергеева

Актуальность проблемы. Влиянию низкихртрицательнцх температур на растительные объекты посвящено большое число исследований. Однако, изучение повреждений плазмалеммы при замораживании в основ- -ном проводилось Is situ ели на изолировании* протопластах и бнло направлено на изучение морозостойкости растений. В то не гремя нет работ, посвященных влиянию глубокого, замораживания на плазмалемму ' культивируемых клеток растений In Vitro. При длительном культивировании клеток возможны генетические изменения, в результате которых штаммы-продуценты теряют, свои уникальные свойства. Единственным надежным способом сохранения генофонда клеток является крио- . генное хранение. Из-за физиологических особенностей растительных объектов процедура их криосохраненил сопряжена со значительными трудностями. С одной стороны» необходимо избежать образования льда внутри клеток, а с другой - попытаться ослабить при .замораживании г повреждения протопласта в результате чрезмерного осмотического сжатия. При медленном программном замораживании с инициацией крхгс-„ таллизации на первое место выходит груша повреждений, связанная с сильной дегидратацией клетки. Гибель клеток в результате осмотического сжатия тесным образом связана о необратимыми повреждениями плазматической мембраны.

Цель и задачи исследования. . с

Основой целью проведенных исследований являлось изучение динамики и причин повреждения плазмалеммы культивируемых растительных клеток на разных этапах процедура гдлюсохранения. : В рамках этого необходимо бнло решить оладущие задачи:

- разработать катод определения повреждений плазмалегаш клеток в ' суспензионных культурах toTitro при их програмсз! замораживании и при моделировании происходящегово время этого процесса осмотического сжатия в растрах ооютшЬв щя +2®Ci

- спомощью данного метода провести наблюдение за динамикой повреждений плазмалеммыклеток на разшх атапахпроцесса замора-гзвания до -196° и последующего оттаивания;

- исследовать взаимосвязь между повреждениями плдзиаш?а клеток при программном замораживании я при моделировании осмотического сжатия происходящего во время этого процесса; , -

- выяснить некоторые механизмы закаливания клеток женьшеня итаима .. ИРР х-2, которое необходимо для приобретения криоустойчивости;

- исследовать, является ли система активного'транспорта олазмалеммн (К+- стимулируемая, Mf^"- зависимая АТвЬаза) основной причиной повреждения клеток при програшвом замораживании. ;

Научная новизна. Впервые установлена динамика повреждения плазмалеммы клеток, культивируемых in vitro на разных этапах процеду-дур! их криосохранения. Выявлена тесная корреляция между повреждениями плазмалеюш клеток суспензионных культур во время замораживания-оттаивания имоделированиемпроисходщего во время этого процесса осмотического сжатия'в растворах осмотиков. Установлено, что холодовое закаливание культур с добавлением сахарозы в среду до 20* или предварительное культивирование с некоторыми аминокислотами позволяет уменьшить при замораживании-оттаивании степень повреждений плазмалемш. Показано, что гибель; клеток при замораживании обусловлена необратимыми повреждениями плазматической мембраны, а не происходит в результате функциональных нарушений Н+- АТФазн.

Практическая значимость. Разработан оригинальный метод определения повреждений плазмалеммы клеток, суспензионных культур In vitro, как при программном замораживании, так и при моделировании происходящего во время этого процесса осмотического сжатия клеток . в растворах с возрастающей осмоляльностью. Использование метода возможно и для определения сальных повреждений плазмалемш при любых экстремальных воздействиях в условиях пониженных (от +5° и ниже) тешератур. Установлено, что,степень повреждений плазмалеммы при осмотическом сватии клеток, происходящем во время замораживания, связана с физиологическим состоянием культуры. Имеющиеся в работе рекомендации имеют фактическое значение в области криосохранения растительных ресурсов.

Апробация работы. Цэтераадн'диссертации были доложены на расширенных семанарах Отдэла.биологии клетки и биотехнологии а П Всесоюзной конференции, голодах ученых по фонологии растительной клетки. Минск,: 15-20 щреля 1990.

Публикации. По материалам диссертации, опубликовано 6 работ.

Обьем в структура диссертации; Диссертационная работа (130 страниц, 25 рисунков, з таблицы) состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 175 наименований, из которых 133 иностранных.

материалы и методы иссашяовшя-:- ''••>/•;•'

Объекты исследования.

.В работе использовали суспензионные культура клеток диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea Wall.) - втимы. ИГР Д-1, ИЗР ДМ -0,5, ПФР ДМ-8 я еэньеоня настоящего (Ралах ginseng L. ) - птамж: ИГР K-I я ИГР п-2 (все голучеиа в льбораторта культуре тканей п морфогенеза ИГР РАН). Выбор данных объектов Сил связал с их различной криоустойчивостью к глубокому зачоратавашю до -1Э50С„ Суспензионные культуры клеток диоскотеи к кеньсеня Ентзагздвалл

-Т

на подвесной качалке (скорость вращения 100 сб. лая радиус вращения 20 км) в темноте при темюратуро 25+1°0, относительной влажности 70», на тдкфгшкровскноа среде Нураскге л Скуга. Шхл пер:га-дпеского культивирования состгзлял 14 днеЯ.

вяуорпметрический нетод определения поврекденлй шшзкалэммы. Метод основан на Систром прошжнотшк - в зтки .ешуоресцекн-даацзтата (СДА), распадо его там под деСствием эстераз с 'образованием свободного Слуорэсцегаа, который'через неповрежденную клеточную кзмбрзну пртг тмиюратурах около 0° выходит очень мэдгеннэ. Сущность метода состоит в добавлении :: клеточной суспензии СФ-. в конечной концентрации 5 ю-3кг/мл за 10 минут перед воздействии на клетки экстремального фактора. Образовавшийся в клетках флуорес-цеин при сильных поврехдеких плазмалеммы выходит в сокрукэгаций криозещнтный раствор. Раствор от клеток отделяли путем фильтрования. Содержащиеся в ©татрата эстеразы кнахтивировали при температуре +вО°С в точение 10 кинут, раствор охлаздали и определяли интенсивность его флуоресценции на спектрофлуориметре Hitachi î£?ï -4 при дша волен возбуздэния 425 ш я длине'волны флуоресценции -515 пл. Учитывали фоновую флуоресценцию среда, го есть те поврег- ■ Дания, которые имеют место до стрессового воздействия и общую (суммарную) флуоресценцию, которую легко определить при 'условии полной деструкции всех испытуемых клеток. Поэтому для определения относи- . тельного количества (%) клеток с , поврежденной шшзмалеммой, при экстремальном воздействии использовали формулу, включающую все

перечисленные вше факторы.

' . •

у =----100% (I), где

Рпв-Рф " ' ■ .

фоновая флуоресценция (контроль I); " " Рт- характеризует полный выход флуоресцеана при двухкратном • быстром заморашванни и медленном оттаивании, приводяпзм к

полной деструкции всех клеток (контроль 2): Р0 - интенсивность,флуоресценция в опытном варианте;-При проведении экспериментов в гипертонических растворах для определения количества (X) клеток о поврежденной плазмалеммой использовали дополнительную формулу, позволяющую вычислить величину

V ' ':' .

Рф - фоновая флуоресценция, создаваемая оказавшимся во внеклеточной среде флуоресцеином после 10 минутной обработки клеток ОДА (контроль I);

Рдл - флуоресценция среда после плазмолиза клеток; рдепл.~ Флуоресценция среда после дешшзмолиза клеток; N - степень разбавления флуоресцирующей среда при плазмолизе; п - степень разбавления флуоресцирующей среды при деплазмолизе; ?0- суммарная интенсивность флуоресценции при плазмолизе и деплазмолизе клеток..

•Определение растворимых внутриклеточных Сахаров. Количество сук,¡арной фракции эндогенных Сахаров определяли феноль-.шм методом СЩо1з, 1956). Параллельно с.определением Сахаров учитывали сырой и сухой вес 'ткани'в 4 повторностях на каждый вариант. . . Выделение фракции плазмалэкш. ■ - • .

Клетки7отштые от.среды культивирования, гомогенезировала при 4° г среде, содержащей 0,5 М сахарозы, БО Ш трис-MES, 8 КМ ЭДТА, 2 Ш ДТТ, 2м\5 l^&jOg рН 8,0 в соомогении ткань:среда - 1:4. Диф-. ференцпальное центрифугирование осуществляли сначала при 8000 g 2'0 минут, затем супернатавт центрифугировали при I0500Q g 35 минут. Полученную, ьакросоыальпую фршда мягко ресуспендировали в буфере, содержащем 0,5 М сахЕрозц.'БОмМ трио-lSS, I кМ ЭДТА, 2 Ш ДГТ, .ра 7,2 и наолаизала па . градиент плотности сахарозы 22-30-40%, цри-готовленныа на буфере.'содеркащеы: 2 iü трпс-ШЗ, ^ кМ ДТТ, рН 7,2, затем центрифугировал! 2 часа пра 60 ООО g. Сракцшо мембран, обогащенную элементами плазмллекма собирали с. иатзрфазы 30/40$ сахарозы Степень обогащения фракции оцэнэдали с помощью шгиСиторного анализа К+-стЕ^улируе;,:оЛ, Кз?±за22сямой Н^-АТСазы.

опр"9дё.тенш1|^-АТСазЕоа~акийзности плазмалеммаГ . При исследовании фос£огидролазной активности препаратов плаз-малеммы реакцию гидролиза ATO проводили при . 37° в реакционной среде: 50 Ш трис-MES, 40 мкы ЭДТА, 50 ¡üi КЫОд, 1 BíM КаЛд, 100 МкЫ (Iffl^gMOyO^. рН 6,5. Реакцию напускали добавлением'в реакционную с

срзду, содержзщ'и суспензии кеморан (2-2,5 г.кг бедха), КзШ и останавливали, добавляя 60S трихлоруксуснуя кислоту. Ерзмя квкубгцзи 20 кинут. Оеркзнтативвуя активность выражала в наноглолях освобождаемого фосфора нз I ккг бояса в чос. КеоргаклческкЯ фосфат определяли по мзтоду Картер и Карл (Carter, F.arle19c3)e я концентрации белка в препаратах - по метод' Брэдфорд (Bradford, 1976). Загрязнение Еззнсулярной фрпкшш юторфззы 30/403 сахароз:: кепласжги-чзссгщ мзкбрэпамя опоютгага путем доЗпвления я реакционную срзду скецпЖйпзскгх кнгпбитсров АТФ-аси тотюяягстз СЯГ0о) к плазчзлзи-(TiäV04), а такта колкбдата «екша " огпдз натр-:;;, oöecrro-n::2an-sar шдап.лстг/.з яоспортф'лескях фэсфотоз « гатохопдргашюй ЛТС-азн соответственно. Позстскту Итасоэ/лза п т'рчсячэяьну» скорость ф>эр;:?:1-татипгсй роскцтп: опрзд»лядн о потечь» сикрш расчета донных по Kanes- Wolf.

Подготовка клеток к глубокому паморзишапип или воздействие пяергспктоскгс: растгорозз. i

Для усшеного крассохршзкяя клеток птп"мо;з ДЧ-0,5, £t-8 :x Z-I перед заморахпванком достаточно л^ь добавление растворов криопро-текторов, а для Д-I и Н-2 крэке этого соответственно нзоб/оджо, либо предварительное культкг-ированпе (5 дней) с аг.'икокиелота.'.п (зсперзгкн или продля 0,02 М), либо закаливая;» (7 дпсЗ при • 12° х 14 дней при +2° с постепенным добавлением сахарозы в среду до 203) Процедура за:,;орагл1за:п'я-оттаивгге:я.

Для экспериментов использовал:! культуру.на 5-6 день посла пересадки в экспоненциальной фазе роста. Крпопротекторсм для клеток дпоскореи служил ДМСО в концентрации 10%, а для женьшеня с!,;зсь сахарозы и глицерина б конечной концентрации IOS каздого вещества., Эксперименты проводили на программном заморзживатолэ 'тша ЕЛ 00.00 00. (СКТБ ИПКиК АН УССР, г.Харьков), по'следующей программе: охлая-дение ампул до -5° со скоростью 0,5°G мин-1;' инициация кристаллизации 1сриозащитного раствора; 10-15 минутной стабилизация при -5°; апсгениэ температуры до -40° со скоростью 0,3-0,5°С а от -40°

до -70° со скоростью 9°С мин-1; быстрое погружение з г:пдклй азот. ' В ходе эксперимента ампулы с клетками для флуориметрки отбирали в температурном интервале от 0° до -40° через каггдпз 10° и при -70° я -196°. Оттаивали клетки в водяной бане при температуре 40°.до исчезновения кристаллов льда. Параллельно с определением количест- ■ ва клеток с поврегданкой мембраной осуществляли цлтологичоский' контроль за.их жизнеспособностью по окраске с феносафраником.

Моделирование осмотического сжатия клеток, происходящего во

время замэрзшвания.

Зксшриментэльешм путем били определены точки замерзания растворов СаС12 и сорбита с возрастающей осмоляльностью в присутствии дао и без него. Для расчета осмоляльностей использовали формулу: осы * At/1,86. Воздействие на клетки гипертонических растворов с осмоляльностями, соответствующими тем, которые возникают в условиях реального замораживания до -10,-20,-30,-40°, проводили при температуре 2°. Используемые раствори готовили на 10% ДЖО для клеток диоскореи или на криозадтной смеси, состоящей из 10% сахарозы и 10% глицерина для клеток женьшеня. РастЕоры .осмо-тпка добавляли к клеткам со скоростью, соответствующей первому этёду программного заморакивания. При достижении установленлешюй концентрации-раствора клетки инкубировали еце в течение 15 минут и отбирали надосадочную гвдкость для флуоряметрии. По флуоресценции в надосадочной кидкости судили о -степени повреждений плазма-леммы клеток в результате плазмолиза. К оставшимся клеткам добавляли охлагдекнуп среду üypacirre и Скуга до исходного объема и отбирали пробу для фяуориметрии, то есть определяли поврекдения плазмалегаа клэток в результате дзплазмолиза.

Полученные данные обрабатывали статистически '(Плохидский,1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБ'СШЗНИЕ.

Особенности использования флуоримэтрического катода.

Флуорцметрический ивтол позволяет определять относительное • количество клеток в подудадни с лрррездешоЗ плазматической мембраной. Число таких кяетш оценивают да выходу флуоресцеина (в процентах) но сравнению о его полным выходом, принимаемым за 100%, при полной дестрдаш дсех маток (см.стр.5). Для использования флуориметрического катода пеобходягло било найти условия, при которых флуоресцеиз достаточно долго сохраняется в клетках. На рис.1 приведена зависимость спонтанного выхода флуоресцеина от эреыещ} при разных температурах, ИшсуСдроБзшю вдэток даоскореи или женьшеня при температуре -5° и 2° в присутствии ьташротектора р течение 60 минут ко приводит к вяходу флуоресцеина из кнтактнах кяе.-ток, в то г® вргт ври 20° потеря флурресцедаа клетками знэтетель-на. Для обеспечения точной работы метода необходима инактивация эстераз (80°, 15 минут), оказавшихся в'фильтрате б результате ва-русения структура шаа.ш8:ды клеток, Я&ккз яссдежФэняяки было 6

ДСКГзЗПНО» что XCpO'J'.O Р:У' УС-.ТГГРЛ'СС'' ^е^ОГ'^-

тур» когда riirpo'KTn-îecKO'i r.slc^x's отеераз свуд?Г:3 г. r/reïi-jvyriy.

О'ЮНЬ '33ОТО^ГОТ c'.'ir'O'ита--

услош<Л пег>я поз1:ол-»ет

;?зрр:а!Ж5№ es полупрсштаи-сг'!* сзойсгва. £

.4

'"а .

\

V

м.я

Fnc.ï. Ззпхскг/сст/» шход* йпуор-зсцс^'нп мз клеток шгиГ.:.-Д-1 (Л) К î'îP гг-ï (Б) от времен/. их мякубавде ядп -5°(12Э (2) -л ?£•'

Поврог-слегшя даггкалеглш клетей днсскорги при

\юргт.:.

-оттаивзниа п осмотическом сжатии и гчетертонкчесщк рястворэх. " ;с следования повоеядек®! плазмзлеммл клеток иазжх

результаты

птаммов диоскорэа показываю?, что прщ зачорахяваят до -ЗС° увеличение числа клеток с нарусенноЛ мембраной к,".зет линейный характер (рис.2А). При,более низких тег.яературак (от -40° и .вплоть до погружения клеток з ггидкгй азот) в гетерогенной клеточной популя-щэт остается пул крпоустойчивых клеток, у которых щи дальней®: охлаждении до -1?з° рост повроадвнкй плагмалеммы незначителен. (от '4-1015 у да-0,5, да-8 и до 237о у Д-1). Для мутантшх штаммов ДМ-0,5Г ДМ-8, отличгэдгся относительно высокой криорезкстентностыэ, число устойчивых ¡слеток в популяции болзо, чем в 2 раза превосходит жизнеспособный клеточный пул, характерный для штамма Д-1. Нами было также обнаружено, что предварительное культивирование клеток Д-1 с аминокислотами позволяет в 2-2,5 раза увеличить этот пул» Отличие в крноустойчпвостп мег-ку очевидно, связано о фи-

зиолог:песк:"С1 особенностям: исслздуе.мых клеток. Вероятно, криоус-

ж'РО

о

•о

I

•5

К.

t;

о-

Б

■-100 -200 л> ёнпергл! ypaj °0

Рис.2. (I) и (А) и

О Щ75''2!^0

• осмошьцлеть

Повреждения плазмзлэкмы клеток диоскореп птаммов КФР Д-1 ПФР ДМ-0,5 (2) и ПОР ДМ-8 (3) щи замораззэнж-оттеиванпи в растворах хлористого кальция (Б).

■ 0 ■ . . /0,75 Щ12 ' %S0 :" .OCr-iOflUflbHpCtnb. РЗСтВОРд

•Рис.8. Осмотические повреждения плазмалемд! клеток .различных штаммов диоскореи при плазмолизе (заштриховано) и деплазмолизе (не заштриховано). I - клетки штамма ИФР Д-1, 2'- клетки штамма ИФР ДМ-0,5, 3 - кленки штат Ш> Д-3. 10 ' .

тойчивыми являйся ялэтки, содержащие большее количество осмотически активных веществ и,как следствий, обладающие меньпим водным потенциалом. Это способствует ограничению их. обезвоживания и снижению механических нагрузок на плазмалемму при сжатии протопласта во время замораяивания клетки, Не исключено, что предварительное культивирование клеток диоскореи с аминокислотами приводит также и к структурным изменениям ее мембранной системы.

Такхе линейно увеличивается количество меток с поврежденной плазмалеммой и при действии одной лишь' дегидратации э растворах CaCLg или сорбита. При достижении осмоляльностя 16,12 осм, соот-ветствушей -30°, выход флуоресцеина из клеток прекращался (рис. 2В). При эквиосмотическом сжатии клеток fî.î-0,5 и JSi-в в растворе CaClg, степень повреждений плазмалеммы соответствует той, которая имеет место при программном замораживании и в 2 раза ниже, чем у клеток стамма Д-I (рио.2Б). При осмоляльностях.10,75 - 21,50 клетки культура Д-I повреждаются заметно больше при деплазмолнзе, чем при плазмолизе. У мутантних штаммов ДМ-0,5 а ДМ-8 столь значительного различия по числу клеток с поврежденной плагматехгсЛ util плазмолизе и деплазмолизе не обнаружено (рис.З) .Результаты пог-зол.ет высказать предположение, что грубые повреэденпя 'шпзмалеммн происходят как при плазмолизе, так й при деплазмолига. Установлена ios-кая корреляция между дегидратацией при зЕМоражявзетй^огтйПвании и эквиосмотдческим сжатием при +2° в растворах ссиэтиков. Гакта об-разом,по нашим данным, решающую роль в пазрепг.гшз! хкзтек скорей при замораживании играет осмотичзсхоэ ежзтхо, в результата которого и происходят летальные повреждает;: тглазмзлекмы..

Повреждения плазмалеммы клеток кэякмйя при згмерйзсташл-от-

таиванш и осмотическом сжатии в гетаргсническях. растворах.

Исследование повреждений плазмалэк.а ита:.":ов iîiP 1>1 и ПФР К-2 в процессе заморакивания-оттааипнпя с лскс^ью ©луор:г.:бтрического метода показало линейный характер нарастания числа клеток с Hàpy-кенной плазматической мембраной до тсулэрзтут.ц -30°. При более низки: температурах (как и в случае :слэтск дксскоре:0 в'гетерогенной популяция остается пул устсйчпзта г. сзерхзшзким температурам клеток, у которых рос? поэрегдоний ячагяахаха незначителен вплоть до -196°. Для культури штиля Н-2, сакадоняой с постепенным добавлением сахарозы в среду, и аткгма "l-l 'тлело клеток с непогребенной плазмаломмой з температурном диапазоне от -<!С° до -ISS0 л 2,5 раза

'Ч

40 т Cl

G

Gj

i?

l ль

о.

Ч>

Si c>

Si

fl

Сз

s

¡¡0

D

r53

r

~ o S-ü

[.¡и>

/

J.,

0

f.

Я !

У

-1

о í

-200 . т

IQJ3 Z'.íC, Самопнльнаспь

■o -ico

mptfnPD¿myo¿¡¡

Рис.4. Повреждения плазмадеуми ххзтоа ьагльпеня итаккзи 1ДР E-I (1} и ПС-Г S-3 (2,3) при за:.!орэ^:вашш-отта;1Башп! (А) к в растворах хлористого кальция (Б),

• ^ ¡30 •

С5 ■ f? ti (-V

5;

к

Cl

о С:

CJ

ад

>4

о я

5,2 5 (0,75 <вд '

оснопяаьнйсть раствора

Рис.5. Оскотичесга.3 повреждения плазмалемка клеток 'кеньсеня при плазмолизе (заштриховано) и деплазмолизе (не заштриховано). I - клэиси втоьма ЖР E--I, 2 - клетки кташа КФР Е-2, проиедико закаливание, 3 - козакалошшо клетки штамма ИФР К-й.

превышает аналогичный показатель для незакаленной культуры штамма Ж-2 (рис.4А). . '

Моделирование осмотического сжатия при замораживании-оттаивании в растворах СаИ^ также показало линейный выход фдуоресцеина при увеличении концентрации раствора до 16,12 осм (рис.4Б). Дальнейшего увеличения повреждений плазматической мембраны почти но происходит. У культур штаммов Я-1 и Ж-2 (заквленной с добавлением сахарозы) осмотическое сзатш, такзгэ-как и заморояиванпо, выявляет больший пул устойчивых ¡елоток, чем у лезакаленной культуры птамма Н-2. Закаливание позволяет снизить суммарные повреждения плазмалеммы при эквиссмотической дегидратации за счет уменьшения степени повреждений плазмалеммы при деплззмолпзо • (рис.5). Необратимые повреждения плазмалеммы, приводящие к нарушения структуры мембраны происходят как при плазмолизе, так и-при деплазмолизе. Аналогичные повреждения имеют место л при замораживании-оттаивании. Таким образом, была еыявлена корреляция мезду ;срко- и ссмо-устойчивость» клотсч двух штаммов аеньгеня. Реиашуа роль з воз-какапэдх повреждениях, плазмалеммы, нарупакцих зэ структуру, лграе? осмотическое сжатие, приводящее к сильной дегидратации клв'.ск. 'Изменение физиологических характеристик суспензионной культуры женьшеня и содержания в клетках рзстворй-лх ссхарэз з процессе холодового закаливания; ' ' Для изучения влияния закаливали тгз.кр'таус'.'о.тглсость плазмалеммы клеток штамма Н-2 были проведены две пегевясгазю серии окспаря-ментов. В первой закаливание проводил с ^-с^энзншм добавлением сахарозы в питательную среду до конзтлсй 20.», а во второй - без добавления сахарозы, то ссчь псслэдогсет .лишь температурного фактора. При зпхзлттг" (21 ) еуеЕЭЖягрщаюЯ культуры штамма ИФР Н-2 с постзшшга зполячекя-ч В0тд;0Я7р8!Ш сахарозы от 3% до 202, лазь в парзуэ нодзлз тхр;? Т2? ВЗОЙШИЯ увеличение сухой массы клеток в 1,7 раза, а з посгедутяда две редели при 2° увеличения сузоЛ массы происходило, Стр гшдга еёьятаю, так как хорошо известно насколько захноэ ¡зна-гездо аграз? т^ЛТэвз-турный фактор для роотз культура 1п т!Лгэ, В то ;?э зрекз, р?вязэ-ш:е сухой массы к енрой возрастает к концу-закаливания з 1,6 раза, В ходе закаливания с постепенны:.! добавлением езззроза оСнзругэдо такке возрастание количества внутриклеточных сзхарсв в 1,6 разя, Зти данные свидетельствуй? о стиании оводненпости клеток.

При зЕлШЕйании клеток на постоянной концентрации сахарозы в среда (3 %), наоборот, происходит уменьшение их содержания в*2 раза по сравнены) с незакйленкой культурой. Это, вероятно,происходит в результате утилизации эндогенных сахароз на подцерканиэ жизнедеятельности клеток. При этом сухая масса культуры и ее отношение к сырой нэ изменяются на протяжении всего процесса закаливания. Этот факт, по-видимому, связан с недостаточным количеством сахарозы для поддержания нормальной инзнедвятельности клеток при 2-12°. Выгиве-емость клеток суспензионной культуры К-2, закаленной с добавлением сахарозы, после процедуры глубокого заморахивания-оттатания находится в прямой зависимости от времени закаливания и концентрации сахарозы в среде, возрастая к концу третьей недели ь 2-3 раза. Однако» при закаливании клеток при постоянной концентращш сахарозы (3%) аналогичная зависимость не наблюдается к выживаемость 1у:згок не возрастает. Увеличение содержать внутриклэточных Сахаров в случае закаливания с добавлением сахарозы до 202 возможо связано с частичным ее поступлением внутрь клеток. Возросшая концентрация Сахаров внутри клеток, ка2с и в случае с диоскореей, ко:сет иметь большое значение для их Еышвания в процессе заморакивания-оттаивания. Кэ исключено такие, что сахароза может предотвращать при дегидратации протопласта повреждения мембраны, замещая молекулы вода вокруг полярных головок фосфолипидов (Сгоие ег а1.,1983). В случае штамма Ж-1 (но требует для успешного криосохранения предварительного закаливания) клетки после процедуры замораживання-от-таивания имеют уровень жизнеспособности примерно в 2 раза выае, чем яезакалэнвке клетки штамма Е-2, хотя содержат приблизительно такое ко количество Сахаров. Следовательно, уровень эндогенных Сахаров нэ является единственным фактором, определяющим крпоустой-чивость, п закаливание не сводится только к повышению этого уровня. Прачкзу оолзе высокой устойчивости клеток К-1, по-сравнения со итакком следует искать как в различиях лшшдного состава плаз малеммы, тгк и в. количественном содержании белков и аминокислот, которые как п сахвра могут обеспечить связывание осмотически активной воды. Кроме того, необходимо иметь ввиду, что различная крио- ' устойчивость 1слэток штаммов Ж-1 и Е-2 может быть обусловлена разливы;.! составом (но цитокининам) питательных сред,на которых выращиваются эти культуры.

Влияние глубокого замораживания на систему;активного транспорта клетки. ' ~~ ~~~

Исследования Палта свидетельствуй (Palta ét al.,1977), что длительное пребывание растительных клеток в условиях низких температур (-10, -1Б°) приводит к повреждениям Н^-АТФазы, в то время как полупроницаемые свойства клеточных мембран не наруоаотся. Однако, Степонкус, изучая поведение изолированных протопластов ржи при замораживали и в условиях гипертонического стресса, утверждает что гибель клетки не связана о изменениями функциональной активности Н*- АТФ-азы (üeinura, Steponcus,t989). 3 связи с этим важно было попытаться ответить на два вопроса: I. Влияет ли закаливание клеток штамма S-2 на функциональные свойства K-,Hg- Н^АТФазы плаз-малеммы; 2. Является ли Й*"-АТФаза причиной начальных повреждений плазмалеммы, приводящих к гибели клетки в процессе программного замораживания до -156°.

АТФ-азная активность плазмалеммы клеток закаленной и незакаленной культуры женыденя до и после заморажизания. При закаливании клеток птамма Iffi? 2-2 с ай сахароз?; з среде наблюдали увеличение АТФ-азной активности - плагмзлэлкч по-ср-вне-шпо'с незакаяенным • контролем, скорость ферментативной реакции возрастала в 1,2 раза. Степень сродства фэрмэята к субстрату (К,,) при это;.' варианте закаливания ке изменялась (см.тпбл.). Поученные результаты находятся в соответствии с-данныкз йвтортг (Hellegrsn et al., 1583,1987;), изучавших изменение ДТФ-сзгса ¡Зетваосзя тапзмэ-леммы на других растительных объектах. Нзблздаклеэ нам на клэтках культуры Н-2 и другими авторшл» на . дрл-пж объектах возрастание активности Н4"- АТСазы, в ходе закэллголяя, сораятпо, направлено на поддержание ионного гсмэостаза клетки в условия;: гагаких положительных температур. Тем нэ кэше, каг 'показали неси зксперимен-ментн по замораживании клетск К5Р Z-2, закзллваниэ с 3& сахарозы не позволяет увеличить их криоустоЗигвссть. Друггкп словами, изменение функциональных своЗстз Ь^-АТФазн з додо голодовсго закаливания ота\ма 2-2 на 3% саззрсзэ лэ кореллирует•с резистентностью к сверхнизким температурам.

Закаливание клеток Н-2 с постепенным добавлением в сроду сахарозы до 202 приводит к 'незначительному росту АТФ-азной активности шгазмагаика по-срашкжии о незакалзнпым контролем. При этом наблюдается возрастание стегани сродства Серлэнта к субстра-

t

ту в 2 раза. Клэтк: при этом успешно переносят процедуру замораживания-оттаивания. Однако, не следует искать прямой связи мевду изменениями функциональных, свойств Н^-АТФ-азы в процессе такого за- ' наливания и увеличением гвзнеспособности после процедуры криосох-ранения. Скорее всего возрастание жизнеспособности обусловлено снижением водного потенциала клетки за счет увеличения фракции растворили Сахаров и других осмотически активных веществ.

Для ответа на вопрос: является ли К*- АТФаза причиной начальных повреждений ялазмалеыма в ходе криосохраненкя растительного обьекта, был;: проведены эксперименты по программному заморшыша-нию культуры £-2 к определения А№-азноа активности до к поело заагэрахивания. Полученные результаты по определении активности фермента до д посла замораживания предстазлеш в таблице.

таблица.

ПЕрЕЫатрл клетки зо- кгизшко без добавления сахароза клетки не аака- ЛвЕШв клетка ЗвКОЛеН- ше о дэббЕлегшем сахароза клетки т закалешшо

ДО аемора- ХЯВйНЯЯ поело заыора- мп$гпш( ДО гаыора-гаазщш поело замора-кивания

ку^.кйатф) 0,53 0,64 1,34 1,08 0,64 0,62

скорость реакции (Ушах) кшхь ? /мкг белка час • 14,6 II,Б 13,2 8,15 12,5. 11.9

Как вздно из приведенных, в таблице данных, показатели, хароктери-зухщиэ функциональные свойства ферые'нта до и после замораживания, изменяются незначительно. Однако, количество клеток с поврежденной плазиалеымой после оттаивания у незакаленной культур! составляет около 805, а у аакаленной около 605. Это-позволяет сделать еывод о том, что в условиях медленного программного замораживания табель клеток происходит на. в результате повреждений на уровне Н*- АТФ-азы, а при необратимых нарушениях непрерывной структуры плазиалем-мы. Мембрана теряет свои полупроницачше свойства и это приводит к гибели клетки, в то время как система активного транспорта еще некоторое время сохраняот свои функциональные возможности.

Заключение. ■ . '<

Наша исследования показали возможность применения флуориметри-ческого метода для наблюдения за динамикой повреждения плазмадежн клеток трех штаммов даоскореи и двух женьшеня при их крзюсохра-нении. Установлено, что при програмшом замораживании имеет место постепенное нарастание повреждений шшзм&яемшг клеток у всех исследуемых штаммов. Из-за сальной гетерогенности клеточных популяций суспензионных культур эта зависимость носит линейный характер до -30,-40°. До этого момента происходят повреждения плазмалеммы у неустойчивых к замораживание типов клеток. При более низких температурах остается пул криоразистентных клеток, у которое при даль нейшем понижении температуры количество повреждений плазмалеммы увеличивается незначительно. Количество клеток, плазмалемма которых была наиболее устойчива к замораживанию, выше у штаммов, прошедших предварительное закаливание с добавлением сахарозы или куль тивирование с аминокислотами.

Серия экспериментов по осмотическому сжатии клеток а растворах хлористого кальция или сорбита, позволила нам выяснить роль дэгид-ратации в повреждениях плазматической мембрены. Была выявлена тесная корреляция в степени повреждений плазмалеммы клеток хек при замораживании-оттаивании, так и в условиях осмотического сжатия в растворах хлористого кальция или сорбита. По нгзлм данным повреждения мембраны происходят как при плазмолизе, тая а при детквзмо-лизе, 'причем соотношение повреждений клотох ппг сжатии и деплазмо-лизе у разных штаммов варьирует. Вероятно огогогачнае повреждения плазмалеммы происходят и при заморажввагш-оггаиввшга.' Установлено, что закаливание клеток Н-2 позволяет несколько слизать степень повреждений плазмалеммы при догшгшлзге. Тгксм образом, основным повреждающим клетка фактором во время глэдлвтюга программного замораживания является дегидратация.

Для выяснения рола закаливания клеток 2-2 в приобретении еми большей криоустойчивости (Псшоа АХ. а др.,1202,1950) изучали изменение физиологических пгра'лзтроз культуры и содержания внутриклеточных Сахаров в ходе пизхсжяягоратураоС закалки. Установлено, что степень поврездений аланиалэкма при закорагавании и осмотическом сжатии обусловлена физиологическим состоянием культур. Закаленные с добавлением сахарозы клетки гэньвеня менее оводнэны а содержат в 1,6 раза болыаэ растворимых внутриклеточных Сахаров.

Известно, что предварительное культивирование клеток диоскореи с аминокислотами также приводит к значительному увеличению содержания эндогенных сахЪров, после чего клетка успешно выдерживают процедуру замораживания-оттаивания (Волкова и др.,1984). Эти факты свидетельствуют о тем, что возрастание количества осмотически активных веществ.в клетке во время закаливания или предварительного культивирования с аминокислотами позволяет уменьшить при ее сжатии нагрузки на плазмалемму. Кроме того, не исключена и известная роль некоторых дисахаров в стабилизации плазматической мембраны при ее дегидратации (Crowe et al., 1968).

Главной причиной гибели клеток при замораживании некоторые авторы считают нарушение оистемц активного транспорта олазмалеммы (Palta etal.,19TT). Однако, нави определения НтМФч>Йактивности после закаливания клеток Е-2 и при глубоком замораживании показали, что изменение функциональна характеристик фермента не коррелируют с жизнеспособностью клеток. Следовательно, при замораживании но указанной выше программе до -19б°С в присутствии криопро-тектора гибель клеток происходит не в результате незначительных изменений физико-химических свойств Н^-АТФазы, а вследствие необратимых повреждений олазмалеммы, нарушающих ее структуру. Таким образом, ваши данные по изучению влияния глубокого завораживания на Н*-ДТФазу плаамалеммн согласуются с результатами уемура и Сте-понкуса, полученными на изолированных протопластах ржи (Uemura, Steponcua,I989).

' ВЫВ О Д Ы.

1. Разработан оршчшальшй флуориматрический метод определения повреждений пвазналеммк культивируемых клеток растений. Доказана возможность использования втого метода при замораживании суспензионных культур до -196°, в также при осмотическом сжатии клеток в гипертонических растворах при 2— 3°.

2. Изучена динамика повреждений плазмалеммк клеток при осмотическом сжатии в ходе программного замораживания и в гипертонических растворах хлористого кальция или сорбита у трех штаммов диоскореи дельтовидной и двух штатов женьшеня настоящего. :

3. Установлено, что повреждения олазмалеммы клеток происходят как при плазмолизе, так и при деплазмолизе, причем степень этих повреждений варьирует в зависимости от видовой принадлежности и

генотипа исследуемого штата.

4. Гетерогенная клеточная популяция содержит пул клеток, устойчивых к осмотическому сжатию, которое возникает при замораживании и при моделировании дегидратации is гипертонических растворах. Количество таких клеток значительно возрастает после закаливания клеток штамма Ж-2 или после предварительного культивирования с аминокислотами штамма Д-1.

5. В ходе закаливания клеток штамма S-2 с увеличением концентрации сахарозы до 20% выявлено возрастание количества внутриклеточных растворимых Сахаров в 1,6 раза и уменьшение оводненности клеток, что свидетельствует об увеличении содергания осмотически активных веществ.

6. Программное замораживание клеток женьшеня до -196° не оказывает существенного влияния на изменение физико-химических параметров системы активного транспорта (К+- стимулируемой» Hg2+-занисимой Н^-АТФазы).

7. Полученные гзми экспериментальные данные доказывают, что существует тесная корреляция между возникновением поврехдений плазмалеммы клеток в ходе' их программного замораживания и при моделировании осмотического сжатия в гипертонических растворах. Дегидратация, имеющая место при замораживании является,, вероятно, основной причиной повреждения плазматической »йибраш и гибели клеток. .

Список работ, опубликованных по те;.:э диссертации.

1. Федоровский Д.Н. Метод оценка -целостности плазматической мембраны растительных клеток в суспензионных культурах. // IV Всесоюзная конференция-молодых ученых по физиологии растительной клетки. Минск, 15-20 апреля 1990 г. Тез., докл., t&xama. 1890.

С.172. " .

2. Федоровский 2.Н. .Попов A.C. Дегндратацвонные повреждения клеток суспензионных культур при криоконсервации. //II Съезд Всесоюзного общества физиологов растений. Ыинск, 24-30 сентября 1990, Тез.докя., Москва. 1992. С.

3. Потов A.C.,Федоровский Д.Н. Повреждения плазмалеммы клеток диоскореи, культивируемых In vitro, в процессе их криосохранения //Физиология растений. 1992. т.39, N 2, С.

ß

4. Федоровские Д.Н. .Попов A.C. Повреждения плазмалеммы различил штаммов диоскореи дельтоздной при криосохранении. //Физиология растений. 1992. Т^ЗЭ., N 3, С.

5. Попов А.С..Федоровский Д.Н. Способ определения плазмалеммы растительных клеток, заявка иа изобретение N* 5003344. Приоритет от 27.09.91.

6. Попов A.C.,Федоровский Д.Н. Повреждения плазматической мембраны растительных клэток, культивируемых In vitro, при их криосохранении. // 2 Международная конференция - успехи современной криобиологии. Харьков, 21-26 апреля 1992, Тез.докл., Харьков. 1992. С.143.

7. Федоровский Д.Н..Черняк Н.Д..Попов A.C. Исследование повреждений шшзмалеммы клеток культуры женыаэня настоящего при криосохранении. //Физиология растений., в печати.

Подл. 8 О -.92. Формат Бумага оберт.Печать офсетная.

*ч.-я8д.я.1.0. Тираж 100 виз. Зажав 165. Бесплатно.

Лабораторжя офсетной печати Новгородского юдивхниеского ю-та. 605022, Н.Новгоро», пр.Гагарина,!