Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Повреждения различных по морозоустойчивости клеточных культур в процессе замораживания - оттаивания

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Повреждения различных по морозоустойчивости клеточных культур в процессе замораживания - оттаивания"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

СОПИНА Нина Фридриховна

ПОВРЕЖДЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ПО МОРОЗОУСТОЙЧИВОСТИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР В ПРОЦЕССЕ ЗАМОРАЖИВАНИЯ —I ОТТАИВАНИЯ

03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1993

Работа выполнена в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук Г. А. Самыгин, доктор биологических наук Т. И. Трунова.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук М. М. Тюрина, кандидат биологических наук А. С. Попов.

Ведущее учреждение — Научно-производственное объединение «Подмосковье», РАСХН.

Защита состоится « »......... 1993 г. в

« » час. на заседании специализированного совета К 002.45.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, г. Москва, Ботаническая ул., д. 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений РАН.

Автореферат разослан « »......... 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат биологических наук

Л. И. Сергеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темн. Среди различных неблагоприятных воздействий, которым подвергаются живые организмы на нашей планете, низкотемпературный стресс является наиболее распространенным.

Низкая температура сама по себе и особенно в сочетании с замораживанием оказывает ярко выраженное действие на биологические процессы. Проблема низкотемпературных повреждений растений привлекает к себе внимание многих исследователей. 'Тем не менее представления о причинах повреждений растений при замораживании и о механизме морозоустойчивости растений до . сих пор далеко не полны. Общепринято, что гибель растений под воздействием мороза так или иначе связана с образованием в них льда. В этом смысле принципиальным является вопрос о месте льдообразо-Ьания, поскольку от этого зависит, дальнейшая судьба клетки (Сангин, 1974; Туманов, 1979). Твердо установлено, что образование льда внутри клетки всегда приводит к ее гибели вследствие нарушения целостности мембран растущими внутри клетки кристаллами льда. Однако, относительно причин повреждения клеток внеклеточным льдом .существуют противоречивые мнения. Разные..авторы придают различное значение последствиям отнятия воды от клеток внеклеточным льдом, таким, как механические воздействия нз протопласт, обезвоживание клеточных структур, увеличение концентрации солей и других растворенных веществ в клетках (Heber et al.,1979;■ Steponkus, 1984; Hincha, Schmitt, 1988). До сих пор спорными остаются вопросы .о том, -какие клеточные мембраны являются мишенью морозного стресса, на каком из этапов процесса за-' мораживания ^ оттаивания происходят повреждения..

Наличие большого числа теорий и гипотез относительно причин, вызывающих гибель растений при воздействий низкотемпературного стресса, указывает как на сложность самой проблемы,' так й на многообразие причин, вызывающих повреждения и гибель клеток и организмов при их различном физиологическом состоянии и при разных условиях.

[Цель и задачи исследований. Целью данной работы являлось Изучение '.факторов,, участвующих в развитии повреждений клеток суспензионной культуры разных по устойчивости растений. Задачи исследования были следующие:- . . ■

1. Определить способность суспензионной культуры пшеницы закаливаться к морозу, установить оптимальные условия этого процесса; выявить некоторые физиолого-биохимические особенности закаленных клеток . 1 ■

2. Оценить роль физико-химических и механических повреждений в процессе замораживания закаленных и незакаленных клеток пшеницы и клеток дтоскореи.

3. Определить, какой из этапов процесса замораживания- от-', таивания является более повреждающим.

4. Исследовать действие криопоротекторов различной природы; определить роль цлазмолизирующих растворов в защите клеток при замораживании.

Научная новизна, Установлено, что суспензионная культура' пшеницы способна закаливаться как под действием пониженной тем-' перагуры, так и под влиянием АБК. Закаливание клеток пшеницы в суспензионной культуре не сопровождается значительными изменениями их осмотических свойств. Показано, что в условиях медленного замораживания повреждения клеток суспензионных культур, различающихся по своей устойчивости, являются результатом как обезвоживания, так и деформации. Криогоксические повреждение характерны для менее устойчивых клеток (диоскорея); механические повреждения вносят больший вклад в сумму повреждений более устойчивых клеток (пшеница). Механический стресс, которому подвергается клетки и их протопласты при внеклеточном зачоракива- 1 нии, обусловлен, с одной стороны, сжатием плазмалеммы и тоноп-ласта в результате выхода воды ив клеток, а, с другой стороны, деформацией, обусловленной контактом плазмалеммы с клеточной. стенкой. Предварительный плазмолиз клеток ослабляет контакт плазмалеммы с клеточной стенкой и уменьшает'повреждения при замораживании. Установлено, / что повреждения клеток диоскореи и пшеницы осуществляются, главны).! образом, - во время замораживания. Обратный' вход воды в протопласт при оттаивании не вносит существенный вклад в повреждения.

. . Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследования имеют значение для разработки теоретических основ ус. тойчивости растений к отрицательной температуре и пониманию механизмов повреждений клеток в процессе замораживания - оттаивания ; Данные по закаливанию клеток клеток пшеницы могут найти

применение в клеточной селекции на морозоустойчивость.

Апробация работы. Результаты исследований были доложениы на 11 Всесоюзной конференции молодых ученых (Москва,1986), • на IY Всесоюзной конференции молодых ученых (Минск, 1900), на V Международном молодежном симпозиюме по метаболизму растительной клетки (Варна, 1990), на II Съезде физиологов растений (Санкт-Петербург,1993).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 109 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы» Содержит- 9 таблиц и 13 рисунков. Список цитируемой литературы включает 167 наименований, из них 123 на иностранном языке.

/•'•• ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. '

Объект исследования: Для опытов использовали суспензионную культуру клеток диоскореи 'Dioscorea deltoides Wall (штамм DM -0,5) и пшеницы Triticum timofeevi Zshuk., полученные в отделе" биотехнологии. ШР РАН. ■ Выбор данных объектов был связан с их ~ разной устойчивостью к промораживанию. Суспензионную культуру • диоскореи выращивали на.модифицированной.среде Мурасиге и Скуга . (Аброшникова и др.,1971); культуру пшеницы - на среде Шенка и Хильдербрандта (Schenk, Childebrandt, 1972). Колбы с суспензией находились , на: подвесной качалке (скорость вращения 95 об/мин) при температуре 25°С и относительной влажности воздуха 70%. Пе- . ресадку суспензии на свежую среду производили каждые 14,дней дней. ..••'••■•

Для- замораживания брали навески клеточной массы по 100 ± 20 мг в четырехкратной биологической повторности .

Замораживание осуществляли.в климатической камере ILKA (ГДР) по следующей схеме: ■• 30 .минут при 2°С; , 30 минут при -3° или . -5°; затем инициировали образование льда для предотвращения внутриклеточного льдообразования. Через 30 минут после этого температуру. в'"-камере' понижали до экспериментальной (-10°, -15°, , -20°); длительность . промораживания при конечной .температуре варьировала от; 30 минут до нескольких часов. . Оттаивание происходило при 2° в

■ ■ W-

течение 2 часов. Контролем служили незамороженные клетки, находившиеся в течение 2 часов при 2° в тех же растворах, что и опытные варианты.

Закаливание суспензионной культуры пшеницы. Холодовое закаливание клеток производили при температуре 2° с постепенным увеличением содержания сахарозы в среде до б или 12%.

Определение степени повреждений. Степень повреждения клеток определяли через 1 час после оттаивания следующими методами:

1. Теразолиевым методом, который основан на способности ми-тохондриальных дегидрогеназ восстанавливать 2,3,5 - трифенил тет-разолий хлорид (ТТХ) (Towill, Masur, 1970). К оттаявшим и контрольным клеткам добавляли по 2 мл 0,8% раствора ТТХ на фосфатном буфере (pH 7,2 - 7,5) и выдерживали в темноте в течение 18 часов при комнатной температуре. Затем надосадочную жидкость сливали, клетки промывали 5 мл дистиллированной воды. Далее к осадку клеток добавляли по 5 мл 06% этанола и экстрагировали.формазан в течение 1,5 - 2 часов. Количество:формазана определяли по зкстинк-ции при длине волны 485 нм на спектрофотометре Spekol 11 {"Karl Zeiss lena", ГДР). Степень повреждений (снижение восстановительной активности промороженных клеток по. отношению' к исходным) определяли по формуле: ■'

Ео ' Et

Ii"—.....— ЮТ. (1) где

Е0 - -'. .:

Ii - индекс повреждений, определенный методом .ТТХ, Ео - значение экстинкции вытяжек из непромороженных клеток Et - значение экстинкции вытяжек из промороженных клеток после температуры t°. '. '>■'.' • '. '

2, По выходу электролитов. К оттаявшим клеткам добавляли изоосмотический раствор сахарозы (в том'.случае, если клетки были заморожены без раствора) или доводили дистиллированной водой до изоосмогического раствора (в случае замораживания в, гиперто- •.. ййческих растворах сахарозы). , Пробирки-с.клетками периодически : встряхивали. Через 1час инкубации измеряли электропроводность раствора,, в котором инкубировали клетки, используя мост пере- ' менного тока Р 577. Индекс'повреждений вычисляли по формуле: *' ~'

Lt - L0 .

' .. :¡¿ ...------- 100 (2), где. ".'..>'' :

; Lk- Lo ; .'=.-.- ;:■'; ■

•'•Й-:-'

I2 L индекс повреждений, определенный методом электропроводности, L0 - электропроводность среды инкубации непромороженных клеток, Lt - электропроводность среды инкубации промороженных клеток Lk - электропроводность среды инкубации клеток, убитых нагревом на кипящей водяной бане в течение 30 мин.

3.' По экзосмосу ионов калия. При определении повреждений этим ^методом процедура: была такой же, как и при определении повреждений по электропроводности. Выход ионов калия регистрировали на. пламенном спектрофотометре "Karl Zeiss Iena",( ГДР. Индекс повреждений 1э вычисляли, подставляя в формулу (2) значения выхода ионов калия из контрольных непромороженных клеток, из клеток промороженных; и из клеток, убитых нагревом На кипящей, водяной бане.соответственно. -. . Определение белка в закаленных и незакаленных клетках пшеницы. Растворимый белок экстрагировали из клеток пшеницы 00,1 М трис-глициновым буфером рН 8,3, содержащим ингибитор протеаз FMSF ("SERVA"). Концентрацию белка определяли по Брэдфорду (Bradford,1976). Для электрофоретического разделения осажденные белки очищали, высушивали и-заливали .буфером,' содержащим 0,0625 ,М трис рН 6,8, 5Z -меркаптаэтанола, 2% ДДС-Na, 10% глицерина и 0,001% 1 бромфенолового синего, затем нагревали на кипящей водяной "бане в течение двух минут и фильтровали (Прошина, 1978), ■применяли реактивы фирмы "Serva" (ФРГ). Белки анализировали по методу Леммли .(laemmli, 1970), используя вертикальную систему, диск-электрофореза в плоском полиакриламидном геле .. в присутствии ДДС-Na. Для определения молекулярных масс полипептидов' применяли 5,10, и 12%-ный полиакриламидный гель. '■'"■:■ Определение растворимых внутриклеточных Сахаров. Количество' суммарной фракции эндогенных Сахаров определяли фенольным методом'' (Dubois; 1956). Параллельно с определением Сахаров учитыва-.. ли сухую и сырую массу клеток. .

Биологическая повторность измерений•4-х кратная, аналитическая. 2 '■- 4 кратная. . Результаты'"экспериментов обработаны статистически (Урбах.1963)-..' В рисунках и таблицах- приведены сред-.ние, арифметические значения и их стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние условий культивирования на морозоустойчивость клеток суспензионной культуры пшеницы. Морозоустойчивость и способность клеток пшеницы к закаливанию зависит от возраста суспензии. Незакаленные клетки наиболее устойчивы на 7-10 сутки после последней пересадки, что соответствует началу экспоненциальной фазы кривой роста. (Рис. 1) При дальнейшем культивировании, хотя рост продолжался до 16 - 20 суток, морозоустойчивость клеток снижалась. В возрасте 7-10 дней клетки находятся в стадии ак-

«*

о и я £

(С

я

о. X о

6 в 12 16 18 длительность роста, дни » - 1 ."-2

х ш ч

о.

ш §

Рис. 1 •Изменение устойчивости клеток пшеницы в зависимости от воэраста^клеточной суспензии' '

I. - оырая масса; 4 - ¡индекс повреждений

тивного деления, еще не переходя »к стадии роста растяжением. Клетки суспензии в это время характеризуются Солылим отношением. площади цитоплазмы к вакуоли, .'небольшим'размером, что, как известно, способствует повышению морозоустойчивости. Возраст 7-10 • дней является, оптимальным для закаливания клеток суспензии пшеницы. Сравнение разных концентраций сахарозы в среде (3%.-конт- ■ роль, 6Х,- 12%) показало, что увеличения ее содержания до М

достаточно для достижения максимального закаливающего эффекта. Повышение концентрации сахарозы в среде до 12Z не приводило к ' увеличению устойчивости по сравнению с 6%-ным содержанием. Сама по себе низкая температура без добавления сахарозы способствовала лишь небольшому повышению устойчивости, В то же время, увеличенное до 6% количество сахарозы в среде без воздействия гипотермии, не приводило к развитию устойчивости. Следовательно, для достижения клетками закаленного состояния необходимо совместное действие низкой температуры и дополнительного источника углеводов, как было показано ранее на проростках пшеницы (Трунова, 1979)

Таким образом, оптимальными для закаливания суспензии пшеницы являются следующие условия: возраст культуры 7 дней после пересадки, содержание сахарозы в среде закаливания - 6Z, температура 2°. При таком сочетании факторов закаливающий эффект начинает проявляться уже после первых суток выдерживания суспензии при пониженной температуре й достигает максимума к 8 суткам, при этом индекс повреждений закаленных клеток уменьшается вдвое.

Закаливающий эффект достигался также действием абсцизовой кислоты. . Добавление АБК в среду выращивания (7,5 1СГ5 М) при" температуре 26° приводило к повышению устойчивости. Следует отметить, что морозостойкость клеток при оптимальных условиях закаливания и действии АБК (без охлаждения) была практически одинаковой. Следовательно, одинакового эффекта - повышения морозостойкости клеточной суспензии можно достичь как путем холодо-вого закаливания, так и введением в среду выращивания АБК без гипотермии (табл. 1)

Аналогичные изменения наблюдаются в содержании сухого вещества, Сахаров, и белков/.

■ Клеточная культура характеризуется более высокой оводнен-ностью и меньшим содержанием Сахаров-по сравнению с тканями ин-тактных растений. После закаливания содержание сухого вещества и растворимых Сахаров увеличивается незначительно. Это может свидетельствовать о менее существенной роли осмотического компонента в развитии устойчивости клеточных культур, чем для клеток в составе целых тканей и растений. ' .

■ Содержание растворимого белка в зачаленных клетках увеличивалось в 1,5 j>a¿a: по -.сравнению с незакаленнкми. Белковый

спектр клеточной суспенаии характеризовался относительной ста-Таблица 1

Влияние холодового закаливания и АБК на устойчивость, содержани сухого вещества, Сахаров и белков в клетках пшеница

i

1 1 1 |Варианты |выращивания Индекс пбвреждений -20°, 1 ч т —" ...... "1 | Сухая | масса, % 1 Содержание Сахаров, мг/г сух. массы 1 Содержание | белков,мг/г 1 сухой массы |

г |Контроль,26° | 37. сахароза 86,5 +_ 5,5 1. | 9,5 + 0,36 1 26 ±. 0,81 2,63 ± 0,20|

г ' " | 2° | 67. сахароза 51,0 ± 3,8 |12,е + о.зо 40 + 1,03 3,49 t 0,34|

Г 1 26°, АБК | 3£ сахароза I............ -.. 66,0 + 4,2 • 1 |.10,5 + 0.37 | 34 ± 0,93 3,62 ± о,за( i " i

бильностью полипептидного состава в ответ на действие низкой температуры. Практически не было найдено новых белков, а полипептидный спектр в основной массе менялся мало: относительное содержание полипептидов с молекулярной массой 14, 24, 97, 200 кД несколько уменьшалось, а количество белгов с массой 21, 26, 39, 67 кД возрастало.

Хотя общее количество осмотически активных- веществ изменя-' лось незначительно, есть данный о том, что суммарное действие Сахаров и некоторых растворимых белков может взаимно усиливать их криопротекторные функции. В этом случае может наблюдаться аддитивный эффект, который приводит к повышению устойчивости клеток , суспензионной культуры. ' ''„ ' ■

Роль обезвоживания в повреждениях клеток пшеницы и диосксреи '

Известно, что во время заыораживания суспензий ■ хлоропластов и изолированных протопластов повреждения происходят преимущест-

венно в результате действия растворенных веществ, особенно солей (Santarlus, Heber, 1970, Steponkus, 1983), Это может быть причиной повреждения и клеток суспензии при замораживании в среде, содержащей соли. Замораживание клеток диоскореи в исходной культу-ральной среде, содержащей соли и в изотоническом бессолевом растворе сахарозы показало, что повреждения клеток имеют место и в солевой и в бессолевой среде, причем в последней они всегда были слабее, (Табл 2.)

Таблица 2. Влияние температуры и длительности замораживания на степень повреждений клеток суспензионной культуры диоскореи в солевой и бессолевой среде.

Т

Длительность вамораживания, час Индекс повреждений.Ii |

солевая среда (с). Г бессолевая | | среда (б) |

0,5 'з- ■. 15,3±3,79 77,6+0,82 -5° 1 I ' 8,5+2,64 | | 49,5*4,94 |

"0,5 3 86,7+2,33 95,8+1,55 -10° | | 50,0+1,91 | | 58,5+3,19 |

0,5 - . 3' 88,5+0,85 . 98,3±0,32 -15° | |. 56,5±3,59 . | | 76,7±1,73 |

Соотношение повреждений б/с

0,56 0,64

0,58 0,61

0,64 0,78

Замораживание незакаленных клеток пшеницы, которые исходно юлее устойчивы по сравнению с клетками диоскореи, и закаленных теток пшеницы показало, что наличие солей в среде замораживания ■акже'усиливает'повреждения в процессе замораживания' - оттаивания тих более устойчивых клеток.•

Вовремя, ■замораживания увеличивается как концентрация

внеклеточной среды, так и концентрация внутриклеточного раствора, который также может оказывать- повреждающее действие. Для того, чтобы проверить эту возможность, мы замораживали клетки с добавлением различных криопротекторов. Использование криопро-текторов может быть удобным подходом для изучению повреждений клеток в процессе замораживания - оттаивания. Анализируя изменение степени повреждения при добавлении к клеткам растворов с известными свойствами, можно судить о тех факторах, которые играют, роль в возникновении повреждений.

В экспериментах использовали проникающие в клетку растворы ДМСО, и непроникающие гипертонические растворы сахарозы и сорбита.' То, что сахароза и сорбит из растворов высокой концентрации, которые были использованы в качестве криопротекторов, в условиях наших опытов не проникали в клетки,.подтверждалось микроскопическими наблюдениями, поскольку они вызывали плазмолиз клеток диоскореи и пшенида. Непосредственное определение количества Сахаров в клетках пшеницы показало, что при сравнительно небольшой длительности наших опытов' сахароза действительно не проникает внутрь клеток: клетки, которые находились в растворе сахарозы 2,1 М (дЬ —5°) содержали 9,5 + 0,81 мг Сахаров на 200 мг сырой клеточной массы, а клетки, которые •находились в среде с нормальным (3%) содержанием сахарозы 9,9 ± 0,75 мг. ' , •

Добавление растворов криопротекторов к клеткам в солевой и бессолевой среде приводило к уменьшению повреждений,, но в разных средах действие криопротекторов было различным (Табл. 3).

В среде, содержащей соли, степень защитного действия у сахарозы и ДМСО была почти одинаковой. Это можно объяснить колли. гативным действием этих растворов, то есть действием по принципу "-¡разбавления" криотоксическ^х веществ во внеклеточной среде. 'Благодаря этому они ослабляют, повреждающее действие увеличивающейся при замораживании концентрации внеклеточного солевого раствора. В том случае, когда клетки замораживают в бессолевой среде, .этот фактор отсутствует■и клетки повреждаются в меньшей степени. Но в качестве повреждающего фактора может действовать увеличение концентрации потенциально токсичных растворенных .ве: ществ внутри клеток. В таком случае защитное- действие проникаю-

щего и непроникающего растворов будет отличаться по своей сте-

ТаОл 3. Влияние криопротекторов на устойчивость клеток ди-оскореи в процессе замораживания в течение 1 часа при -10° в солевой и бессолевой среде

индекс повреждений Ь

1 1 1 Без | криопротек-| тора ДМСО -4- 1 Сахароза | . л£ -4° |

! Солевая 1 среда 1 | 98,3 ± 5,3 I 40,3 ± 0,28 48,0 ± 1,2 |

| Бессолевая 1 среда . 1 ... 1 I 71,4 + 6,4 | 0 | 28,4 ± 2,1 1 |

пени и механизму, Проникающий раствор ДМСО оказывается более эффективным криопротектором по сравнению с непроникающим раствором сахарозы. Повреждающим фактором, от которого защищает ' ДМСО в данном случае, является увеличение концентрации внутриклеточных криотоксических веществ.

Таким образом, можно заключить, что при замораживании клеток суспензионной культуры диоскореи повреждающими являются как увеличение концентраций внеклеточного раствора до криотоксичной, . которое оказывает дестабилизирующее влияние на мембрану извне, так. и увеличение концентрации растворенных веществ внутри клеток, повреждающее знутриклеточные структуры.

Дестабилизирующее действие повышенной концентрации токсичных веществ в клетках подтверждается также фактом усиления повреждений клеток диоскореи при увеличении длительности промораживания как в солевой, так и бессолевой среде ., что было видно из таблицы 2. Особенно наглядно это проявилось в опытах, в которых мы выясняли динамику нарастания повреждений со временем при разных температурах, в бессолевой изотонической среде. (Рис.2)

-п-

РИС. 2. ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОСТИ ЗАМОРАЖИВАНИЯ ПРИ РАЗНОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ НА ПОВРЕЖДЕНИЕ КЛЕТОК ДИОСКОРЕИ

0 12 3 4 длительность промораживания, часы "

1 -6°С 2 -Ю°С 3 -20°С

При всех испытанных значениях температуры повреждения усиливаются по мере увеличения длительности замораживания, но при более высоких температурах влияние длительности выражено сильнее.

Нужно отметить, что механические повреждения и повреждения, вызванные физико-химическим действием криотоксичных концентраций веществ различаются по своей кинетике. Механические повреждения происходят сразу после достижения критической степени обезвоживания и, возникнув, не усиливаются со временем, а физико-химические повреждения нарастают постепенно ^еропкиэ, 1984). Это может служить критерием для оценки того, какого рода повреждения .имеют место.

Таким образом, можно заключить, что при замораживании клеток суспензионной культуры диоскореи повреждающими являются как-увеличение концентрации внеклеточного раствора до криотоксич-. ной, которое окавывает дестабилизирующее влияние на мембрану извне, так и увеличение концентрации растворенных веществ внут-рикпеток, повреждающее внутриклеточные структуры. ■ •

' РИС. з. ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОСТИ ЗАМОРАЖИВАНИЯ ПРИ -20°С НА СТЕПЕНЬ ПОВРЕЖДЕНИЯ ЗАКАЛЕННЫХ И »^ЗАКАЛЕННЫХ КЛЕТОК ПШЕНИЦЫ

длительность промораживания, ч "5 - закаленные 2 - неэакалэнкые

Однако, не все полученные нами результаты можно объяснить с этой точки зрения. Так, не было обнаружено зависимости степени повреждений от длительности промораживания закаленных и не-вакаленных клеток пшеницы (Рис. 3). Основные повреждения клеток пшеницы происходили ¿течение первого часа после ' замерзания и не усиливаличь при дальнейшем промораживании при постоянной температуре. Можно говорить, о том, что для клеток пшеницы, особенно для закаленных, повреждения происходят преимущественно в' результате механических деформаций. Кроме, того, показано, что уменьшение . повреждений клеток диоскореи наблюдается при добавлении сахарозы не только в солевую, но и в бессолевую среду; (табл. 3, 4), что об ином, отличном от коллигативного. пркнципе защитного действия (и, следовательно, об иной причине повреждений клеток)

В этом случае сахароза не могла также уменьшить повреждения внутриклеточных структур, вызванные их обезвоживанием, поскольку она не проникает внутрь клетки из гипертонических ' растворов и не может повышать водоудерживающие силы, как это

происходит в случае проникающих растворов. Наоборот, гипертонические растворы сахарозы сами отнимают воду от протопластов еще до замораживания, вызывая плазмолиз, и не могут поэтому защи-

Табл. 4. Влияние состава среды замораживания на. повреждения клеток суспензионной культуры диоскореи после замораживания при -15° в течение 0,5 и 3 часов

1 1 1 1 Повреждения, 11 1

1 иреда |— |замораживания | 1 1 1 0,5 ч | 1 3 Ч |

1 1 |Солевая, сахарзы| | (0,09 М, д 1' —0,3°| 1 1 1 88,5 ± 0,85 | 1 98,3 ± 0,30 |

1 1 [Солевая, 21% сахар.) 1(0,61 М, й?—1,5°| 1 1 13,1 ±4,85 | 26,3 ± 2,68 |

1 I |Бессолевая, 9% сах.| 1(0,26 М, л Ь"— 0,6° | 1 1 56,4 ± 3,59 | 76,6 ± 1,73 |

1 1 [Бессолевая,21% сах.[ 1(0,61 М, д -1,5°| 1 Г 25,5 ± 4,62 | | 35,6 ± 3,46 [ ......:. 1

щать протопласты от вредных процессов, вызванных обезвоживанием. .

Защитное действие гипертонических растворов веществ, непроникающих в протопласты, ряд авторов объясняют тем,, что они уменьшают различные деформации последних в случае медленного замораживания протопластов (Самыгин, 1974,- Тао еЬ а1,1983; Мегушап, УЛШатБ, 1985;). Уменьшение повреждений клеток, суспензий в гипертоническом бессолевом растворе сахарозы также, может указывать на защиту протопластов от деформаций.

Полученные результаты приводят, к выводу, что повреждение протопластов внеклеточным льдом . является следствием обоих-стрессов - физико-химических процессов, вызванных обезвоживани-

ем, и механических повреждений клеток суспензии.

■ При разных значениях температуры и у разных клеток относительная роль этих факторов может быть 'различна. У диоскореи • физико-химические повреждения сильнее проявляются при -6°; при температуре -20°, очевидно, преобладают повреждения механической природы. У закаленных и незакаленных клеток пшеницы, повреждения происходят при более низких температурах и обусловлены, по-видимому, в,основном, деформацией протопластов.

Защитное действие рзстворов сахарозы на разных этапах замораживания -оттаивания.

Одним из спорных является вопрос о том, на каком этапе цикла замораживания - оттаивания осуществляется криопротек-торное действие, и следовательно, происходят повреждения кле-

Таблица 5. Занятное действие растворов сахарозы различ-. ной концентрации на разных этапах цикла замораживания -оттаивания незакаленных клеток пшеницы

" ........ Концентрация раствора сахарозы Метод, оценки повреждений I Добавление раствора | сахарозы | . Вез сахарозы

перед замо-живанием |перед отта- | |иванием ■ |

. 2,1 ТТХ Н 8,7 ± 7,8 1-47,1 ± 4,6 | 55,3 ± 3,9

-дг\ _.5о электропроводность , !2 14,3 ± 8,3 | 69,5 ± 2.6| 68,4 ± 3,5

1,0 м • ". ТТХ I ; 20,5 ± 9,7 1 87,2 ± 1,91 87,5 ± 1,0

л£< - 2° электропроводность 12 ' 39,6 ± .5,3 87,5 ± 0,9| 87,4 ± 1,3

ток. Ответ на него имеет принципиальное значение, так как от него зависят представления о механизме повреждений клеток внеклеточным льдом. В многочисленных работах с замораживанием • тканей получены противоречивые результаты.

Для выяснения этого вопроса мы оценивали защитное действие' раствора сахарозы на равных этапах цикла замораживания - оттаивания. Для этого мы добавляли криопротекторный раствор . перед замораживанием и перед оттаиванием. Б таблице 5 представлены результаты одного из таких опытов с незакаленными клетками пшеницы, где степень повреждения определяли одновременно двумя методами: ТТХ и по электропроводности. Из таблицы видно, что сахароза, добавленная к замороженным клеткам перед их оттаива- , нием, практически не оказывает криолротекторного Действия или оно выражено очень слабо. Эта закономерность имеет место при различной концентрации раствора сахарозы и при измзрении устой' чивоста различными методами. . , ' ■ о

' Аналогичные результаты были получены при замораживании клеток диоскореи, отличающихся меньшей ло сравнению с клетками пшеницы устойчивостью

Примененный нами способ разделения 'защитного действия растворов во время замораживания и во время оттаивания позволяет сделать вывод, что в условиях наших опытов с клетками, обладающими высокой морозоустойчивостью и менее морозостойкими, основные повреждения происходили во время замораживания.

Результаты, представленные выше, получены на клетках, которые после оттаивания-были возвращены в изотонические условия, и, ' следовательно имели возможность восстановить первоначальный объем. Можно было предположить, что какая-то часть повреждений проявляется при доведении концентрации раствора до -.изотоничёс-кой вследствие обратного поступления воды в клетку и растяжения плазмалеммы. В связи с.этим были,поставлены эксперименты," - где после оттаивания клетки не-возвращались в изотонический раствор, а определение повреждений проводили в гипертонической среде: протопласты при этом не восстанавливали'исходный объем, ,а оставались сжатыми в той же степени, в какой они были при замораживании. (Рис.4 ). Наблюдается-некоторое увеличение поврежде-г ний. во время растяжения клеток при обратном входе, воды при оттаивании. Это имеет место как при добавлении сахарозы перед за. "■•■■ -Л-.- ■'*'''

мораживанием, так й перед оттаиванием. Но это увеличение повреждений очень незначительно й можно сделать вывод о том, что погло-

<£ X X

ш <=х X в> о.

ш

о с

«

а: х

Рис. 4. Защитное действие раствора сахарозы = -2°) на разных

этапах процесса замораживания-оттаивания клеток суспензионной культуры пшеницы. А - раствор сахарозы добавлен перед замораживанием; Б - раствор сахарозы добавлен перед оттаиванием. Определение повреждений в- гипертонической среде (заштриховано) и в изотонической среде (неза'штриховано).

щение воды протопластами во время оттаивания при разбавлении раствора сахарозы не вносит существенный вклад в степень повреждений.

Для более подробного изучения защитного действия сахарозы и причин повреждений клеток при замораживании были применены различные методы оценки повреждений. Использованные нами способы определения повреждений оценивают различные изменения в протоп-.пластах в результате замораживания- - оттаивания. Метод ТТХ определяет дегйдрогеназную активность митохондрий; изменение электропроводности 'свявано с потерей плазмалеммой свойства полупроницаемости, а выход ионов калия с повреждением также и тонопласта, поскольку подавляющее количество ионов калия, локализовано в вакуоли. Все три метода позволяют оценивать повреждения клеток как без защитного.раствора, " так и при его добавлении. /

. Возникает' вопрос; ст какого рода повреждений растворы са-■

харозы защищают клетки во время замораживания?

Постановка наших опытов исключала коллигативное действие сахарозы, поскольку растворы, в которых замораживали клетки, не содержали солей. Возможность защитного действия.ОН - групп сахарозы на . плазмалемму многими авторами подверагается сомнению (Levitt,1966, Sakai,1962); если такой.механизм криопротекции имеет место, то он должен проявляется уже.при небольших концентрациях сахароз.ы, тогда как в наших экспериментах основное защитное действие осуществлялось при добавлении растворов сахарозы в высоких концентрациях,. Кроме того, степень,криопротек-торного действия оказалось примерно одинаковой при определении повреждений .тремя различными методами: . увеличение электропроводности среды и выход ионов калия указывает, на повреждение плазмалеммы а также тонопласта, определения по ТТХ .указывают на повреждения митохондрий. Поскольку сахароза не проникала^в цитоплазму, она не могла защищать внутриклеточные структурь1 не- ', посредственно. Причиной .повреждений митохондрий не могла быть их деформация вследствие малой величины- и расположения между -двумя клеточными мембранами (плазмалеммой и тонопластом);, не . могло быть причиной и обезвоживание, так как сахароза не уменьшала его. Есть данные о.том, что повреждения могут быть обусловлены взаимодействием клеточной стенки и плазмалеммы (Сами-гин, 1973). При образовании льда вне клеток "он отнимает от клеток воду , Ч1ТО приводит к уменьшению клеточного объема и деформации ;клеточной стенки. Сжимающийся протопласт тянет за собой клеточную сТенку, плазматическая, мембрана подвергается неравно-,-мерному растяжению - сжатию.' При сильной деформации это может приводить к разрыву плазмалеммы, которое летально. " Эти преде- '■ тавления хорошо объясняют защиту клеток во время;замораживания . их предварительным плазмолизом, так как он отделяет,плазмалемму от клеточной стенки, что ослабляет, деформацию протопластов.' Это • предотвращает структурные изменения в плазмалемме. -- Таким же образом, он может действовать и на тонопласт, который, вероятно, повреждается также в результате механических деформаций '-, одновременно с плазмалеммой. Повреждением тонопласта и связан' шм с.этим выходом ионов калия и токсичных веществ в цитоплазму.. можно объяснить повреждения митохондрий.. :■ . ;

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, можно сделать вывод, что в условиях медленного замораживания повреждения клеток - суспензионных культур, различающихся по своей устойчивости, являются результатом как обезвоживания,, так и деформации. Обезвоживание дестабилизирует мембрану (плазмалемму, тонопласт и др.) вследствие повышения концентрации ионов и некоторых органических соединений внутри протопластов и уменьшения содержания воды в самих мембранах. Эта дестабилизация усиливается со временем и, вероятно, делает мембраны менее устойчивыми к деформациям. Механический стресс, которому подвергаются клетки и их протопласты при внеклеточном замораживании, обусловлен, с одной стороны, сжатием плазмалеммы и тонопласта в результате выхода вода из протопластов, а с другой стороны, контактом плазмалеммы с клеточной стенкой, которая обладает малой растяжимостью, в результате плазмалемма подвергается механическому растяжению, что может привести к ее разрыву. Установлено, что повреждения клеток диоскореи и пшеницы осуществляются, главным образом, во время замораживания. Обратный вход воды в протопласт при оттаивании не вносит, существенный вклад в повреждения.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что суспензионная культура пшеницы ТгШсиш ито£ееу1 способна повышать свою устойчивость как под действием холодового закаливания, так и под действием АБК. Максимальной устойчивостью и наибольшей способностью к закаливанию обладают клетки суспензии на 6-8 сутки после пересадки, что соответствует началу экспоненциальной фазы кривой роста.

2. Закаливание клеток суспензионной культуры пшеницы не сопровождается значительным накоплением сухого вещества и саха-юв, как это происходит в ингактных растениях, что свидетельст-¡ует о менее существенной роли осмотического компонента в раз-1итии устойчивости клеток суспензионной культуры.

3. Как низкотемпературное закаливание, так и обработка АБК :риводят к увеличению фракции растворимых белков. Наблюдается енденция клеточной суспензии к накоплению в процессе закалива-ия средне- и низкомолекулярных белков, при относительной ста-

-УЗ-

билъности высокомолекулярных

4. Показано, что в условиях медленного замораживания клеток суспензионных культур разных по своей устойчивости, повреждения . происходят как в результате обезвоживания клеточных структур и повышения концентрации растворенных веществ, так и в результате деформаций. Последние играют большую роль в повреждениях более устойчивых клеток.

5. Показано, чго основные повреждения клеток суспензии ди-оскореи и пшеницы в цикле замораживания-оттаивания происходят на стадии замораживания. Процесс оттаивания не вносит существенный вклад в развитие повреждений.■

6. Подтвержден коллигативный механизм защитного действия проникающих растворов, а также непроникающих растворов в присутствии солей в среде замораживания. Криопротекторное действие непроникающих растворов сахарозы связано с их плазмолизирующим действием на клетки, . что ослабляет контакт плазмалеммы с Неточной стенкой и уменьшает деформации плазмалеммы во время замораживания. ' .

По результатам диссертационной работы соискателем опубликовано 6-научных работ:

1. Н.Ф.Гаврилова. Факторы повреждения при замораживании клеток суспензионной культуры диоскореи.//П Всесоюзная конференция молодых ученых по физиологии растительной клетки. Москва. -1986. -С. 95.. . .. .

2.' Н.Ф.Гаврилова, Г.А.Самыгин. Причины повреждении клеток

Dioskorea deltoidea Wall, при замораживании. //Физиология

растений. -1988. -Т.35. -Вып.3. -С.585-590.

3. N.F.Sopiha. Cryoproyective effect of sucrose on wheat cultured cells.// Abstr. Vth International Youth symposium on plant.metabolism régulation. Varna 8-13,october.,1990. -P.36.

4. Н.Ф.Сопина. О способности клеток суспензионной культуры , пшеницы закаливаться к морозу.// IV Всесоюзная конф. молодых

ученых по физиологии растительной клетки.' (Минск.-1990.): ; ■ Тез. докл. М., 1990. -С. 147. ; . '

5;Н.'Ф,Сопина, Г.А^Самыгин О механизме защитного действия-плагмолизирующих растворов сахарозы .при-замораживании суспензии клеток щеницы.// Физиология-растений.-1993. Т. '- Вып:з.- С;

' 6. Н.Ф.Сопина, Г'.С. Карасев. Влияние Солодового закаливания .' и АБК ; 'на морозоустойчивость суспензионной культуры- пшеницы '. TriUcum timophe'eyi. //Третий съезд Всероссийского- общества физиологов растений (Санкт-Петербург, '1993):.. Тез; 'докл.-:,0Пб,4,1993. ' С--732. -