Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Криоконсервирование перевиваемой клеточной линии ВНК-21/2 для производства культуральной противоящурной вакцины

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Криоконсервирование перевиваемой клеточной линии ВНК-21/2 для производства культуральной противоящурной вакцины"

О п и

/ В 1К)П и

' " ' На правах рукописи

УДК.619:57.043:578.835.2:615.371

МАШ1Н Борис Леокидовнч

КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ ПЕРЕВИВАЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ ВШС-21/2 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА КУЛЬТУРАЛЫЮЙ ПРОТИВОЯ1ЦУРНОЙ ВАКЦИНЫ

03.00.06 « Вирусология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Владимир -1998

/

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ) Минсельхозпрода Российской Федерации.

Научный руководитель: Михалпшнн Валерий Васильевич,

доктор ветеринарных наук.

Официальные оппоненты: Пономарёв Алексей Петрович - доктор

биологических наук (ВНИИЗЖ, г. Владимир)

Юрков Сергей Григорьевич -кандидат биологических наук (ВНИИВВиМ, г. Покров)

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (ВНИиТИБП) г. Щёлково Защита состоится « 3^» 1998 г. в 11 часов

на заседании диссертационного совета Д 120.60.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных МСХиП РФ по адресу: 600900 г. Владимир, пос. Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных.

Автореферат разослан «^<Г» мая 1998 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор ветеринарных наук, профессор -Ю.А. Черняев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Актуальность проблемы. Для получения противовирусных вакцинных препаратов требуется большое количество живых клеток чувствительных к вирусам , которое можно было бы использовать в условиях производства. Такой запас клеток можно сохранять при сверхнизких температурах (-196°С), что позволит иметь необходимое количество генетически однородного материала.

При хранении клеток и тканей при температурах + 20°... -70°С в них происходят многие физиологические процессы и фазовые физико-химические переходы, которые сопровождаются накоплением продуктов жизнедеятельности и морфоструктурными изменениями. Даже при температурах -120°... -130°С происходит рекристаллизация растворов, которая приводит к деформациям в биологических объектах (А. М. Воротнлин и др., 1984). Эти процессы не позволяют длительно сохранять клеточные культуры и другие биологические объекты в вышеуказанных условиях. При криоконсервировании и хранении клеток в жидком азоте не наблюдается температурных перепадов, все биохимические и физические процессы сильно замедлены. Поэтому наиболее надёжным и перспективным способом сохранения биологических объектов на клеточном уровне является криоконсервирование до температуры сжиженных газов (азота, кислорода, гелия и др.).

Интенсивное развитие криобиологической науки в начале 50-60 годов нашего века привело к значительным успехам в области консервирования соматических и половых клеток растительного и животного происхождения. Криоконсервирование стало неотъемлемой частью технологии производства некоторых вакцин против бактериальных и вирусных инфекций, а также надёжным способом сохранения коллекционных культур микроорганизмов (Е.Е.Никитин, И.В.Звягин, 1971) и тканевых культур (В.Н.Опарин и др., 1970, Н.С.Юдина, 1970, Л.Н.Миронова и др., 1973, И.С.Кучмасов, 1974, Ю.В.Дьяченко и др. 1974, Д.М.Мэй, 1976, Б.Т.Стегний,1982, И.И.Малыгина и др., 1984).

В приготовлении культурапьной противоящурной вакцины важные этапом является получение матровой расплодки клеточной культуры, имеющей одно происхождение. Источником её в обычных производственных условиях как правило, служит партия однородных паспортизованных клеток, хранящих« при сверхнизких температурах(-196°С) в ампулах ёмкостью 1-5 мл. Обычно и: такого объёма суспензии нарабатывают промышленную партию клеток I течение 2-3 пассажей в монослое, а затем клетки выращивают в суспензии I сосудах объёмом 3-5 литров. Полученную расплодку клеток культивируют I реакторах большей ёмкости. Проведение указанных этапов требует дпительногс времени н усложняет технологический процесс производства вакцины. В связ1 с этим актуальной является разработка метода хранения перевиваемых культу]: клеток при низких температурах _в количествах, достаточных для начал« первичного культивирования в объёмах 5-10 литров, а затем в реактора? большого объёма. Однако остаются нерешёнными вопросы, связанные < оптимизацией режимов замораживания-оттаивания больших количест! клеточных культур, и не установлены допустимые концентрации клеток которые бы не влияли на последующую выживаемость клеток после отгаиванш и культивирования в больших объёмах. Несмотря на то, что в настоящее врем; используется большое количество криопротекторов при замораживании клеток нет единого мнения о возможности применения любого криопротектора пр! замораживании большого количества клеток одновременно и влияши криопротекторов на жизнеспособность клеток после оттаивания. Не отработань оптимальные режимы замораживания больших количеств матровых клеточны: культур с криопротекгорами, не изучены вопросы, связанные I чувствительностью клеточных культур после замораживания-оттаивания 1 вирусу ящура.

Все эти вопросы являются актуальными и необходимыми при разработю методов крупномасштабного культивирования клеток и вирусов при разработю производства противоящурных вакцин.

Цель исследования. Основной целью данных исследований была отработка оптимальных режимов замораживания-оттаивания больших объёмов матровы.х расплодок культур клеток с сохранением исходных биологических свойств для промышленного культивирования клеток и вируса ящура при производстве культуральных противоящурных вакцин.

Для достижения основной цели необходимо было решить следующие задачи:

-сконструировать, построить и апробировать в производственных условиях лабораторные установки для замораживания больших объёмов клеточной суспензии ВНК-21/2;

-отработать оптимальные режимы замораживания клеточных суспензий в ёмкостях большого объёма;

-обосновать максимальную концентрацию клеток, которая в созданных условиях криоконсервирования не влияет на выживаемость клеток после оттаивания;

-подобрать криопротекторы, пригодные для замораживания перевиваемых клеток в больших объёмах;

-изучить влияние разработанных условий криоконсервирования на пролиферативную активность клеток и их чувствительность к вирусу яшура после оттаивания;

-разработать методы тестирования свойств клеточных культур после криоконсервирования.

Научная ношпна. В результате проведённых исследований: -разработан метод криоконсервирования клеток ВНК-21/2 в объёмах 75-80 мл., который обеспечивает возможность после оттаивания клеток выращивать их в культиваторах, начиная с объёмов 5-10 литров, минуя монослойную стадию;

-сконструированы, построены и испытаны лабораторные установки для замораживания больших объёмов клеточной суспензии, которые оказались более экономичными по сравнению с программными замораживателями;

-изучено защитное действие на клетки веществ разной химической природы, ряд из которых обладает хорошими криопротективными свойствами по отношению к клеточной культуре ВНК-21/2. Впервые в качестве криопротектора при замораживании клеточной суспензии в больших объёмах обоснован и предложен этилеигликоль, который обладал хорошими защитными свойствами по отношению к перевиваемой клеточной культуре ВНК-21/2 при замораживании до температуры -196°С;

-для тестирования и изучения физиологического состояния клеток после криоконсервирования предложен комплекс различных методов, включающих: цейтрафферную киносъёмку, люминесцентную микроскопию, определение дзета-потенциала и др;

-изучены морфофункциональные криоповреждения в клетках ВНК-21 с использованием окраски акридиновым оранжевым;

-проведена оценка физиологического состояния клеток по их морфологии при криоконсервировании с помощью различных методов.

Практическая ценность. На основе проведённой работы: -разработана методика криоконсервирования клеток, которая утверждена директором ВНИЯИ и рекомендована для использования в промышленных условиях при производстве культуральной противоящурной вакцины. Эта методика в настоящее время используется в качестве этапа(технологической стадии) при наработке промышленного количества клеточной культуры ВНК-21/2 при изготовлении противоящурных вакцин;

-предложены оптимальные условия замораживания-оттаивания и хранения перевиваемой культуры ВНК-21/2 в стеклянных ёмкостях с объёмом замораживаемой суспензии 75-80 мл., при концентрации клеток 25 млн/мл с применением в качестве криопротектора этиленгликоля в концентрации 5%. При этих условиях криоконсервирования клетки после оттаивания и (сультивирования сохраняют чувствительность к вирусу ящура;

-изготовлены и внедрены в лабораториях и производственных цехах две лабораторные установки на основе сосуда Дыоара СД-40 для замораживания клеточных культур;

-предложен метод цейтрафферной киносъёмки для изучения структуры и активности клеток ВНК-21, замороженных под защитой этиле игл и кол я.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены: на научных конференциях Всесоюзного научно-исследовательского ящурного института (ВНИЯИ, а затем -ВНИИЗЖ), посвященных проблеме ящура в 1980, 1983, 1986, 1987, 1988, 1995, 1997 годах; на второй Всесоюзной конференции по теоретическим и прикладным проблемам криобиологии и криомедишшы (Харьков, 9-11 октября 1984 г.);на рабочем совещании стран членов СЭВ по ящуру в ГДР (о. Риме, 1981г.); в ЧССР, (г. Терезин, 1984 г.); на первой Всесоюзной конференции по биотехнологии ( Москва, ВИЭВ, июнь 1986 г.); на втором Симпозиуме специалистов стран членов СЭВ по проблеме ящура (НРБ, 1987 г.); на Всесоюзной научно-технической конференции «Применение биотехнологий в животноводстве и ветеринарии» (Ленинград, октябрь, 1988г.); на второй Международной конференции «Успехи современной криобиологии» (Харьков, апрель, 1992 г.).

Положения, выносимые на защиту.

1. Оптимизация режимов криоконсервирования культур клеток при промышленном производстве культуральных вакцин.

2. Подбор и обоснование криопротекторов при криоконсервировании клеточных культур.

3. Изучение физиологического состояния культур клеток после замораживания-оттаивания и определение чувствительности к вирусу ящура.

4. Создание лабораторной установки для замораживания больших объёмов клеточной суспензии.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 печатная работа.

Объём н структура диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических предложений. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 46 рисунками. Список

использованной литературы включает 210 источников, из них 65 на иностранных языках.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Настоящая работа выполнялась в соответствии с планом научно-исследовательских работ ВНИЯИ (ВНИИЗЖ) по темам «Создание музея клеточных линий и штаммов, их стандартизация и паспортизация», и «Поддержание, паспортизация, хранение для исследовательских и производственных целей музейных культур клеток», а также в плане научно-технического сотрудничества стран членов СЭВ в области сельского и лесного хозяйства по теме «Профилактика и эффективная борьба с ящуром, а также создание высокоэффективных противоящурных вакцин».

Материалы и методы исследований

Клеточные культуры. В нашей работе были использованы монослойно-суспензионные трофоварианты клеточных культур ВНК-21/135, ВНК-21/2 и ППК-666. Для исследования брали клеточные культуры в конце логарифмической стадии роста с индексом пролиферации 4-6 при культивировании в суспензии и 6-8 при выращивании в монослое.

Копцептрпрование клеточных суспензий. Концентрирование клеточных суспензий проводили с помощью центрифуги Мистраль-бЦМБЕ) при 1000 об/мин в течение 3-5 минут. После центрифугировавния над осадочную среду сливали и клетки разбавляли свежей средой до нужной концентрации.

Вирусы. При проведении исследований использовали штаммы вируса ящура А22-550, 01-194, С|-5ы, САТ-1, САТ-2, САТ-3, Азия-1-48, репродуцированные в культуре клеток ВНК-21 с исходным титром не ниже 7,0^ ТЦД 50/мл.

Замораживание клеточных культур. При замораживании клеточных культур охлаждение до криогенных температур проводили на программном замораживагеле, созданном на опытном производстве Института проблем криобиологии и криомедицины АН УССР и на лабораторных установках, сконструированных и изготовленных нами на основе сосудов Дьюара АСД-16, СД-40, АСДС-50, СД-50. Для контроля скорости понижения температуры использовали прибор КСМ-4 (уравновешенный мост переменного тока) и

малоинерционный, платиновый датчик в 100 ом, пометённый внутрь ампулы или контейнера с имитатором. Основным хладогентом на всех установках был жидкий азот, который в конечном результате охлаждал суспензии клеток до температуры -196 °С.

В качестве ёмкостей для замораживания клеточных суспензий испытывали ампулы 1-5 мл., флаконы ёмкостью 50, 100, 250, 500 мл., стальные контейнеры ёмкостью 50, 100, 250 мл., алюминиевые контейнеры с ребристой поверхностью ёмкостью 50 и 250 мл., а также ампулы, изготовленные нами из пипеток Мора ёмкостью 50 и 100 мл.

Криопротекторы. В наших исследованиях изучали криопротективную активность и токсичность по отношению к клеточным культурам ВНК-21 и ППК-666 такие традиционные защитные вещества как глицерин и диметилсульфоксид (ДМСО), а также вещества разного химического состава, как эндоцеллюлярного, так и экзоцеллюлярного действия: этиленгликоль (ЭГ); диэтиленгликоль; полипропиленгликоль м. м. 1025 и 504 (Д); полиэтиленгликоли (ПЭГ) м. м. 300, 600, 1000, 1540, 2000, 3000, 10000 Д; полиэтиленоксиды (ПЭО) м. м. 100, 150, 200, 300, 400, 600, 1000, 1500, 2000, 3000, 20000, 40000, Д; оксиэтилированный полиглицерин (ОЭГ) м. м. 1400 Д; оксиэтилированный полиглицерин (ОЭПГ) со степенью полимеризации (п) 4 и 7; оксиэтилированные этилцеллосольвы (ОЭЭЦ) м. м. 400, 1500 Д; оксиэтилированный диэтаноламин (ОЭДА), оксиэтилированный моноэтаноламин (ОЭМЭА); диметилформамид (ДМФА); поливинилпирролидон (ПВГТ) м. м. 12000 Д. Большинство использованных криопротекторов были любезно предоставлены докт. биол. наук М.И. Шраго и членом кор. АН УССР Н.С. Пушкарем из Института проблем криобиологии и криомедицины.

Среды культивирования. В опытах по криоконсервированию и культивированию клеток использовали среду Игла и ПС-Е с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота (5-10%).

Оценка жизнеспособности н физиологической активности клеток. Оценку жизнеспособности клеток проводили с помощью окрашивания

трипановой синью (0,01% раствор). Пролиферативную активность оценивали по кратности прироста клеток за 48 часов.

Изучение динамики пролиферации и физиологической активности клеточных культур проводилось с помощью центрафферной киносъёмки на инвертированном микроскопе МБИ-13.

Для изучения криоповреждений с помощью люминесцентной микроскопии клетки выращивали на покровных стеклах до образования 80% монослоя. Интактные препараты сразу же окрашивали в растворе акридинового оранжевого (концентрация 1:10000) в течение 1-2 минут и просматривали под микроскопом МЛД-1. При испытании действия криопротектора препарат экспонировали в течение 5 минут в 5-10% его растворе, далее окрашивали и просматривали под микроскопом. Замораживание препаратов, обработанных криопротекторами и без них, проводили путём опускания в жидкий азот (скорость охлаждения около 6300°/мин.); оттаивали в ростовой среде примерно с такой же скоростью, после чего препараты окрашивали и исследовали. Полученные препараты фотографировали через фотоприставку МНФ-5 камерой «Зенит» на плёнку ЦНД-32.

Электрофорез клеток проводили на устройстве, собранном нами в лабораторных условиях на платформе микроскопа МББ-1А.

Условия криоконсервирования. Для выбора оптимальных условий криоконсервирования было проведено 137 опытов: подбор контейнеров, криопротекторов, скоростей замораживания-оттаивания, испытание лабораторных устройств. Уже по отработанному методу было проведено более 600 циклов криоконсервирования различных клеточных культур на сконструированных нами установках с применением 5% этиленгликоля.

Определение чувствительности клеток к вирусу. Определение чувствительности клеток к вирусу ящура после криоконсервирования проводили совместно с сотрудниками лаборатории культур клеток и лаборатории производственных штаммов по стандартным методикам (более 9 опытов).

Мсюды статистической обработки. При анализе и обобщении результатов исследований использовали методы, описанные в руководствах по биометрии (И.II. Ашмарнн, АЛ. Воробьев. 1962. ПФ Ракицкий, 1%7. НА Плохинский, 1970).

В выполнении различных разделов диссертации оказывали практическою и консультативную помощь сотрудники института Ю И. Филин. Г А. Худяков, ЕЕ. Фёдорова, ТА. Фомина, Т.Н. Корпусова, НИ. Герасимова, за что приношу им свою благодарность

Результаты исследований

Выполняя основную цель исследований по отработке режимов замораживания-оттаивания больших объёмов матровой расплодки кульгур клеток для промышленного культивирования клеток и вируса ящура при производстве культуральных вакцин, нами был проведён целый ряд конструктивных работ, а также исследования по изучению выживания клеток в процессе криоконсервирования и последующего культивирования. Проведённые исследования по изучению влияния различных физических и химических факторов на сохраняемость клеточной культуры ВНК-21 при криоконсервировании показали, что значимость их не одинакова. Особенно важной и сложной оказалась разработка подходов к криоконсервированию значительных концентраций клеток (более 20 млн/мл) в больших объёмах (80 мл. и более). В данной ситуации мы столкнулись с дополнительными факторами, а именно: большой объём замораживаемой суспензии, длительная экспозиция с криопротекторами, неоптимальная конфигурация применяемых контейнеров и ампул, которые влияли на выживаемость клеток после оттаивания. Условия, оптимальные для клеток крови (по данным литературы), оказались непригодными для криоконсервирования активно пролиферируюших клеток, которые используются в вирусологии и биотехнологии, особенно в больших количествах при производстве противоящурных вакцин.

Подбор п конструирование аппаратуры для за.мораж-нванпя При производстве противоящурных инактивированных вакцин из культурального вируса возникла необходимость хранения больших количеств

матричной клеточной культуры, которую обычно хранят в замороженном виде при сверхнизких температурах.

Необходимость крупномасштабного крпоконсервирования клеток ВНК-21/2 потребовала применения надёжной криогенной аппаратуры, которая была представлена вначале криокомплексом, созданном на опытном производстве ИПКиК (г. Харьков). В него входили программный замораживатель и размораживатель. Однако, этот криокомплекс требовал специального обслуживания и потреблял большое количество жидкого азота. Поэтому одним из важных аспектов наших исследований было создание дублирующих устройств, которые надёжно заменяли бы программный замораживатель, позволяющих одновременно замораживать большие количества клеточных суспензий и осуществлять регулируемый контроль за скоростью охлаждения.

Нами были сконструированы в лабораторных условиях четыре замораживателя с контролем и регуляцией скорости охлаждения. Для крпоконсервирования клеточных суспензий, расфасованных в ампулы ёмкостью 75 мл., был собран замораживатель на основе сосуда Дыоара СД-40 (лабораторная установка №2). Малые скорости охлаждения достигались на первом этапе в результате помещения ампул в градиент температур, который формируется над поверхностью жидкого азота. Максимальная скорость охлаждения на втором этапе лимитировалась предельной температурой паров жидкого азота, которая достигала в камере -150°С(при включении вентилятора), а также особенностями контейнеров и ампул, заполненных клеточной суспензией. В итоге удалось достигнуть скорости замораживания после кристаллизации равной 7-8°/мин, которая оказалась приемлемой для клеток ВНК-21/2. Выживаемость клеток после криоконсервирвания достигала 96%. Были выявлены некоторые преимущества перед программным замораживателем, в частности, экономия жидкого азота, простота в обслуживании, надёжность. Если для цикла замораживания на программном замораживателе необходимо было минимум 25 литров азота, то в лабораторном устройстве расходовалось 8-10 литров. Одно из преимуществ заключалось в меньшей инерционности начального этапа охлаждения, так как в лабораторном

устройстве ампула попадает сразу в градиент температур, который обеспечивает скорость охлаждения 1-2 0 /мин, программное устройство создаёт этот градиент через некоторое время. Кроме того, имея информацию о снижении температуры в самом объекте (датчик помешается в ампулу), можно анализировать и при необходимости изменять характеристики в зависимости от типа ампул и контейнеров.

Максимально удобным в обращении оказалось лабораторное устройство на основе узкогорлого сосуда Дьюара АСД-16 (лабораторная установка №3), скорость охлаждения в котором регулировалась величиной напряжения, подаваемого на нагреватель, опущенный в жидкий азот. Устройство рассчитано на замораживание 15 ампул ёмкостью 5 мл. С его помощью замораживались не только клетки ВНК-21, но миеломные и гибридомные клеточные линии. Дальнейшая модификация лабораторной установки №3 (ua основе узкогорлого АСДС-50), которая преследовала увеличение количества замораживаемого объекта, привела к тому, что удалось воспроизвести режим охлаждения, приемлемый для клеточной линии ВНК-21/2, но при этом сузился диапазон максимальных скоростей, который ограничился 4°/мин.

Технология воспроизведения режимов замораживания зависит как от удачного подбора замораживателей, так и от применяемых ёмкостей для клеточных суспензий.

Подбор контейнеров для замораживания клеточных суспензий

В мировой практике наиболее перспективными считаются контейнеры из нетоксичного термопластика (J. Shyoji, Н. Kazuliisa , 1980), но нам пока не удалось приобрести даже опытный образец такого контейнера. Металлические контейнеры, обладающие хорошим коэффициентом теплопередачи, также малодоступны. К тому же при повторном применении этих контейнеров возможно попадание жидкого азота вовнутрь, что приводит к взрыву при размораживании.

Предложенный нами контейнер в виде стеклянной ампулы ёмкостью 7580 мл. сделан из пипеток Мора ёмкостью 100 мл. Одновременно со многими удобствами в обращении ампула имеет недостаток - значительный диаметр (до

36 мм ), что создаёт трудности в воспроизведении режима замораживания для клеток ВНК-21. Для преодоления этого фактора проведена значительная работа по подбору скорости замораживания на программном замораживателе и лабораторных установках. Для того, чтобы скорость охлаждения в объекте была равной |°-2°/ мнн., оказалось необходимым воспроизведение скорости охлаждения в камере - 5°/мин. А для воспроизведения минимально необходимой скорости оттаивания (не менее 60°/мин.), нужно довести температуру водяной бани до +42°С и увеличить интенсивность перемешивания воды (по сравнению с разморозкой ампул объёмом 5 мл.). При соблюдении таких условий можно достичь максимальной выживаемости клеток ВНК-21.

Режимы замораживания и оттаивания клеточных суспензий в зависимости от применяемых контейнеров и аппаратуры замораживания

В результате проведённого многофакторного эксперимента были выявлены диапазоны допустимых интервалов скоростей замораживания-оттаивания для клеточной культуры ВНК-21, а также точки перехода с одного этапа охлаждения на другой. Оказалось, что на первом этапе скорость охлаждения может варьировать от I до 4°/мин., на втором этапе от 8 до 25°/мин. Оптимальная точка перехода с первого этапа на второй лежит в диапазоне -25° --30°. Интегральная скорость отогревания может колебаться от 60 до 180°/мин.

Проведенные исследования по определению факторов предподготовки клеточной суспензии к замораживанию показали, что концентрация добавляемого криопротектора (в первых опытах был использован глицерин), скорость перемешивания (от 200 до 280 об./мин.), скорость добавления криопротектора и температура суспензии в выбранных интервалах (от 0 до 37°) не оказывали существенного воздействия на жизнеспособность клеток. В большей степени на выживаемость клеток влияет экспозиция суспензии с криопротекторами при комнатной температуре. В этих опытах показано, что эквилибрация клеток с 10% глицерина приводит к снижению жизнеспособности. Поэтому для успешного криоконсервирования с использованием этого криопротектора экспозиция не должна превышать 30 минут, после чего наступают необратимые явления, которые приводят к гибели

клеток. Этот факт в последующих исследованиях заставил нас искать менее токсичный криопротектор для того, чтобы уменьшить влияние временного фактора при взаимодействии клеток с защитными веществами.

Сравнительная опенка различных крнонротекторов для замораживания клеточных культур При изучении криопротективной активности различных химических соединений для замораживания клеточной культуры ВНК-21 использование 36 веществ разной химической природы. 33 вещества оказались пригодными для криоконсервирования данной клеточной культуры Наиболее перспективными оказались полиэтиленгликоли и полиэтиленоксиды с низкой молекулярной массой (менее 1000 Д), защитное действие которых было таким же, как ДМСО и глицерина, а токсичность этих веществ была ниже.

В серии наших опытов были изучены жизнеспособность и скорость пролиферации клеток ВНК-21 после криоконсервирования с этиленгликолем и ПЭГ разной молекулярной массы. Изучение именно этих криопротекторов определялось тем, что данные вещества кроме малой токсичности и хорошей криопротективной активности были наиболее доступны и хорошо изучены в качестве стабилизаторов сыворотки крови и в вирусологических исследованиях. В результате проведённых опытов было установлено, что токсичность ПЭГ значительно увеличивается с возрастанием молекулярной массы свыше 1000 Д и при временной экспозиции с клетками более 4 часов. Основное токсическое действие высокомолекулярных ПЭГ, вероятно, связано с тем, что эти вещества агрегируют клетки до такой степени, при которой уменьшается доступ питательных веществ из среды в клетки, в результате чего наступает их гибель. Исследования показали, что на первом пассаже после криоконсервирования полный монослой клеток образуется только при использовании ПЭГ-300. Оптимальная защитная концентрация этого вещества составляла 5-7%. Аналогичными свойствами обладай также этиленгликоль. Токсичность этих двух веществ проявлялась при концентрации их в суспензии свыше 15%, а защитная - при криоконсервировании начиналась с 2,5%. Возможен разброс рабочих концентраций от 2,5 до 12%. Однако, в дальнейших опытах

предпочтение было отдано этиленгликолю из-за его доступности и удобства в работе. Этиленгликоль является быстрорастворимым веществом и самым текучим криопротектором после ДМСО. Благодаря этим физическим свойствам, исключается даже кратковременный контакт клеток с концентрированным криопротектором. При этом достигается высокая точность применяемой концентрации, т.к. на стенках пипеток остаётся минимум вещества. При дальнейшем изучении токсичности этиленгликоля оказалось, что его ингибирующее действие в растущей суспензии клеток проявляется при концентрации 1%, что в 10 - 15 раз превышает количество, которое попадает в систему культивирования клеток после криоконсервирования. Поэтому отпадает необходимость отмывания клеточной суспензии от этиленгликоля. В процессе замораживания больших объёмов клеточных суспензий увеличивается экспозиция концентрата клеток с криопротектором при комнатной температуре, вследствие чего после криоконсервирования резко падает их жизнеспособность (особенно при концентрации более 30 млн./мл.). Это происходит из-за изменения рН среды в сторону заклсления до момента замораживания и влияния токсических метаболитов на ослабленные реконсервированные клетки.

Подбор оптимальных концентраций клеток для замораживания их в

больших объёмах При изучении процесса криоконсервирования необходимо было определить оптимальные концентрации клеток для замораживания, время экспозиции клеток с криопротектором до замораживания, а также оптимизировать режим размораживания и ресуспендирования концентрата клеток, освобождения клеток от криопротектора и влияние величины рН на клетки при замораживании-оттаивании. В результате проведённых опытов была выявлена возможность замораживания клеточной суспензии при концентрации от 10 до 100 млн./мл и более клеток. При большой концентрации клеток экспозиция с криопротектором и время до замораживания после концентрирования должны быть сведены до минимума. На практике, особенно в производственных масштабах, время от момента концентрирования клеток до начала замораживания может достигать 2-4 часов, следовательно очень

зысокая концентрация клеток нежелательна и поэтому нами была предложена эабочая концентрация клеток в пределах от 20 до 30 млн./мл. Из всего этого :ледуег, что при замораживании больших объёмов клеточной суспензии необходимо быстро проводить все манипуляции предподготовки: по концентрированию, добавлению криопротектора, расфасовке, запайки ампул, контейнеризации. После оттаивания клеток, их необходимо ресуспендировать в :вежей питательной среде до нужной концентрации. В опытах был установлен и такой факт, что присутствие ЭГ в 5% концентрации в суспензии практически не :нижает жизнеспособность клеток по сравнению с концентратом без криопротектора. Следовательно, в производственных условиях нет необходимости удалять криопротектор. Для того, чтобы величина pH среды в концентрате клеток значительно не снижалась, необходимо в процессе предподготовки клеток к заморозке заменять ростовую среду свежей, в которой эуферная ёмкость ещё не истощена.

Культивнрование клеток в ферментёрах после крпоконсервированнп В результате проделанной работы нам удалось отработать необходимый режим замораживания в ампулах ёмкостью 75-80 мл., используя программный замораживатель и две лабораторные установоки. В лабораторных опытах был подобран и изучен малотоксичный криопротектор - этнленглнколь, определена оптимальная рабочая концентрация клеток для замораживания (20-30 млн./мл.), а также отработан режим размораживания. При строгом соблюдении условий предподготовки, замораживания и опаивания, выживаемость клеток достигала 96% и при культивировании их в КС-2 за 48-72 часа концентрация клеток в суспензии достигала 2-3,6 млн./мл. В течение наблюдаемого срока (более шести пет) выживаемость клеток после оттаивания не снижалась. Результаты восстановления клеток в суспензии зависели от среды и точного соблюдения условий культивирования. После многократных лабораторных опытов по выращиванию клеток ВНК-21 в КС-2, размороженную суспензию стали применять в производственных подразделениях института, где цикл культивирования начинался сразу в объёме 10 литров. После культивирования в КС-50 эти клетки неоднократно проходили все стадии наработки в

металлических реакторах, вплоть до объема 1800 литров (всего 6 пассажей) В целом, после криоконсервирования клетки восстанавливали свои функции и морфологию на первых пассажах. Таким образом было показано, что предложенный метод криоконсервирования позволяет значительно сократить цикл наработки клеточной культуры ВНК-21 до производственных масштабов Чувствительность клеточной культуры ВНК-21 к вирусу ящура

после крноко11серпнрова11Ш1 Как уже было упомянуто выше, главная цель крупномасштабного культивирования клеток - изготовление противоящурной вакцины. Поэтому криоконсервированные клетки исследовались на чувствительность к вирусу ящура сразу после размораживания (клетки хранились при температуре -196°С). Оказалось, что клетки, обладающие хорошей выживаемостью (не ниже 90%), не меняли чувствительность к вирусу типов А2:-5>и,САТ-1, САТ-2, САТ-3, Азия-1-48 (таблица № I). В наших опытах незначительно снижалась чувствительность к вирусу ящура 0194 и Ооы.

Таблица 1

Чувствительность клеток ВНК-21 к вирусу ящура после заморозки-оттаивания

Тип Интактные Криоконсервированные

вируса %живых Титр вируса %живы.х Титр вируса

ящура клеток ( 1ц ТЦД 50/мл.) клеток ( 1цТЦД 50/мл.)

А22-550 92 7,70 87 7,75

01'« 90 8,00 86 7,74

С|-5М 90 8,25 85 7,54

САТ-1 95 7,00 91 7,32

САТ-2 95 7,00 92 7,50

САТ-3 95 7,60 87 7,75

АЗИЯ-1-48 96 7,60 89 7,75

Известно, что в нежизнеспособных клетках вирус ящура не размножается, т.к нарушается механизм репродукции, начиная с адсорбции и

депротеинизацин вирионов. Поэтому сохранение чувствительности размороженных клеток ВНК-21 к вирусу по сравнению с интактными говорит о том, что структуры, ответственные за этот процесс не разрушены. Это явление может служить тестом выживаемости их после криоконсервирования.

Предложенный метод криоконсервирования применяется в производстве противоящурпой вакцины более 10 лет. Даже при четырёхлетнем хранении клеток при температуре -196°С удалось на конечной стадии культивирования в объёме 1800 литров получить концентрацию 3,5 млн./мл. и 2,5 мкг/мл. общего специфического белка штамма вируса ящураА22-55о

Подбор н разработка методов тестирования клеточных культур после криоконсервирования Способность к пролиферации в суспензии и монослое является объективным показателем оценки качества реконсервированных клеток, однако, эти два показателя дают мало информации о морфологических и физиологических изменениях в изучаемом объекте. Поэтому нами были применены и модифицированы некоторые методы изучения клеточных культур, которые можно было бы применять в лабораторных и производственных условиях: цейтрафферную киносъёмку (А.Т. Кравченко и др., 1963), люминесцентную микроскопию (М.А. Шесточенко и др., 1973). Было желательно также выяснить, почему после разморозки двукратный прирост клеток в суспензии происходил в большинстве опытов не за 24 часа, а за 40. Для того, чтобы не затормозить начало пролиферации после оттаивания, опытным путём было установлено, что в первые сутки культивирования необходимо исключить газообмен между суспензией и внешней средой. Вероятно, дыхательная активность клеток после криоконсервирования снижается из-за повреждений митохондрий и мембран эндоплазматической сети.

Применение цейтрафферной киносъёмки позволило выявить клетки, отличающиеся по степени жизнеспособности. Так, например, активные клетки после замораживания-оттаивания (в оптимальном режиме) приобретали морфологические признаки, отличимые от интактных. У них в первые часы после инокуляции была заметна повышенная зернистость. При анализе кадров

фильма выяснилось, что повышенная зернистость была обусловлена мелкими цитоплазматическими выростами, которые проявлялись по всей поверхности клеток. Кроме жизнеспособных были обнаружены клетки с целой наружной мембраной., но с увеличенным перинуклеарным пространством. Эти клетки не окрашивались трипановой синью, но через 6-8 часов лишались наружной мембраны, при этом обнажался кариопласт. Таких клеток в поле зрения могло быть до 20%. Ядра погибших клеток ВНК-21 могут длительное время существовать в среде культивирования. Эти ядра могут быть захвачены активными клетками, в результате чего образуются многоядерные клетки. С помощью цейтрафферной киносъёмки было установлено, что клетки свиного происхождения IB-RS-2 и 111 1К-666 активнее растут в тесной колонии по сравнению с отдельными клетками. В таких колониях происходят рост и размножение клеток, при этом наблюдается постепенное «растекание» их по субстрату. Даже во время деления метафазная клетка имеет связь через цитоплазматические выросты с монослоем. После деления дочерние клетки раздвигают окружающие их клетки и прикрепляются к стеклу. Если связь с субстратом нарушается, то поделившаяся клетка становится центром растущего конгломерата.

В отличие от культур свиного происхождения, клетки ВНК-21 в меньшей степени нуждаются в контактной стимуляции пролиферации. При культивировании в монослое они перемещаются по поверхности стекла на относительно большие расстояния. Наружные клеточные мембраны не вступают в тесный контакт и постепенно меняют пространственное положение. Отдельные клетки могут расти и делиться на определённом расстоянии от основной популяции.

Выявленный цейтрафферной киносъёмкой опережающий рост реконсервированной популяции клеток по сравнению с контрольной на третьи сутки, можно объяснить криостимуляцией ферментативных процессов. Сходное явление наблюдается у животных и людей прн криохирургических операциях, когда происходит более активная регенерация тканей, подвергшихся

гипотермии, по сравнению с обычным оперативным способом (М.И. Шкромида, В.П. Панько, 1988).

После заморозки-оттаивания во время роста клеток ВНК-21 были обнаружены трёх полюсные митозы, в результате которых образовывались три дочерние клетки. В некоторых случаях после трёх полюсного митоза дочерние клетки не расходились, а вновь сливались с образованием крупноядерной или многоядерной клетки. По нашим наблюдениям, образование многоядерных клеток - это адаптивная реакция клеточной культуры не только на криовоздействия, но и на ухудшение качества питательной среды. При стабильных же параметрах культивирования в монослое не происходит заметных изменений в кариотипе и морфологии клеток в течение даже 100 пассажей. В целом, цейтрафферная киносъёмка стала наиболее информативным методом оценки пролиферации клеточных культур после экстремальных воздействий.

Для изучения морфологии и физиологического состояния клеток в процессе криоконсервирования нами был использован также метод люминесцентной микроскопии. С помощью этого метода нам удалось выявить степень устойчивости различных клеточных структур к низким температурам. Оказалось, что ядра клеточной культуры ВНК-21 являются самыми устойчивыми органеллами при воздействии сверхнизких температур. В некоторых случаях изолированные ядра, имеющие зеленое свечение (признак живой субстанции) сохранялись при культивировании в монослое до 10 суток. Размеры этих ядер были в 2-3 раза меньше тех, которые находились в живых клетках, а интенсивность их свечения была выше, чем у нормальных, что свидетельствует об уплотнении хроматина в свободных ядрах. Люминесцентная микроскопия позволила обнаружить этапы эндоцитоза и наличие поликарионов, различающихся между собой по количеству и размерам ядер. Метод цейтрафферной киносъёмки в сочетании с люминесцентной микроскопией даёт возможность чётко представить механизм образования многоядерных клеток ВНК-21. Жизнеспособные клетки после криоконсервирования активно

адсорбируют па себе обнажённые ядра и во время деления включают их о цитоплазму.

Аналогичные опыты были проведены с клеточной культурой ППК-666. клетки которой в монослое значительно уплощены, поэтому различить летальные и живые клетки друг от друга при использовании люминесцентной микроскопии было значительно проще, чем при работе с клетками ВНК-21. Оказалось, что в результате криовоздействий без применения криопротектора. ядра этой культуры разрушаются почти одновременно с цитоплазмой. На препаратах было видно, что монослой начинает разрушаться с периферической части колонии. Сопоставляя данные люминесцентной микроскопии с фактом уменьшения количества клеток в результате экспозиции их при комнатной температуре до криоконсервирования и сразу после криоконсервирования можно сделать вывод, что погибшие клетки распадаются до фрагментов, не видимых в световом микроскопе, но обнаруживаемых в люминесцентном. Е дальнейшем эти фрагменты способствуют образованию конгломератов. Этот биологический признак характерен для клеточной культуры ППК-666.

Проведённые в небольшом объёме электронно-микроскопически« исследования подтвердили устойчивость ядер клеток ВНК-21 посж криодеструкцин цитоплазмы при температуре - 196°С без защитных веществ Ядра сохраняют целостность наружных ядерных мембран, в некоторых случая) наблюдается уплотнение хроматина и локализация его по периферии.

Проведённые нами исследования по изучению морфологии живых (н< фиксированных) клеток ВНК-21 и ППК-666 позволили сделать заключение, чтс нет необходимости в выделении множества стадий криодеструкций (H.H. Coca 1977), так как признаки летальных и сублетальных повреждений невозможнс определить на фиксированных препаратах. Люминесцентная микроскопия например, показала, что монослойные клетки ППК-666 после заморозки оттаивания без криопротектора имели красную цитоплазму. При использованш криопротектора клетки после оттаивания имели зеленоватую цитоплазму < вкраплениями оранжевых гранул рибосом. Живые и погибшие клетки имел! одинаково округлые ядра и одинаковые размеры. Основные морфологически«

изменения в цитоплазме, вероятно, происходят в результате дегидратационных процессов, связанных с воздействием криопротекторов и понижением температуры ещё в жидкой фазе ( Л.Г. Кулешова и др., 1983). Но эти изменения обратимы и имеют место при каждом процессе криоконсервирования.

По нашему мнению в процессе криоконсервирования можно выделить 6 стадий состояния клеток: а) интактные клетки в нормальном физиологическом состоянии; б) клетки с признаками дегидратации, экспонированные с криопротектором; в) живые реконсервирсванные клетки - с микроворсинками и деформированной цитоплазмой; г) летальные клетки - неокрашиваемые трипановой синью, с увеличенным перинуклеарным пространством или крупной дегидратационной вакуолью; д) летальные клетки, мембраны которых проницаемы для трипановой сини (этот признак коррелирует с покраснением цитоплазмы при люминесцентной микроскопии); е) клетки с разрушенной наружной мембраной.

Проведённые опыты по определению дзета-потенциала показали, что скорость перемещения реконсервированных жизнеспособных клеток в постоянном электрическом поле не изменялась по сравнению с интактными. Это свидетельствует об устойчивости наружных мембранных структур клеток ВНК-21. Метод электрофореза оказался малочувствительным для выявления не летальных изменений в клетках после криоконсервирования.

В целом, использованные нами методы тестирования позволили нам при отработке условий криоконсервирования выявить степень влияния факторов предподготовки и замораживания-оттаивания на жизнеспособность клеточных культур.

Таким образом, разработанный метод криоконсервирования позволил выделить главные и второстепенные факторы, влияющий на этот процесс. Для стабильности технологического процесса целесообразно использовать лабораторную установку №2, которая позволяет замораживать сразу 12 ампул объёмом 75 мл. - это концентрат 10 литров суспензии. При введении термодатчика непосредственно в объект замораживания, создаются условия, при которых контролируется температура и фазовые переходы в клеточной

суспензии. В этом случае при необходимости можно изменять скорость охлаждения замораживаемой суспензии. Изготовленные нами ампулы объёмом 75 мл. из пипеток Мора после заполнения суспензией герметизируются запаиванием на кислородной горелке. Тем самым исключается попадание жидкого азота в ампулы, что очень важно при хранении. Предлагаемые металлические и пластиковые контейнеры массового производства (Криоконсервирование клеточных суспензий, 1983, под ред. A.A. Цунаевой) не гарантируют достаточную герметичность и стерильность замораживаемого объекта, к тому же они мало доступны.

В процессе испытания разных криопротекторов было установлено, что в производственных условиях для клеток ВНК-21/2 лучшим криопротектором оказался этиленгликоль, который обеспечивал высокую выживаемость клеток при замораживании-оттаивании и не требовал отмывки после оттаивания. При хранении запасов этот криопротектор не окисляется (в сравнении с диметилсульфоксидом) и поэтому с одной партией проверенного вещества можно работать несколько лет.

Разработанный метод контроля за физиологическими и морфологическими изменениями в клетках в процессе криоконсервирования позволяет систематически следить за состоянием изучаемого объекта. Проведённая корреляция между цейграфферной киносъёмкой, люминесцентной микроскопией и обычным контролем показала, что новые методы более объективны, в то время как окраска трипановой синыо не обеспечивает точные показатели выживаемости клеток. В экспериментах было отмечено, что в питательной среде вследствие нарушения целостности эндонлазматической сети и ядерных структур много клеток гибнет. Поэтому были предложены более простые методы для оценки жизнеспособности клеток по их морфологическим признакам. Эти методы тестирования возможно применять для изучения взаимодействия вирусов с клетками.

Предложенный нами метод криоконсервирования клеток был успешно применён также и для длительного хранения миеломных, гибридомных клеточных культур (Л.А.Глобенко и др., 1985) и асцитной карциномы Эрлиха

(Герасимова Н.И., и др., 1986). Хорошая выживаемость клеток ВНК-21/2, криоконсервированных этим методом, позволяет быстро адаптировать их к суспензионному режиму культивирования и через 6 пассажей получить максимальный объём клеток (до 1800 литров), а затем на этих клетках культивировать вирус ящура, получая расплодки вируса с высокими титрами инфекционности, обладающими хорошими иммунобиологическими свойствами.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод длительного (не менее 3 лет) сохранения жизнеспособных клеток ВНК-21/2 с концентрацией 20-30 млн/мл, в больших объёмах (75-80 мл.) при температуре жидкого азота. Метод позволяет сократать технологический цикл промышленного производства культуралышй противоящурной вакцины на 7-10 дней.

2. Сконструированы 4 замораживающих устройства, позволяющие воспроизводить необходимые режимы замораживания суспензий клеток в ампулах объёмом 5 и 75 мл.

3. Оптимальным для замораживания клеток ВНК-21/2 является режим, обеспечивающий понижение температуры вначале 1-2°/мин.(до -30°С), затем 8-15°/мин. (до -15°... -130°С) и наконец - форсированное снижение температуры путём погружения в жидкий азот (до -196°С).

4. При замораживании клеток ВНК-21 изучено защитное действие 36 веществ различного происхождения с эндоцеллюлярным и экзоцеллюлярным механизмом действия. Установлено, что 33 из них обладают криопротективными свойствами, а наиболее удобным, дешёвым и переспективным для промышленного производства оказался этиленгликоль, добавляемый в суспензию в количестве 5-7%.

5. Высокая жизнеспособность клеток ВНК-21/2, хранившихся в замороженном состоянии, обеспечивается при быстром размораживании в водяной бане при условии повышения температуры со скоростью 60-180°/мин.

6. Установлено, что клетки ВНК-21/2 после замораживания-оттаивания по разработанной методике сохраняют высокую чувствительность к вирусу ящура типов А,О,С, САТ-1, САТ-2, САТ-3* Азия-1.

7. Длительное хранение клеток при -196°С (более 3 лет) позволяет на конечном этапе культивирования ( в объёме 1800 литров) получить концентрацию клеток более 3 млн/мл. Клетки могут использоваться для культивирования вируса ящура с последующим приготовлением высококачественных противоящурных вакцин.

8. Показано, что для изучения влияния различных факторов на выживаемость клеток при их криоконсервировании наиболее

информативными являются методы цеитрафферной киносъёмки и люминесцентной микроскопии.

Практические предложения

1. На основании проведённых исследований внесены «Дополнения к регламенту по изготовлению и контролю вакцин против ящура(из вируса, выращенного в клетках ВНК-21),которые утверждены директором завода «Юрьевецветбиопрепарат».

2. В процессе исследований разработана «Методика по длительному сохранению при -196°С клеточной культуры ВНК-21/2, используемой для производства культуральной противоящурной вакцины», утверждённая директором ВНИЯИ в 1988 году и «Методика по длительному сохранению при -196°С миеломных клеточных линий и гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к 146S компоненту вируса ящура А22.», утверждённая директором ВНИЯИ в 1987 году.

3. Внесены следующие методические рекомендации, которые рассмотрены и одобрены учёным советом ВНИЯИ:

-по изготовлению в лабораторных условиях замораживателей на основе сосудов Дьюара;

-по изготовлению ампул ёмкостью 75-80 мл. из пипеток Мора;

-по применению этиленгликоля в качестве криопротектора;

-по применению цеитрафферной киносъёмки и люминесцентной микроскопии в качестве тестов оценки морфологического и физиологического состояния клеток после криоконсеркирования

Список, работ опубликованных по теме диссертации

1 .Манин Б.Л., Филин Ю.И., Худяков Г.А., Кулаков В.Ю. Устройство для замораживания клеточных культур: Тез. докладов научной конференции ВНИЯИ, г. Владимир, 1980, с.16-17.

2. Манин Б.Л., Худяков Г.А. Мембранный потенциал клеток ВНК-21 при криоконсервировании: Тез. докладов научной конференции ВНИЯИ, г. Владимир, 1980, с.16-17.

3. Худяков Г.А., Манин Б.Л., Филин Ю.И., Скоморохов H.H. Лабораторное устройство для контролируемого и регулируемого замораживания клеточных культур. - доклад на рабочем совещании стран членов СЭВ по ящуру, о. Риме, ГДР, 1981./11.

4. Худяков Г.А , Новиков A.M., Лобынцева Г.С., Филин Ю.И., Манин Б.Л. и др. Поиск перспективных криофилактиков для сохранения клеток ВНК-21 в условиях низких температур: Тез. научной конференции ВНЯИ , г. Владимир, 1983, с.14-15.

5. Манин Б.Л., Худяков Г.А. Криоконсервирование перевиваемых клеток ВНК-21 под защитой этиленгликоля: Тез. докладов Всесоюзной

конференции по проблемам « Криобиологии и Криомедицины», г. Харьков, 1984, Т-1, с.173

6. Худяков Г.А., Манин Б.Л. Применение цейтрафферной киносъёмки для изучения структуры и активности клеток ВНК-21 замороженных под защитой этиленгликоля: Тез. докладов Всесоюзной конференции по проблемам « Криобиологии и Криомедицины», г. Харьков, 1984, Т-1, с.226.

7. Худяков Г.А., Манин Б.Л., Ковалёва И.А., Михайлова Т.П., Фёдорова Е.Е. Получение, поддержание, длительное сохранение при -196° перевиваемых линий клеток, их паспортизация: В книге СЭВ. Приложение вне протокола рабочего совещания по теме - Y.I.I., под тема - Y.I.I.I., г. Терезин, ЧССР, 1984.

8. Манин Б.Л., Худяков Г.А., Юдина Н.С., Шншова Т.И., Фомина Т.А. Использование стеклянных ёмкостей 50-80 мл. для криоконсервирования больших концентраций клеток ВНК-21 : Тез. научной конференции ВНИЯИ, г. Владимир, 1986, с. 19-20.

9. Герасимова Н.И., Худяков Г.А., Манин Б.Л. Сохранение асцитной карциномы Эрлиха: Тез. докладов научной конференции ВНИЯИ, г. Владимир, 1986, с.23-24.

10. Глобенко Л.А., Манин Б.Л., Бурдов А.Н., Худяков Г.А., Давыдова Н.Л., Маматкулова Л.У. Поддержание и длительное сохранение перевиваемых клеток мышиной миеломы: Тез. докладов научной конференции ВНИЯИ, г. Владимир, 1986, с.23-24.

11. Манин Б.Л., Худяков Г.А., Бурдов А.Н. Криоприставка на СД-40, для контролируемого замораживания клеточных культур: Тез. докладов научной конференции по биотехнологии, г. Москва, ВИЭВ, 1986,

12. Манин Б.Л., Худяков Г.А., Фёдорова Е.Е., Левицкая Е.Е. Выявление морфофункциональных криоповреждений в клетках ВНК-21 с использованием окраски акридиновым оранжевым: Тез. докладов научной конференции по биотехнологии, г. Москва, ВИЭВ, 1986.

13. Худяков Г.А., Манин Б.Л., Фёдорова Е.Е., Ковалёва И.А. Отбор популяции клеток ВНК-21 устойчивой к низким температурам: Тез. докладов научной конференции ВНИЯИ, г. Владимир, 1986, с.22-23.

14. Иванющенкова И.В., Худяков Г.А., Сюсюкин A.A., Фёдорова Е.Е., Манин Б.Л. и др. Получение и первичная паспортизация клонированных клеток ВНК-21/13 с высокой чувствительностью к вирусу ящура: Тез докладов научной конференции ВНИЯИ, г. Владимир, 1986, с. 12-14.

15. Худяков Г.А., Манин Б.Л., Давыдова Н.Л., Глобенко Л.А., Бурдов А.Н. Использование этиленгликоля для криоконсервирования гибридом: Материалы 2-го симпозиума специалистов стран членов СЭВ по проблеме « Профилактика и эффективная борьба с ящуром, а также

создание высокоэффективных противоящурных вакцин», София, 1988, с.67-68.

16. Манин Б.Л, Худяков Г.А., Давыдова Н.Л., Фёдорова Е.Е. Использование цейтрафферной киносъёмки для контроля физиологического состояния и репродукции в криорезистентных клетках ВНК-21: Материалы 2-го симпозиума специалистов стран членов СЭВ по проблеме «Профилактика и эффективная борьба с ящуром, а также создание высокоэффективных противоящурных вакцин», София, 1988 , с.70-71.

17. Манин Б.Л., Худяков Г.А., Фёдорова Е.Е., Козина A.A. Конструирование замораживателей на основе сосудов Дьюара в лабораторных условиях для криоконсервирования культур клеток: Тез. докладов Всесоюзной конференции, г. Ленинград, 1988, с.110-112.

18. Манин Б.Л., Худяков Г.А., Бурдов А.Н. Оценка физиологического состояния клеток по их морфологии при криоконсервировании с помощью различных методов: Тез. докладов научной конференции ВНИЯИ, г. Владимир, 1988, с.5-6.

19. Манин Б.Л. Кариофагоцитарный механизм образования симпластов в культуре клеток ВНК-21 после воздействия глубокого холода: Тез. П-ой Международной конференции «Успехи современной криобиологии», г.Харьков, 1992, с.110-111.

20. Корпусова Т.И., Шипилов В.И. Гриценко А.И., Манин Б.Л. Применение перевиваемой линии гонад козы в технологическом процессе производства противовирусных препаратов: Тез. докладов научно-практической конференции ВНИИЗЖ, г. Владимир, 1995, с. 107.

21. Корпусова Т.И., Михалишин В.В., Шипилов В.И., Манин Б.Л., Гочмурадов М.Г., Алексанян Р.Л., Герасимов В.Н. Перевиваемые культуры - тест системы для титрования вируса бешенства: Тез. докладов научной конференции ВНИИЗЖ, Владимир, 1997, с. 173-174.

Спечатано на базе отдела координации научных исследований, информации и международных связей ВНИИЗЖ Тираж 80 экз., май 1998