Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности формирования банка вегетативных и генеративных диаспор орхидных для длительного хранения

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Особенности формирования банка вегетативных и генеративных диаспор орхидных для длительного хранения"

На правах рукописи

003488034

АНТИПИНА Виолетта Анатольевна

ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ БАНКА ВЕГЕТАТИВНЫХ И ГЕНЕРАТИВНЫХ ДИАСПОР ОРХИДНЫХ ДЛЯ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ

03.00.05 - ботаника

1 О ДЕК 2009

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003488034

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Главном ботаническом саду им. Н.В.Цицина РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Коломейцева Галина Леонидовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Кириченко Евгений Борисович

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова

Защита состоится «24» декабря 2009 г. в 13 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д.002.028.01 при Учреждении Российской академии наук Главном ботаническом саду им. Н.В.Цицина РАН в конференц-зале лабораторного корпуса по адресу: 127276, г. Москва, Ботаническая ул., д. 4. тел./факс (495) 977-91-72. e-mail: orchid-83@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Главного ботанического сада им. Н.В.Цицина РАН

Автореферат разослан <А> ttoSfifa- 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Широков Александр Игоревич

доктор биологических наук

Виноградова Ю.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Коллекция тропических и субтропических орхидных (Orchidaceae Juss.) Фондовой оранжереи ГБС РАН, на сегодняшний день, насчитывает 1120 видов, подвидов и форм из 222 родов, а также более 300 гибридных сортов и является самой представительной коллекцией орхидных в России (Демидов, Коломейцева, 2007).

В оранжерейных условиях имеется ряд трудностей, связанных с получением полноценных семян. Прежде всего, это ограниченное число образцов из разных популяций, представленных в коллекциях, а также нестабильность цветения. Как правило, семена орхидных получают с помощью искусственного опыления. Успешное перекрестное опыление предполагает наличие в коллекции генетически различных образцов и детальное изучение особенностей репродуктивной биологии (Буюн, 2009).

Успешность прорастания семян орхидных в асимбиотических условиях зависит, прежде всего, от степени развитости зародыша (или зародышей), наличия биологического и экологического покоя и др. Немаловажное значение имеет и строение семенной кожуры, ее плотность и скульптурность, наличие в ее клеточных стенках дубильных или иных веществ, ингибирующих прорастание (van Waes, Debergh, 1986; Коломейцева, 2005). Для снятия физиологического механизма торможения прорастания широко применяют методы предпосевной обработки семян (удаление ингибиторов путем длительного вымачивания зрелых семян), оптимизации питательных сред и условий содержания сеянцев, однако наиболее эффективен посев незрелых семян в асимбиотической культуре по методике «green pod culture» (Tsuchiya, 1954; Sauleda, 1976). Культивирование незрелых семян позволяет не только повысить их всхожесть, но и существенно сократить срок созревания (Withner, 1955; Arditti et al., 1982; Rasmussen, 1995).

Одним из наиболее перспективных способов сохранения генетического материала редких растений ex situ является создание банков семян, пыльцы и культуры клеток, хранящихся в условиях глубокого замораживания при температуре -196°С. При таких сверхнизких температурах прекращаются процессы метаболизма и отсутствуют существенные физико-химические изменения, что дает возможность сохранять объекты живыми в состоянии анабиоза неограниченно длительное время (Бутенко, Попов, 1979; Stanwood, 1985; Engelmann, 1991; Тихонова, 1999; Попов и др., 2004).

Немногочисленные исследования по криоконсервации семян представителей семейства орхидных свидетельствуют о том, что, благодаря особенностям структуры, семена этих растений являются идеальным объектом для криосохранения, поскольку не требуют криопротекторов и сложных методов защиты от повреждающего действия сверхнизких температур (Pritchard, 1984; Никишина и др., 2001,2003).

Альтернативой длительному хранению вегетативных и генеративных диаспор орхидных в жидком азоте является создание банка протокормов в культуре in vitro, что особенно актуально в целях сохранения сортового разнообразия коллекций и массового (промышленного) размножения (Черевченко и др., 2009).

Актуальность настоящих исследований обусловлена и тем, что все представители семейства орхидных включены в списки редких и исчезающих видов растений, в частности, в Международную Красную книгу и Приложения I и II к Конвенции о международной торговле видами дикой флоры и фауны, находящимися под угрозой исчезновения (IUCN, 1994, 2001; CITES, 1995, 1997, 2001).

Цель исследования: Выявление специфики развития генеративных структур редких видов орхидных и оптимизация способов длительного хранения их семян и протокормов.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности цветения и искусственного опыления орхидных в оранжерейной культуре;

2. Выявить механизмы автоопыления;

3. Оптимизировать генеративное размножение редких видов орхидных;

4. Оценить жизнеспособность и изучить морфологические особенности семян;

5. Вывить экологическую дифференциацию семян видов из родов Paphiopedilum Pfitz. и Dendrobium Sw.;

6. Разработать методы длительного хранения протокормов in vitro;

7. Оценить возможность использования зрелых семян для криосохранения орхидей.

Научная новизна исследований:

Впервые изучены особенности искусственного опыления и выявлено многообразие по степени перекрестноопыляемости у орхидных в оранжерейной культуре. Изучены механизмы автоопыления и выявлены различия их проявления у разных образцов одного вида. Выявлены особенности и динамика развития семян в плодах 4 редких видов орхидных. Впервые проведено сравнительно-морфологическое изучение семян 95 видов и внесены уточнения в разработанную R.Dressler (1993) классификацию типов семян орхидных. Выявлена корреляция между морфометрическими показателями семян и принадлежностью видов к разным экологическим группам. Впервые установлены сроки созревания плодов 95 видов орхидных в оранжерейных условиях. Получены данные о высокой криоустойчивости семян 5 видов орхидей при прямом погружении в жидкий азот и показаны различия в методах оценки жизнеспособности криосохраненных семян. Практическая значимость работы:

1. Криобанк семян орхидных пополнен 85 видами; разработаны паспорта семян, хранящихся в жидком азоте;

2. Создан банк протокормов in vitro, включающий 38 видов;

3. Установлены оптимальные схемы скрещивания 120 видов тропических и субтропических орхидных;

4. Определены наиболее ранние оптимальные сроки посева незрелых семян 4 редких видов;

5. Произведен посев семян 95 видов орхидей на питательные среды в культуре in vitro;

6. Разработана безгормональная питательная среда, ингибирующая прорастание и органогенез протокормов орхидных в целях их длительного хранения.

Полученные данные могут быть полезны для уточнения спорных вопросов систематики и филогении, в селекционной практике, а также при дальнейшей работе по созданию банка семян и протокормов орхидных.

Апробация работы. Основные положения диссертации изложены на студенческой конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии» (Пермь, 2005 г), 10-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006 г), VIII Международной конференции «Охрана и культивирование орхидей» (Тверь, 2007 г), XVI Международной научной конференции «Роль ботанических садов в изучении онтогенеза интродуцированных растений» (Харьков, 2008 г), II Всероссийской научно-практической конференции «Биология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2008 г), 12-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008 г), международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии» (Донецк, 2009 г), международной научно-практической конференции «Сохранение биоразнообразия тропических и субтропических растений» (Киев, 2009 г), VII международной конференции по морфологии растений, посвященной памяти И.Г. и Т.И.Серебряковых (Москва, 2009 г), ученых советах ГБС РАН.

Научные публикации по теме диссертации. По материалам исследований опубликовано 15 научных работ (10 статей, 5 тезисов докладов), в которых отражено основное содержание диссертационной работы. Одна статья опубликована в рецензируемом научном журнале.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на^^страницах печатного текста, состоит из введения, литературного обзора, 6 глав, заключения, выводов, библиографического списка (369 наименований, в том числе 272 на иностранных языках), приложения. Диссертация иллюстрирована 87 рисунками, включая фотографии, и содержит 25 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы. Особенности репродуктивной биологии орхидных

Обзор литературы состоит из 6 разделов. Рассмотрены вопросы морфологии репродуктивных органов орхидных, особенности цветения и опыления растений в природе и в условиях интродукции, распространенность автоопыляемых образцов внутри семейства и многообразие механизмов автоопыления, эмбриологические аспекты: специфика оплодотворения, строение и развитие семязачатков и зародыша орхидных, причины его слабой дифференциации. Обсуждены преимущества метода «green pod culture» при размножении видов, характеризующихся затрудненным прорастанием семян в асимбиотической культуре in vitro, а также опыт лабораторного проращивания зрелых семян. Рассмотрена морфологическая классификация семян орхидных и обоснована необходимость ее дальнейшей разработки и уточнения.

На основе анализа работ по замедлению прорастания семян и органогенеза протокормов орхидных in vitro в целях длительного хранения обнаружена

фрагментарность или отсутствие данных по этой проблеме. Рассмотрены вопросы, касающиеся длительного сохранения вегетативных и генеративных диаспор орхидных в жидком азоте, и обоснована необходимость их дальнейшего изучения.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования стали 120 видов тропических и субтропических орхидей, интродуцированных в Фондовой оранжерее ГБС им. Н.В,Цицина РАН из естественных популяций. Экспериментальные растения содержали в четырех оранжереях, где поддерживались разные температурные режимы. Растения выращивали при относительной влажности воздуха 70-90% и естественной освещенности.

Наблюдения за периодом, продолжительностью и особенностями цветения экспериментальных видов проводили на протяжении 3 лет (2006-2009 гг.). В условиях интродукции периоды цветения различных образцов одного вида часто не совпадали, что являлось препятствием для осуществления перекрестного опыления. Для решения этой задачи использовали метод хранения пыльцы при пониженной температуре'(+4...+5°С) (Dillon, 1957).

Искусственное опыление растений проводили в течение двух лет (2006-2008 гг.). Опыление в пределах одного цветка принимали за автогамное (самоопыление). При переносе пыльцы с одного цветка на рыльце другого в пределах одного соцветия происходило соседственное опыление (гейтоногамное 1). Если пыльца попадала с одного цветка на рыльце другого в разных соцветиях одного образца, опыление считали гейтоногамным 2. Опыление между цветками образцов из разных популяций принимали за ксеногамное (перекрестное) (Пономарев, Демьянова, 1980).

Зрелые плоды хранили в бумажных пакетах при температуре +24°С (две недели), после чего закладывали в холодильник на постоянное хранение (+4°С) (Буров и др., 2004).

Семязачатки, зрелые и незрелые семена изучали с помощью светового микроскопа MICMED-5, фотоаппарата Canon Power Shot А95 (программы Image J) и сканирующего электронного микроскопа LEO 1430VP (программа LEO SRV-32). Вычисляли среднюю длину и ширину семенной кожуры и зародыша (у семян с прозрачной семенной кожурой), отношение длины к ширине, процент семян без зародыша. Объем семенной кожуры и зародыша, соотношение этих показателей и объем воздушного пространства в семени вычисляли по следующим формулам:

Vs (объем семени) = 2 [(w/2)2* (V41) * (1,047)], где w - ширина семенной кожуры, 1 - длина семенной кожуры, 1,047 - я/3;

VE (объем зародыша) = 4/3* 7t*(141)* (!4w)2, где w - ширина зародыша, 1 - длина зародыша;

As (объем воздушного пространства в семени) = (Vs -Ve)/ Vs* 100% (Arditti et al., 1979; Healey et al., 1980). Брали от 50 до 200 семян каждого образца. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Excel. Тип семян определяли по методике R.Dressler (1993).

Влажность семян определяли методом высушивания навески (при +100°С), жизнеспособность - с помощью тетразольного метода, предложенного G.Lakon

(1949). В основе данного метода лежит взаимодействие водного раствора 2,3,5-трифенилтетразол хлорида (ТТХ) с дегидрогеназами живых клеток и их последующее окрашивание в красный цвет за счет образования нерастворимого соединения формазан. Для реакции 75 мг ТТХ растворяли в 15 мл буферного раствора (рН 7,5). Семена погружали в данный раствор и выдерживали 18-24 часов при температуре +24°С, после чего производили подсчет окрашенных зародышей.

Способы проращивания семян в асимбиотической культуре in vitro и последующее содержание сеянцев в асептических условиях включали следующие приемы: оптимизация предпосевной обработки (посев незрелых семян), оптимизация компонентов питательных сред, оптимизация содержания сеянцев в климакамерах.

Зрелые семена стерилизовали в 5% растворе гипохлорита кальция (30 мин.), промывали в стерильной дистиллированной воде и высевали в колбы на питательные среды: безгормональную среду Knudson в модификации Т.МЛеревченко и Г.ПКушнир (1986), Murashige & Skoog (1962) с половинной концентрацией солей и на среду Thomale-м собственной модификации (от 100 до 400 семян на колбу). Посев незрелых семян осуществляли путем стерилизации поверхности плода в 90% спирте (Tsuchiya, 1954; Культивирование орхидей..., 2005). Число повторностей (колб для каждого вида) составило от 2 до 10, в зависимости от исходного количества семян. Началом прорастания считали набухание развивающегося зародыша с последующим разрывом семенной оболочки (Arditti, 1967). Семена, образовавшиеся протокормы и сеянцы культивировали в климакамерах с общим режимом: температура +22-24°С, влажность 50-70%, освещенность 2000 люкс, 16-часовой фотопериод. При создании банка протокормов in vitro производили посев зрелых и незрелых семян на среду Thomale-м собственной модификации с последующим содержанием сеянцев в охлаждающем инкубаторе SANYO MIR-153.

Замораживание семян проводили в пластиковых ампулах, погружая их непосредственно в жидкий азот (-196°С). После нескольких месяцев хранения в жидком азоте ампулы с опытными образцами оттаивали в воде при температуре +40°С в течение 60 с и высевали на питательные среды Knudson (модифицированную Т.МЛеревченко и Г.П.Кушнир (1986)) и Murashige & Skoog (в половинной концентрации). Семена экспериментальных видов хранили в холодильнике (+4-5°С) от 6 суток до 15 мес. до их помещения в криобанк. Оценку всхожести контрольных и криосохраненных семян проводили через 2 месяца после посева. Прорастание семян и последующий рост протокормов изучали с помощью бинокуляра МБС-1 и микроскопа Axioplan 2. Рисунки и основная часть фотографий, приведенных в работе, выполнены автором.

Результаты исследования

Глава 1. Особенности цветения и искусственного опыления тропических и субтропических орхидных в оранжерейных условиях

В 1 главе проанализированы результаты трехлетних фенологических наблюдений за 120 редкими и эндемичными видами тропических и субтропических

орхидей в условиях интродукции, приведено описание их цветков и соцветий, выполнены рисунки репродуктивных структур, а также обобщены данные по различным способам искусственного опыления.

Колонка (гиностемий) - характерный диагностический признак цветка орхидных, представляющая собой сросшиеся тычинки и пестик. Она включает рыльцевую поверхность, пыльник, который располагается в особом углублении на ее вершине (клинандрии), ростеллум (стерильная часть рыльца, отделяющая его от пыльника) и несколько (от 2 до 8) поллиниев (склеенных пыльцевых зерен), имеющих особые придатки (тегулу, каудикулы, висцидий), которые играют важную роль при опылении (рис. 1).

Рис. 1. Колонка (А - вид спереди, В - вид спереди с приподнятым пыльником, С - вид сбоку) и поллинарий (D - вид спереди, Е - вид сбоку) Angraecum magdalenae.

Продолжительным цветением в культуре (до нескольких месяцев) характеризовались виды из подсемейства Cypripedioideae Kostel. (20 видов из рода Paphiopedilum Pfitz. и 2 вида из рода Phragmipedium Rolfe). Колонка имеет щитковидный стаминодий и две фертильные тычинки по бокам от рыльцевой поверхности. Поллинии восковой консистенции, без придатков. В результате искусственного опыления этих растений самонесовместимость не выявлена: эффективность различных способов искусственного опыления (ЭИО) составила 100%.

Цветение единственного экспериментального вида из подсемейства Orchidoideae Eaton (Stenorrhynchos speciosum) непродолжительное (около 1,5 мес.). Пыльник располагается на дорзальной стороне колонки, поллинии мучнистой консистенции (состоят из массул), имеют каудикулы и висцидий. Эффективность автогамного и гейтоногамного опыления составила 60-80%.

Продолжительность цветения видов из подсемейства Epidendroideae Lindl. (97 видов из 6 триб и 15 подтриб) составила от 2-3 дней (Sobralia macrantha, Stanhopea tigrina, Dendrobium crumenatum, Flickingeria fimbriata) до нескольких месяцев (виды из подтриб Coelogymnae, Aeridinae, Cymbidiinae). Число поллиниев в поллинарии

равно 2 (Ви1ЬорЬу11тае, Р1еигоЛаШс1тае, большинство видов из трибы Уапс1еае, ОпасНтае), 4 (АгеШизеае, Вепс1гоЬппае, ЬаеПтае, МахШашпае) и 8 (8оЬга1Ппае).

В зависимости от наличия и степени механизмов самонесовместимости выделяли три группы: 1) отсутствие самонесовместимости (5оЪгаНа, Flickingeria, СаШеуа, Ер1с1епс1гит, большинства видов из трибы Уапёеае, СутЫйшт, Lemboglossum, Osmoglossum, виды из подтрибы Zygopetalinae, РегаГепа, ЙалЛореа); 2) наличие строгой самонесовместимости (большинство видов Coelogyne, Ви1ЬорИу11ит, Вгазя^а, Кос1п£ие21а, виды из подтрибы МахШашпае). Эффективность перекрестного опыления составила от 32 до 100%. 3) частичная самонесовместимость фепдгоЫит (14 видов из 27 проявляли строгую самонесовместимость, у остальных видов ЭИО колебалась от 33 до 100%), ЕпсусНа, ОпЫсИит, МШота).

В целях оптимизации искусственного опыления видов, у которых периоды цветения разных образцов не совпадали (Coelogyne, ВепйгоЫит), проводили опыление сохраненной пыльцой при пониженной температуре от 10 суток до 11,5 мес., при этом ЭИО составила 20-33%.

Анализ экспериментальных данных показал, что наиболее эффективным способом опыления оранжерейных орхидных является перекрестное опыление: из 478 опыленных цветков 328 - завязали плоды, содержащие жизнеспособные семена, что составило 68,6% (табл. 1).

Таблица 1. Общее число опыленных цветков и полученных плодов в результате

искусственного опыления различными способами

Способ опыления Общее число опыленных цветков Общее число образованных плодов %

Автогамный (А) 649 177 27,3

Гейтоногамный 1 (Г1) 585 163 27,9

Гейтоногамный 2 (Г2) 710 154 21,7

Ксеногамный (К) 478 328 68,6

Всего 2422 822 33,9

Опыление, производимое в пределах одного образца (автогамное и гейтоногамное), имело приблизительно одинаковую эффективность (21,7-27,9%), несмотря на то, что степень и проявление самонесовместимости колебались в широких пределах и имели видоспецифичный характер. В целом, суммарная эффективность искусственного опыления составила 33,9% (из 2422 опыленных цветков 822 - образовали плоды с нормально развитыми семенами), демонстрируя достаточно высокий уровень адаптации тропических и субтропических орхидных к специфическим условиям искусственной среды обитания.

Глава 2. Автоопыление у оранжерейных орхидных

В Фондовой оранжерее ГБС РАН часть видов тропических и субтропических орхидей регулярно образует плоды и жизнеспособные семена посредством автоопыления. В целях изучения его эффективности в условиях интродукции определяли механизмы и типы автоопыления в соответствии с общепринятой

классификацией (Catling, 1990), Объектами исследования стали 6 видов, представленных в коллекции разным числом образцов.

Автоопыление предполагало наличие особых механизмов автоматического перемещения поллиниев или рыльца внутри цветка, связанное с его структурной и/или функциональной перестройкой (Catling, 1990). Цветки автоопыляемых видов отличались от перекрестноопыляемых по нескольким признакам: 1) меньшими размерами цветков и соцветий; 2) более однотонной окраской околоцветника и отсутствием контрастного рисунка на губе (видоизмененном лепестке); 3) отсутствием или редукцией структур цветка и др. Механизмы автоопыления экспериментальных растений включали: избыточную секрецию рыльца (1 - в соответствии с классификацией), разрастание или втягивание ткани рыльцевой поверхности (ЗЬ), сгибание каудикул или пыльцевых масс по направлению к рыльцевой поверхности (4d), отсутствие или растворение ростеллума и/или клинандриума (5а), структурные модификации цветка - поллинии и стигма развиваются в контакте благодаря искривлениям и изменениям в длину ветвей рыльца (5d). У большинства видов механизм автоопыления сочетал в себе несколько факторов: у Cephalantheropsis lateriscapa, MaxiUaria crassifolia и Polystachya concreta 1 и 5a, y Angraecum calceolus - 3b, 5a, у Epidendrum noctumum - 5a, 5d и y Xylobium pallidiflorum - 4d.

Эффективность автоопыления (ЭА) колебалась от 40 до 100%. Максимальная ЭА характерна для видов, имеющих одноцветковые соцветия (Maxillaria crassifolia) или соцветия, цветки которых раскрывались поочередно (Epidendrum noctumum). Кроме того, для Maxillaria crassifolia и Epidendrum noctumum характерна клейстогамия, тогда как у остальных видов автоопыление происходило в полностью открытом цветке. Необходимо отметить, что из трех образцов Polystachya concreta автоопыление выявлено только у образцов, привезенных из Кубы и Борнео. Цветки вьетнамских образцов имели приспособления для перекрестного опыления и не завязывали плодов.

Глава 3. Динамика развития семян и выявление ранних стадий их прорастания у некоторых редких видов орхидных

Оптимизация генеративного размножения редких видов растений сводится к разработке методов, способствующих ускоренному прохождению жизненного цикла, и включает такие приемы, как предпосевная обработка и использование незрелых семян при посеве в асимбиотической культуре in vitro (Tsuchiya, 1954).

В качестве экспериментальных объектов выбрали 4 вида: Paphiopedilum appletonianum, P. haynaldianum, Dendrobium cruentum и D. crumenatum, из которых первые три занесены в Приложение I к списку CITES, как редкие и исчезающие (CITES, 1995). Кроме того, Paphiopedilum haynaldianum и Dendrobium cruentum имеют узколокальный ареал и являются эндемиками (Cribb, 1998; Lavarack et al., 2000). В литературе отсутствуют данные о динамике развития семян в плоде и наиболее оптимальных сроках посева незрелых семян экспериментальных видов.

Срок созревания плодов Paphiopedilum appletonianum, P. haynaldianum, Dendrobium cruentum и D. crumenatum составил 8,5; 6,5; 5 и 3 мес. соответственно. Выявлены различные изменения, происходящие в семенах по мере созревания

плода. В процессе развития семян происходило неравномерное увеличение линейных размеров зародыша и семенной кожуры. Семенная кожура достигала максимальных размеров к 2,5 мес. после опыления у Dendrobium cruentum, к 1,5 мес. после опыления у D. crumenatum, к 5 мес. после опыления у Paphiopedilum appletonianum и к 3,5 мес. после опыления у P. haynaldianum, что составило примерно половину от полного срока созревания их плодов. Зародыш продолжал расти и увеличиваться вплоть до окончания срока созревания плода. Размер семенной кожуры уменьшался к концу созревания плода, что связано с особой стадией развития семян - дегенерацией живых клеток семенной кожуры и накопления в них ингибиторов прорастания (табл. 2).

При посеве незрелых семян на модифицированную среду Knudson в асимбиотической культуре in vitro показано, что способность семян к прорастанию находится в тесной зависимости от состояния клеток семенной кожуры и степени развития зародыша (Андронова, 2000).

Таблица 2. Средние размеры семенной кожуры и зародыша Д сгиепШт и _1_всхожесть незрелых семян на разных сроках их созревания

Срок созревания плода, мес. Размер сем. кожуры, мкм Размер зародыша, мкм Всхожесть семян, %

длина ширина длина ширина

1 54±5 28±2 - - 0

2 150±16 73±4 - - 0

2,5 313±15 104±9 172±16 59±6 45

3 300±13 95±б 150±34 53±3 100

4 280±16 92±9 153±11 62±6 85

5 297±12 72±5 189±9 64±5 75

Примечание: - зародыш не просматривался.

Семена £>. сгиепЫт способны к прорастанию уже в 2,5 мес. после опыления, однако доля проросших семян на этой стадии невелика (45%). Оптимальным сроком посева незрелых семян стал срок 3 мес. после опыления (100%), при этом семена прорастали одновременно, и протокормы развивались примерно с одинаковой скоростью. По мере дальнейшего созревания способность к прорастанию снижалась, и всхожесть зрелых семян составила 75%. Оптимальным сроком посева незрелых семян Д сгитепаШт оказалось 2 мес. после опыления, зрелые семена имели 65% всхожесть. Зрелые семена Paphiopedilum аррШотапит и Р. ЬаупаЫгапит почти не прорастали без дополнительного воздействия на клетки семенной кожуры и удаления из них ингибиторов, оптимальными сроками посева их незрелых семян стали 5-6 и 3,5 мес. после опыления соответственно.

Глава 4. Особенности строения плодов и семян орхидных. Жизнеспособность зрелых семян

4.1. Особенности строения и сроки созревания плодов орхидей Впервые проведен анализ сроков созревания, размеров и веса плодов 95 экспериментальных видов тропических и субтропических орхидных. Плод орхидей - сухая коробочка, вскрывающаяся при созревании одной (УапДеае) или

несколькими щелями (большинство видов). Плацентация трехгнездная, париетальная. Срок созревания плодов экспериментальных видов варьировал в широких пределах: от 1 мес. (Stenorrhynchus speciosum) до 29,5 мес. (Coelogyne trinervis). Выделено 5 групп, в зависимости от срока созревания плодов: от 1 до 3 мес. (9 видов), от 3,5 до 6 мес. (24 вида), от 6,5 до 9 мес. (37 видов), от 9,5 до 12 мес. (15 видов) и более 12 мес. (10 видов), что составило 9%, 25%, 39%, 16% и 11% от общего числа видов соответственно. Минимальные размер и вес плодов оказался у автоопыляемого вида Polystachya concreta (1,1±0,1 х 0,3 см, 0,04±0,01 г), максимальный - у Pescatorea wallisii (11,0 х 3,5 см, 46,72 г), при этом срок созревания их плодов был одинаковым - 5 мес.

Некоторое число видов орхидных в оранжерейных условиях образовывали плоды, содержащие нежизнеспособные семена (без зародыша) или плоды, не содержащие семян. К первой группе относится 11 видов из двух подтриб: Laeliinae {Cattleya walkeriana, Encyclia atropurpúrea) и Aeridinae (Aerides houlettiana, A. rubescens, Ascocentrum chrystensonianum, Doritis pulcherrima, Ornithochilus difformis, Phalaenopsis aphrodite, P. schilleriana, Schoenorchis seidenfadenii, Trichoglottis brachiata). Плоды Cymbidium sanderae, полученные в результате опыления цветков гейтоногамным способом, не содержали семян. Вероятное объяснение данному явлению состоит в наличии у растений механизмов самонесовместимости, поскольку в большинстве случаев (за исключением Doritis pulcherrima, Encyclia atropurpúrea, Phalaenopsis aphrodite и P. schilleriana) скрещивание проводили внутри образцов.

4.2. Морфоструктура зрелых семян орхидных в связи с экологической и таксономической принадлежностью

Сравнительно-морфологическое изучение семян орхидных является важным аспектом при выявлении филогенетических связей в пределах семейства как на внутривидовом уровне, так и при анализе более крупных систематических единиц (Clifford, Smith, 1969; Dressier, 1993). Изучены семена 95 видов орхидей. Сравнительно-морфологический анализ показал, что семена экспериментальных видов относятся к 11 типам и 1 подтипу по классификации R.Dressler (1993): тип Goodyera (1 вид); тип Limodorum (22 вида); тип Epidendrum (5 видов); тип Pleurothallis (1 вид); тип Dendrobium (32 вида); тип Eulophia (1 вид); тип Bletia (1 вид); тип Cymbidium (4 вида); тип Maxillaria (9 видов); тип Maxillaria, подтип Chondrorhyncha (2 вида); тип Stanhopea (1 вид); тип Vanda (14 видов). Два вида (Miltonia spectabilis и Oncidium longipes) отнесены к переходному типу Vanda-Maxillaria.

При сравнительно-морфологическом изучении семян, относящихся к типам Limodorum, Goodyera, Eulophia, Bletia, Cymbidium и Maxillaria выявлена корреляция между морфометрией семян и их экологической и систематической принадлежностью, при этом наиболее значимым признаком является внутренний объем воздушного пространства. Для наземных видов характерно наличие крупных веретеновидных семян с большим объемом воздушного пространства внутри семени, что играет важную роль при анемохории, тогда как для эпифитов и литофитов отмечены более короткие эллипсовидные семена с минимальным объемом внутреннего воздушного пространства.

Для большинства изученных типов семян не выявлено корреляции между способом опыления и процентом неполноценных семян: высокий процент семян, не имеющих зародыша, отмечен в плодах, полученных как в результате перекрестного опыления, так и в результате различных способов самоопыления. Доля беззародышевых семян в плодах автоопыляемых видов колебалась от 0,1 до 35%.

В ходе проведенного анализа были внесены уточнения и дополнения в разработанную классификацию семян орхидных: уточнены размеры семян в типах Goodyera, Limodorum, Dendrobium и Maxillaria, а также выделены две основные формы у семян, принадлежащих к последним трем типам - эллипсовидная и веретеновидная.

4.3. Жизнеспособность зрелых семян орхидных и особенности их асимбиотического проращивания

С целью изучения жизнеспособности полученных семян орхидных произведен их посев в асимбиотической культуре in vitro на питательную среду Knudson без регуляторов роста. В зависимости от скорости прорастания семян выделяли три группы: 1 группа (34 вида) - быстро прорастающие виды (семена начинают прорастать сразу после посева, в среднем - 7-15 сут.), 2 группа (30 видов) - виды со средней скоростью прорастания семян (от 15 до 30 сут.), 3 группа (31 вид) -медленно прорастающие виды (более 30 сут.). Максимальная скорость прорастания характерна для семян, относящихся к типам Dendrobium, Cymbidium, Epidendrum, Bletia и Stanhopea, а наиболее длительным периодом прорастания характеризовались виды, семена которых относятся к типам Vanda, Eulophia, Maxillaria (Chondrorhyncha var.), Pleurothallis, Limodorum и Goodyera. Медленно прорастающие семена имели плотную, как правило, окрашенную семенную кожуру, в клеточных стенках которой содержались ингибиторы прорастание.

Всхожесть семян варьировала от 5% (у Cephalantheropsis lateriscapa и Stenorhynchus speciosa) до 95% (у Coelogyne moor earn, Cymbidium erythrostylum и Dendrobium cruentum). Невысокая всхожесть (5-60%) характерна, прежде всего, для семян, в семенной кожуре которых имелись ингибиторы прорастания (виды из родов Paphiopedilum, Phragmipedium), а также для семян некоторых наземных видов (iCephalantheropsis lateriscapa и Stenorhynchus speciosa). Жизнеспособность семян большинства автоопыляемых видов высокая - 80-90% (за исключением вьетнамского наземного вида Cephalantheropsis lateriscapa), два вида характеризовались высокой скоростью прорастания (Epidendrum nocturnum, Maxillaria crassifolia), три вида - средней (Angraecum calceolus, Polystachya concreta, Xylobium pallidiflorum) и семена одного вида (Cephalantheropsis lateriscapa) имели невысокую скорость прорастания.

Глава 5. Вегетативные диаспоры орхидных в условиях длительного хранения

5.1. Создание банка протокормов орхидных in vitro

На сегодняшний день исследования в области замедления прорастания и приостановки органогенеза у семян и протокормов орхидных не проводятся, поэтому целью работы явилось создание банка протокормов тропических и субтропических орхидных in vitro путем оптимизации химического состава

питательных сред и условий культивирования, а также разработка методов долговременного хранения in vitro живого растительного материала.

При разработке питательной среды для долговременного культивирования протокормов орхидных взяли за основу состав среды Thomale (1957), модифицировав ее по некоторым компонентам. Основным отличием модифицированной среды Thomale (Thomale-м) от среды Thomale (1957) являлось наличие азота в нитратной, а не в аммонийной форме, а также углеводов в виде сахарозы, а не глюкозы и фруктозы.

С целью изучения влияния компонентов питательной среды на прорастание семян и дальнейшее развитие протокормов, произведен посев семян 38 видов орхидей на среду Thomale-м. Контролем служила питательная среда Knudson без регуляторов роста. Выявлено, что среда Thomale-м оказывала ингибирующее действие на прорастание и дальнейший рост и развитие протокормов. Прорастание семян на среде Knudson начиналось, в среднем, через 15-30 суток после посева, тогда как на среде Thomale-м отмечено замедление прорастания (в среднем, на 15 суток). В первом случае семена увеличивались в размерах, образуя зеленые шаровидные протокормы, на которых затем появлялись ризоиды. Во втором случае наблюдали угнетение роста (протокормы меньшего размера) и развития (замедление органогенеза).

В целях активации органогенеза у протокормов, развивающихся на среде Thomale-м, произведена их пересадка на среду Knudson. Экспериментальными объектами стали протокормы эпифитного вида Dendrobium bullenianum, культивируемые на среде Thomale-м 212 суток и находящиеся на стадии бесхлорофилльных протокормов с хорошо развитыми ризоидами. Спустя месяц пересаженные протокормы начинали активно развиваться, увеличиваться в размерах и фотосинтезировать.

Для создания банка протокормов in vitro посевы 38 видов орхидей, культивируемые от 154 до 648 суток на среде Thomale-м и находящиеся на стадии бесхлорофилльных протокормов с ризоидами, помещены в охлаждающий инкубатор при низких положительных температурах (+ 5°С) и отсутствии освещения. Спустя 4 мес. культивирования посевы оставались живыми и характеризовались минимальными ростовыми процессами. Отсутствие освещения и низкие положительные температуры не оказывали заметного отрицательного влияния на протокормы большинства видов орхидей.

Глава 6. Генеративные диаспоры орхидных в условиях криосохранения

С целью расширения криоколлекции семян тропических и субтропических видов орхидей проведена работа по изучению их криоустойчивости. В качестве экспериментальных объектов выбрали 85 видов, представленных 11 типами и 1 подтипом семян и относящихся к разным экологическим группам. Предварительное хранение семян (при +5°С) до их прямого погружения в жидкий азот варьировало от 6 до 457 суток.

Существенным критерием для сохранения всхожести семян орхидей после глубокого замораживания является их влажность (Pritchard, 1984; Никишина и др., 2001). Влажность свежесобранных семян варьировала от 10,5% (Stanhopea tigrina)

до 81,3% (СутЫсИит егуМгойфШт). В процессе хранения влажность семян значительно снижалась и к моменту их погружения в жидкий азот у подавляющего большинства видов не превышала критического значения (11-13%).

Определение жизнеспособности методом проращивания на питательных средах зрелых свежесобранных семян и семян после продолжительного хранения при низких положительных температурах показало, что жизнеспособность видоспецифична и зависит от срока хранения. Так, спустя 3,5 мес. хранения жизнеспособность семян Сое1одупе тоогеапа снизилась почти в 10 раз (с 95% до 10%), тогда как жизнеспособность семян СутЫсИит та51егвИ и Беп&оЫит сгитепаШт через 2,5 и 5,5 мес. хранения существенно не изменилась и осталась на высоком уровне (85% и 80% соответственно).

Выявлены различия при проращивании семян, хранящихся 1 мес. в жидком азоте, по сравнению с контрольными семенами. У трех видов наблюдали увеличение всхожести криосохраненных семян на 40-55% (табл. 3), которое можно объяснить морфо-функциональными изменениями, происходящими в живых клетках при воздействии на них сверхнизких температур (РгксЬак!, 1984; Попова и др., 2006; Никишина и др., 2008).

Для двух видов - ВепйгоЫит сгитепаШт и £>. сгиепШт - характерно уменьшение всхожести криосохраненных семян на 15-20% соответственно, но в целом, глубокое замораживание не оказало заметного отрицательного влияния на всхожесть семян и образование протокормов и ювенильных растений.

Таблица 3. Всхожесть семян после криоконсервации и в контроле, %

Вид Срок хран. семян до погруж. в ж.а., сут. Контрольные семена Криосохраненные семена

Сое1о%упе тоогеапа 206 5 60

СутЫсЧит егуЖго5!у1ит 183 35 80

С. та$1ег$и 220 20 60

Веп&оЫит сгиепШт 43 75 55

270 0 0

В. сгитепаШт 210 65 40

Примечание: Всхожесть семян определена через 45 сут. после посева; ж.а. - жидкий азот

Следует отметить, что не обнаружено прорастания у семян Вепс1гоЫит сгиепШт, хранящихся 9 мес. до погружения в жидкий азот, несмотря на то, что ТТХ-тест показал их высокую жизнеспособность (95%). Наиболее вероятно, что это вызвано физиологическими изменениями, приводящими к вторичному покою, а не действительной потерей жизнеспособности (Нпапо е1 а1., 2009).

Таким образом, зрелые семена орхидей являются наиболее удобным и надежным объектом для криосохранения, поскольку их глубокое замораживание-оттаивание не требует применения трудоемких методик и не оказывает достоверного влияния на последующее развитие протокормов и ювенильных растений.

Проведенные исследования послужили основой для разработки паспортов семян, предназначенных для длительного хранения, в которых содержится полная информация о каждом хранящемся образце (табл. 4).

Таблица 4.

Паспорт образца семян РепйгоЫит сгиеШит,

предназначенного для долговременного хранения в жидком азоте_

1 Инвентарный номер образца 08134

2 Подсемейство Вид Epidendroideae Lindl. Dendrobium cruentum Rchb.f.

3 Статус редкости I Приложение CITES, эндемик

4 Экологическая группа эпифит

5 Ареал Таиланд

6 Место содержания генеративных растений Фондовая оранжерея ГБС им. Н.В.Цицина РАН, Москва

7 Параметры климатического режима оранжереи: температура Влажность Освещенность Способ культивирования зима (дневная 20-22 °С, ночная 16-18 °С), лето (дневная 22-28 °С, ночная 18-20 °С) 70-90 %; зима (1500 люкс), лето (23000 люкс); блочный

8 Число генетически различных образцов Число образцов, с которых собраны семена 1 1

9 Характер опыления Автогамное, гейтоногамное

10 Число собранных плодов 20 плодов

11 Длительность созревания плодов 5 месяцев

12 Дата сбора семян 6.12.2008 г.

13 Средние размеры семян ДЛИ! шир ДЛИ! шир га семени: 297±12 мкм; ина семени: 72±5 мкм; та зародыша: 189±8 мкм; ина зародыша 64±5 мкм_

14 Электронная фотография семени. Длина линейки - 70 мкм.

15 Оценка качества семян: Влажность Начальная всхожесть Всхожесть перед закладкой в ж. а. Всхожесть после хранения в ж. а. 1 мес. Количество семян без зародыша свежесобранные - 27,4%, через 7 мес. хранения (+4 °С) - 4,0% 95% 75% 55% 0,1%

16 Дата закладки семян в жидкий азот 19.01.2009 г.

17 Номер стеллажа Номер штатива Число заложенных ампул с семенами 7 7

18 Место хранения семян Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, Москва. Группа криосохранения растений.

выводы

1. Семена 95 экспериментальных видов отнесены к 11 типам и 1 подтипу, согласно классификации R.Dressler (1993);

2. Уточнены морфометрические параметры семян в типах Goodyera, Limodorum, Dendrobium и Maxillaria; у трех последних типов впервые выделены две основные формы семян - эллипсовидная и веретеновидная;

3. В типе семян Limodorum (род Paphiopedilum) выявлена корреляция между морфометрией семян и экологической и систематической принадлежностью видов. Наиболее значимым признаком является объем внутреннего воздушного пространства семени. Для наземных видов характерно наличие крупных веретеновидных семян с большим объемом внутреннего воздушного пространства, что играет важную роль при анемохории, для эпифитов и литофитов отмечены более короткие эллипсовидные семена с минимальным объемом внутреннего воздушного пространства. В типе семян Dendrobium подобной корреляции не выявлено;

4. Важным условием для получения полноценных семян в подсемействе Epidendroideae (кроме видов из трибы Vandeae и некоторых других) является наличие нескольких гетерогенных образцов генеративных растений в оранжерейных коллекциях;

5. Выявлен механизм автоопыления у шести видов орхидей, включающий несколько процессов: избыточную секрецию рыльца, разрастание или втягивание ткани рыльцевой поверхности, сгибание каудикул или пыльцевых масс по направлению к рыльцевой поверхности, отсутствие или растворение ростеллума и/или клинандриума, структурные модификации цветка;

6. Впервые выявлены особенности развития семян в плодах четырех редких видов орхидных (Paphiopedilum appletonianum, P. haynaldianum, Dendrobium cruentum и D. crumenatum) и оптимальные ранние сроки посева их незрелых семян в культуре in vitro. В среднем, время созревания их плодов сокращается на 30-50%;

7. Среда Thomale-м оказывает ретардантное действие на прорастающие семена и замедляет органогенез протокормов орхидных. Зародыши в семенах, культивируемых на данной среде, остаются живыми в течение 12-14 мес.;

8. Всхожесть семян орхидей после криосохранения путем прямого погружения в жидкий азот видоспецифична. Глубокое замораживание/оттаивание не оказывает достоверного отрицательного влияние на жизнеспособность и всхожесть криосохраненных семян в культуре in vitro.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шибанова H.JL, Антипина В.А. Коллекция тропических и субтропических орхидей ботанического сада ПГУ // Вестник Пермского университета, 2005, Вып. 6, С.34-36.

2. Антипина В.А. Особенности выращивания орхидей в условиях оранжереи // Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии: материалы студенческой конференции (Пермь, 11-15 апреля 2005 г). Сборник тезисов, С.4-6.

3. Антипина В.А, Тропические и субтропические виды орхидей в коллекции ботанического сада 111 У // Биология - наука XXI века: 10-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, (Пущино, 17 -21 апреля 2006 г). Сборник тезисов, С. 250.

4. Коломейцева Г.Л., Антипина В.А. Эффективность автоопыления и искусственного опыления тропических орхидных в оранжерейных условиях // Вестник Тверского Государственного Университета. 2007. № 7. С. 193 — 197.

5. Антипина В.А., Коломейцева Г.Л. Особенности опыления и семенного размножения эндемичной орхидеи Вьетнама Coelogyne mooreana ex situ // Биологический вестник, 2008, Т. 12, № 1, С. 66-69.

6. Антипина В.А., Коломейцева Г.Л. Размножение редких тропических орхидных in vitro II Биология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира: материалы II всерос. науч-практ. конф,, Волгоград, 1921 августа 2008 г / Под ред. A.C. Демидова; Отд. биол. наук РАН, Сов. бот. садов России [и др.]. - Белгород: Изд-во БелГУ, 2008. С. 29-33.

7. Антипина В.А., Шелейковский В.Л., Коломейцева Г.Л. Тропические орхидные в банке in vitro II Биология - наука XXI века: 12-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, (Пущино, 10-14 ноября 2008 г). Сборник тезисов, С. 193-194.

8. Никишина Т.В., Попов A.C., Антипина В.А. Криоколлекция семян тропических орхидей в ИФР РАН // Биофизика живой клетки: материалы XIX совещания «Консервация генетических ресурсов» (Пущино, 28-30 октября 2008 г), Сборник тезисов, Т. 9, С. 95.

9. Антипина В.А., Коломейцева Г.Л. Динамика развития семян и выявление ранних стадий прорастания двух видов из рода Paphiopedilum Pfitzg. (Orchidaceae Juss.) II Фундаментальные и прикладные исследования в биологии: материалы I Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (23-26 февраля 2009 г, г. Донецк). Т.1. Донецк, 2009. С. 10-11.

Ю.Антипина В.А., Прямкова Е.Ю., Шелейковский В.Л., Коломейцева Г.Л. Оптимизация генеративного размножения Dendrobium cruentum (Orchidaceae Juss.) в оранжерейной культуре // Сохранение биоразнообразия тропических и субтропических растений: материалы международной научно-практической конференции (Киев, 10-13 марта, 2009 г). Киев: НБС НАНУ, 2009. С. 142-145.

П.Антипина В.А., Коломейцева Г.Л. Автоопыление у оранжерейных орхидных // Сохранение биоразнообразия тропических и субтропических растений: материалы международной научно-практической конференции (Киев, 10-13 марта, 2009 г). Киев: НБС НАНУ, 2009. С. 138-141.

12.Антипина В.А., Коломейцева Г.Л., Никишина Т.В., Попов A.C. Криосохранение семян редких тропических и субтропических орхидных // В ¡сник Кшвського нащонального ушверситету iMem Тараса Шевченка. КиТв, 2009, С. 89-91.

13.Антипина В.А., Коломейцева Г.Л. Эффективность опыления тропических орхидных ex situ // Экспериментальные основы интродукции декоративных растений. М., 2009. Вып. 1. С. 142-145.

14. Антипина В. А., Коломейцева Г. Л., Никишина Т.В., Попов A.C. Криосохранение семян Dendrobium cruentum - тропической орхидеи из первого Приложения CITES // 1нтродукщя, селекщя та захист рослин: матер1али Друга м1жнародно1 науково!' конференцп (м. Донецьк, 6-8 жовтня 2009 р.) Донецьк, 2009. Т. 1. С. 41-47.

15.Антипина В.А., Коломейцева Г.Л. Морфометрия семян видов рода Paphiopedilum Pfitzg. (Orchidaceae Juss.) в связи с их систематикой и экологией // Труды международной конференции по морфологии растений, посвященной памяти И.Г. и Т.И.Серебряковых. Т.1. М.: Ml 11 У, 2009. С. 2731.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 19.11.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,1 Печать авторефератов: 730-47-74,778-45-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Антипина, Виолетта Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ОСОБЕННОСТИ РЕПРОДУКТИВНОЙ БИОЛОГИИ ОРХИДНЫХ

1. Фенология и особенности опыления орхидей.

1.1. Цветок орхидных: морфология и терминология.

1.2. Цветение орхидей в природе и в условиях интродукции.

1.3. Естественное и искусственное опыление тропических и субтропических орхидей.

2. Автоопыление в семействе орхидных.

3. Проращивание незрелых семян in vitro и некоторые аспекты эмбриологии орхидных.

4. Плоды орхидей и морфологическая классификация семян орхидных.

5. Особенности проращивания зрелых семян орхидных и возможности создания банка протокормов in vitro.

5.1. Асимбиотическое проращивание зрелых семян орхидных.

5.2. Перспективы и возможности создания банка семян и протокормов орхидных in vitro.

6. Криосохранение редких и исчезающих видов орхидей и создание банков зародышевой плазмы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Характеристика использованных методик.

2. Характеристика объектов исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 1. Особенности цветения и искусственного опыления тропических и субтропических орхидных в оранжерейных условиях.

1.1. Подсемейство Cypripedioideae Kostel.

1.2. Подсемейство Orchidoideae Eaton.

1.3. Подсемейство Epidendroideae Lindl.

ГЛАВА 2. Автоопыление у оранжерейных орхидных.

ГЛАВА 3. Динамика развития семян и выявление ранних стадий их прорастания у некоторых редких видов орхидных.

ГЛАВА 4. Особенности строения плодов и семян орхидных. Жизнеспособность зрелых семян.

4.1. Особенности строения и сроки созревания плодов орхидей.

4.2. Морфоструктура зрелых семян орхидных в связи с экологической и таксономической принадлежностью.

4.3. Жизнеспособность зрелых семян орхидных и особенности их асимбиотического проращивания.

ГЛАВА 5. Вегетативные диаспоры орхидных в условиях длительного хранения.

5.1. Создание банка протокормов орхидных in vitro.

ГЛАВА 6. Генеративные диаспоры орхидных в условиях криосохранения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности формирования банка вегетативных и генеративных диаспор орхидных для длительного хранения"

Коллекция тропических и субтропических орхидных (Orchidaceae Juss.) Фондовой оранжереи ГБС РАН, на сегодняшний день, насчитывает 1120 видов, подвидов и форм из 222 родов, а также более 300 сортов и является самой представительной коллекцией орхидных в России (Демидов, Коломейцева, 2007).

В оранжерейных условиях имеется ряд трудностей, связанных с получением полноценных семян. Прежде всего, это ограниченное число образцов из разных популяций, представленных в коллекциях, а также нестабильность цветения. Как правило, семена орхидных получают с помощью искусственного опыления. Успешное перекрестное опыление предполагает наличие в коллекции генетически различных образцов и детальное изучение особенностей репродуктивной биологии (Буюн, 2009).

Успешность прорастания семян орхидных в асимбиотических условиях зависит, прежде всего, от степени развитости зародыша (или зародышей), наличия биологического и экологического покоя и др. Немаловажное значение имеет и строение семенной кожуры, ее плотность и скульптурность, наличие в ее клеточных стенках дубильных или иных веществ, ингибирующих прорастание (van Waes, Debergh, 1986; Коломейцева, 2005). Для снятия физиологического механизма торможения прорастания широко применяют методы предпосевной обработки семян (удаление ингибиторов путем длительного вымачивания зрелых семян), оптимизации питательных сред и условий содержания сеянцев, однако наиболее эффективен посев незрелых семян в асимбиотической культуре по методике «green pod culture» (Tsuchiya, 1954; Sauleda, 1976). Культивирование незрелых семян позволяет не только повысить их всхожесть, но и существенно сократить срок созревания (Withner, 1955; Arditti et al, 1982; Rasmussen, 1995).

Немногочисленные исследования по криоконсервации семян представителей семейства орхидных свидетельствуют о том, что, благодаря особенностям структуры, семена этих растений являются идеальным объектом для криосохранения, поскольку не требуют криопротекторов и сложных методов защиты от повреждающего действия сверхнизких температур (Pritchard, 1984; Никишина и др., 2001, 2003).

Альтернативой длительному хранению вегетативных и генеративных диаспор орхидных в жидком азоте является создание банка протокормов в культуре in vitro, что особенно актуально в целях сохранения сортового разнообразия коллекций и массового (промышленного) размножения (Черевченко и др., 2009).

Актуальность настоящих исследований обусловлена и тем, что все представители семейства орхидных включены в списки редких и исчезающих видов растений, в частности, в Международную Красную книгу и Приложения I и II к Конвенции о международной торговле видами дикой флоры и фауны, находящимися под угрозой исчезновения (IUCN, 1994, 2001; CITES, 1995, 1997, 2001).

Цель исследования: Выявление специфики развития генеративных структур редких видов орхидных и оптимизация способов длительного хранения их семян и протокормов.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности цветения и искусственного опыления орхидных в оранжерейной культуре;

2. Выявить механизмы автоопыления;

3. Оптимизировать генеративное размножение редких видов орхидных;

4. Оценить жизнеспособность и изучить морфологические особенности семян;

5. Вывить экологическую дифференциацию семян видов из родов Paphiopedilum Pfitz. и Dendrobium Sw.;

6. Разработать методы длительного хранения протокормов in vitro\

7. Оценить возможность использования зрелых семян для криосохранения орхидей.

Научная новизна исследований:

Впервые изучены особенности искусственного опыления и выявлено многообразие по степени перекрестноопыляемости у орхидных в оранжерейной культуре. Изучены механизмы автоопыления и выявлены различия их проявления у разных образцов одного вида. Выявлены особенности и динамика развития семян в плодах 4 редких видов орхидных. Впервые проведено сравнительно-морфологическое изучение семян 95 видов и внесены уточнения в разработанную R.Dressler (1993) классификацию типов семян орхидных. Выявлена корреляция между морфометрическими показателями семян и принадлежностью видов к разным экологическим группам. Впервые установлены сроки созревания плодов 95 видов орхидных в оранжерейных условиях. Получены данные о высокой криоустойчивости семян 5 видов орхидей при прямом погружении в жидкий азот и показаны различия в методах оценки жизнеспособности криосохраненных семян. Практическая значимость работы:

1. Криобанк семян орхидных пополнен 85 видами; разработаны паспорта семян, хранящихся в жидком азоте;

2. Создан банк протокормов in vitro, включающий 38 видов;

3. Установлены оптимальные схемы скрещивания 120 видов тропических и субтропических орхидных;

4. Определены наиболее ранние оптимальные сроки посева незрелых семян

4 редких видов;

5. Произведен посев семян 95 видов орхидей на питательные среды в культуре in vitro;

6. Разработана безгормональная питательная среда, ингибирующая прорастание и органогенез протокормов орхидных в целях их длительного хранения.

Полученные данные могут быть полезны для уточнения спорных вопросов систематики и филогении, в селекционной практике, а также при дальнейшей работе по созданию банка семян и протокормов орхидных.

Апробация работы. Основные положения диссертации изложены на студенческой конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии» (Пермь, 2005 г), 10-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006 г), VIII Международной конференции «Охрана и культивирование орхидей» (Тверь, 2007 г), XVI Международной научной конференции «Роль ботанических садов в изучении онтогенеза интродуцированных растений» (Харьков, 2008 г), II Всероссийской научно-практической конференции «Биология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград, 2008 г), 12-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008 г), международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии» (Донецк, 2009 г), международной научно-практической конференции «Сохранение биоразнообразия тропических и субтропических растений» (Киев, 2009 г), VIIv международной конференции по морфологии растений, посвященной памяти И.Г. и Т.И.Серебряковых (Москва, 2009 г), ученых советах ГБС РАН.

Научные публикации по теме диссертации. По материалам исследований опубликовано 15 научных работ (10 статей, 5 тезисов докладов), в которых отражено основное содержание диссертационной работы. Одна статья опубликована в рецензируемом научном журнале.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 360 страницах печатного текста, состоит из введения, литературного обзора, 6 глав, заключения, выводов, библиографического списка (369 наименований, в том числе 272 на иностранных языках), приложения. Диссертация иллюстрирована 87 рисунками, включая фотографии, и содержит 25 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Ботаника", Антипина, Виолетта Анатольевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При интродукции в условия защищенного грунта полный цикл онтогенеза проходят не все тропические растения. Одними из них являются представители семейства орхидных, связанные с окружающей средой сложными биотическими взаимоотношениями.

В ходе проведенных исследований выявлено, что наиболее эффективным способом опыления тропических и субтропических орхидей является перекрестное опыление (68,6%), для осуществления которого необходимо наличие в коллекции нескольких генетически различных образцов растений одного вида, интродуцированных из разных естественных популяций. Степень и проявление реакции самонесовместимости видоспецифичны: отсутсвие самонесовместимости обнаружено у видов из подсемейств Cypripedioideae и Orchidoideae, тогда как в подсемействе Epidendroideae выявлены три группы по степени проявления этой реакции: 1) отсутсвие самонесовместимости {Sobralia, Flickingeria, Cattleya, Epidendrum, большинства видов из трибы Vandeae, Cymbidium, Lemboglossum, Osmoglossum, виды из подтрибы Zygopetalinae, Peristeria, Stanhopea); 2) наличие строгой самонесовместимости (большинство видов Coelogyne, Bulbophyllum, Brassia, Rodriguezia, виды из подтрибы Maxillariinae), при этом эффективность перекрестного опыления составила от 32 до 100%. 3) частичная самонесовместимость {Dendrobium (14 видов из 27 проявляли строгую самонесовместимость, у остальных видов ЭИО колебалась от 33 до 100%), Encyclia, Oncidium, Miltonia).

В Фондовой оранжерее ГБС РАН часть видов тропических и субтропических орхидей регулярно образует плоды и жизнеспособные семена посредством автоопыления. На примере шести экспериментальных видов показано, что механизм автоопыления сложен и включает в себя несколько процессов, из которых наиболее распространенными являются избыточная секреция рыльца и отсутствие или растворение ростеллума. Автоопыляемые виды самостоятельно проходят большой жизненный цикл онтогенеза в оранжерейных условиях, и их семена способны успешно прорастать, вступая в симбиоз с оранжерейными грибами.

Несмотря на то, что только небольшой процент семян тропических орхидей содержат ингибиторы прорастания, а их семена на искусственных агаризованных средах прорастают сравнительно легко, мы рекомендуем оптимизировать генеративное размножение редких видов путем посева незрелых семян, поскольку длительное вынашивание плодов ослабляет растения.

Выявлено, что особенности развития семян в плодах четырех редких видов орхидей {Paphiopedilum appletonianum, P. haynaldianum, Dendrobium cruentum и D. crumenatum) во многом сходны. Клетки семенной кожуры в процессе развития отмирали и накапливали ингибиторы прорастания, зародыш увеличивался в размерах вплоть до окончания срока созревания плода. При этом всхожесть семян по мере их созревания уменьшалась и имела минимальное значение у наземных видов рода Paphiopedilum (2-5%), тогда как у эпифитных видов рода Dendrobium к моменту полного созревания плода она составила 65-75%. Наиболее ранние оптимальные сроки посева незрелых семян в асимбиотической культуре in vitro соответствуют 3 мес. после опыления у Dendrobium cruentum, 2 мес. после опыления у D. crumenatum, 5-6 мес. после опыления у Paphiopedilum appletonianum и 3,5 мес. после опыления у Р. haynaldianum, что составило 50-70% от полного срока созревания их плодов.

Срок созревания плодов экспериментальных видов варьировал в широких пределах: от 1 мес. (Stenorrhynchus speciosum) до 29,5 мес. (Coelogyne trinervis)., В зависимости от срока их созревания выделяли 5 групп: от 1 до 3 мес. (9 видов), от 3,5 до 6 мес. (24 вида), от 6,5 до 9 мес. (37 видов), от 9,5 до 12 мес. (15 видов) и более 12 мес. (10 видов), что составило 9%, 25%, 39%, 16% и 11% от общего числа видов соответственно. При этом некоторое число видов орхидных в оранжерейных условиях образовывали плоды, содержащие нежизнеспособные семена (без зародыша) или плоды, не содержащие семян.

Сравнительно-морфологический анализ полученных семян орхидей показал, что они относятся к 11 типам и 1 подтипу, в соответствии с К.Вгеэзкг (1993): тип Оооёуега (1 вид); тип Ышоёогиш (22 вида); тип Ер1ёепёгиш (5 видов); тип Р1еигоШаШ8 (1 вид); тип БепёгоЬшш (32 вида); тип Еи1орЫа (1 вид); тип В1ейа (1 вид); тип СутЫсНит (4 вида); тип МахШапа (9 видов); тип МахШапа, подтип СЬопёгогЬупсЬа (2 вида); тип 81апЬореа (1 вид); тип Уапёа (14 видов). Два вида (МШота эреМаМШ и ОпЫсИит \ongipes) отнесены к переходному типу Уапс1а-МахШапа.

При сравнительно-морфологическом изучении семян, относящихся к типам 1лтос1огит, Оооёуега, Еи1орЫа, В1ейа, СутЫсИит и МахШапа выявлена корреляция между морфометрией семян и их экологической и систематической принадлежностью, при этом наиболее значимым признаком, на наш взгляд, является внутренний объем воздушного пространства. Для наземных видов характерно наличие крупных веретеновидных семян с большим объемом воздушного пространства внутри семени, что играет важную роль при анемохории, тогда как для эпифитов и литофитов отмечены более короткие эллипсовидные семена с минимальным объемом внутреннего воздушного пространства.

Для большинства изученных типов семян не выявлено корреляции между способом опыления и процентом неполноценных семян: высокий процент семян, не имеющих зародыша, отмечен в плодах, полученных как в результате перекрестного опыления, так и в результате различных способов самоопыления. Доля беззародышевых семян в плодах автоопыляемых видов колебалась от 0,1 до 35%. <

В ходе проведенного анализа были внесены уточнения и дополнения в разработанную классификацию семян орхидных: уточнены размеры семян в типах вооёуега, Ытоёогит, ОепёгоЫит и МахШапа, а также выделены две основные формы у семян, принадлежащих к последним трем типам -эллипсовидная и веретеновидная.

Микосимбиотрофизм орхидных предопределил развитие в их плодах большого количества семян микроскопического размера, в связи с этим, технология их проращивания имеет специфические особенности. Максимальная скорость прорастания характерна для семян, относящихся к типам Dendrobium, Cymbidium, Epidendrum, Bletia и Stanhopea, а наиболее длительным периодом прорастания характеризовались виды, семена которых относятся к типам Vanda, Eulophia, Maxillaria (Chondrorhyncha var.), Pleurothallis, Limodorum и Goodyera. Медленно прорастающие семена имели плотную, как правило, окрашенную семенную кожуру, в клеточных стенках которой содержались ингибиторы прорастание.

С целью замедления прорастания семян и приостановки органогенеза протокормов орхидных создан банк протокормов in vitro, путем оптимизации химического состава питательных сред и условий культивирования. При заданных климатических режимах, в том числе при комнатной температуре и 16-ти часовом фотопериоде, разработанная безгормональная среда Thomale-м оказывала ретардантное действие на прорастание семян и органогенез протокормов орхидных. Зародышы в семенах, культивируемых на этой среде, оставались живыми в течение 12-14 мес. (у видов Cymbidium erythrostylum, Dendrobium crumenatum, D. hercoglossum и Cleisostoma birmanicum). При пересадке протокормов Dendrobium bullenianum с питательной среды Thomale-м на среду Knudson наблюдали восстановление нормального роста и развития.

Семена орхидей имели высокую криоустойчивость и были успешно криосохранены путем прямого погружения в жидкий азот без криопротекторов и сложных методов защиты от повреждающего действия сверхнизких температур. В результате проведенных исследований, криобанк семян тропических и субтропических орхидных пополнен 85 образцами, на каждый из которых разработаны специальные паспорта.