Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиология криоустойчивости и криосохранения культивируемых in vitro клеточных штаммов растений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиология криоустойчивости и криосохранения культивируемых in vitro клеточных штаммов растений"

: Г В ОД На правах рукописи

2 7 OKI 1998 УДК58,.143.6

ПОПОВ Александр Сергеевич

ФИЗИОЛОГИЯ КРИОУСТОЙЧИВОСТИ И КРИОСОХРАНЕНИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ IN VITRO КЛЕТОЧНЫХ ШТАММОВ РАСТЕНИЙ

03.00.12 — физиология растений 03.00.23 — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. КА. Тимирязева Российской Академии Наук.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Т.И. ТРУНОВА

доктор биологических наук В.В. МАЗИН

доктор биологических наук, профессор Л.П. ДЬЯКОНОВ

Ведущая организация: Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской Академии Наук, Москва.

Защита диссертации состоится 0££&.$ДД998 г. в II00

на заседании Диссертационного совета Д 002.45.01 по защитам диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте физиологии растений им. КА. Тимирязева РАН (127276, Москва, Ботаническая ул., 35).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. КА. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан " .../.).."

год

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

Н.В. ЗАГОСКИНА

- О -

Актуальность проблемы. В условиях глобального экологического неблагополучия проолема сохранения генофонда растений приобрела особое значение. В России нуждаются в охране около 4000 видов, из которых 533 уже внесено в Красную Книгу, а 76 находятся под непосредственной угрозой исчезновения [Красная Книга, 1988]. Традиционных средств сохранения биологического разнообразия растений (заповедники, ботанические сады, коллекции семян и вегетативно размножаемых форм) из-за присущих им ограничений давно уже недостаточно.

Методы культивирования In vitro клеток, тканей, меристем, зи-готических и соматических зародышей растений позволили создать биотехнологию поддержания и хранения генофонда при замедленном росте этих объектов (депонирование). Клеточные штаммы растений сохраняют значительную часть генома и, обеспечивая биосинтез вторичных метаболитов, имеют уже не только чисто научное, но и производственное значение. Однако, коллекции in vitro требуют значительных непроизводительных затрат ручного труда, энергии, реактивов. Поддерживание клеточных штаммов в таких коллекциях является вынужденным, так как клетки, растущие in vitro, (за редкими исключениями) нестабильны и могут утратить свои свойства [Шамина, 1978]. Коллекции клеток животных давно уже хранятся в жидком азоте (-196°С).

Проблема длительного хранения генофонда растений и их клеточных штаммов стала, в сущности, проблемой криосохранения семян, апексов побегов, эмбрионов и клеток in vitro [Туманов, Бутенко и др. 1968; Street, 19Т5; Бутенко, Попов, 1979; Fay, 1994]. Апексы in vitro, в отличие от клеток, регенерируют исходный генотип и обеспечивают сохранение не только сортов, форм и видов вегетативно размножающихся и других растений, но и клонирование отдельных экземпляров. Для криоколлекций растений прежде всего надо использовать семена и меристемы побегов. По криохранешш семян проведены отечественные работы В.Ю.Молодкиным [1987], В.Л.Тихоновой [1985, 1992], Т.Ф.Стрибуль [1993]. Ряд авторов в некоторых совместных экспериментах, проведенных в Институте физиологии растений им.К.А. Тимирязева РАН, достигли криосохранения апексов картофеля [Манжулин и др., 1982, 1983; Донец и др., 1991; Попов и др., 1991], наперстянки, ромашки [Diettrich et al., 1987, 1990], земляники садовой [ Высоцкая и др., 1996 ].

однако, настоящее исследование ограничено проблемой криосохра-

нения клеточных штаммов. Решение этой проблемы не только позволил*, бы гарантировать неизменность хранимых образцов и резко сократить

затраты на коллекцию, но и обеспечить ее миниатюризацию, так как в криобанке (например, в нашем) 15 ООО ампул объемом по 1,5-2,0 мх каждая (5-50 ампул на образец) размещаются на площади около I кв.м и возможности дальнейшего уплотнения хранения далеко еще не исчерпаны. Таким образом, проблема криорезистентности клеток и тканей растений In vitro, их естественная и искусственная защита от криоповреждений выходит на первый план.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение физиологии криоустойчивости клеточных штаммоЕ растений, культивируемых In vitro, разработка научных основ биотехнологии криосохранени и организация криобанка клеток, тканей и микроорганов растений.

Необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать закономерности формирования криоустойчивости и повысить ее до необходимого уровня, изучая физиологические характеристики штаммов и оптимизируя режимы их культивирования.

2. Исследовать влияние на криоустойчивость скорости охлаждения и зависимость от нее процессов льдообразования в криозащитных растворах и в клетках. Разработать универсальный для клеток растений режим замораживания.

3. Изучить крио- и осмонарушения клеточной мембраны, как главной мишени повреждений при замораживании, и разработать для этого относительно простой метод выявления летальных для клеток деструк-ций плазмалеммы.

4. Исследовать некоторые решающие процессы на этапе восстановления роста штаммов на основе изучения концентраций токсичных ве-щестЕ и снижения осмотических градиентов. Усовершенствовать удаление криопротекторов и рекультивирование клеток.

5. На основе выявленных закономерностей разработать концепцию криорезистентности клеток растений, культивируемых In vitro.

в. Охарактеризовать восстановленные после криоконсервации клеточные культуры по цитологическим, цитогенетическим, физиологическим признакам. Проверить сохранность этих признаков, а также биосинтетического потенциала у рекультивированных штаммов. Регенерировать растения из клеток штаммов, возобновивших рост после оттаивания из жидкого азота, в тех случаях, в которых исходные культурь

- 5 -

обладали спосооностью к регенерации.

Научная новизна работы. Впервые в России изучена криоустойчи-вость до -I96°ü 2У клеточных штаммов In vitro, полученных из 18 видов растений. Разработаны научные основы криохранения.

Для успешного возобновления роста и развития оЕодненных клеток и тканей после глубокого замораживания-оттаивания обязательно не-ходимо использовать криозащитные вещества. В качестве криопротек-торов полезно иногда применять необычные для клеток растений среды. Обнаружено впервые, что сыворотка крови эмбрионов телят оказывает мощную дополнительную криозащиту при замораживании (2°С/мин) клеток моркови без инициации кристаллизации.

Впервые доказана необходимость инициации кристаллизации крио-защитного раствора при медленном (<1°С/мин) охлаждении клеток растений In vitro с целью их криосохранения. Тем самым наша программа замораживания обеспечивает отсутствие губительного внутриклеточного льда (по крайней мере до -27°С).

Установлено, что для многих клеточных штаммов растений нужна подготовка (специальное предварительное культивирование) к криосо-хранению и найдены новые способы такой подготовки: I. Холодовое закаливание суспензионных культур клеток Panax ginseng, которое обеспечило наилучшие результаты при условии постепенного добавления в среду сахарозы. 2. Предкультивирование с некоторыми аминокислотами крионеустойчивого штамма Dloscorea deltoiüea. 3. Инкубация этих же и некоторых других клеток 18-20 ч при 9-10°.

Доказано, что после многолетнего криохранения штаммы восстанавливают все свои основные характеристики, в том числе и биосинтез вторичных соединений, а также регенерируют растения, если они обладали такой способностью до замораживания.

Обнаружено, что криоустойчиЕость клеток In vitro лишь отчасти коррелирует с повышенным содержанием эндогенных Сахаров и сниженной оводненностью. В то же время у изученных штаммов Dloscorea deltoídea- криорезистентность коррелировала с преобладанием да- и триплоидных клеток.

Разработан новый флуориметрический метод,- однозначно выявляющий деструктивные повреждения плазмалеммы, летальные для клеток. Обнаружено почти полное совпадение между крио- и осмоустсйчивостью при 2 - 4 °С у 5 клеточных штаммов столь отдаленных видов, как Рапат ginseng и dloscorea deltolúea.

- в -

Выдвинута и экспериментально обоснована концепция формирований криоустойчивости клеток растений, которая использует приншпы как предотвращения образования внутриклеточного льда, так и повышения устойчивости плазмалеммы при глубокой дегидратации и регидратации клеток. Предположено, что необратимый этап повреждения (деструкции этой мембраны (образование мицелл #11-фазы в липидах ее бислоя) не ступает тогда, когда начинается удаление вода из самого бислоя.

Практическое значение работы. Создан первый в России и сопредельных странах криобанк клеточных штаммов растений, постоянно хранящий 18 линий 12 еидов (13 линий продуценты); клетки исчезающих эндемичных видов Dtoscorea caucasica Lipsky и D.balcantca Ко-Sanln регенерировали растения. Разработаны устройства к заморажи-вателям для автоматической инициации кристаллизации раствора в ампулах, одно из которых согласно акту об использовании изобретения установлено уже на нескольких моделях таких аппаратов.

Апробация работы и публикации. Результаты работы докладывались на: I, 2, 3 и 4 Всесоюзных и Международных конференциях "Успехи современной криобиологии" (Харьков, 197?, 1984, 1988, 1992); 3, 4, 5 и 6-й (Абовян, 1979, Кишинев, 1983, Новосибирск, 1988, Алматы, Казахстан, 1993) Международных конференциях "Биология культивируемых клеток и биотехнология"; 4 и 5 Съездах ВОГИС им. Н.И.Вавилова (Кишинев, 1982, Москва, 1987); International Symposium "Plant Tls-sue and. Cell Culture: Application to Crop Improvement" (Olomouc, Czechoslovakla, 1984); Symposium "Biogene Arsnelstoffe, Auffindung, Chemie, Biotechnologie" (Berlin, 1986); VII International Congress for Culture Collectlons: "Biodlversity and the Role of Culture Collectlons" (Beijlng, China, 1992); XI Simposium Jugo-slovenskog DruStva за Flsiologi^u Biljaka (Novi Sad, Jugoslavija, 1995), а также на совещаниях Группы Консервации Генома Международного Союза Охраны Природы в Пущино н/Оке и на других конференциях.

По материалам данного исследования вышло 73 публикации, в том числе 39 статей и глав в книгах в отечественных и зарубежных изданиях, получено 6 авторских свидетельств и патентов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 6 глав, заключения, выводов и списка литературы. Физиологические процессы, определяющие криорезистентность клеток In vitro, многообразны и различны на разных этапах сложной, экстремальной процедуры криосо-

хранения, а криоусгойчивость не может быть оценена без последовательного проведения 5-6 основных этапов, каждый из которых оказывает на нее решающее влияние. Поэтому логика построения и литературного, и собственного экспериментального материала следует за' этой процедурой. Работа изложена на 300 страницах машинописного текста и содержит 62 рисунка, 31 таблицу и I схему. В списке литературы 413 названий, из которых 313 иностранных.

В работе участвовали: сотрудники Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН А.М.Носов, Н.В.Горская, В.Н.Пауков (ГЖХ определения стероидных веществ даоскореи и ДМСО), О.В.Решетняк (измерения панаксозидов женыненей); сотрудники Группы мембранных аспектов адаптации ИФР РАН В.С.Дзюбенко, И.Ф.Хозина, Е.В.Лопатникова (анализ АТФазы плазмалеммы). Из сотрудников группы криосохранения клеток и растений наибольший вклад в работу внесла Л.А.Волкова, проявлявшая значительную инициативу, затем - Н.Д.Черняк и аспирант Д. Н.Федоровский. Опыты с клетками и апексами наперстянки проведены на нашем оборудовании в ИФР им.К.А.Тимирязева РАН совместно с Dr.B.Di-ettricíi и T.Wolf из Университета им.М.Лютера в г.Галле, Германия.

Сокращения. Крио - приставка для обозначения глубокого холода. КЕ = культивируемые единицы - все образования в суспензионных культурах: и отдельные клетки, и различные клеточные агрегаты. -At,°C - понижение температуры замерзания воды в растворах. ДМСО - диметилсульфоксид. ТТХ - 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид. ФДА - флуоресцеин диацетат.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объекты. Объектами исследования служили следующие клеточные штаммы In vitro: женыненей - Panax ginseng С.А.Меу. ИФР Ж-1, Ж-2Д-К+, Ж-3А+К+; P.Japonlcus С.А.Меу. ИФР Ж-6 и Ж-7; Р.quinquefolios L. ИФР Ж-10; дисскореи дельтовидной (В1озсогеа deltoiüea Wall.) - ИФР Д-I, ДМ-8д+к+, ДМ-1, ДМ-0,5. Клеточные каллусные штаммы исчезающих видов диоскорей: кавказской (D.caucasica Lipsky) и балканской (D.bal canica Koéanln), получены Л.Чулафич (Белградский Университет, CP Югославия) - эти штаммы, как и штаммы М-34 клеток дикой моркови Ваисиз carota L. и КТ-3, КТ-4 (но не Т-4) клеток картофеля Solanum tuberosum L. индийского сорта Tava сохраняли способность к регенерации растений. Штаммы клеток Nicottana

sylvestris L. исходный и мутантный NpEg-I; люцерны Medlcago sat tve L. Л-I; Rcamolfia serpentina Benth. R-III; Vicia faba L. ИФР КБ; дикой пшеницы Triticvm ttmopheevl (Zhük..) Zhuk. ИФР T-I ; Catha-rantus гозеиз L. Ct-28; левзеи сафлороЕидаой (маралий корень) Rha-ponticim cartiujmoiûss (Willd) Iljln Ehs-1. Клеточные штаммы культурной мягкой пшеницы Tr.aestiwm L. ; табака N.tabacwi L. сорт Висконсин; Crépis caplllaria L. В экспериментах с разными скоростям! замораживания, использовали штаммы Jfctè I и VII клеток наперстянки шерстистой Digitalis lanata Ehrïi. cv. Dresden, полученные в Университете им.М.Лютера в г.Галле, Германия [Garve et al., 1980].

Штаммы Dicscorea balcanica и D.caucaaica выращивали при 25-26°, 60-70% относительной влажности и освещенности 3 клк с фотопериодо8 16/8 час (день/ночь) на агаризованной среде в чашках Петри. Среда Мурасиге и Скуга с 3% сахарозы, 0,7% агара и фитогормонами: для органогенных каллусов - 0,6 мг/л 2,4-Д и 0,5 мг/л БАЛ; при эмбрио-и органогенезе с целью регенерации растений, в том числе и после оттаивания из жидкого азота и возобновления роста каллусов - 0,18 мг/л ИУК и 0,5 мг/л БАЛ.

Остальные штаммы выращивали в суспензионных культурах в колба: на роторной качалке (95-98 об/мин, радиус вращения 20 мм), в темноте при той же температуре и влажности на жидких средах, разработанных ранее для этих штаммов их авторами. Клетки ИФР КБ и ИФР Т-: росли на среде Шенка и Хильдебрандта, а клетки М-34 - на среде Лина и Стаба. Все остальные культуры выращивали на среде Мурасиге и Скуга с различными добавками ауксинов, цитокининов, витаминов и других биологически активных веществ, состав которых указан в соответствующих авторских свидетельствах и публикациях.

Методы. Клетки культивировали стандартными методами, соблюдая установленные для каждой культуры размер инокулюма и длительность цикла субкультивирования - для большинства штаммов обычно 14 сут. Кривые роста суспензий в цикле построены по числу клеток в I мл (плотность культуры), приросту сырой и сухой клеточной массы. Индекс роста подсчитывали как отношение выросшего е конце цикла "урожая" к инокулюму. Количество клеток определяли по методу Кинг; с хромовой кислотой, считая их в камере Фукса-Розенталя. Агрегиро-Еанность суспензий определяли, анализируя не менее 1000 агрегатов Жизнеспособность культур оценивали микроскопически по окраске 0,1!

феносафранином [Widholm, 1972]; в части опытов использовали и другие методы: нингидриновый [Sugawara, Sakal, 1978], тетразолиевый [Towlll, Mazur, 1976], определение электропроводности [Ollen, Smith, 1977] и эффективности образования колоний не менее I мм в диаметре при высеве известного числа клеток в агаризованную питательную среду [Bergmann, 1959].

Для подсчета хромосом (оценки плоидности) клетки фиксировали в смеси этиловый спирт-уксусная кислота и окрашивали ацетокармином. Суммарные внутриклеточные растворимые сахара определяли фенольным методом [Dubois et al., 1956]. Осмотическое давление клеточного сока рассчитывали по формуле Льюиса [Самыгин, 1974, с.12], исходя из наблюдений начального плазмолиза и ранее определенных -At растворов маннита. -At растворов криопротекторов определяли, прикасаясь к ним медной проволкой, охлажденной в жидком азоте и измеряя

температуры пиков кристаллизации, осмоляльность растворов рассчи-

«+

тывали по формуле: осм = _ÜL [Сашгин, 1974, с.II].

1 ,86

Криопротекторами служили ДМСО, глицерин, сахароза, трегалоза, про jam, сорбит, маннит, аспарагин, аланин, серин и глицин и смеси этих Ееществ.

Для глубокого замораживания использовали клеточные культуры в экспоненциальной фазе роста. Клетки отстаивали в ледяной бане 2030 мин (иногда центрифугировали), к осадку клеток добавляли 3-4 порциями равный объем холодного криозащитного раствора удвоенной (по сравнению с конечной) концентрации и клетки переносили в пластиковые ампулы. Ампулы охлаждали несколько минут в ледяной бане и переносили в камеру программного замораживателя после того, как температура в ней снижалась до околонулевой. Использовали аппараты ЗП.00.00.00 и 3PK-I (ХарькоЕское СКТБ с ОП при ИПКиК НАНУ). 3PK-I снабжен изобретенным нами устройством для инициации кристаллизации кркозащитного раствора одновременно во многих ампулах в процессе программного замораживания, который проходит полностью автоматически. При работе на ЗП.00.00.00 инициацию кристаллизации обеспечивали специальными найденными нами манипуляциям!. Для наблюдения возникновения льда в клетках применили микроскоп с криоприставкой [Самыгин, Красавцев, 1962] и классический способ инициации.

После хранения в жидком азоте ампулы оттаивали, встряхивая в воде (40°), и помещали в ледяную баню. Определяли выживаемость, отмывали токсичные криопротекторы и высевали в чашечки Петри на поверхность агаризованной среды, или на бумажный фильтр, расположенный над жидкой средой. После возобновления роста культуры каллус переносили в жидкую среду. При разработке щадящего способа отмывки количество отмытого ДМСО определяли с помощью ГЖХ.

Флуориметрический метод, предложенный и разработанный нами и однозначно обнаруживающий деструктивные повреждения плазмалеммы клеток, описан в экспериментальной части работы.

Воздействие на клетки растворов осмотиков (СаС12 или сорбит) в возрастающих концентрациях до осмоляльностей, возникающих в крио-защитных растворах в условиях реального замораживания до -40° или промежуточных температур, проводили при 2° в ледяной бане. В пробирки переносили по 2 мл суспензии клеток с криопротектором и ФДА и добавляли порциями по 0,2 мл приготовленные растворы осмотиков д< объема 5 мл со скоростью, соответствующей первому этапу замораживания. Инкубировали клетки 15 мин, фильтровали и по флуоресценции фильтрата судили о повреждении при плазмолизе. К осадку клеток добавляли охлажденную среду до 5 мл, снова отбирали пробу для флуо-риметрии и определяли повреждение при деплазмолизе.

Стероидные соединения в культурах диоскореи определяли методом ГЖХ после экстракции воздушно-сухой массы клеток смесью хлороформ-метанол (2 : I), гидролиза 1н. НС1 в 50% этаноле при 85° 15 час и экстракции даэтиловым эфиром [Носов А.М., 1984; Волкова и др., 1986]. Анализы сделаны в 2-8 повторностях из 1-3 сборов клеточной массы. Каждый сбор проводили в течение 2-3 последовательных пассажей из 6-8 культуральных колб.

Определение активности К+-стимулируемой М^+-зависимой Н+-АТФазы плазмалеммы клеток женьшеня штамма Ж-2 проводили совместно с В.С.Дзюбенко посредством ингибиторного анализа. Реакция гидролиза АТФ проходила при 3?° и рН 6,5 в растворе, включавшем 50 мМ трис-МЕЗ, 40 мкМ ЭДТА, 50 мМ МО3> I мМ ЫаЫ3> 100 мкМ ;Ш4)Мо?024. Загрязнение неплазматическими мембранами оценивали, добавляя специфические ингибиторы АТФаз плазмалеммы (ШУО^) и то-нопласта (КЫО^). Фосфат определяли по методу Картера и Карла, а белок - по методу Брэдфорд.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I.ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР. Успешное преодоление стрессов крайне экстремальной процедуры криосо-хранения возможно лишь в том случае, если культуры in vitro находятся в оптимальном физиологическом состоянии и имеют наивысшую жизнеспособность. Необходимо брать клетки для замораживания в экспоненциальную фазу роста именно той субпопуляции, которая образует центры размножения, когда они содержат наибольшее число постмито-тических, меристемоидных, наименее вакуолизированных клеток, еще не подвергшихся значительному растяжению. В суспензионных культурах, как правило, преобладают клеточные агрегаты, которые содержат десятки клеток, маскирующих друг друга, сосчитать их точно трудно. Мы разработали визуальную оценку жизнеспособности при окраске красителями, дифференцирующими живые и мертвые клетки [Wiclholm, 1972]. Агрегат считали мертвым, если на глаз в нем было больше половины окрашенных феносафранином или синим Эванса, т.е. погибших клеток [Попов и др., 1978]. Сравнение четырех методов: по электропроводности, нингидринового, ТТХ и при окрашивании феносафранином показало, что полученные значения жизнеспособности укладывались на одну и ту же теоретическую прямую; ошибки всех этих методов оказались близкими [Самыгин и др., 1985]. Следовательно, наша оценка жизнеспособности по КЕ вполне сопоставима с дэено используемыми методами, которые не обеспечивают меньшего разброса значений.

I.I. Физиологические особенности культуры клеток моркови. Штамм этих клеток М-34 был гетерогенным. Его суспензия состояла из трех групп образований: свободных крупных клеток (49%), рыхлых агрегатов из небольшого числа слабо связанных друг с другом растянутых в различной степени клеток с межклетниками, открытыми в среду, и плотных агрегатов из очень мелких, мало вакуолизированных, интенсивно делящихся клеток (22%). Эти агрегаты являлись центрами размножения культуры и формировали проэмбриоидные клеточные массы или рыхлые агрегаты. Исходная суспензия перед замораживанием тлела 83% живых КЕ, в том числе среди плотных агрегатов - 94-97%. При крио-сохранении рыхлые агрегаты не выживали. Большинство живых клеток было сосредоточено в плотных агрегатах; часть свободных клеток тоже выживала. Выживаемость зависела от соотношения объема клеток и среды, заполнявшей также и межклетники, т.е. от плотности культуры

ТаОлица_1.

Влияние соотношения клеток и среда при замораживании на выживание (%) КЕ штамма М-34 клеток моркови после хранения в жидком азоте^

5 Плотность суспензии х 10 КЕ/мл

Культивируемые __е5шпщы__ЩЕ_)___ Свободные клетки Плотные агрегаты 0,4-0,5 (исходная)** ! 1,0-1,7 *** I

_осавде1ше1центриф£г^ование1оса;щете 3,0+1,4 1,5+0,9 7,4+1,7 10,5+1,7 3,2+2,0 1,2+1,2 5,2+1,7 7,5+1,9

Криопротектор - ДМСО (5%), скорость первого этапа замораживания -2°С/мин. **Исходная неконцентрированная суспензия после осаждения или центрифугирования была ресуспензирована в том же объеме.

Такое же осаждение или центрифугирование исходной суспензии, однако с последующим выбрасыванием надосадочной жидкости и ресус-пензированием в меньшем объеме при соответствующем возрастании плотности, добавление ДМСО и перенос в ампулы для замораживания.

(Табл.1). Суспензию концентрировали осаждением или центрифугированием при 108 g, 5 мин. Без концентрирования (исходная суспензия) выживаемость КЕ очень низка, в то время как у сконцентрированных культур она выше в 2-7 раз.

Обогатить суспензионные культуры мелкими слабо вакуолизирован-ными клетками можно, повышая митотическую активность частыми пересадками. Мы сравнили результаты криосохранения штамма М-34, изменяя длительность субкультивирований: в одних опытах суспензию предварительно несколько раз пересаживали с периодом 14-17 сут, а в других - субкультивирования были сокращены до 7 сут. Такое различие не влияло на выживаемость свободных клеток (11,8+1,8 и 10,4+3,5%). Но выживаемость плотных агрегатов при 7-9-дневных пересадках увеличилась в 3,7 раза: 3,8+0,8 и 14,0+1,0% соответственно (критерий 1=7,97, доверительный уровень больше 99,9%, условия криозащиты и замораживания как в табл.1).

1.2. Культуры клеток даоскореи дельтовидной. По сравнению с клетками моркови клетки диоскореи дельтовидной в суспензионных культурах отличались большими размерами и вакуолизацией и крупными крахмальными зернами. Но культуры морфологически были менее гете-

рогенны, четкой дифференциации агрегатов на плотные и рыхлые не было. Свободные клетки (5%) почти все мертвые. Индекс роста по числу клеток у различных штаммов диоскореи варьировал незначительно (Табл.10) и жизнеспособность (65-80%) была практически одинаковой. У мутантных штаммов осмотическое давление клеточного сока вдвое выше, чем у исходного штамма Д-1. И содержание Сахаров (мкг/мг сухой массы) у данных линий составляло: Д-1 - 37,5; ДМ-0,5 - 70,4; ДМ-1 - 55,0 и ДМ-8 - 56,0, т.е. клетки мутантных штаммов содержали в 1,5-2 раза больше сахароЕ, чем исходный штамм.

После глубокого замораживания и оттаивания выживаемость клеток исходного штамма Д-1 была около 6% при 5-10% ДМСО, что совершенно недостаточно для возобновления роста культуры. Для этого штамма пришлось разработать способы подготовки к криосохранению (разделы 3.3. и 3.4.). Производные от данных клеток мутантные линии и без подготовки показали выживаемость, достаточную для возобновления, т.е. около 30% и более (Табл.2). Такое резкое (в 5-6 раз) различие между штаммами не может быть связано только с повышенным осмотическим давлением клеточного сока и содержанием Сахаров, хотя эти фа-

Таблица_2^

Выживаемость различных штаммов клеток диоскореи дельтовидной после глубокого замораживания-оттаивания: % живых клеточных агрегатов.

Культура

_3г1

_Кле точный_штамм__

____|___5М=1.

Контроль Размороженная

70,6+6,5(1 б) 5,2+0,5(49)

75,3+5,7(4) ! 77,0+8,1(3) 29,4+2,3(14)! 29,3+2,7(7)

74,5+7,8(6) 33,6+7,9(31)

Примечания: В скобках указано число п (суммарное число определений в 2-16 опытах). Криопротектор - ДМСО (7%), контроль - его токсичность без замораживания. Скорость первого этапа замораживания 0,5° С/мин с инициацией кристаллизации.

кторы и снижают степень сжатия клеток при медленном замораживании. Должны действовать и другие физиологические механизмы.

Цитогенетический анализ показал, что культуры Есех клеточных штаммов диоскореи миксоплоидны и анеуплоидны. Диплоидный набор хромосом равен 20, а их число в клетках популяции изменялось от 9 до 80 и выше. Распределения клеток мутантных штаммов по уровням

шюидности отличались от исходного штамма и между собой. Если у исходного штамма Д-1 преобладали три- и тетраплоидные клетки, то у мутантных резко увеличено число диплоидных за счет соответствующего уменьшения тетраплоидных. Отсутствие витаминов в течение 17 пересадок не влияло на жизнеспособность и рост культур линий ДМ-0,5 и ДМ-8, но изменилось распределение клеток по уровням шюидности. К 25-й пересадке на среде без витаминов у линии ДМ-0,5 преобладали высокоплоидные клетки, а у штамма ДМ-8 - клетки с окологаплоидным набором хромосом. После возвращения культур на полную среду к 20 пересадке восстанавливалось исходное распределение по шюидности.

Однако, после перевода мутантных штаммов ДМ-0,5 и ДМ-8 на среду без витаминов оказалось, что выживаемость снизилась у штамма ДМ-0,5 в 1,5-2,5 раза, а у клеток ДМ-8 в 2-3 раза (Табл. 3). После возвращения этих штатов на полную среду к 16-20 субкультивированию наблюдали восстановление первоначальной выживаемости. Эти результаты четко коррелировали с изменениями в распределении клеток по шюидности, происходившими при исключении витаминов из среды и последующем возврате культур на полную среду. Другие результаты изучения криоустойчивости и криосохранения штаммов диоскореи дель-

Таблица 3.

Выживаемость КЕ {%) после криосохранения суспензий мутантных штаммов диоскореи дельтовидной в зависимости от среды культивирования.

Среда культивирования

Штамм исходная, полная г _____без_5итаминов___ Л пас _возврат_на_ сажа _полн^ю_среду;_

6 - 8 ! 13 I 4 15 - 16

ДМ-0,5 39,0+4,3 25,0+3,3 \ - \ 15,2+3,2 31,6+4,2

ДМ-8 31,5+8,1 9,2+4,2 ! 14,8+3,8 ! - 32.8+5.4

Примечания: криопротектор 1% ДМСО, скорость первого этапа замораживания - 0,5°С/мин с инициацией кристаллизации.

товидной изложены в разделах 3.3., 3.4., 4.2., 5.1. и 6.2. 1.3.Каллусные клеточные культуры даоскорей кавказской и балканской.

Через 3-4 нед после пересадки каллусы содержали максимальное количество зеленых точечных бугоркоЕ (зачатков почек). Культуры орали в опыты до значительного образования зеленых бугорков, когда

основная масса каллуса имела бледный желтозеленоватый цвет, а на его поверхности появлялись лишь первые прозрачные (эмбриогенные) структуры. Результаты криосохранения этих штаммов изложены в разделах 2., 6.2. и 7.

1.4. Суспензионные клеточные культуры яеныпеней Panas ginseng, P.quinquefolius, P.japcnicua. Популяции этих клеток в суспензиях, подобно клеткам диоскореи дельтовидной, состоят из агрегатов, близких по морфологии, но разного размера (наименьшие - у штамма Ж-1, более крупные у прототрофа по гормонам Ж-Зд+К+ и полупрототрофа Ж-2Д+К~). Но размеры клеток в агрегатах существенно больше, чем у диоскореи, и даже в центрах размножения клетки уже содержат большие вакуоли. Результаты исследования криоустойчивости и криосохранения данных клеточных линий изложены в разделах 2., 3.1., 3.2., 4.3., 4.4., 6.1. и 6.2.

Таким образом, криоустойчиЕость разных (даже родственных) клеточных штаммов в их исходном физиологическом состоянии варьировала в очень широких пределах в зависимости от морфо-, цито- и физиологических характеристик и часто была недостаточна для их криосохранения при различных сочетаниях криопротекторов ^раздел 2). Поэтому была разработана концепция и ряд новых способов подготовки (специального предварительного культивирования - раздел 3) клеток растений. Изучение основных характеристик, хотя и не столь подробное, как у диоскореи предшествовало исследованию криоустойчивости и всех других штаммов.

2. ВЛИЯНИЕ КРИОПРОТЕКТОРОВ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ. Одним из наиболее мощных криопротекторов является ДМСО. Его мы применили в качестве единственного криопротектора для клеток моркови штамма М-34 (Табл. I, 9 и 12), диоскореи дельтовидной всех штаммов (Табл.2, 3, 6, 7, 10 и II), линии клеток левзеи сафлоровидной (маралий корень) Rhs-1 и люцерны штамма Л-I. Выживаемость по окраске для штамма Rh.s-1 (3 опыта) была 37,0-42,3%, а для Л-I (среднее из 8 опытов) - 36%, что позволило успешно возобновить рост данных культур, а также клеток М-34 и мутантных штатов диоскореи ДМ-0,5; ДМ-I и ДМ-8 [Волкова и др., 1986] после замораживания до жидкого азота и оттаивания.

С остальными клеточными культурами одного ДМСО оказалось недостаточно, т.к. повысить концентрацию не удавалось из-за токсичности. Для культур Dioacorea caucaalca и D.balcanica наилучший результат (25,5-34,0%) был получен при сочетании 7% ДМСО с Ъ% трега-

лозы. После глубокого замораживания и оттаивания возобновили рост каллусных тканей обоих редких видов и регенерировали растения. Эт-сочетание успешно использовано наш для клеток картофеля штаммов КТ-3 и КТ-4. Особенно возрастала эффективность криозащиты при ком бинации трегалозы (10%) с ДМСО (7%) и сахарозой (10%) - 42,2+2,2% выживаемости. В результате клеточный штамм КТ-4, состоявший в сус пензии на 70% из плотных агрегатов и имевший высокий морфогенети-ческий потенциал, во всех опытах возобновил рост после оттаивания и регенерировал растения In vitro (раздел 7). Именно этот штамм заложен в криобанк на длительное хранение. На суспензиях Ulcotiaru îabacvm, Crépis captllaria, Vicia faba испытывали ДМС0(7%), сахарозу (20%) и смесь ДМСО и сахарозы (7+10%), но примерно 30%-ного уровня, необходимого для возобновления роста после оттаивания, не достигли. Пролин испытали на клетках 6 видое, но безуспешно.

Криозащитный раствор, Еключавший ДМС0(5%), сахарозу(10%), ман-нит(5%), был применен нами для культур клеток двух видов пшениц: дикой Tritlcvm tlmofeevt и культурной Tr.aestlvm, сорт Целинная юбилейная (ЦЮ-194). Средняя выживаемость клеток Tr.tlmofeevl в 5 опытах - 33,9% и штамм успешно возобновил рост после оттаивания. Клетки Tr.aestIvvm ЦЮ-194 выживали несколько хуже, в среднем -25,2%, но тем не менее в двух опытах также возобновили рост после оттаивания и восстановили культуру. На клетках женьшеня (Panax ginseng, Р.quinqué fol lus, P.Japonicus) мы комбинировали криозащит-ные смеси также на основе ДМСО и сахарозы, но с добавлением глицерина (Табл. 4). Для штамма Ж-I выживаемость 28-38% достаточна для

Таблица 4.

Выживаемость (%) клеточных штаммов женьшеня после глубокого замораживания-хранения-оттаивания с разными криопротекторами.

Криопротектор !--------Штаумы_Рапах_ё1П5§Г£-----

¡ Ж—1 I Ж—2 ! Ж—3

Panax

ДМСО, 1% 3,3+1,0 - 2,8+1,5

Сахароза, 20% 11,7+2,8 - 7,8+2,2

Soit 20% 18,3+3.6 5,4+0,7 19,0+4,7 54,3+3,4

SS \о% 38'1±3'2 27'б±4'1 20,2+1,5 37,5+2,6

Примечание: скорость первого этапа замораживания - 0,5 °С/мин с инициацией кристаллизации.

его возобновления после оттаивания, а для мутантных линий Ж-2 и Ж-3, оказавшихся менее криоустойчивыми, и для штаммов Р.quinqué,Jolina (Табл.4) и P. Japonicu3 (S-7, 31,5% среднее, 4 опыта) та же и более высокая выживаемость по окраске недостаточна. Для названных штаммов пришлось применить подготовку к криосохранению. Аналогичную ситуацию наблюдали также с диким штаммом Nicotlana sylvestris (выживаемость - 39,0+1,9%) и с некоторыми другими. В то же время мутантный штамм клеток N.sylvestris NrEs-1, устойчивый к NaCl и накапливающий в его присутствии очень много пролина, показал с тем же криопротектором (ДМС0,7%+сахароза,20%) наивысшую выживаемость, какую когда-либо получали для клеток растений - 66,3%, и в деух опытах быстро возобновил рост после оттаивания.

Следовательно, оценка выживаемости по окраске может быть лишь предварительной, окончательный критерий - возобновление роста.

3. ДЕЙСТВИЕ СПЕЦИАЛЬНОГО ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ.

(ПОДГОТОВКА К КРИОСОХРАНЕШВО) 3.1. Закаливание суспензионных культур. Закаливание к холодам растений умеренного климата является естественным физиологическим процессом, который проводили также искусственно для растений [Туманов, Трунова, 1963] и каллусных культур In vitro [Туманов, Бу-тенко и др., 1968]. Закаливание суспензий клеток женьшеня проводили, постепенно (поэтапно) снижая температуру культивирования и одновременно увеличивая концентрацию сахарозы в среде, затем добавляли разные криопротекторы и замораживали после каждого этапа, причем клетки проходили все предыдущие: 1+2-й, I+2+З-й, I+2+3+4-й. Выживаемость клеток Ж-I после криосохранения значительно повышалась (Табл. 5). Этот эффект проявился особенно наглядно с ДМСО, но наивысшие цифры получены с сахарозой, добавленной дополнительно как криопротектор после закаливания в течение 3-х этапов.

При закаливании по той же схеме в течение 3-х этапов клеток Ж-3 их выживаемость с криопротектором сахароза (20%) увеличилась в 2,5 раза и рост культуры неоднократно восстанавливали. Без закалки клетки Ж-3 не возобновляли рост после оттаивания. В трех опытах отношение сух/сыр масса монотонно возрастало (в среднем на 59%) по мере закаливания - оводненность клеток уменьшалась. Содержание же Сахаров даже в ходе одного опыта изменялось неоднозначно. Т.е. ни внутриклеточные сахара, ни уменьшение оводненности клеток не могут

Таблица_5.

Влияние закаливания на выживаемость суспензионной культуры (% живых КЕ) женьшеня штамма Ж-1 после криосохранения.

Криопротекторы

Контроль-____Ц°£5ЁЗ°1этельте_этапы_закажващ1я___

! 1-Й : 2-Й ! 3-й ! 4-й

ДМСО, 7-10 3,3+1,0 14,0+3,2 Сахароза,20-25 12,0+3,0 25,8+2,8 Глицерин, 10 сахароза, 10

ДМСО, 10 сахароза, 20

28,3+3,2 29,4+3,0 21,5+4,4 41,7+4,1

18,9+5,7 28,2+4,2

41,7+2,7

27,9+1,9 51,1+4,0

48,8+2,5

25,4+2,4 36,3+3,0

29,2+3,1 37,0+2,'

39,7+3,1 38,5+2,1

Примечание. Параметры этапов закаливания: 1 - температура 10 , дли тельность 5 сут, концентрация сахарозы в среде 7%; 2 - соответственно: 2°, 6 сут, 15%; 3 - 2°, 7 сут, 20%; 4 - 2°, 7 сут, 25$. Снижение температуры на первом этапе замораживания - 0,5°/мин с инициацией кристаллизации.

объяснить резкий рост - в 2,5 раза - выживаемости линии Ж-3 вследствие закалки. Значит, наряду с давно известными процессами в ходе закаливания должны действовать и другие механизмы повышения крио-устойчивости.

На штамме Ж-2, также требовавшим подготовки для успешного крио-сохранения, закалку проводили в течение 3-х этапов (недель) как с добавлением сахарозы в среду до 20%, так и без добавления. С добавлением сахарозы выживаемость клеток Ж-2 после глубокого замораживания-оттаивания с глицерином(10%)+сахароза(Ю%) возрастала с 13,0 до 35,0% к концу 3 нед (в 2,7 раза). Однако, никакого роста выживаемости не происходило при закалке без добавления сахарозы. При закаливании с добавлением сахарозы наблюдали увеличение сухой массы клеток на 70% лишь в 1-ю нед при 12°, а в последующие 2 нед при 2° роста биомассы не происходило. При закалке этих же клеток с постоянной концентрации сахарозы (3%) увеличения массы клеток не было ни в 1-ю, ни во 2-ю нед. Закаливание с добавлением сахарозы приводило к монотонному росту отношения сух/сыр масса на 60%, а без добавления это отношение было постоянным. Содержание Сахаров внутри клеток Ж-2 при закаливании с добавлением сахарозы (в отличие от Ж-3) линейно увеличивалось на 60% к концу 3-ей нед, а без

- 19 -

добавления, наоборот, уменьшалось почти в 2 раза.

Следовательно,закаливание суспензий клеток достаточно морозостойких растений эффективно повышает криоустойчивость.

3.2. Снижение водного потенциала питательной среда клеточных

культур. Другой физиологический подход для подготовки к криосохра-нению основан на снижении водного потенциала среды при включении в нее осмотически активных веществ, затрудняющих процесс растяжения клеток. Мы применили предварительное культивирование с маннитсм для штзмма Ж-10 Рапса: ди1щие/о11из и некоторых других. Маннит добавляли в среду в концентрации 6% на 6 сут. Выживаемость по окраске линии Ж-10 не изменилась (37,5+2,6 и 38,6+2,7), но ее криоустойчивость после подготовки возросла и рост этой линии неоднократно был возобновлен после оттаивания. Отношение сух/сыр масса увеличивалось за время предкультивирования на 49,3%. Положительный эффект данной подготовки к криосохранению клеток Ж-10 явно связан со снижением их оводненности.

3.3. Эффект пролина и других антистрессовых аминокислот. Третий способ подготовки мы применили для крионеустойчивого штамма Д-1 диоскореи дельтовидной, исходя из известной физиологической роли некоторых эндогенных аминокислот, в особенности пролина, при солевом и иных стрессах, связанных с водным дефицитом. Мы применили также аланин, аспарагин, серин или глицин. Клетки до замораживания культивировали с одной из названных аминокислот в концентрациях от 0,01 до 0,05 М; их жизнеспособность (65-80%) и ростовые характеристики оставались на уровне контрольной культуры в течение 6 сут, а на 7-10-е сут жизнеспособность клеток падала, появлялись уродливые формы. Для замораживания клетки брали на 5-е сут пока длилась еще экспоненциальная фаза роста. В этот срок при культиеи-ровании с аланином или аспарагином отмечали исчезновение больших зерен крахмала. Содержание растворимых Сахаров в клетках на 5-е сут с аспарагином превышало их количество в контрольных клетках на 80%, с аланином - на 60%, с пролином превышение составило 40%.

Питогенетический анализ линии Д-1 на 5-е сутки культивирования с аминокислотами показал, что распределение клеток по уровням пло-идности стало вполне аналогичным исходному распределению у мутантных штаммов (рост числа диплоидных клеток за счет тетраплоидных). В обоих случаях такое распределение коррелировало со сравнительно

высокой выживаемостью после глубокого замораживания-оттаивания. Если штамм Д-1 после предкультивирования с аспарагином не замораживали, а переводили на обычную среду, то его исходное распределение по плоидности восстанавливалось к 14 пассажу и одновременно падала криоустойчивость.

При наблюдении за клетками под криомикроскопом вполне четко видели образование внутриклеточного льда - наиболее опасное изменение в них, находящееся в прямой зависимости от степени переохлаждения, от скорости замораживания (предкультивирование с аминокислотами влияло на допустимую скорость), от наличия или отсутствия инициации кристаллизации раствора, окружающего клетки. Важнейший результат этих опытов следующий: - при замораживании с 7% ДМСО, скоростью 0,5-1,0 °С/мин и инициацией кристаллиации льда в клетках не было вплоть до -27° (при более низких темперзтурах наблюдения технически становились невозможными). Переохлаждение клеток достигало, следовательно, значительной величины - 24,2°, т.к. по нашим определениям дг 7%-ого ДМСО в среде -2,82°С.

Таблица_6_.

Выживаемость клеток диоскореи дельтовидной штамма Д-1 после предкультивирования с аминокислотами и замораживания-хранения при -19£

' ■ ■ -......- ■ контрольная культура аминокислоты

аспарагин 0Х02 М т ! аланин ! 0Х05 М т пролин ! 0,02 М ! серин 0А01 М

5,7+1,2 30,3+2,6 20,6+1,9 12,3+1,0 10,8+1 ,1

31=16 п=29 п=24 n=19 п=12

Примечания: криопротектор '(% ДМСО, п - число ампул в 4-7 повторны: экспериментах, скорость первого этапа замораживания - 0,5°С/мин с инициацией кристаллизации (ИК).

Выживаемость клеток по окраске после 5-тисуточного предкультивирования с аминокислотами и глубокого замораживания-оттаивания (Табл.6) увеличилась в 5-6 раз, приблизившись к выживаемости сравнительно криоустойчивых мутантных клеточных штаммов D.deltoldea. , уровень Сахаров в расчете на одну живую клетку (1,8 х 10_2нг) возрос на 5 сут максимум лишь на 80%. Следовательно, как и в результате закаливания клеток женьшеня, рост выживаемости клеток диоско реи при предкультивировании с аминокислотами намного превысил уве личение количества Сахаров, что, по-видимому, подтверждает пред

положение о вероятном действии других, кроме Сахаров, механизмов повышения криоустойчивости.

3.4.Влияние краткой инкубации при пониженной положительной температуре. Некоторые литературные данные позволяли надеяться на положительные влияние на криоустойчивость сравнительно кратковременного пребывания клеток при пониженной температуре. Мы применили инкубацию при 9-10° е течение 18 - 20 час. Жизнеспособность к концу инкубации не снижалась. Такое воздействие мы испытали со штатами клеток картофеля КТ-3, раувольфии 11-111, диоскореи Д-1 и ДМ-0,5 и люцерны Л-1 (Табл. 7).

Таблица_7^

Выживаемость после глубокого замораживания с 1% ДМСО в случае предварительной инкубации клеток в течение 18 - 20 ч при 9 - 10?

видА штамм и подготовка ! I 10° I 1 1 контроль

Картофель, КТ-3 22 .9+1 ,9 15, 8+2 ,3

Раувольфия, Н-111 1 ,2+0 ,06 8, 3+3 ,8

И-111, предкультивирование с глицином 20 ,5+3 ,5 17, 5+2 1 '

Диоскорея, Д-1 26 ,0+3 ,2 ю, 4+2 ,4

Д-1, предкультивирование с а спарагином 50 ,0+2 О 9 *— 39, 0+3 ,1

Диоскорея, ДМ-0,5 48 ,5+3 а 5 ^ 31, 0+2 ,8

ДМ-0,5, предкультивирование с аспарагином 54 ,0+2 ,1 38, 0+2 ,7

Люцерна, Л-1 42 ,5 22, 0

Примечание: скорость первого этапа замораживания 0,5°С/мин с ИК.

Выживаемость клеток раувольфии резко снижалась вследствие инкубации, причем предкультивирование с глицином снимало эту отрицательную реакцию и выживаемость оставалась на уровне контроля. Возросла жизнеспособность клеток люцерны: почти в 2 раза. Столь разная реакция клеток этих видов на понижение температуры, вероятно, связана с их генетикой: раувольфия, в отличие от люцерны - растение тропиков. На 45% повышалась выживаемость клеток картофеля и весьма существенно диоскореи: Д-1 в 2,5 раза, ДМ-0,5 - в 1,5. Рост выживаемости в результате инкубации сохранялся и при предкультивировании с аспарагином, т.е. при сочетании обоих способов подготовки.

Следовательно, на названных штаммах клеток В.беИо1йеа. наблюдали аддитивность действия двух воздействий, которая обеспечила 50%

выживаемость даже наименее криоустойчивой линии Д-I. Аддитивность двух методов подготовки доказана повторными опытами, показавшими несовпадение механизмов их действия. Если предкультивирование с аспарагином клеток Д-I Бело к повышению в них содержания растворимых Сахаров на 80%, то не обнаружено никакого роста Сахаров в результате инкубации при 9-10° в течение 18-20 ч. Значит, положительное влияние краткой инкубации при пониженной температуре также проявляется благодаря механизму, не связанному с сахарами.

4.ИССЛЕДОВАНИЯ КРИО- И ОСМОУСТОИЧИВОСТИ ПЛАЗМАЛЕММЫ КЛЕТОК РАСТЕНИИ In vitro. Вероятно, что другие механизмы повышения криоустой-чивости активно метаболизирующих клеток действуют на клеточной мембране, т.к. она - главная мишень криоповреждений. Мы разработали новый метод оценки деструктивных повреждений плазмалеммы клеток растений, приводящих их к гибели, с целью выяснить, существует ли корреляция между крио- и осмоустойчивостью клеток и этими повреждениями [Попов, Федоровский,1992]. Осмоустойчивость - устойчивость к действию плазмолизирующих растворов в концентрациях, эквиосмо-ляльным тем, которые возникают в окружающей клетку среде при глубоком замораживании. В наших опытах растворы действовали при околонулевой температуре, т.е. без замораживания. Тем самым мы изучили резистентность клеток к глубокому дегидратационному стрессу, возникающему в условиях их реального криосохранения, у родственных клеточных штаммов, отличавшихся по криоустойчивости. 4.1.Флуориыетрический метод определения деструкций плазмалеммы. Мы использовали ФДА, который сам не флуоресциирует и быстро проникает в клетки через неповрежденную клеточную мембрану. Эстеразы в клетках разлагают его с образованием свободного флуоресцеина. Он ярко флуоресциирует, но через неповрежденную плазмалемму выходит так медленно, что его свечение в клетках сохраняется по крайней мере в течение 25 мин при комнатной температуре, надежно свидетельствуя об их жизнеспособности [Widholm, 1972]. ФДА добавляли к клеткам за 10 мин до начала экстремального воздействия: программного замораживания или иммитирующего его эквиосмоляльного сжатия в растворах осмотиков. Клетки были уже обработаны криопротектором. При возникновении деструквдй плазмалеммы образовавшийся в клетках флуоресце-ин выходит из них в окружающий криозащитный раствор. Отобранные в ходе воздействия пробы сразу же быстро оттаивали, либо деплазмоли-

зировали, разбавляя холодной средой. Немедленно отфильтровывали клетки, фильтрат сразу же прогревали и его флуоресценцию измеряли на спектрофлуориметре Hitachi MPF-4 (Япония) при длине еолны возбуждения 425 нм и длине волны флуоресценции 515 нм. Учитывали повреждения, имевшие место до воздействия (контроль I), и максимально возможную флуоресценцию (контроль 2), которую определяли после полной деструкции всех клеток. Такое разрушение обеспечивали быстрым замораживанием в жидком азоте с последующим медленным оттаиванием на воздухе при комнатной температуре. Данная процедура позволяет возникшим в изобилии и свободно растущим кристаллам льда разрушить все структуры и даже клеточную стенку [Withers, 1973). Для надежности эту процедуру проводили дважды.

Для определения доли(%) клеток с деструкциями плазмалеммы при экстремальном воздействии применили следующую формулу [Попов A.C., Федоровский Д.Н., 1992):

V - р о £ф Y = -- 100 %

'ПВ ф

где Fq- интенсивность флуоресценции в опыте; Рф- контроль I, фон, создаваемый оказавшимся во внеклеточной среде флуоресцеином через 10 мин после добавления к клеткам ФДА; F - контроль 2.

При исследовании осмоустойчивости в сверхгипертошгаеских растворах для определения доли(%) клеток с деструктивными повреждениями плазмалеммы использовали дополнительную формулу:

F F

гФ пл

Ро = рф + ( Гпл - — > + < Рдепл

где Ро - суммарная интенсивность флуоресценции при плазмолизе и деплазмолизе; Рпл - флуоресценция среда после плазмолиза клеток; ^д^пл ~ Флуоресценция среды после деплазмолиза клеток; N - степень разбавления флуоресцирующей среды при плазмолизе; п - степень разбавления флуоресциирующей среды при деплазмолизе.

Зависимость спонтанного выхода флуоресцеина от времени при разных температурах показала, что инкубация клеток при температуре от -5 до 3° в течение 60 мин не приводит к выходу флуоресцеина из ин-

тактных клеток даоскореи или женьшеня. Поэтому все операции проводили на льду. Для инактивации эстераз, оказавшихся в фильтратах в результате деструкции плазмалеммы и разлагающих ФДА даже на холод-ду, мы применили прогрев до 80°, который полностью прекращал рост флуоресценции фильтратов во время их хранения до измерений.

Флуориметрический метод позволяет обнаружить деструкции плазма-леммы, лишающие ее полупроницаемости и приводящие к полной проницаемости и потере клетками осмотической реактивности. Тем самым наш метод выявляет клетки, погибшие в максимально сжатом состоянии, что сопоставимо с данными Степонкуса [Згеропкиз, 1984] о существовании этой формы гибели и преобладании ее при охлаждении ниже -15? 4.2.Повреждения плазмалеыыы клеток даоскореи при заыораживании-от-таивании и эквиосиотическом сжатии. При глубоком замораживании суспензии штамма Д-1 оказалось, что выход флуоресцеина из клеток линейно возрастал с понижением температуры (Рис.1). Каждая полученная кривая явно составлена двумя прямыми, что показывало наличие двух популяций клеток с очень разной крио-устойчивостыо. Доля клеток с поврежденной плазмалеммой увеличивалась от 22% при -10° до 63% при -40°. Дальше рост числа таких клеток резко замедлился: при -70° - 72%, а при -196° - 82%. Ту же зависимость наблюдали и после предварительного культивирования с аспарагином или пролином, но степень повреждения была значитель- клеток с деструкциями плаз-но ниже, чем у обычной культуры: доля малеммы. 1 - клетки, пред-клеток с деструкциями плазмалеммы при культивированные с аспара--196° была соответственно 54% и 62%. гином, 2-е пролином, 3 -Такие же результаты получены и на му- контрольная культура без тантных линиях ДМ-8 и ДМ-0,5: для добавления аминокислот, каждой из них первая прямая в составной кривой заканчивалась при -30° и степень повреждения клеточных мембран была намного ниже, чем у штамма Д-1 (50-60% при -196°).

Осмоустойчивость изучали в растворах хлористого кальция или

плазмалеммы клеток диоскоре] дельтовидной штамма Д-1 при глубоком замораживании-оттаивании. Внизу графика -температура,°С, слева - %

¡00

5 ¡0

юа

0 Щ75 Я,Ш аамом'льноеггй

¡,31 10.7! 13.!! lt.SH Осмолйаьносгпь растбора, вел

сороита е присутствии 10% ДМСО. Для этого сначала экспериментально определили -Д1; этих растворов. Скорость сжатия соответствовала скорости первого этапа замораживания (до -30°). При медленном плазмолизе и быстром деплазмолизе, моделировавшем процесс оттаивания, выход флуоресцеина из клеток Д-1 линейно возрастал с увеличением осмоляльности раствора до значений, соответствующим тем, которые возникают при замораживании клеток до -30° (16,12 осм). ^ Дальнейшего увеличения выхода | флуоресцеина при добавлении Со- * лее концентрированных растворов почти не происходило. Такие же результаты получены и на мутан-тных штаммах ДМ-8 и ДМ-0,5 (Рис. 2). Осмоустойчивость штаммов коррелировала с их крио-устойчивостью.

Эквиосмотическое моделирование сжатия клеток при медленном замораживании позволило нам раздельно наОлюдать повреждения при плазмолизе и при деплазмолизе. У штамма Д-1 (Рис.3) повреждений при деплазмолизе больше, чем при плазмолизе, причем при средних и высоких осмоляльностях - в 2-3 раза. У мутантных же штаммов ДМ-0,5 и ДМ-8 соотношение де-струкций плазмалеммы при плазмолизе и деплазмолизе зависело от уровня осмоляльности. При изучении осмоустойчивости клеток Д-1 без ДМСО деструкции после плазмолиза незначительны и одинаковы при всех концентрациях осмотика. Напротив, при де-

Рис.

Рис.3.

Рис^ьл Повреждения плазмалеммы клеток диоскореи разных штаммов при эквиосмотическом сжатии (вместо замораживания) при околонулевой: температуре (2-3^) в растворах СаС1,э. Вш1зу графика - осмоляль-ность раствора, осм, 21,5 осм соответствует -40". Слева - % клеток с деструкциями плазмалеммы. Штаммы: 1 - Д-1, 2 - ДМ-0,5, 3 - ДМ-8.

Осмотические повреждения плазмалеммы клеток штамма Д-1 при плазмализе (заштриховано) и деплазмолизе (незаштриховано) в раствораз Са01о (1-3) или сорбита (4). Слева - % клеток с деструкциями плазма-

лемммы. 1 ,<■

контрольная культура.

2 - клетки, ггредкультивировашше с аспарагином, 3-е пролином.

плазмолизе число клеток с деструкциями линейно росло вплоть до наивысшей осмоляльности 21,5 осм и флуоресценция была в 4-5 раз больше, чем при плазмолизе. Суммарные повреждения плазмалеммы при сжатии и деплазмолизе без ДМСО оказались ниже, чем с ним.

4.3.Повреждения плазмаленыы клеток женьшеня при заыораживании-от-таивании и эквиосмотическом сжатии. При глубоком замораживании с криопротектором (10% сахарозы+10% глицерина) суспензий штаммов Ж-1 и Ж-2 еыход флуоресцеина из клеток линейно возрастал с понижением температуры (Рис.4). Кривые такие же, как и у клеток диоскореи. осмоустойчивость изучали по той же схеме. Медленный плазмолиз и быстрый деплазмолиз клеток приводили к выходу флуоресцеина из клеток, возрастающему линейно с увеличением концентрации до 16,12 осм (условные -30°) (Рис.5). Дальнейшего роста повреждений плаз-

£ 100 с

I-

1 /' ■

/И*

I т ■

о .

К ___

О 10.75 21.50 Осмоляльиасть, осм

Рисл5^ Повреждения плазмалеммы клеток женьшеня при эквиосмотическом сжатии (вместо замораживания) при околонулевой температуре (2-3°) в растворах 0аС1о. 1 - штамм Ж-1, 2 - штамм Ж-2 закаленный, 3 - штамм Ж-2 незакаленный.

малеммы (в 21,5 осм) почти не было. Холодовое закаливание линии Ж-2 примерно в 2 раза увеличивало число клеток без деструкций плазмалеммы, что четко соответствует результатам при замораживании. Соотношение повреждений при плазмолизе и деплазмолизе зависело от штамма. В случае линии Ж-1 и низких осмоляльностей оно было почти равное. Но при высоких концентрациях (16,12 и 21,50

Рис^Д^ Повреждения плазмалеммы клеток женьшеня при глубоком замораживании и оттаивании. Внизу графика отрицательная температура, °С, слева - % клеток с деструкциями плазмалеммы. 1 - штамм Ж-1, 2 - штамм Ж-2, 3 — штамм Ж—2 закаленный.

>см! преобладали, хотя и незначительно, повреждения при деплазмо-газе. У клеток Ж-2, как незакаленных, так и закаленных при всех >смоляльностях заметно преобладали деструкции при сжатии. В целом го и на штаммах женьшеня осмоустойчивость почти полностью совпада-1а с их криоустойчивостью.

1.4.Влияние глубокого замораживания клеток женьшеня штамма Я-2 на 1араметры К+-стимулируемой М^+-зависимой Н+-АТФазы плазмалеммы.

,)дним из важных показателей состояния и функционирования плазмале-лмы является активность Н+-АТФазы, о роли которой в повреждении эастений при замораживании имеются противоречивые данные. Мы пытались ответить на вопрос: существует ли связь между изменениями гсриоустойчивости клеток женьшеня штамма Ж-2 при закаливании и изменениями функциональных свойств Н+-АТФазы их плазмалеммы. Для суспензии клеток Ж-2 пришлось модифицировать метод выделения плазма-леммы и проверить чистоту выделенных везикул для всех вариантов зпытов. Определяли активность Н+-АТФазы плазмалеммы контрольной и закаленной культуры клеток до и после глубокого замораживания и вычисляли основные параметры фермента: константу Михаэлиса (Км), характеризующую сродство к субстрату, и скорость реакции (Табл.8). Для сопоставления в этой же таблице показана жизнеспособность клеток (после замораживания - выживаемость).

Таблица_8^

Параметры Н+-АТФазы плазмалеммы клеток женьшеня Ж-2 до и после глубокого замораживания и жизнеспособность клеток.

Кле тки Клетки Клетки закаленные Клетки

не закален- с добавлением не

Параметр зака- ные с 3% __£§5ЁРозы_ао_20%__ закаленные

ленные сахарозы до I после замораживания до I после з амо^жив ания

К,л (мМ, 1!§АТФ) 0,64 0,59 1,34 1,08 0,64 0,52 Скорость реак-

ЙЕяъ'ЙК 11 '5 13.2 8,15 12,5 11,9

______________________________________________________

Жизнеспособность, % 87,0 72,0 75,0 35,0 87,0 13,0

Можно видеть, что у незакаленных клеток после глубокого замораживания кинетические показатели Н+-АТФазной активности плазма-

леммы не менялись, хотя жизнеспособность (выживаемость) резко падала. В то же время закаливание клеток с увеличенной до 20% сахарозой приводило к возрастанию Км в 2 раза, а после замораживания таких клеток эта величина снизилась только на 19%, хотя погиоло 65% клеток. Следовательно, нет корреляции между величиной Км и вы жиЕаемостью клеток после глубокого замораживания. Не установлено также корреляции между скоростью реакции и гибелью клеток после замораживания как в вариантах закаливания без добавления сахарозы или с ее добавлением, так и в случае незакаленной культуры. Значи' невозможно связать противоположно направленные изменения параметров Н+-АТФазы плазмалеммы с деструкциями клеточной мембраны и гибелью клеток - показателями, которые очень хорошо коррелировали между собой. Таким образом, в условиях медленного глубокого замораживания возможные нарушения Н+-АТФазы плазмалеммы не являются первопричиной ее деструкций, которые приводят клетки к гибели.

5. ЗНАЧЕНИЕ СКОРОСТИ ЗАМОРАЖИВАНИЯ И ПРОЦЕССОВ ЛЬДООБРАЗОВАНИЯ ]

РАСТВОРЕ ДЛЯ ВЫЖИВАЕМОСТИ КЛЕТОК. Мы начали исследования на клеткг моркови, замораживая их с помощью холодовой бани без стабилизации температуры и инициации кристаллизации. Сравнили два режима: первый - температуру снижали с одной скоростью (2 °С/мин) до -70°. Второй - диапазон до -70° был разделен на два поддиапазона: до -40° скорость замораживания была 1°С/мин, а далее - 2°С/мин. После -70° ампулы быстро погружали в жидкий азот. Второй режим оказался гораздо благоприятнее, чем первый по всем показателям и в особенности по еВДэективности высева при образовании колоний (Табл.9). На двух клеточных штаммах из наперстянки на нашем аппарате и по нашей программе совместно с Е.Дит-трих изучили выживаемость клеток в зависимости от скорости замораживания в полном диапазоне: от 0,5 до 75,0°С/мин. У обоих штаммов выживаемость увеличивалась при снижении скорости замораживания, причем при 0,5°С/мин оптимум еще не был достигнут (Рис.6). Впоследствии, когда со-

ток штатов ¡Ш 1 и 7 1>\ дИаИэ Юпсйа, в завис! мости от скорости замораживания. Внизу графи*

- скорость,°С/мин, слеЕ

- % живых КЕ.

стояние и предкультивирование штамма М VII были улучшены, максимальная выживаемость его клеток (>60%) была достигнута при скорости 0,25°С/мин Ш1е«г1с11 et а!., 1985]. По-видимому, в начале процесса замораживания скорости 0,2-0,5°С/мин оптимальны для большинства клеток растений. Благоприятный эффект таких скоростей связан с более медленным обезвоживанием и снижением вероятности проникновения льда в клетки.

Далее мы изучили кристаллизацию, происходящую в нашем программном аппарате. Эти опыты проводили на клетках Д-1 с 7% ДМСО в питательной среде, Д1; = -2,32°С.Оказалось, что при линейном снижении температуры в камере аппарата спонтанная кристаллизация возможна в широком диапазоне: от -7 до -19°. Следовательно, происходило существенное переохлаждение, которое приводило к нестабильности результатов. Однако, стабилизировав температуру камеры на 1-2° ниже дг раствора, мы могли инициировать кристаллизацию в ампуле, коснувшись ее дна жидким азотом на 0,5-1,0 с. Б этом случае вместо спонтанного внезапного высокого скачка температуры в ампуле наблюдали небольшой, но вполне четкий экзотермальный пик, вершина кото-

Таблица_9_;.

Эффективность Еысева и выживаемость {% выживших КЕ) суспензии клеток моркови М-34 после глубокого заморакиЕания.

! !Скорость замораживания

Культивируемые единицы Контроль первого этапа, °С/мин

(КЕ) до замораживания 1 о

Свободные клетки 80 (73-87) 24,8+4,0 11,2+1,7

Плотные агрегаты 95 (93-97) 15,2+2,3 8,3+1,9

Все КЕ 82 (77-87) 16,4+2,3 7,6+1,1

Эффективность высева, % 0,34 (0,70-0,98) 0,171 0,037

Примечания: Плотность суспензии - 0,9 х 10^ КЕ/мл. Криозащита - 5% ДМСО. Эффективность высева определяли по колониям, диаметр которых был 1 мм или больше. Различия между скоростями статистически достоверны. В контроле в скобках показаны пределы варьирования.

poro была примерно равна At раствора. Кристаллизация после пика, соответствующая температуре стабилизации, и полное выравнивание температуры ампулы и камеры требовали максимум 20 мин.

Для использования инициации кристаллизации с различными криопро-

текторами необходимо знать At их растворов. В специальных опытах мы определили эти величины для нескольких концентраций ДМСО, сахарозы, маннита, глицерина и некоторых др. веществ. Чтобы вручную инициировать кристаллизацию одновременно во многих ампулах, не нарушая стерильность, при замораживании их в аппарате ЗП.00.00.00 были разработаны особые манипуляции, которые проводили после стабилизации температуры в камере аппарата приблизительно на 2° ниже суммы At всех инградиентов раствора.

На том же клеточном штамме Д-1 с криопротектором ДМСО (7%) сопоставили программное замораживание с поэтапным в морозильных шкафах: 1-й этап от 0 до -5 (или -9°) I ч; 2-й этап - до -25 ( -27°) 2 ч; 3-й этап - перенос ампул в жидкий азот. Программа замораживания включала охлаждение до -5°, инициацию кристаллизации с последующей выдержкой 2Q мин при той же температуре, дальнейшее охлаждение до -30° со скоростью 0,5°С/мин, а от -30 до -70° - S °С/мин и быстрый перенос в жидкий азот. На культурах с пролином и аланином оба способа дали одинаковые результаты, но в случае аспа-рагина программное замораживание позволило полутать более высокую выживаемость. Подготовка клеток с пролином резко подняла выживаемость при наличии инициации, но не без нее. Положительный эффект инициации кристаллизации был очевиден также на культуре с аланином. Чтобы вполне убедиться в преимуществе инициации были поставлены дополнительные опыты, в которых предкультивированные с пролином клетки из одной и той же колбы в один день были заморожены по указанной программе с инициацией кристаллизации и выдержкой и без них. В первом случае (с инициацией) выживаемость в 5 повторностях была в среднем - 23,4%, а во втором - 8,3%.

Совместно с Б.Диттрих были проведены опыты на апексах Digitalis lanata на нашем аппарате и по нашей программе, которые также четко показали преимущество инициации кристаллизации с последующей выдержкой как по выживаемости этих микроорганов, так и по способности регенерировать побеги после оттаивания из жидкого азота; оптимальной была скорость замораживания 0,25°С/мин CDiettrlch et al., 1987]. Инициация исключает переохлаждение внешней водной среды с последующей опасностью проникновения льда в клетки, а выдержка обеспечивает наиболее медленное обезвоживание в начале глубокого замораживания.

Значит, при криосохранении клеток, тканей и микроорганов расте-

ний целесообразно программное замораживание с инициацией кристаллизации и скоростью охлаждения на первом этапе замораживания 0,25--1,0°С/мин (до -30, -40°). На втором этапе мы увеличивали скорость до 9-Ю°С/мин и около -60° быстро погружали ампулы в жидкий азот.

5.1.Обеспечение плавного обезвоживания клеток при инициации кристаллизации. Вышеприведенные данные о преимуществе инициации с последующей выдержкой показали значение максимально медленного охлаждения и, соответственно, обезвоживания клеток. Между тем для инициации приходилось назначать температуру стабилизации с некоторым градиентом по отношению к дг и в результате получался хотя и небольшой, но все же пик температуры в ампуле. К тому же выполнение манипуляций для инициации кристаллизации зависит также и от тренировки экспериментатора - субъективного фактора. Для стандартности процесса этот фактор нужно исключить. Желательно также, чтобы весь процесс замораживания, включая и инициацию кристаллизации, проходил полностью автоматически без участия человека, т.к. при малых скоростях охлаждения этот процесс требует нескольких часов. Нами разработано 3 устройства к программным замораживателям для инициации кристаллизации.

Наше первое предложение состояло в использовании специального держателя и полиэтиленовых ампул одноразового применения [А.С.СССР Ш 1097875 и 1144673, 1983]. Ампулы вставляли в отверстия держателя плотно, как пробки - так, чтобы мениск криозащитного раствора в них находился на 2-3 мм Еыше дна кюветы-держателя, если в ампулах была суспензия клеток. Если же замораживали другие объекты, помещенные е уровне мениска раствора, то вставляли ампулы только их донной частью. После охлаждения ампул до температуры на 2° ниже Д1; раствора в держатель быстро вливали холодный спирт, приготовленный заранее. Температуру его нашли в специальных опытах. Наступало локальное внезапное сильное охлаждение ампул с раствором, которое вызывало кристаллизацию в растворе. И главное - инициация происходила в зоне раствора, удаленной от объекта, т.к. клетки обычно оседают на дно ампул. Поэтому, когда при дальнейшем медленном замораживании возникшие кристаллы льда начинали расти, то они достигали зоны с клетками не сразу, что обеспечивало обезвоживание объекта еще до подхода к нему кристаллов льда.

Данное изобретение имеет ряд недостатков. Поэтому мы разработали второе устройство, сохранив главный принцип: локальное крат-

повременное охлаждение вертикально расположенных ампул происходит в зоне, удаленной от зоны, в которой находятся клетки (ткани, микроорганы) [А.С.СССР № 1440137, 1987]. Т.е. охлаждение происходит в верхней части ампул в зоне мениска раствора, если клетки оседают на дно, или в нижней части, если объекты расположены сверху.

В третьем нашем устройстве Еведено усовершенствование, которое позволяет не рассчитывать дг криозащитного раствора и упростить программу замораживания, назначая стабилизацию для инициации при одной и той же температуре для любых раствороЕ [Попов, Донец и др. Патент № 1522005, 1988]. В этом устройстве импульс холода поступает в полости пробок ампул, которые в ходе опыта заполняются водным нетоксичным гелем. Если объекты располагают на поверхности раствора (например, апексы), или в случаях, когда клетки не оседают на дно (при высокой вязкости раствора), гель необходимо еносить не в пробки, а в нижнюю треть ампул и соответственно их устанавливать. В геле замерзает только вода (е этом мы убедились в специальных опытах), дг отсутствует, поэтому камеру аппарата достаточно стабилизировать при температуре -I, -2°С перед импульсом холода. В результате в воде геля возникали кристаллы льда. Стабилизацию продолжали еще 5-10 мин, чтобы эти кристаллы доросли до поверхности геля, касающейся раствора. В этот момент наблюдали торчащие из геля кристаллы. Но криозащитный раствор кристаллов не содержал совсем, т.к. дг практически всех таких растворов ниже -1°. После возобновления охлаждения с заданной скоростью и снижения температуры до дг растворов с клетками, автоматически начиналась плавная кристаллизация в растворах и, соответственно, столь же плавное обезвоживание клеток. Какие-либо скачки температуры, даже небольшие пики, и вызванные ими изменения скоростей роста кристаллов льда и обезвоживания были полностью исключены.

6. ВОССТАНОВЛЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ И ТКАНЕВЫХ КУЛЬТУР ПОСЛЕ ОТТАИВАНИЯ.

6.1. Изучение концентрационных градиентов при удалении криопро-текторов и рекультивировании клеток. Этап удаления криопротекторов и рекультивирования требует особых предосторожностей, т.к. выжившие клетки перенесли сильнейшие стрессы и частично повреждены. Для сохранения таких клеток необходимо свести к минимуму все воздействия, которые могут дополнительно повреждать клетки и их плазмалем-му. Но токсичные криопротекторы должны быть удалены. При высеве на

поверхность агаризованной среды не обеспечивается достаточно быстрого и значительного снижения их концентраций. Промывка клеток с помощью двухкратного ресуспендирования, которую мы с успехом применяли во многих случаях, не удовлетворяла вышеприведенному условию и не была эффективной для ряда клеток. Мы разработали более физиологический, щадящий способ и интенсифицировали рекультивирование [Попов, Черняк и др., 1984]. Этот способ основан на диффузии криопротекторов из клеток в жидкую среда после высева суспензии на фильтры, расположенные на поверхности раствора. Манилуляционные воздействия на клетки минимальны. Такая система позволяет менять среда, не тревожа клетки. Причем можно постепенно снижать осмотические градиенты среды, снабжая каждую последующую ее порцию соответствующими концентрациями сахарозы, чтобы избежать дополнительного стресса для клеток при уменьшении осмотичности.

Эффективность данного способа проверили в специальных опытах с густой суспензией клеток женьшеня Ж-1 с ДМСО. После различного времени инкубации при комнатной температуре с помощью ГЖХ определяли концентрацию ДМСО, вышедшего вследствие диффузии. Оказалось, что уже через 10 мин экспозиции суспензии на фильтрах 98% ДМСО переходило в воду. Для снижения токсичности все операции лучше проводить на холоде, поэтому определили диффузию в течение 15 мин при 20 и 0°. На холоду выходило в раствор 90% от количества ДМСО, диффундировавшего при комнатной температуре.

В других опытах использовали криозащитную смесь: 10% ДМС0+20% сахарозы. Диффузия проходила не только в жидкую питательную среду, но и в растворы сахарозы (3-15%), которые затем заменяли обычной жидкой средой. В некоторые чашки на отдельном фильтре помещали "ткань-няньку". Без отмывки никакого возобновления роста клеток не произошло, а при наличии "няньки" рост был более интенсивным, чем без нее. Воздушно-сухой вес выросшей клеточной массы показал, что наилучшие результаты были получены путем диффузии в 15%-ную сахарозу. В этом случае размороженные клетки, находившиеся в криоза-щитном растворе с 20% сахарозы, испытывали наименьший осмотический стресс. Предложенный нами способ является наиболее физиологичным, т.к. он е наименьшей степени травмирует клетки, быстро избавляет их от токсичных криопротекторов, обеспечивает сколь угодно постепенное снижение гиперосмотичности криозащитного раствора и позволяет интенсифицировать рекультивирование.

6.2.Физиологические, цитологические и биохимические характеристик клеточных культур, восстановленных после длительного хранения в жидкоы азоте. При восстановлении культур клеток моркови М-34 мы отметили, что независимо от срока хранения выживаемость и морфолс гия возобновленной каллусной ткани не меняется. Клетки М-34 были успешно рекультивированы и после 5, и после 12 лет хранения в криобанке. Каллусная ткань образовывалась в обычные сроки. Клетки 01озсогеа с2е!1;о1<Зеа Д-1 и ДМ-0,5 после оттаивания из криобанка че рез 1,5 месяца хранения, 4,5 года и 6 лет имели практически одина ковую выживаемость и длительность образования газона растущей тка ни при высеве на поверхность агаризованной среды.

Восстановленные каллусные ткани были перенесены в жидкую среду Полученные суспензионные культуры анализировали по нескольким показателям (Табл.10 - ростовой индекс) и снимали кривые роста клеток в культуральном цикле (Рис.7). Ростовые характеристики возобновленных культур всех изученных штаммов В.йеИо1бва совпали с характеристиками исходных. Доказано сохранение штаммами исходного распределения клеток по числу хромосом (Рис.8). Каждый мутантный штамм имеет свой собственный спектр синтезируемых им стероидов, измененный по сравнению со спектром исходного штамма Д-1 и существенно отличный от спектров других мутантных штаммов

ом-а

П9„ ЕЗ 2л О Зп

Рис.8^ Сохранение распределения по числу хромосом в суспензион-культурах клеток диос-кореи штаммов ДМ-1 и ДМ-8 после криосохра-нения. 1 - исходные культуры, 2 - возобновленные культуры. Внизу - штаммы (обозначены латинскими буквами) и уровни плоидности. Слева - % клеток.

Рис/Л Кривые роста размороженных и контрольных суспензионных культур диоско-реи и женьшеня. По осям: абсцисс - дни цикла субкультивирования, ординат - чис ло клеток/мл. 1 и 2 диоскорея (Д-1 ), 3 и 4 женьшень (Ж-1 ). 1

и 3 - контроль, 4 - размороженные.

и

[Носов A.M., 1984]. Показано качественное и количественное совпадение всего профиля ГЖХ хроматограмм контрольных суспензий и восстановленных после несколько лет хранения в жидком азоте (Табл. II).

Аналогичные данные были получены и для каллусных культур D.caucásico, ж D.balcaníca (фурастаноловые гликозиды) и для суспензий клеток женыленей Р.ginseng, чьи кривые роста представлены на рис.?, и Р.quinquéfolíus (панаксозиды - анализ О.В.Решетняк).

Таким образом, криосохранение клеток растений обеспечивало полное восстановление в возобновленной спустя много лет культуре исходного образца биосинтетической активности, и всех других основных характеристик.

Таблица_10л

Индекс роста (по числу клеток) суспензионных культур клеточных

штаммов диоскореи дельтовидной после хранения в жидком азоте.

„ „„„ ! Клеточный штамм Культура т------------г-----------т------------т------------

__________________|____ДГ1____|___SM-Oj.5__i___5Mrl____i___ДМг8____

Исходная 6,8+0,3 7,9+0,5 6,9+0,4 7,1+0,3

После криохранения 6,9+0,4 8,1+0,3 7,9+0,6 7,9+0,5

7. РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИИ ПОСЛЕ КРИОХРАНЕНИЯ ИХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР.

У клеток моркови в культуре In vitro способность к регенерации растений сохраняется на хорошем уровне 4-5 месяцев. Когда нам передали штамм М-34 его способность к соматическому эмбриогенезу уже снижалась и к моменту криосохранения еще упала. Однако, мы попытались Есе же регенерировать растения после оттаивания. Каллусы, выросшие из размороженных клеток, пересадили в условия, индуцирующие эмбриогенез, и через 2-4 недели возникли эмбрионы, некоторые из которых сформировали корешки (Табл. 12). Эмбрионы изолировали и пере-ресадили в пробирки с жидкой средой для доращивания. Через 2 нед из эмбриоидов развились проростки с зеленым побегом и корешками. Эти проростки были пересажены на ту же среду, но без (3-индолилмас-ляной кислоты, а сахароза была снижена до 0,7%. На некоторых проростках образовались почки и зеленые листочки длиной 3-4 мм. Значит, эмбриогенные и морфогенетические потенции клеток моркови в результате криосохранения не пострадали, а дальнейшего роста растеньиц не получилось потому, что еще до замораживания эти потенции у данной культуры были почти исчерпаны.

Таблиуа_Пл

Содержание стероидных веществ в клеточных штаммах диоскореи дельтовидной в расчете на воздушно-сухую массу клеток, мг/г, после хранения в жидком азоте.

Штамм

диосгенин +

ямогенин

_Сктостер™_]__Стигмастерж_|_Ка^естерга_ 6,07±0,04 1,33+0,06 0,43+0,01 0,59+0,02

Д-1

6,12+0,21 1,20+0,13 0,45+0,02 0,63+0,01

ДМ-0,5 12,7+1,0 0,44+0,04 0 0 0,36+0,08

13,3+0,4 0,48+0,04 0,38+0,08

да-1 4,4+0,4 0,41+0,01 1 ,03+0,03 0,48+0,03

3,8+0,2 0,37+0,04 0,95+0,08 0,54+0,05

ДМ-8 5,5+0,2 0,57+0,01 0,46+0,01 0,40+0,04

5,7+0,2 0,60+0,04 0,48+0,02 0,47+0,02

Примечание: В числителе контроль, в знаменателе - культура после хранения в жидком азоте. Таблица 12. Регенерация проростков из каллусных тканей моркови, выросших из размороженных клеток, хранившихся при -196° 2 месяца.

День |___ ___Число_стру;ктур__ 5_24_пробирках_ ________

пас- !__ ___эмбриоиды_____ _____проростки_ ________

_сажа_]_до 0Х5 мм И-2 мм !с _ко2ещком|без_ко2ещка_

5 1 0 0 0

15 16 10 0 0

20 10 16 0 0

33 1 19 5 1

Более длительное время сохранялась способность к регенерации ъ суспензионных культурах клеток картофеля, полученных из каллусов, образовавшихся на эксплантах из пробирочных растений индийского сорта Тата. Клетки штамма КТ-4, находившиеся в хорошем состоянии и

замороженные с ДМСО и трегалозой, после оттаивания из жидкого азота возобновляли рост и образовали каллусную ткань, которая после длительного рекультивирования регенерировала растения In vitro.

Рост органогенных каллусных тканей очень редких, исчезающих эндемичных растений - Lioacorea balcanica и D.caocasica был восстановлен при высеве после оттаивания из жидкого азота через примерно 4-6 нед. Спустя 1-1,5 мес эти ткани были пересажены для размножения на ту же среду, а еще через I мес перенесены на среду для органогенеза с 0,5 мг/л БАЛ и 0,18 мг/л ИУК. На этой среде на свету каллусы активно росли, многие их участки приобрели интенсивную зеленую окраску и образовали корни и побеги [Popov, Volkova, Culafic 1997]. Эти реликтовые растения были регенерированы In vitro и in vivo (в оранжерее). Хранение в криобанке ампул с каллусами этих растений, замороженных в тех же успешных опытах, продолжается. Тем самым положено начало спасению названных исчезающих видов с помощью криосохранения.

Таким образом, если к моменту глубокого замораживания клеточные штаммы сохраняли способность к регенерации, то после криосохранения также имеется возможность регенерировать эти растения независимо от сроков хранения в жидком азоте, т.к. восстанавливать рост клеточных культур можно спустя много лет, а эмбриогенные и морфоге-нетические потенции в результате криосохранения не изменяются. Конечно, если режим хранения не был нарушен, т.е. температура никогда не превышала -140°С, и все этапы были достаточно оптимизированы. Следовательно, криосохранение является фактически консервацией в состоянии анабиоза (криобиоза), когда все процессы жизнедеятельности прекращены, но при правильном оттаивании и рекультивировании их можно возобновить и "оживить" микроскопические объекты.

8. АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ И РАЗРАБОТКА КОНЦЕПЦИИ КРЙОУСТОИЧИВО-СТИ. Наш подход к формированию криорезистентности клеточных штаммов растений исходит из процессов криоповреждения клеток, подразделяющихся на две основные группы: одна группа этих процессов вызвана вероятным проникновением льда из внешней среды в клетки при замораживании и последующим губительным ростом кристаллов внутриклеточного льда. Другая группа процессов определяется так называемыми solution eífects: многими различными механизмами криоповреждения, которые вызываются очень сильно повышающейся концентрацией внешнего раствора по мере замораживания в результате кристаллизации в

Н8М воды в лед. Значит, чтобы обеспечить выживание клеток после глубокого замораживания, прежде Есего необходимо было исключить образование и рост льда внутри клеток. Простого подбора криопротекторов было недостаточно. Наблюдение за образованием льда в кле тках с помощью криомикроскопа и процессом кристаллизации внешнего раствора при разных режимах замораживания показало, что при инициации кристаллизации и скорости охлаждения около 0,5°С/мин или ни»

льда в клетках не было по крайней мере до -27°, хотя At была -2,82°. Столь сильное переохлаждение (24,2°!) показывает, что найденный нами режим замораживания в присутствии криопротектора (ДМСО) обеспечивал такое обезвоживание клеток внеклеточным льдом, при котором в них не оставалось воды, способной кристаллизоваться Следовательно, оптимальная криозащита и наш режим замораживания, оказавшийся достаточно универсальным, исключают образование льда внутри клеток.

Но остаются и становятся важнейшими причинами криоповреждений solution eííects, среди которых основную роль, тем большую, чем больше клетки и их вакуоли, играет чрезмерный осмотический стресс сжатие протопласта при обезвоживании и последующий деплазмолиз npi оттаивании. Полностью исключить эти процессы невозможно, но ослабить их действие и повысить выживание клеток можно эндоцеллюлярны-ми криопротекторами и специальным предварительным культивированиег (подготовка). Названные вещества, связывая воду в клетке, не только предотвращают ее кристаллизацию в губительный лед, но и удерживают ее во внутренних компартментах и тем самым уменьшают степень сжатия протопласта. Так же действует и подготовка, если она лишь снижает оводненность клеток (предкультивироЕание с маннитом, штам? Ж-10 Ралах quinquéfoltus; закаливание штэммое Ж-2 и Ж-3 Р.ginseng и повышает в них уровень Сахаров (закалка Ж-2, предкультиЕирование с аминокислотами штамма Д-I Dloscorea deltoidea). Но в том-то и дело, что действие подготовки в этих наших опытах, очевидно, не исчерпывалось указанными эффектами, т.к. снижение оводненности клеток Ж-3 на 59% не могло объяснить резкий рост (до 250%) их выживаемости. Значит, кроме изученных, давно известных процессов, в ходе закаливания должны действовать и другие механизмы повышения криоустойчивости. Аналогичный вывод следует и из несоответствия увеличения Сахаров в клетках Ж-2 при закаливании (на 60%) и в клетках Д-I при предкультиЕировании с аминокислотами (до 80%) намног<

5ольшему (в 2,7 и 5-6 раз, соответственно) росту выживаемости этих слеток. Этот вывод и привел нас к исследованиям плазмалеммы.

Флуориметрические измерения процента клеток с деструкциями пла-шалеммы показали,что у всех изученных 5 штаммов, принадлежащих к ;толь отдаленным видам (женьшень и диоскорея - разные классы) су-1ествует почти полное совпадение между деструкциями этой мембраны ipii медленном программном замораживании с последующим быстрым оттаиванием и при моделировании этого процесса при околонулевой тем-тературе в эквиосмотических растворах. По своей осмо- и криочувст-зительности штаммы располагались в одном и том же порядке, в том теле и после предварительного культивирования, и процент клеток с деструктивными повреждениями плазмалеммы при обоих воздействиях Зыл очень близким. Значит, не отрицая других возможных механизмов товреждения при глубоком замораживании-оттаивании, наши результаты указывают на плазмалемму, как главную мишень криоповреждения, и на чрезмерный осмотический стресс, как основную причину ее деструкций. Анализ осмочувствительности указывает на существование нескольких типов повреждений клеточной мембраны, нарушающих непрерывность ее дипидного бислоя, т.е. приводящим к деструкциям: повреждения при злазмолизе, возникающие в начале сжатия; повреждения при дальней-нем сжатии, усиливаемые криопротекторами (в особенности ДМСО); повреждения, возникающие при плазмолизе, но проявляющиеся при депла-змолизе; повреждения в процессе деплазмолиза; повреждения при де-злазмолизе, усиливаемые ДМСО.

Обращает на себя внимание совпадение зоны критических для вызывания клеток при замораживании температур (вернее, как мы теперь знаем, осмоляльностей) по результатам работ разных лабораторий: это зона от -30 до -40°С, эквиосмотически соответствующая 16,12 - 21,5 осмолей. Следовательно, совокупность данных, полученных нами при исследовании деструкций плазмалеммы и выявивших эту критическую зону (переломы кривых); и данных [Chen et al., 1984], показавших с помощью ЯМР, что обезвоживание при замораживании заканчивается в этой же зоне и клетки Catbnrantus гозеиз выживали, если сохраняли хотя бы 20% свободной воды; и данных рентгеноструктурно-го анализа, что при меньшей гидратации площадь, занимаемая фосфо-липидными молекулами бислоя, уменьшается и увеличивается вероятность перехода лидидов из жидкокристаллической фазы в гель и последующих переходов [Crowe et al., 1987, 1988], свидетельствует,

что образование в плазмалемме мицелл й-^-фазы [Stepontois, 1984] необратимый этап криоповрездений, деструкции - наступает тогда, когда начинается удаление воды непосредственно из бислоя липидов плазмалеммы Шопов, 19933.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Как наши результаты, так и литературные данные, i том числе полученные на клетках, культивируемых In vitro, свидетельствуют о многообразии и сложности процессов, которые вовлече} в формирование криоустойчивости клеток. И естественно протекающие и специально применяемые экспериментаторами процессы nocJieMoeaTej но сменяют друг друга на разных этапах предварительного культивирования, криозащиты и охлаждения. Более того: эти различия и последовательная смена процессов накладываются на морфо-физиологичс ские характеристики разных клеток в популяциях In vitro и различных компартментов растительной клетки, ее собственный рост и вза! модействия клеток между собой. Различия определяются также генот! пическими характеристиками исходных растений, из которых были получены культуры [Norgaard. et al., 1993]. Сложность и разнообразие процессов формирования криоустойчивости определяются, естествекнс разнообразием механизмов повреждения, с которыми растительные кл; тки встречаются на разных этапах охлаждения и замораживания. С учетом известных к настоящему времени экспериментальных фактов, гипотез и предположений эти механизмы могут быть представлены в виде схемы (см. следующую стр.).

При снижении температуры и/или надлежащих экспериментальных воздействиях (подготовка, криозащита) в клетках, в соответствии i их генотипическими возможностями и физиологическим состоянием, м< гут развиваться процессы холодовой адаптации и формирования крио устойчивости, из которых основными следует считать следующие:

- накопление Сахаров, некоторых аминокислот, полипептидов и друг]

веществ, связывающих воду, а также изменения цитоскелета;

- торможение растяжения клеток, повышение вязкости цитоплазмы,

прочности и гибкости плазмалеммы;

- синтез белков холодового стресса и в том числе:

- ферментов, осуществляющих вышеперечисленные процессы, изменя

кщих синтез и обмен липидов, в особенности в плазмалемме;

- осмотинов - белков, повышающих осмотическое давление и препя

ствующих чрезмерному обезвоживанию и плазмолизу;

- белков-детоксикаторов;

Схема развития процессов повреждения клеток при замораживании.

ТешератураЛ

ОсноЕше_поврежаащие_мехашзмыЛ

+25 С - температура жизнедеятельности и культивирования.

нарушения активности ферментов и метаболизма.

дисульфидные и другие сшивки в белках.

перестройки (фазовые переходы) липидов в мембранах, важнейшие - плазмалемма и (после нее) тонопласт.

0°С

? ф

-дг раствора

-25°С*

нарушения АТФаз и систем активного транспорта.

образование льда в растворе вокруг клеток, возможно повреждение этим льдом при быстром его росте.

токсичность при увеличении концентраций солей, аминокислот и других веществ вне*и внутри клеток.

при деплазмолизе при оттаивании возможен разрыв плазмолеммы вследствие ее непрочности - гибель, проникновение льда в клетку по той же причине -гибель клетки вследствие роста его кристаллов.

переход липидов плазмалеммы в фазу Ятт - гибель ! при максимальном сжатии (коллапс клетки).

-40 С - критическая температура для дегидратации клеток по

условию обезвоживания бислоя плазмалеммы.

!40 С - нижний предел для роста и перестроек кристаллов льда.

-196 С - температура хранения в жидком азоте, средняя цифра, начало процесса в популяциях - около -12, -15°С.

- белков, стабилизирующих и экранирующих мембраны, в особенном

плазмалемму;

- белков, непосредственно выполняющих криозащитную функцию и

снижающих At цитоплазмы;

- белков-антинуклеаторов, препятствующих образованию зародышей

(нуклеусов) кристаллов льда в цитоплазме, и наоборот -

- белков-нуклеаторов, секретируемых наружу и облегчающих кри-

сталлизацию внешнего раствора и тем самым своевременное

обезвоживание клеток.

Многие из перечисленных процессов уже показаны на растениях, как например активация у арабидопсис, кукурузы, люцерны, костра генов "cor", регулируемых холодом и АБК и кодирующих синтез спевд фических полипептидов (Mohapatra et al., 1988; Robertson et al., 1988; Lin et al., 1990; Anderson M., Prasad T. et al., 1994; Ьащ et al., 1994], т.е. запускающих синтез части белков холодового стресса. Появились первые данные и о значении цитоскелета для Kpi оустойчивости [Morlsset et al., 1994]. У разных объектов и даже } родственных клеточных штаммов относительная роль тех или иных ои( химических процессов криоустойчивости различна. Поскольку на кул] тивируемых in vitro клетках исследования этих процессов почти отсутствуют, а их проведение требует большой специальной и трудоемкой работы, в течение которой клетки могут измениться, то большю ство работающих по криосохранению эмпирически подбирают условия криозащиты и подготовки клеток. Мы действовали аналогично, макси мально используя известные предпосылки, и в результате Институт физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН располагает теперь кри банком клеточных штаммов, рост которых может быть возобновлен пр необходимости. В этом все еще единственном в России криобанке хр нятся также семена 160 видов редких и исчезающих растений из кол лекции В.Л.Тихоновой (ГБС РАН), и апексы побегов ряда вегетативн размножаемых ягодных культур [Высоцкая, Попов, 1996].

- 43 -ВЫВОДЫ.

1. Выдвинута и экспериментально обоснована концепция формиро-зния криоустойчивости клеточных штаммов, тканей, микроорганов ра-гений, которая использует физиологические принципы как предотвра-зния образования губительного внутриклеточного льда и ослабления резмерного сжатия протопласта, так и структурной модификации на-ужной клеточной мембраны и повышения ее стойкости при дегидрата-т и регидратации клеток.

2. Для обеспечения криоустойчивости клеточных штаммов In vitro редложена система криозащиты, включающая совместное применение вдо- и экзоцеллюлярных криопротекторов (ДМСО, гл1щер1ш, трегало-а, сахароза, маннит и др.).

3. Изучена криоустойчивость (глубокое замораживание-хранение в идком азоте-оттаивание) 29 клеточных штаммов In vitro, полученных т 18 видов растений (в том числе впервые Dloacorea deltoidea, D. aucasica, D.balccnica, Panax glnzeng, P.qulnqusfollus, P.Japonl-из, Trttlcum tlmopheevt, Rhaponttcum carthamotcles). Криоустойчивы ишь слабовакуолизированнне клетки, сосредоточенные в период ак-ивного деления в агрегатах-центрах размножения. Сокращение цикла убкультивирования и повышение плотности культуры увеличивали бы-иваемость такт агрегатов в несколько раз. Успешное криосохране-ие возможно лишь при максимальной жизнеспособности клеточных ультур, наблюдаемой у большинства из них в первой половине экспо-енциальной фазы роста. Ко для ряда длительно культивируемых in itro клеточных штаммов максимальная жизнеспособность и оптималь-ая криозащита недостаточны для толерантности к стрессам глубокого амораживания, оттаивания и последующего высева.

4. Выдвинуто представление о необходимости физиологической одготовки к криосохранению клеток и микроорганов растений и раз-аботана система специального предварительного культивирования, озволяющая большему числу клеток успешно преодолеть эту экстре-:альную процедуру и обеспечить возобновление роста культуры. Наря-у с пршенением маннита предложены три новых способа предкульти-ирования: закаливание (начиная с 12° и до 2°, 3 нед) суспензий леток с повышением концентрации сахарозы, добавление некоторых минокислот и инкубация суспензий при 9-10° в течение 18-20 ч; со-:етание 2-го и 3-го способов было аддитивно.

5. У штаммов диоскорей дельтовидной криоустойчивость коррелирует с преобладанием в их популяциях да- и триплоидных клеток и предкультивирование крионеустойчивого штамма Д-I с аминокислотами привело к такому же преобладанию за счет снижения числа тетра- и полиплоидных наборов хромосом.

6. Криоустойчивость In vitro лишь отчасти связана с содержанием растворимых Сахаров и свободной воды в клетках, что следует из несоответствия между многократным возрастанием выживаемости клеточных штаммов D.deltoiüea и Р.ginseng и увеличением Сахаров и/или уменьшением ОЕодаенности. Наряду с этими процессами должны функционировать и другие физиологические механизмы повышения криоустой-чивости клеток, вероятно - на плазмалеше, которая является главной мишенью криоповреждения.

7. С помощью разработанного нами флуориметрического метода выявлены деструктивные повреждения плазмалеммы, нарушающие ее непрерывность и полупроницаемость и приводящие к полной проницаемости и, следовательно, гибели клетки. Метод однозначно показывает количество клеток с такими повреждениями и позволил обнаружить дее популяции, резко отличающихся по криоустойчивости, в суспензионных культурах всех исследованных клеточных штаммов столь отдаленных видов, как Р.ginseng и D.üeltoídea.

8. На этих 5 штаммах впервые установлено почти полное совпадение между крио- и осмоустойчивостью клеток, т.е. их устойчивостью в процессе дегидратации (плазмолиза) и регидратации (деплазмолиза) при околонулевой температуре без замораживания. С помощью флуориметрического метода обнаружено нескольких типов деструктивных повреждений плазмалеммы, происходящих ео время плазмолиза и/или деплазмолиза, развитие которых зависит от присутствия криопротектора (ДМСО), подготовки клеток и степени их сжатия при замораживании или в эквиосмоляльных растворах. Соотношение разных типов повреждений различно у клеток разных штаммов и видов.

9. В условиях медленного глубокого замораживания наблюдаемые изменения К+-стимулируемой М§^+-зависимой Н+-АТФазы плазмалеммы не коррелируют с гибелью клеток. Значит, изменения Н+-АТФазы не могут быть первопричиной деструктивных повреждений наружной клеточной мембраны. Ответственными за такие повреждения могут быть, вероятно, конфигурационные изменения ее бислоя, нарушающие его непрерывность и вызванные его дегидратацией и фазовыми переходами липидов.

10. В целях интенсификации рекультивирования клеток обеспечено быстрое удаление токсичных криопротекторов и постепенное снижение гиперосмотичности криозащитного раствора с помощью физиологичного, щадящего способа.

11. После многолетнего криосохранения и возобновления роста штаммов получено точное восстановление исходного образца их биосинтетической активности, а также эмбриогенных, морфологических, цитогенетических и ростовых характеристик. Тем самым доказана возможность криобанка сохранить в клеточной культуре без нарушений генетический потенциал данного вида.

12. После криосохранения восстановленные клеточные штаммы могут регенерировать растения так же, как и до замораживания (проростки моркови, растения картофеля In vitro, реликтовые исчезающие еиды Dioscorea balcanlca и D.caucasíca - In vitro и In vivo). Змб-риогенные и морфогенетические потенции в результате криосохранения не изменялись. Максимальный испытанный срок успешного криосохранения - 12 лет (морковь), хранение продолжается более 20 лет.

13. Впервые доказано, что при криосохранении клеток, тканей и микроорганов растений в процессе программного замораживания целесообразно применять инициацию кристаллизации и скорость первого этапа замораживания 0,25 - 1,0 °С/мин. Разработанный режим охлаждения при наличии криопротекторов (ДМСО) обеспечивал отсутствие губительного внутриклеточного льда по крайней мере до -27°. Следовательно, в клетках практически не оставалось воды, способной замерзнуть.

Для реализации данного режима разработаны три устройства к программным замораживателям для инициации кристаллизации одновременно в большом количестве ампул с клетками без нарушения стерильности, что обеспечивает автоматическое проведение всего процесса замораживания (от помещения ампул в аппарат и до переноса их в жидкий азот). Одно из этих устройств (A.C. СССР J6 I440I37) с 1988 г. установлено на нескольких моделях программных заморажиЕэтелей, в том числе на нашем аппарате 3PK-I и работает надежно с любыми программами.

14. В результате проведенных исследований разработаны физиологические основы уникального биотехнологического способа сохранения генофонда растительных клеточных культур in vitro и растений путем криоконсервации, т.е. помещения клеток, тканей и микроорганов в

жидкий азот ( -196°С) с последующим оттаиванием, восстановлением роста культур и регенерацией растений. Этот способ уже позволил сохранить генофонд 18 клеточных штаммов (из них 2 регенерировали исчезающие растения In vivo) 12 видов в течение до 20 лет. В основе способа лежит повышение природной криоустойчивости с помощью оптимизации криозащиты, специального предварительного культиЕиро-вания, режима охлаждения и рекультивирования после оттаивания.

Список основных статей и изобретений по материалам диссертации.

1. Попов A.C., Бутенко Р.Г., Глухова И.Н. - Влияние условий подготовки и глубокого замораживания на возобновление суспензионной культуры клеток дикой моркови//Физиология растений, 1978, т.25, J& 6, сс.1227-1236.

2. Попов A.C., Бутенко Р.Г., Глухова И.Н. - Способ сохранения клеток и тканей растений//Автор. Свид. СССР № 865245, 1978, Б.И.

JÉ 35, 1981.

3. Бутенко Р.Г., Попов A.C. - Банк клеток растений - возможности : проблемы//Природа, 1979, Jé 4, сс.2-11.

4. Попов A.C. - Криогенное хранение культур клеток растений//"Кул: тура клеток растений", М., Наука, 1981, сс.150-162.

5. Попов A.C., Черняк Н.Д., Бутенко Р.Г. - Возобновление суспензи онной культуры клеток женьшеня Panax glnzeng С.А.Меу после глубокого заморакивания//Докл.АН СССР, 1982, т.262, ЛЗ, со.765-768

6. Волкова Л.А., Попов A.C., Носов A.M., Бутенко Р.Г. - Сохранени биосинтетического потенциала клетками диоскореи (Dioscorea del-го idea Wall.) после криогенного хранения//Докл.АН СССР, 1982, т 265, Jí 2, сс.504-506.

7. Dlettricii В., Popov A.S., Píelfler В., Neumann D., Butenko R.G Luckner M. - Cryopreservation of Digitalis lanata cell cultures //Planta Medica, 1982, v.46, J& 2, pp.82-87.

8. Бутенко P.Г., Попов A.C., Волкова Л.А. Диттрих Б., Лукнер М. -Жизнеспособность клеток растений при различных режимах глубокого замораживания//Цитология, 1983, т.25, & 10, cc.II9I-II96.

9. Попов A.C., Черняк Н.Д., Пауков В.Н. - Совершенствование рекультивирования клеток и тканей растений после хранения в жидко азоте//Физиология растений, 1984, т.31, Jí 3, сс.602-605.

10. Волкова Л.А., Попов A.C., Самыпш Г.А. - Влияние аминокислот

на суспензионную культуру клеток диоскореи дельтовидной и ее возобновление после хранения при -196°С//Физиология растений, 1984, т.31, J6 4, сс.632-638.

11. Попое А.С. - Значение криобанка клеток и меристем растений для их биотехнологического пршенения//"Биотехнология", М., Наука, 1984, сс.254-260.

12. Попов А.С. - Методические указания по криоконсервации клеток и тканей растений/71984, Изд.ВАСХНИЛ, М., 22 стр.

13. Попов А.С., Бутенко Р.Г. - Устройство для замораживания живых биологических объектов в контейнерах//Автор.Свид.СССР № 1097875, 1984, Б.И. JS 22.

14. Попов А.С., Волкова Л.А., Бутенко Р.Г. - Способ консервирования живых клеток и тканей растений//Автор. Свид. СССР № I144673,

1984, Б.И. № 10, 1985.

15. Butenko R.G., Popov A.S., Volkova L.A., Chemyak N.D., Nosov

A.M. - Recovery of cell cultures and their biosynthetlc capacity after storage of В1сзсогеа deltoidea and. Panax ginseng cells In liquid nitrogen//Plant Scl.Letters, 1984, v.33, J6 3, pp.285-292.

16. Butenko R.G., Popov A.3. - The possibilities .and problems of creating a plant cell and tissue cryobank//"Man and Biosphere", M., Nauka, 1984, pp.229-242.

IT. Popov A.S., Volkova L.A., Butenko R.G. - Significance of improved freezing program to organize a plant cell ana merlstem cryobank//Proceedings of Intern. Syrup. "Plant Tissue and Cell Culture Application to Crop Improvement", Prague, 1984, pp.561-562.

18. Diettrlch В., Haack U., Popov A.S., Butenko R.G., luckner M. -Long-term storage In liquid nitrogen of an embryogenlc cell strain of Digitalis Zaiaia/ZBiochem. Physiol.der Pflanzen, 1985, Bd.180, № I, ss.33-43.

19. Самыгин Г.А., Волкоеэ JI.А., Попов А.С. - Сравнение различных методов для оценки жизнеспособности клеток суспензионных и кал-лусных культур//Физиология растений, 1985, т.32, Я 4, сс.813-818.

20. Popov A.S. - Cryoconservation and plant cell bank//"Plant Cell Cultures", M., MIR, 1985, pp.175-197.

21. Волкова Л.А., Горская H.B., Попое А.С., ПаукоЕ В.Н., Урманцева

B.В. - Сохранение основных характеристик мутантных клеточных штаммов диоскореи после хранения при сверхнизких температурах// Физиология растений, 1986, т.33, & 4, сс.779-787.

22. Попов A.C., Волкова JI.А., Черняк Н.Д. - Криобанк клеток и тканей растений: программа замораживания и некоторые методы подготовки и рекультивирования//"Культура клеток растений и биотехнология", М., Наука, 1986, сс.219-222.

23. Diettrich В., Wolf Т., Bormarai A., Popov A.S., Butenko R.G., luckner M. - Cryopreservatlon of Digitalis lanata shoot tips// Planta Medica, 198T, v.53, M 4, pp.359-363.

24. Попов A.C. - Криоконсервирование культивируемых тканей и клеток растений//"Криобиология и биотехнология", Киев, Наукова дамка, 1987, сс.160-181.

25. Попов A.C., Исаков H.A., Бутенко Р.Г. - Устройство для замораживания живых биологических объектов в контейнерах//Автор. Свид. СССР ¡i 1440137, 1988.

26. Попов A.C. - Криоконсервация клеток растений//"Методы культивирования клеток", Л., Наука, 1988, сс.70-77.

27. Попов A.C., Донец Н.В., Исаков H.A., Бутенко Р.Г. - Устройство для замораживания живых биологических объектов в контейнерах//Па-тент России (Автор. Свид. СССР) & 1522005, 1989, Б.И. № 42.

28. Попов A.C., Вожоеэ Л.А., Гонзалез A.M.Т., Диттрих Б., Донат П. Донец Н.В., Черняк Н.Д. - Криосохранение клеточных штаммов и меристем растений: влияние подготовки и криопротекторов//"Биология культивируемых клеток и биотехнология растений", М., Наука, 1991, СС.260 - 270.

29. Донец Н.В., Мусин С.М., Попов A.C. - Стабильность состава полиморфных белков растений картофеля, полученных из меристем после их криогенного хранения//СельскохозяйстЕенная биология, 1991,

J6 3, СС.76 - 83.

30. Попов A.C., Федоровский Д.Н. - Повреждения плазмалеммы клеток диоскореи, культивируемых in vitro, в процессе их криосохранения //Физиология растений, 1992, т.39, J* 2, сс.335 - 343.

31. Федоровский Д.Н., Попов A.C. - Повреждения плазмалеммы различных штаммов диоскореи дельтовидной при криосохранении//Физиоло-гия растений, 1992, т.39, № 3, сс.592 - 598.

32. Popov A.S. - The Cryopreservatlon and Cryoreslstance oí Plant Cell Membrane//"Blodiversity and the Role of Culture Collections" 1992, Beijing, China, VII Intrenat.Congress for Culture Collections, Abstracts, p.44.

33. Федоровский Д.Н., Черняк Н.Д., Попое A.C. - Исследование по-

вреждений плазмалеммы клеток женьшеня настоящего при криосохра-нении//Физиология растений, 1993, т.40, № I, cc.IIV - 123.

¡4. Попов А.С. - Некоторые механизмы криоповреждения клеток In vitro и особенности их криосохранения//Физиология растений, 1993, т.40, Ш, сс.485 - 496.

1Ь. Попов А.С., Волкова Л.А. - Криосохранение и некоторые изменения культур клеток диоскореи на среде без витаминов//Физиология растений, 1994, т.41, № 6, сс.923 - 928.

!6. Чулафич Л., Грубишич Д., Вуичич Р., Вожова Л.А., Попов А.С. -Соматический эмбриогенез In vitro дисскорей кавказской и балканской и криосохранение их органогенных каллусных тканей//Физиология растений, 1994, т.41, И 6, сс.929 - 934.

17. Мокроноссв А.Т., Купцова Е.С., Попов А.С., Кузнецов Зл.В. -Генетическая коллекция как способ сохранения биоресурсов планеты //Вестник РАН, 1994, т.64, Я II, сс.991 - 1001.

¡8. Popov A.S., Volkova L.A., Butenko R.G. - Cryopreservatlon of Germplasm of Dtosccrea cfeZtoicfea//"Blotechnology In Agriculture and Forestry, Vol.32, Cryopreservatlon oi Plant Germplasm", ed. BajaJ Y.P.S., Berlin-HeidelPerg, Springer, 1995, pp.487-499.

19. Попов А.С. - Криосохранение генофонда растений в культурах In vitro//"Консервация генетических ресурсов". Пущино н/Оке, ОНТИ ПНЦ РАН, 1996, СС.128-129.

/ I

Ю. Popov A.S., Volkova L.A., Culailc L. - Cryopreservatlon oi In vitro plants and plant tissue genofond Dto3Corea balcantca and D. caucasiсо//Bulletin de 1'Instltut et du Jardin botaniques de l'Universite de Beograd, 1997, t.XXIX, pp.1-9. ,

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Попов, Александр Сергеевич, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К.А. ТИМИРЯЗЕВА

И 1 . ' 1! Л I

\ * {0 ■ На правах рукописи

"■'.....'

" Пойов Александр: Сергеевич

ФИЗИОЛОГИЯ КРИОУСТОИЧИВОСТИ И КРИОШ?ХРАНЕНИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ Ш У1ТШ КЛЕТОЧНЫХ ШТАММОк РАСТЕНИИ

03.00.12 - физиология растеши! 03.00.23 - биотехнология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1998

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВОДНАЯ ГЛАВА. - 6

1.1. Актуальность работы. - 6

1.2. История проблемы криохранения генофонда. - 8

1.3. Особенности криосохранения культивируемых клеток растений- II

1.4. Цели и задачи исследования - 14

1.5. Научная новизна работы -15

1.6. Практическое значение исследования - I?

1.7. Апробация работы - 18

2. ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:

ОСНОВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ КРИОПОВРЕЖДЕНМЯ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ - 21

2.1. Образование льда -21

2.2. Влияние solution effects - 28

2.3. Обезвоживание клеток и плазмалемма

Я 9

'Jw

3. ГЛАВА 3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:

КРИОСОХРАНЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ШТАММОВ РАСТЕНИЙ - 56

3.1. Поиски подходов к решению проблемы - 56

3.2. Процедура криосохранения - 60

3.2.1. Специальное предварительное культивирование (рге^отп!!)- 60

3.2.2. Сбор и концентрирование клеточной культуры - 65

3.2.3. Криозащита

3.2.4. Глубокое замораживание

3.2.4.1. Программное замораживание - 72

3.2.4.2. .Упрощенные способы замораживания - 74

3.2.4.3. Витрификация

66

'У о

( ь-'

/

О 9 Ц

О » к^ •

. Хранение

О • bj 1

6. Оттаивание - 80

О о гу

л-/ . К/ . ( I

Возобновление роста клеток - рекультивирование - 81

2.8. Характеристики восстановленных клеточных культур - 84

4. ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ:

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ - 89

4.1. Объекты - 89

4.2. Методы - 95

5. ГЛАВА 5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ: РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕД0ВАНМЯ-103 5.1. Исследование физиологического состояния клеточных культур-103

кто

'J « i » и

>.1.1. Физиологические особенности культуры клеток моркови -108

5.1.2. Суспензионные культуры клеток диоскорен дельтовидной -112 Каллусные клеточные культуры диоскорей

кавказской и балканской -119 5Л.4. Суспензионные культуры клеток женьшеней Рапах ginseng,

Р. quinquefoliua (американского), Р. Japonicua -124

5.2. Влияние криопротекторов на выживаемость -125

5.2.1. Дополнительная криозащита клеток моркови -133

5.3. Действие специального предварительного культивирования (подготовка к криосохранению) -138

5.3.1. Закаливание суспензионных клеточных культур -138

5.3.2. Снижение водного потенциала питательной среды -150

5.3.3. Эффект пролина и других антистрессовых аминокислот -153

5.3.4. Влияние краткой инкубации при пониженной температуре -160

5.4. Исследования крио- и осмоустойчивости плазмалеммы

клеток растений in vitro -165

5.4.1. Флуориметрический метод определения деструкций плазмалеммы -166

5.4.2. Повреждения плазмалеммы клеток диоскореи при замораживании-оттаивании и эквиосмотическом сжатии -171

5.4.3. Повреждения плазмалеммы клеток женьшеня при замораживании-оттаивании и эквиосмотическом сжатии -184

5.4.4. Влияние глубокого замораживания на К'-стимулируемую Mg2+-saBHCHMyro Н+-АТФазу плазмалеммы клеток женьшеня штамма Ж-2 -189

5.4.4.1. Модификация метода выделения везикул плазмалеммы

для культивируемых клеток женьшеня штамма Ж-2 -191

5.4.4.2. Активность K+-, Mg2+-, Н+-АТФазы плазмалеммы контрольной и закаленной культур клеток женьшеня

штамма Ж-2 до и после глубокого замораживания -194

5.5. Значение скорости замораживания и процессов льдообразования в растворе криопротекторов для выживаемости клеток -201

5.5.1. Изучение процессов кристаллизации криозащитных растворов -206

5.5.2. Обеспечение плавного обезвоживания клеток при

инициации кристаллизации -216

5.6. Исследование восстановления клеточных и тканевых

культур после оттаивания из жидкого азота -233

5.6.1. Оттаивание -233

5.6.2. Изучение концентрационных градиентов при удалении криопротекторов и рекультивировании клеток -233

5.6.3. Физиологические, цитологические и биохимические характеристики клеточных культур, восстановленных

после длительного хранения в жидком азоте -240

5.7. Регенерация растений после криохранения

их клеточных культур -256

6. ГЛАВА 6. АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ И РАЗРАБОТКА КОНЦЕПЦИИ

КРИОУСТОИЧИВОСТИ (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ) -266

ЗАКЛЮЧЕНИЕ -289

ВЫВОДЫ -294

ЛИТЕРАТУРА -299

Список сокращений и некоторых терминов.

Крио- - приставка, происходящая от греческого "криос"= мороз, в последние годы употребляется в литературе для обозначения глубокого холода.

Криопротекторы - химические вещества, принадлежащие к разным классам соединений, но объединяемые способностью ослаблять крио-повреждения биологических объектов, как затрудняя и уменьшая образование и распространение льда, так и другими путями.

Solution effects - собирательное понятие - употребляется в литературе для обозначения группы явлений, имеющих место при замораживании и повреждающих клетки, но не связанных прямо с действием льда, а вызванных сопутствующими изменениями во внешнем растворе.

НЕ = культивируемые единицы - понятие, объединяющее все морфологические образования в суспензионных культурах in vitro: и свободные (отдельные) клетки, и различные клеточные агрегаты.

-At,UC - понижение температуры замерзания воды в капиллярах и в растворах.

ЯТ]--фаза = гексагональная инвертированная фаза - группировка молекул липидов, в которой они образуют (вместо бислоя) мицеллы с торчащими наружу углеводородными цепями жирных кислот.

ДМСО - диметилсульфоксид.

ТТХ - 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид.

ФДА - флуоресцеин диацетат.

ПЭО - полиэтиленоксид, фактически синоним полиэтиленгликоля.

2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота.

БАЛ - бензиламинопурин.

ИУК - индолилуксусная кислота.

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс.

ЯМР - ядерный магнитный "резонанс.

I. ВВОДИМ ГЛАВА.

I.I. Актуальность работы.

В условиях экологического неблагополучия как в глобальном масштабе, так и в России и, в особенности, в отдельных ее регионах проблема сохранения генофонда растений, входя в общую проблему охраны живой природы, приобрела особое значение. Растения важны не только как источник пищи, лекарственного и другого технологического сырья. Зеленые фотосинтезирующие растения, в особенности леса -главные создатели нынешнего баланса кислорода в атмосфере Земли, пока еще поддерживающие его несмотря на весь антропогенный прессинг и тем самым обеспечивающие само существование высших форм жизни. Растения удовлетворяют не только материальные, но и духовные потребности человека. Но многие виды растений в опасности. В России нуждаются в охране около 4000 видов, из которых 533 уже внесено в Красную Книгу, в том числе 440 покрытосеменных, а 76 находятся под непосредственной угрозой исчезновения [ Красная Книга, 1988 ]. Сохранение разнообразия видов, подвидов, рас и сортов (в особенности местных) сельскохозяйственных растений и их диких сородичей - непременное условие широкой селекционной работы. Традиционных средств сохранения биологического разнообразия растений (заповедники, ботанические сады, постоянно поддерживаемые полевые коллекции и коллекции семян) в силу присущих им ограничений давно уже недостаточно. Даже хорошо оснащенные коллекции семян при низких положительных температурах не обладают необходимой надежностью для длительного хранения [ Зайцев В.А., Лихачев B.C., 1985 ].

Развитие методов культивирования In vitro клеток, тканей и микроорганов (апикальные меристемы побегов, зиготические и соматические эмбрионы) растений позволило создать биотехнологию поддержания и хранения в условиях пониженного метаболизма (депониро-

ванне) мериклонов оздоровленных растеньиц в пробирках. Полевые коллекции важнейших вегетативно размножаемых растений были дополнены и частично заменены коллекциями мериклонов суперэлитного материала, которые обеспечили надежное хранение и резкое сокращение потребных площадей: 200 - 400 образцов при диаметре сосудов 15-50 мм и 5 сосудах на образец занимают лишь I м2 в специальной лаборатории [ Kartiia К., 1985 b ].

Однако, коллекции in vitro требуют значительных непроизводительных затрат ручного труда, энергии, реактивов. Для поддержания клеточных штаммов растений, которые приобрели уже не только чисто научное, но и производственное значение, такие коллекции являются вынужденным решением, далеким от оптимального, поскольку растущие постоянно клетки in vitro (за очень редкими исключениями) генетически нестабильны [ Шамина З.Б., Бутенко Р.Г. и др., 1966; Тогтеу J., 1967; D'Amato F., 1975; Шамина З.Б., 1978; Gould А., 1982 3. Также нестабильны длительно культивируемые линии клеток животных, штаммы микроорганизмов, но для большинства этих объектов давно уже разработаны рутинные методы криохранения, исключающие любые биохимические процессы и обеспечивающие состояние анабиоза.

Следовательно, проблема длительного хранения генофонда растений и их клеточных штаммов стала проблемой криосохранения семян, апексов побегов, эмбрионов и клеток in vitro. Это впервые понято около 30 лет назад [ Туманов И.И., Бутенко Р.Г. и др.,1968; Quatrano R., 1968 ], подчеркнуто в проблемных статьях [ Street Н., 1975; Неп-siiaw G., 1975; Бутенко Р.Г., Попов А,С., 1979 3 и стратегия данного направления продолжает разрабатываться [ Stuslmofi С., 1991; Withers L., 1992; Iwanaga М., 1993; Pay м., 1994 3. Для криохранения генофонда следует прежде всего использовать семена, пыльцу и апексы побегов, которые в культурах in vitro, в отличие от клеток.

почти всегда регенерируют исходный генотип. Это особенно важно для вегетативно размножаемых растений, отдельных элитных экземпляров, материнских и трансгенных форм. По криохранению семян проведены хорошие отечественные работы В.Ю.Молодкиным [ 1987 3, В,Л.Тихоновой [ 1985, 1992 ], Т.Ф.Стрибуль [ 1993 3. Совместно с рядом авторов мы провели успешные эксперименты по криосохранению апексов кар тофеля [ А.В.Манжулин и др. 1982, 1983; К.В.Донец и др., 1991; Попов A.C., Волкова Л.А. и др., 1991 3, наперстянки Е Diettrich. В., Wolf Т. et al., 1987 3, ромашки Е Diettrich В., Donath Р. et ab, 1990 ] и земляники садовой Е Высоцкая О.Н., Попов A.C., 1996 3.

Однако в данную работу мы не включаем эти опыты, т.к. меристемы побегов являются отдельной экспериментальной системой, более сложной, чем клетки In vitro. Апекс - организованная структура, орган, состоящий из ряда тканей, взаимодействия клеток которого, выживших после криохранения, определяют возможность последующей прямой (без нежелательного каллусообразования) регенерации растений. В настоящем исследовании мы ограничиваемся проблемой криосо-хранения клеточных штаммов. Решение этой проблемы позволило бы гарантировать неизменность хранимых образцов и резко сократить затраты на коллекцию и требуемую площадь, т.к. в криобанке (например, в нашем) 15000 ампул объемом до 2 мл каждая (5-50 ампул на образец) размещаются на I м^ и еще возможно уплотнение хранения. Таким образом, криоустойчивость клеток и тканей растений in vitro, их естественная и искусственная защита от криоповреждений стали важным, первоочередным направлением исследований.

1.2. История проблемы криохранения генофонда.

Первые (и успешные!) попытки криохранения живых объектов были предприняты на семенах обычных сельскохозяйственных растений сразу после сжижения воздуха, т.е. 100 лет назад Е Thiselton-Dyer W.,

1899; Becquerel P., 1905, 1907 3. В дальнейшем эти работы периодически повторялись на- ортодоксальных семенах других растений за рубежом и у нас [ Самыгин Г.А., Варламов В.Н. и др., I960 3 и, наконец, начиная с 70-х годов приступили к широким исследованиям и организации криобанков таких семян важнейших сельскохозяйственных растений и Arabidopsia thai lam t Roberts E., 1975; Gressiioff P., Gartner E., 1977; Stanwood P., Bass L., 1978; Молодкин В.Ю., 1984, 1987; Стрибуль Т.Ф., 1993 3.

Наша страна была первой в изучении хранения ортодоксальных семян культурных растений при неглубоком замораживании в вечной мерзлоте l Данилова М.С., 1982 3 - наиболее экономичному способу сохранения генофонда, который, почти не потребляя энергии, существенно продлевает долговечность семян по сравнению с положительными околонулевыми температурами, хотя и уступает в этом отношении более низким (однако последние требуют непрерывной работы холодильных машин). Пионером криосохранения семян дикорастущих охраняемых редких и исчезающих видов является В.Л.Тихонова, которая уже в течение ряда лет хранит в жидком азоте в нашем криобанке свою коллекцию семян 160 видов, собранных ею и ее помощниками на всей территории России: от Южных Курил до Балтики [ Тихонова B.JL 1985, 1992; Николаева М.Г., Тихонова В,Л. и др., 1992 3. Лишь в последние годы аналогичные работы появились за рубежом; наиболее масштабные - в Австралии С Touchell D., Dixon К., 1993 3. Уже разработаны способы криохранения подавляющего большинства микробов и соматических клеток животных, которые при постоянном культивировании генетически нестабильны. Для этих объектов понятие "коллекция" означает криоколлекцию (некоторые бактерии хранятся в лиофилизиро-ванном состоянии при околонулевой температуре - ангидробиоз). Коллекции клеток и мериклонов растений в растущем состоянии или

щж депонирования в условиях пониженного метаболизма, которое позволяют разрядить пересадки до года, а иногда и до 2-х лет, хотя столь же необходимы и решают те же задачи, все еще далеки от коллекций других живых микрообъектов.

Исторически возникло два подхода к решению проблемы, Первый шел от генетически детерминированной способности морозостойких растений к холодовому закаливанию и обширных исследований этого феномена в трудах H.H.Максимова и И.И.Туманова с сотрудниками [ Максимов H.A., 1952; Тумаков И.И., 1979 3. Именно у нас в Институте физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН были сделаны пионерные успешные работы по криоустойчивости побегов и тканей, и целых травянистых растений при замораживании до жидкого азота ( -196°С) и до жидкого водорода ( -253°С)[ Туманов М.И., Красавцев O.A. и др., 1959, 1965; Туманов И.И., Красавцев O.A., 1966; Туманов И.Й., Трунова Т.И., 1963, 1967; Трунова Т.Н., 1965 3. Были также проведены первые работы, расширившие данное направление на культивируемые in vitro каллусные ткани наших обычных плодовых растений г Туманов И. И., Бутенко Р.Г. и др., 1968 3. Уже тогда можно было бы организовать криобанк морозостойких сортов и форм хотя бы только этих вегетативно размножаемых древесных, кустарниковых и травянистых плодовых и ягодных культур и тем самым подкрепить их полевые коллекции. гарантируя сохранение генофонда, но, к сожалению, И.И.Туманов не ставил такую задачу.

Второй подход к решению проблемы криоустойчивости клеток растений имел своим началом программное замораживание в присутствии криопротекторов (веществ, затрудняющих образование льда и действие других повреждающих факторов) с постоянной малой (1-5иС/мин) скоростью, давно разработанное для клеток животных [ Nag К., Street М., 1973 3.

.<¥ А

- 11 ~

1.3, Особенности криосохранения культивируемых клеток растений. Термин "криосохранение" (сгуорге,зегуаг1оп) употребляется для обозначения сложного многоэтапного процесса, который проводит экспериментатор с целью неограниченно долго сохранить стабильными живые клетки, ткани и органы в состоянии анабиоза. Единственным надежным средством для решения этой задачи является глубокий холод ( -140иС и ниже), обеспечиваемый пока наиболее практично с помощью жидкого азота ( ~ГЭ6°С). Поэтому важнейший этап процесса криосо-хранения - замораживание. Этот процесс прост только для достаточно сухих объектов (пыльца, ортодоксальные семена), которые можно прямо погружать в жидкий азот и оттаивать впоследствии на воздухе в обычных условиях. Для оводненных клеток, тканей и органов растений криосохранение является крайне экстремальной процедурой, вызывающей чрезвычайные стрессы, и начинается, как правило, с этапа подготовки (специальное предварительное культивирование), а заканчивается рекультивированием, проводимым часто в условиях, обеспечивающих интенсивное деление клеток. Успешным этот процесс считается при возобновлении роста культур. Собственно хранение занимает центральное положение среди 9-10 этапов: подготовка культуры, концентрирование ее, добавление криозащитного раствора, замораживание, хранение в .жидком азоте, оттаивание, удаление криопротектора, определение жизнеспособности (выживаемости), рекультивирование и регенерация растений (в случае культур, способных до криосохране-ния к морфо- и/или эмбриогенезу). После регенерации желательны специальные исследования регенерированных растений, чтобы установить их тождество контрольным и исходным.

Основные трудности связаны со спецификой как самих растительных клеток, так и их популяций 1п \г1ьго. Клетки растений, в том числе и культивируемые 1п ухьго, отличаются прежде всего большими

размерами: максимально длина достигает 2000 мкм, но и в среднем, грубо приблизительно, линейные размеры больше, чем у клеток животных по крайней мере в 5-10 раз, а объем, пропорциональный 3-ей степени, следовательно, - в 1000 раз. Причем, и это главное - около 90% этого объема занято вакуолярной системой (по мере роста клеток растяжением - одной центральной вакуолью), клеточный сок которой представляет с