Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка вариабельности ДНК-маркеров в каллусной ткани пшеницы (Triticum aestivum L.) после криосохранения

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Оценка вариабельности ДНК-маркеров в каллусной ткани пшеницы (Triticum aestivum L.) после криосохранения"

На правах рукописи

СОЛОВЬЕВА Александра Ивановна

Оценка вариабельности ДНК-маркеров в каллусной ткани пшеницы (ТгШсит аеьйчит Ь.) после криосохранения

03.01.05 ~ физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2011

1 9 МАЙ 2011

4847106

Работа выполнена в лаборатории генетики культивируемых клеток и группе криосохранения Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва.

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Долгих Юлия Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Лось Дмитрий Анатольевич

доктор биологических наук

Веселова Татьяна Владимировна

Ведущая организация:

Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН, г. Москва

Защита состоится «24» мая 2011 г. в 11 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Учреждении Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35.

Факс: (495) 977 8018, электронная почта: m-azarkovich@ippras.ru; ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан « » апреля 2011г.

Ученый секретарь : ,.■-.•.-■

совета по защите докторских ■ -

и кандидатских диссертаций

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время хранение культивируемых in vitro тканей растений при температуре жидкого азота (-196°С) рассматривается как самый надежный способ долговременного сохранения генетических ресурсов. Криогенное хранение позволяет снизить до минимума потерю ценных образцов и сократить материальные затраты на поддержание коллекций (Engelmann, 2004; Pañis, Lambardi, 2005). Вместе с тем, криосохранение - сложная, многостадийная процедура, включающая подготовку клеток, дегидратацию, замораживание в жидком азоте и восстановление тканей, в ходе которых клетки испытывают стресс и в результате могут возникать генетические изменения. Существующие данные о влиянии замораживания в жидком азоте на геном культивируемых тканей растений довольно противоречивы. Во многих работах показана генетическая стабильность объектов после криосохранения (Harding, 2004; Pañis, Lambardi, 2005), однако в ряде исследований были выявлены изменения последовательностей ДНК. Результаты этих работ позволяют говорить о возможности появления модификаций генома в ходе процедуры криогенного хранения, но до сих пор не ясно какие именно этапы криосохранения могут оказывать дестабилизирующее влияние на генотип.

При криосохранении растительного материала весьма перспективно применение метода дегидратации, поскольку он позволяет исключить использование дорогостоящих программных замораживателей, а также криопротекторов, обладающих токсичностью и способных оказывать дестабилизирующее воздействие на геном растений (Aronen et al., 1999; Kaity et al., 2008). Было целесообразно оценить возможность использования данного метода для сохранения в жидком азоте каллусных тканей яровой пшеницы (Triticum aestivum L.).

Воздействие отдельных этапов криосохранения с помощью метода дегидратации на генетическую стабильность тканей и органов растений, культивируемых in vitro, не было изучено. Между тем это имеет огромное значение при выборе способа сохранения растительных тканей. Все это явилось основанием для проведения нами работы в данной области.

Цель и задачи работы. Целью диссертационной работы было изучение влияния отдельных стадий процедуры криосохранения каллусов мягкой яровой пшеницы (Triticum aestivum L.), выполненного методом дегидратации, на

стабильность ДНК восстановленного растительного материала.

В связи с этим был поставлен ряд задач:

1. Выбрать ДНК-маркеры для оценки генетического полиморфизма и осуществить подбор условий для проведения ПЦР.

2. Получить исходный растительный материал, однородный по ряду ДНК-маркеров.

3. Оценить влияние отдельных этапов процедуры криосохранения на жизнеспособность и морфогенетический потенциал каллусов яровой пшеницы.

4. Определить уровень изменчивости ДНК-маркеров каллусов и полученных из них растений-регенерантов после каждого из этапов криосохранения.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые показано, что каллусы яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) способны восстанавливать свой рост после криосохранения по протоколу дегидратации. Проанализировано влияние отдельных этапов криосохранения с помощью метода дегидратации на генетическую стабильность, жизнеспособность и морфогенетический потенциал культивируемых тканей.

Единичные изменения генома, частота которых была менее 1%, обнаружены после этапа дегидратации. Остальные стадии криосохранения не вызывали изменения ДНК-маркеров. У растений, регенерированных из каллусов после каждого из этапов криосохранения, не выявлено вариаций генома.

Показана высокая степень выживаемости каллусов яровой пшеницы после криосохранения использованным методом. Уменьшение морфогенетической способности культивируемых тканей наблюдали после этапа дегидратации, однако восстановленные как после всей процедуры, так и после отдельных этапов криосохранения каллусы сохраняли способность к регенерации растений.

Низкая вероятность появления вариаций генома. при криосохранении растительного материала по исследованному протоколу дегидратации указывает на перспективность этого метода для сохранения ценных клеточных линий.

Апробация результатов работы. Материалы диссертации были представлены на X Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Звенигород, 2008), Всероссийской школе-конференции

молодых ученых "Методы культивирования клеток" (Санкт-Петербург, 2008), VII Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток" (Звенигород, Москва, 2009), III Всероссийской научно-практической конференции "Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира" (Волгоград, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из которых 3 в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 106 страницах машинописного текста, включает 15 таблиц, 4 схемы и 21 рисунок. Список литературы содержит 235 источников, из которых 217 на иностранном языке.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования - растения и культивируемые ткани яровой пшеницы трех сортов: Энита, Новосибирская 22 и Кинельская 59.

Каллус получали из оснований листьев недельных проростков, незрелых зародышей, собранных на 14 день после опыления, и зрелых зародышей, разрезанных на несколько частей. Для индукции и культивирования каллусных тканей использовали среду Мурасиге-Скуга (Murashige, Skoog, 1962), дополненную 2 мг/л 2,4-Д, 3% сахарозы, 7% агара (среда МС-И). Индукцию каллусообразования проводили в течение трех недель в темноте при температуре 26±2°С, Дальнейшее культивирование тканей проходило в стандартных условиях: 26±2°С и освещении (16 ч/сут, 2-3 клк).

Растения-регенеранты образовывались на среде МС-И, их пересаживали на среду МС без гормонов, культивировали в стандартных условиях.

При определении способности к образованию морфогенных каллусов анализировали по 20-90 эксплантов на вариант опыта, опыт проводили в двух повторностях.

Криосохранение каллусов проводили с помощью метода дегидратации, по протоколу, разработанному в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева

РАН для криосохранения Fragaria х ananassa (Высоцкая и др., 2007а) и модифицированному нами (Соловьева и др., 2010). Схема криосохранения каллусов представлена на Рис. 1.

Культивирование каллусов

на среде МС-И *

10 сут на свежей среде МС-И т "

10 сут на свежей среде МС-И

♦ -

Предкультивирование 48 ч на среде Д*

в темноте при 22 °С *

Дегидратация 4 ч в стерильном потоке

воздуха ламинар-бокса *

1 ч в жидком азоте (~196°С) ♦

Оттаивание в водяной бане при 20°С

Регидратация, восстановление роста:

7 сут на МС-И в темноте при 26±2°С *

Культивирование на МС-И на свету (2-3 клк, 16 ч/сут) при 26±2°С

Рис. 1. Схема криосохранениия каллусов. ♦Среда Д - среда МС, дополненная 0.8 М сахарозы, 0.7% агара и регуляторами роста

(Высоцкая и др., 2007а).

Оценка восстановления каллусных тканей после отдельных стадий криосохранения. Для определения влияния предварительного культивирования, высушивания и замораживания-оттаивания ... на . жизнеспособность и морфогенетический потенциал растительного материала по окончании каждого этапа часть каллусов отсаживали и продолжали культивировать на среде МС-И. После 21 дня культивирования тканей на свету жизнеспособность образцов определяли визуально по числу каллусов, возобновлявших свой рост на питательной среде МС-И. ...

Определение содержания воды. Содержание воды в образцах определяли после их высушивания при температуре 104°С до постоянного веса и выражали в процентах от исходной массы каллусов.

Оценка способности каллусных тканей к морфогенезу. Частоту морфогенеза (отношение числа морфогенных каллусов к числу выживших каллусов) определяли

через 21 сут культивирования образцов из разных вариантов на свету.

Молекулярный анализ ДНК. Из проб растительного материала весом 50 мг выделяли ДНК по СТАВ методике (Moller et al., 1992). Полиморфизм ДНК оценивали двумя ПЦР-методами - ISSR и REMAP, с помощью праймеров, комплементарных микросателлитным последовательностям и именуемых Ml - М7, а также их комбинаций с праймерами, комплементарными различным LTR-последовательностям ретротранспозонов пшеницы, именуемых Wis, Таг, Tager и Thv 19 (Queen et al., 2004). Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 2%-м агарозном геле в ТВЕ-буфере.

Анализ ДНК фрагмента. Полиморфные ПЦР-фрагменты препаративно выделяли из агарозного геля и очищали с использованием набора "Выделение ДНК из агарозных гелей на GlassMilk" (Силекс, Россия). Далее фрагмент клонировали в "Т-векторе" с использованием набора "pGEM-T Vector System" (Promega, USA). Выделение плазмиды из E.coli JM109 осуществляли с помощью набора реактивов "Wizard Plus Minipreps DNA Purification System" (Promega, USA). Секвенирование ДНК проводили в Межинститутском Центре коллективного пользования "ГЕНОМ" ИМБ РАН. Для полиморфного фрагмента был осуществлен поиск сходных ДНК последовательностей с помощью программы (BLAST) по базам данных GenBank T1GR (Wheat Home) и Rice Genome Annotation Project на период сентябрь 2010 года.

Статистическая обработка данных. Достоверность отличий оценивали по t-критерию F-критерию Фишера при Р=0.95. Для результатов опытов, включавших в себя повторности, рассчитано среднее квадратичное отклонение (Плохинский, 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для исследования влияния криосохранения на генетическую стабильность растительного материала нужно было провести ряд предварительных опытов с целью выбора праймеров, обеспечивающих регистрацию полиморфизма, проверки генетической однородности исходного материала, пригодности выбранного метода криосохранения для каллусов яровой пшеницы.

Выбор и характеристика праймеров

Учитывая низкую вероятность возникновения изменений в геноме в ходе процедуры криосохранения, в качестве маркеров для оценки изменчивости ДНК

восстановленного растительного материала были выбраны широко распространенные в геноме повторяющиеся последовательности, обладающие высокой изменчивостью: микросателлиты и ретротранспозоны.

На основании этих последовательностей были выбраны два ПЦР-метода: ISSR и REMAP. Первый метод позволяет находить изменения геномных последовательностей между микросателлитными повторами (Zietkiewicz et ah, 1994). REMAP-метод основан на амплификации участков ДНК между внутренней частью последовательности концевого повтора ретротранспозона (LTR) и микросателлитом (Kalendar et al., 1999).

Для оценки полиморфизма ДНК-маркеров нужно было выбрать наиболее информативные пары праймеров и подобрать условия проведения полимеразной цепной реакции.

Чтобы подобрать температуру отжига и выбрать праймеры для исследования проводили ПЦР с каждым праймером/комбинацией праймеров и двумя образцами ДНК пшеницы, которые были выделены из случайно отобранных проб каллусов. Ориентировочную температуру отжига для каждого праймера определяли по формуле:

Отжига = 4(G+C)+2(A+T),

где G-число оснований гуанина; С-число оснований цитозина; А-число оснований аденина; Т-число оснований тимина в последовательности праймера.

Помимо расчетной температуры отжига использовали еще два-три значения для каждого из семи микросателлитных праймеров и их комбинаций с четырьмя LTR-праймерами. В результате были подобраны температуры отжига, при которых в ходе амплификации происходил синтез наибольшего числа хорошо различимых фрагментов. Значения этих температур сильно варьировали между праймерами и их комбинациями (Табл. 1).

На основании проведенного анализа отобрали шесть наиболее информативных вариантов, т.е. праймеров, в результате ПЦР с которыми амплифицировалось максимальное количество хорошо различимых фрагментов. К ним относятся две микросателлитных последовательности - М4 и Мб, а также комбинации праймеров Wis+M4, Wis+M6, Таг+М1 и Tar+M6.

Таблица 1. Температуры отжига и число ампликонов, полученные с праймерами и их комбинациями, выбранными для и ИЕМАР-анализа образцов пшеницы

Праймер Температура отжига,°С Число ампликонов

^БЯ-анализ

М4 55 7

Мб 64 8

ЯЕМАР-анализ

\Ук+М4 56 15

ХМя+Мб 60 9

ТагМ1 58 10

Таг+Мб 59 9

Оценка генетической однородности растений трех сортов яровой пшеницы

Для выявления возможных изменений генома, возникающих именно в результате криосохранения, необходим генетически однородный материал. ПЦР-анализ ДНК, выделенной из 9-10 растений каждого сорта, с выбранными праймерами показал генетическую гетерогенность использованных сортов (Рис.2). При этом полиморфизм ряда маркеров был обнаружен не только у сорта КинелЬская 59, отдельные растения которого имели признаки, отклоняющиеся от сортового описания, но и у внешне однородных сортов Энита и Новосибирская 22.

Следовательно, перед проведением исследования влияния отдельных этапов криосохранения на стабильность растительного материала, необходимо было получить линии растений, однородных по всем выбранным ¡ББЯ- и 11ЕМАР-маркерам.

Помимо генетической неоднородности исходного материала данный анализ показал возможность выявления молекулярно-генетического полиморфизма у мягкой пшеницы с помощью использованных праймеров.

п. и. К- М 12 3-15678 9

'ШШШМЩ Ий- : •

200—

* ^ Ш. *4 ' 100— * • ".'■'*

"■Ш 35 'Ш ШШ •

Рис, 2. ЯЕМАР-профили растений яровой пшеницы сорта Новосибирская 22 (1-9), полученные с комбинацией праймеров Таг+М1.

К- - отрицательный контроль, М - маркер молекулярного веса. Стрелками указаны полиморфные маркеры.

Выбор объекта исследования

Для выбора объекта нашего исследования была проанализирована способность к образованию морфогенных каллусов тремя видами эксплантов, взятых от растений пшеницы сортов Энита, Новосибирская 22 и Кинельская 59 (Рис. 3).

Из оснований листьев семидневных проростков у сортов Энита и Кинельская 59 образование морфогенного каллуса происходило с высокими частотами, однако на данном типе эксплантов у сорта Новосибирская 22 каллусная ткань, способная к морфогенезу, не образовывалась.

Самая высокая частота образования способных к морфогенезу каллусов из фрагментов зрелых зародышей была отмечена у сорта Новосибирская 22. Для других двух сортов она оказалась невысокой.

Доля незрелых зародышей, из которых образовывались каллусы, способные к морфогенезу, у сорта Кинельская 59 была максимальной, у сорта Новосибирская 22 данный показатель был несколько меньше. Для сорта Энита доля эксплантов, формирующих морфогенные каллусы, была одной из самых низких.

Таким образом, проанализированные сорта пшеницы различались по способности к формированию морфогенных каллусов из различных эксплантов.

| I Энита

ь».1,»-1 Новосибирская 22

и г 7 л Кинельская 59

Рис. 3. Частота образования морфогенных каллусов на разных типах эксплантов у трех сортов яровой пшеницы.

Для получения каллусов пшеницы чаще других видов эксплантов используют незрелые зародыши, однако работа с ними ограничена весенне-летним периодом. Кроме того, их применение связано с рядом трудностей: сложностью получения материала одного возраста и нежелательным прорастанием зародышей. Основания листьев и фрагменты зрелых зародышей более удобны, поскольку их использование возможно в течение круглого года и частота прорастания значительно ниже. При ограниченном количестве семян применение в качестве источника получения каллусных тканей фрагментов зрелых зародышей более обосновано, чем оснований листьев, потому что в первом случае из одной зерновки можно получить три-четыре экспланта, а во втором только один-два.

Из соображений удобства и доступности в течение круглого года в качестве эксплантов для получения каллусной ткани, обладающей способностью к морфогенезу, для нашего исследования были выбраны фрагменты зрелых зародышей. Поскольку с наибольшей частотой такие каллусы образовались у сорта Новосибирская 22 он и был выбран в качестве объекта исследования.

Исследование стабильности растительного материала после криосохранения методом дегидратации

Ввиду того, что анализ исследуемых сортов показал их неоднородность, перед проведением исследования влияния криосохранения на генетическую стабильность растительного материала на базе сорта Новосибирская 22 был получен

3 ? 2

* ¡5

8. £

ю е?

е к

£ *

о а

= =

Щ 5

= ь

80

60

40

Е. 20

—

1 |

— 1 |

основания фрагменты незрелые листьев зрелых зародыши зародышей

ряд самоопыленных линий, каждая из которых являлась потомством одного растения.

Из фрагментов зрелых зародышей нескольких самоопыленных линий были инициированы каллусы, которые подвергли криосохранению. Анализ влияния стадий криосохранения на генетическую стабильность растительного материала включал две серии опытов.

Первая серия опытов

В рамках первой серии опытов каллусы яровой пшеницы линий Нв8, Нв9, Нв14 и Нв16 подвергали последовательным этапам криосохранения. По окончании каждого этапа часть каллусов продолжали культивировать на среде МС-И для анализа восстановления роста тканей и их способности к морфогенезу. Генетическую стабильность каллусов оценивала после 7, 14 и 28 дней культивирования. Оставшаяся после отсаживания часть каллусной ткани переходила на следующий этап криосохранения. Схема криосохранения и отбора проб первой серии опытов представлена на Рис. 3.

Оценка генетической однородности исходного материала. ПЦР-анализ показал, что пробы ДНК каллусных тканей были идентичны по всем 18511- и НЕМАР-маркерам внутри каждой линии. На Рис. 4 приведены ЯЕМАР-профили проб исходных каллусов линии Нв16.

Рис. 4. ЯЕМАР-профили контрольных проб каллусов {1-8) самоопыленной линии Нв16 с праймерами \\^з+М4. М - маркер молекулярного веса; К- - отрицательный контроль.

М I 2 ) 4 $ 6 ? К-

• . е . I - г . - г ' ■• £ : - „..'л

ЛООО -1000

200 ■ 100

Рис. 3. Схема криосохранения каллусов пшеницы и отбора проб ДНК в первой серии опытов.

К - контрольные пробы каллусов, которые не подвергали обработкам; пробы каллусов инкубированные на среде МС-И в течение недели в темноте при 26°С: 7ПК - после предкультивирования на среде Д; 7ДГ - после предкультивирования, высушивания, и регидратации; 730 - после полной процедуры криосохранения. 14ПК, 14ДГ, 1430 - пробы растительного материала через 7 дней после соответствующего воздействия и переноса тканей на свет; 28ПК, 28ДГ, 2830 - через 21 день после соответствующего воздействия и переноса тканей на свет.

Содержание воды в тканях перед замораживанием в жидком азоте. Оводненность растительного материала перед замораживанием является крайне важным показателем, от него в значительной степени зависит восстановление тканей после криосохранения. Поэтому перед погружением в жидкий азот в части каллусов было определено содержание воды. Каллусы самопыленных линий достоверно не отличались друг от друга по содержанию воды. Перед замораживанием в жидком азоте оно составляло 13.5-18%.

Восстановление камусов четырех самоопыленных линий после криосохранения. Отдельные воздействия протокола дегидратации не оказывали существенного влияния на возобновление роста образцов. Оно происходило с высокой частотой (Табл. 2).

Таблица 2. Восстановление роста и морфогенетическая способность каллусов четырех самоопыленных линий после этапов криосохранения

Вариант Линия Число Доля каллусов, %

каллусов Растущих* Способных к морфогенезу **

Культивирование in vitro Нв8 110 100 1.7

(контроль) Нв9 80 100 20.3

Нв14 98 100 54.1

Нв16 75 100 68.0

Предкультивирование Нв8 120 87.4 0

Нв9 132 92.8 15.2

Нв14 124 95.7 49.2

Нв16 78 92.0 62.8

Дегидратация Нв8 137 86.7 0.7

Нв9 70 83.8 0

Нв14 74 95.2 28.4

Нв16 36 92.0 . 16.7

Замораживание- Нв8 140 81.1 0

оттаивание Нв9 70 88.9 1.4

Нв14 76 91.8 26.3

Нв16 38 88.6 10.5

* Нет достоверных отличий доли растущих каллусов после каждого из этапов криосохранения при Р=0.95.

** Снижение доли способных к морфогенезу каллусов линий Нв9, Нв14 и Нв16 после этапа дегидратации достоверно при Р=0.95..

Слабое снижение жизнеспособности, которое составило 4-13%, было отмечено после предкультивирования каллусов на среде с 0.8 М сахарозы, однако с вероятностью 0.95 оно является недостоверным. Дегидратация и замораживание-оттаивание каллусов также не вызывали заметного снижения доли активно растущих

каллусов. Результаты данного опыта подтвердили отсутствие существенного влияния стадий криосохранения по протоколу дегидратации на жизнеспособность каллусных тканей яровой пшеницы. Доля каллусов, восстановивших свой рост после полной процедуры криогенного хранения, в данном опыте составила 88%. Этот показатель превысил максимальную из ранее достигнутых частоту выживания образцов, полученной Chen с соавт. на каллусах озимой пшеницы - 82% (Chen et ai, 1985).

Влияние стадий криосохранения на морфогенетическую способность тканей. Каллусы, принадлежащие к линиям, выделенным из одного сорта пшеницы, исходно отличались друг от друга по морфогенетической способности (Табл. 2). Это еще раз свидетельствует о неоднородности семенного материала сорта Новосибирская 22.

Из всех исследованных воздействий только после этапа дегидратации происходило существенное снижение морфогенетической способности каллусов трех из четырех линий: у линии Нв9 - до нуля, у линий Нв14 и Нв16 - в 1.7 и 1.5 раз соответственно. Вероятно, различия в степени снижения способности к морфогенезу тканей исследованных линий, связаны с неодинаковой устойчивостью генотипов к высушиванию.

Влияние отдельных этапов замораживания в жидком азоте на стабильность ДНК-маркеров в каллусных тканях. У трех из четырех исследованных линий ни один из этапов процедуры криосохранения не индуцировал полиморфизма фрагментов, амплифицированных с ISSR- и LTR-праймерами.

С помощью метода REMAP с комбинацией праймеров Wis+M4 только для каллусов линии Нв16 в двух пробах ДНК было отмечено появление новых маркеров размером около 90 п. н.: после этапа дегидратации (Рис. 5 - 7ДГ2) и после всей процедуры криосохранения (Рис. 5 - 730/). Поскольку для экспериментов использовали образцы каллусов, полученные из разных эксплантов одной линии, нельзя полностью исключить возможности присутствия в исходном материале фрагмента ДНК, обнаруженного у каллусов линии Нв16 после дегидратации и замораживания-оттаивания. Вместе с тем, происхождение каждой использованной линии пшеницы от однрго самоопыленного растения и проверка генетической однородности каллусов перед процедурой криосохранения должны существенно

уменьшать вероятность этого события. Поэтому мы предполагаем, что, данное изменение ДНК могло быть результатом стресса, испытываемого клетками в ходе этапов криосохранения. Причем, поскольку не представляется возможным успешно выполнить процедуру криосохранения каллусных тканей без их дегидратации, трудно сказать, может ли вызывать вариабельность генома сам процесс замораживания-оттаивания. Однако ввиду того, что после дегидратации, и после замораживания-оттаивания было зарегистрировано появление ампликонов сходного размера с одной и той же парой праймеров, вероятно, данное изменение ДНК возникло на стадии дегидратации.

Рис. 5. Профили ДНК каллусов самоопыленной линии Нв16 с праймерами Ш1з+М4. 7ПК - каллусы, восстановленные в течение недели в темноте после предкультивирования; 7ДГ -после предкультивирования, высушивания, и регидратации; 730 - после полной процедуры криосохранения; К - каллусы, не подвергавшиеся обработкам; М -маркер молекулярного веса; К- -отрицательный контроль.

1, 2 - случайные пробы, отобранные из соответствующего варианта и состоящие из двух-трех каллусов. Стрелками указаны полиморфные фрагменты.

Среди тканей, которые продолжали культивировать на свету после отдельных стадий криосохранения, ни через 7 (14ПК, 14ДГ, 1430), ни через 21 (28ПК, 28ДГ, 2830) день не было обнаружено отличий спектров ампликонов от контроля (Рис. 6). То, что на более поздних этапах предположительно полиморфные фрагменты не были выявлены, можно объяснить тем, что в ходе эксперимента на каждый следующий этап процедуры криосохранения переносили не все каллусы, прошедшие предыдущий этап, и та часть клеток, которые имели вариации в геноме, вероятно, не попала в пробы.

м 7ПК 7ДГ 730 К К-

¡1 2 \ 1 2 \ 1 Гр Л

м к

14Г1К ИДГ 1430

28ЛК 28ДГ 2S30 К-

"П i 12 I / Л

П I / I 1

А

.5000— *

1000-

и ттштт

щ щ т р Щ Щ fm р* \fm

200-

100

Рис. 6. REMAP-профили каллусов линии Нв16 с праймерами Wis+M4.

К - каллусы, не подвергавшиеся обработкам; каллусы через 7 дней (14ПК, 14ДГ, 1430) и через 21 день(28ПК, 28ДГ, 2830) после переноса тканей на свет. М -маркер молекулярного веса; К- - отрицательный контроль; 1, 2 - случайные пробы, отобранные из соответствующего варианта и состоящие из двух-трех каллусов.

Анализ природы полиморфных ДНК-фрагментов. Для того чтобы выяснить природу полиморфных фрагментов, выявленных в пробах каллусов после этапа дегидратации и полной процедуры криосохранения (Рис. 5 - 7ДГ2, 730/), эти фрагменты были клонированы и секвенированы. Затем их нуклеотидные последовательности сравнили с последовательностями, имеющимися в базах данных.

Согласно полученным данным последовательности полиморфных фрагментов, обнаруженных в пробах 7ДГ2 и 1301, полностью совпадают. Это подтверждает предположение о том, что появление нового фрагмента в пробе 730/ связано с дегидратацией, а не с замораживанием тканей в жидком азоте. С одного конца они фланкированы микросателлитным повтором, с другого - LTR ретротранспозона Wis-2-IA или BARE-1. В данном случае возможны оба варианта, поскольку на 5'-конце имеют одинаковые последовательности длиной 19 п.н. (Queen et al., 2004), которые были взяты в качестве LTR-праймера Wis. Длина последовательности между праймерами у полиморфного фрагмента составила 24 нуклеотида.

Поиск в базах данных позволил обнаружить сходство фрагмента с

неидентифицированной последовательностью ДНК, принадлежащей геному мягкой пшеницы (7". aestivum) - ВН759170 (клон из ВАС библиотеки).

Однако ввиду того, что обнаруженный фрагмент имеет очень малую протяженность, он может совпадать с большим числом последовательностей ДНК генома мягкой пшеницы, в том числе несеквинированных на настоящий момент. Таким образом, на основании поиска в базах данных сложно говорить о природе обнаруженных отклонений. Несмотря на это, маловероятно, что появление ранее незарегистрированных фрагментов в REMAP-профилях связано с мутацией, приведшей к возникновению новой микросателлитной последовательности, комплементарной последовательности праймера М4, поскольку в ISSR-профилях ампликонов проб 7ДГ2 и 730/, полученных с праймером М4, не было отмечено отклонений от контрольных профилей, а появление фрагментов регистрировали только при сочетании данного праймера с LTR-праймером Wis. Из этого следует, что наиболее вероятной причиной отмеченных изменений является спровоцированное стрессом, испытываемым клетками во время дегидратации, встраивание новой копии ретротранспозона рядом с микросателлитной последовательностью, комплементарной М4.

Таким образом, по результатам данной серии опытов можно заключить, что из всех этапов криосохранения только дегидратация оказывает негативное действие на способность каллусов к морфогенезу. Из воздействий, которым подвергаются каллусные ткани яровой пшеницы в ходе криосохранения с помощью исследованного протокола, только дегидратация может вызывать единичные изменения последовательностей исследованных ДНК-маркеров.

Вторая серия опытов

В рамках второй серии исследования из одной части семян двух линий: Нв4 и Нвб, получали каллусы, а из другой части семян этих линий были выращены растения, листья которых использовали в качестве Контроля при анализе ДНК (и каллусов, и регенерантов). В данной серии опытов анализировали ДНК каллусов, прошедших отдельные стадии криосохранения (аналогично первой серии опытов) и культивированных в течение 28 дней, и растений, которые были регенерированы из таких каллусов. Для того чтобы исключить возможное влияние культивирования in vitro, опыт включал дополнительные контроли - каллусную ткань, не

подвергавшуюся никаким обработкам и культивируемую в течение того же периода времени, что и опытные каллусы, а также полученные из таких каллусов регенеранты.

Оценка однородности растений двух линий. Анализ ДНК контрольных растений, выращенных из части семян линий Нв4 и Нвб, показал их идентичность внутри линий по всем исследуемым маркерам.

Содержание воды в каллусах после каждого из этапов криосохранения. Учитывая негативное влияние дегидратации на морфогенетическую способность каллусов яровой пшеницы, содержание воды контролировали на всех этапах, степень высушивания была снижена по сравнению с первой серией опытов. После двух суток предкультивирования на среде Д (0.8 М сахарозы), этот показатель у тканей линии Нв4 снижался на 9%, а у Нвб в два раза сильнее - на 18%. Перед замораживанием в жидком азоте, образцы каллусов достоверно отличались между собой по степени оводненности: ткани линии Нв4 содержали 26.7% воды, а линии Нвб - 21.4%.

Восстановление роста растительного материала после стадий криосохранения. Частота восстановления роста после полной процедуры криосохранения, отмеченная в данной серии опытов была такой же высокой, как и в предыдущей части исследования (Табл. 3). Полученные результаты подтверждают, что этапы замораживания в жидком азоте с помощью метода дегидратации не влияют на жизнеспособность каллусных тканей яровой пшеницы.

Влияние этапов криосохранения на способность к морфогенезу. После этапа предкультивирования у тканей линии Нв4 достоверного изменения доли морфогенных каллусов и числа растений-регенерантов не было зарегистрировано (Табл. 3). Однако у другой линии - Нвб, после данного этапа происходило снижение способности к морфогенезу. Возможно, это связано со значительной потерей воды тканями линии Нвб, отмеченной после предкультивирования на среде с повышенным содержанием сахарозы. Стадия дегидратации оказывала существенное негативное влияние на морфогенетическую способность тканей линии Нв4, несмотря на меньшую степень обезвоживания каллусов по сравнению с первой серией опытов.

Из результатов обеих серий опытов видно, что степень обезвоживания оказывала существенное влияние на способность тканей яровой пшеницы к образованию морфогенных участков. Так наибольшие значения этого показателя

после этапа дегидратации были отмечены у каллусов линий Нв8, Нв4 и Нвб, которые были высушены до 18.3%, 26.7% и 21.4% содержания воды, соответственно. В свою очередь, у наиболее дегидратированных в опыте тканей линии Нв9, содержавших перед замораживанием 13.5% воды, морфогенетическая способность падала до нуля без погружения каллусов в жидкий азот.

Таблица 3. Восстановление роста, доля способных к морфогенезу каллусов и частота регенерации растений линий Нв4 и Нвб после отдельных этапов криосохранения

Вариант Линия Общее число каллусов Доля каллусов, %

Растущих* Способных к морфогенезу ** Образующих регенеранты ***

Культивирование in vitro (контроль) Нв4 50 100 60.0 12.0

Нвб 63 90.5 58.7 11.1

Предкультивиро-вание Нв4 54 100 64.8 13.0

Нвб 33 90.9 33.3 1.8

Дегидратация Нв4 53 98.1 28.3 5.7

Нвб 35 82.7 31.4 2.9

Замораживание-оттаивание Нв4 53 90.6 20.8 9.4

Нвб 64 81.3 21.9 4.7

*Нет достоверных отличий доли растущих каллусов каждой из линий в результате последовательных этапов криосохранения при Р=0.95

"""Снижение доли способных к морфогенезу каллусов линии Нвб после предкультивирования, линии Нв4 после этапа дегидратации достоверно при Р=0.95 ***Частота регенерации тканей линии Нвб достоверно снизилась после предкультвирования, линии Нв4 - после дегидратации (Р=0.95).

Оценка стабильности ДНК-маркеров в восстановленных после отдельных стадий замораживания в жидком азоте каллусных тканях и регенерированных растениях. ПЦР-анализ показал отсутствие каких-либо отклонений профилей образцов всех вариантов от профилей контрольных растений и культивированных каллусов, не подвергавшихся обработкам, как в случае каллусов линии Нв4, так и в случае Нвб (Рис. 7).

2000-

М К КЛ ПК дг зо

I 1 2 1 I 2 I I I 2 I / 2 л

• —* » I ! г -1 "—г»--» Рис.

^^^ууамвр-ии профили

Рис. 7. ЯЕМАР-растений-

юоо....... Ш 1Р Щ Н ^ ™ ; | Я регенерантов из

каллусов линии Нвб с

500__< праймерами Wis+M4.

200-

М - маркер молекулярного веса; К - контроль; КЛ (7, 2) - контроль культивирования; ПК (1-3) - предкультивирование; ДГ (/, 2) - дегидратация; ЗО (1-3) - замораживание-оттаивание.; К- - отрицательный контроль.

Уровень изменчивости растительного материала пшеницы после отдельных этапов криосохранения методом дегидратации

Для того чтобы определить частоту появления изменений ДНК-маркеров после каждого из этапов криосохранения, число полиморфных локусов выразили в процентах от числа локусов, зарегистрированных для каллусов каждой линии.

У растительного материала пяти из шести линий, взятых в опыты, после каждого из последовательных воздействий криосохранения число локусов оставалось неизменным. Как было отмечено ранее, только в случае тканей линии Нв16, после дегидратации и после замораживания-оттаивания было отмечено появление вариабельности. Доля полиморфных локусов в этих вариантах составила по 1.7%. В первой серии опытов частота появления изменений после этапов дегидратации и после замораживания-оттаивания составила по 0.85%, а в целом по опытам - 0.58%.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы показана возможность применения протокола дегидратации для успешного криогенного хранения каллусов яровой пшеницы (ТгШсит аеяНуит Ь.) и получения из них растений. Результаты работы подтвердили возможность использования 188Я- и КЕМАР-методов для оценки стабильности растительного материала пшеницы, восстановленного после криосохранения.

В ходе экспериментов установлено, что дегидратация является критическим моментом исследованного протокола. Она приводит к существенному снижению способности каллусных тканей пшеницы к морфогенезу и регенерации растений, а также может вызывать вариации в геноме восстановленных каллусов. Отмеченная частота вариаций в ДНК каллусов в целом по опыту составила 0.58%. У регенерантов, восстановленных из каллусных тканей, которые подвергали как отдельным стадиям криосохранения, так и полной процедуре подготовки и замораживания в жидком азоте, изменения не были выявлены. Вероятно, такой результат связан с низкой частотой появления вариаций.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что каллусы яровой пшеницы (ТгШсит аейНуит Ь.) способны восстанавливать свой рост после криосохранения по протоколу дегидратации. Ни один из этапов криосохранения не вызывал снижения жизнеспособности тканей.

2. Обнаружено, что восстановленные после криосохранения каллусы не утратили способности к регенерации растений, хотя частота формирования морфогенных структур достоверно снижалась на этапе дегидратации, дальнейшие замораживание в жидком азоте и оттаивание существенно не влияли на этот показатель.

3. Впервые проведена оценка влияния этапов криосохранения по протоколу дегидратации на генетическую стабильность восстановленного растительного материала. После этапа дегидратации были обнаружены единичные изменения генома, частота которых составила 0.58%. Остальные стадии криосохранения не вызывали изменений ДНК-маркеров.

4. Регенераты, восстановленные из каллусов, подвергавшихся отдельным этапам криосохранения, полностью сохраняли ' стабильность по ряду проанализированных ДНК-маркеров.

СПИСОК РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Соловьева : А.И. .. (2008) Влияние многократного криогенного замораживания-оттаивания на прорастание сухих семян мягкой пшеницы. Тезисы докладов и сообщений, представленные на школу-конференцию молодых ученых "Методы культивирования клеток". Цитология, 50 (9), с. 822-823.

2. Соловьева А.И., Высоцкая O.H. (2008) Влияние повреждений на прорастание растительного материала Triticum aeslivum без и после замораживания в жидком азоте. Тезисы докладов IX Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология". Звенигород, с. 360-361.

3. Соловьева А.И., Высоцкая O.H., Долгих Ю.И. (2009) Стадии криосохранения каллусной ткани пшеницы и стабильность ДНК-маркеров. Программа и тезисы VII Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток". Звенигород, Москва, с. 61-62.

4. Мухаммед С., Соловьева А.И., Долгих Ю.И. (2009) Оценка биотехнологического потенциала различных сортов пшеницы. Вестник РУДН, сер. Агрономия и животноводство, 4, 78-83.

5. Соловьева А.И., Высоцкая О.Н., Попов A.C., Долгих Ю.И. (2010) Замораживание в жидком азоте дегидратированных каллусов яровой пшеницы (Triticum aestivum L.) и их морфогенетическая способность. Изв. РАН. Сер. биол., 5, 1-7.

6. Соловьева А.И., Высоцкая О.Н. (2010) Способ криосохранения каллусов яровой пшеницы {Triticum aestivum L.), полученных из двух типов эксплантов. Сборник статей по материалам III Всероссийской научно-практической конференции "Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира". Волгоград, с. 110-113.

7. Соловьева А.И., Высоцкая О.Н., Долгих Ю.И., Попов A.C. (2011) Спектры ISSR- и REMAP-маркеров ДНК после этапов криосохранения по методу дегидратации каллусов яровой пшеницы (Triticum aestivum L.). Физиология растений, 58 (3), 359-366.

Подписано в печать: 20.04 11

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 233 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соловьева, Александра Ивановна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Криосохранение тканей и органов Роасеае

1.1.1. Объекты криосохранения

1.1.2. Физиологическое состояние растительного материала

1.1.3. Подготовка растительного материала к замораживанию 10 1.1.4 Защита культуры in vitro с помощью криопротекторов

1.1.5. Дегидратация

1.1.6. Инкапсуляция

1.1.7. Методы замораживания

1.1.8. Оттаивание

1.1.9. Отмывание растительного материала от криозащитных растворов

1.1.10. Восстановление роста

1.1.11. Частота восстановления роста растительного материала

Т. aestivum после различных протоколов криосохранения

1.2. Стабильность растительного материала после криосохранения

1.2.1. Фенотипические изменения

1.2.2. Вариабельность тканей и органов растений на биохимическом уровне

1.2.3. Стабильность растительного материала на цитологическом уровне

1.2.4. Вариабельность последовательностей ДНК

1.2.5. Тип сохраняемой ткани и генетическая вариабельность

1.2.6. Влияние протокола криосохранения на изменчивость растительного материала

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объект исследования

2.2. Молекулярный анализ ДНК 37 ! 2.3. Получение и культивирование каллусных тканей Т. aestivum

2.4. Регенерация и культивирование растений

2.5. Получение самоопыленных линий

2.6. Криосохранение каллусов

2.7. Оценка восстановления каллусных тканей после отдельных стадий криосохранения

2.8. Определение содержания воды

2.9. Оценка способности каллусных тканей к морфогенезу

2.10. Статистическая обработка данных

2.11. Анализ ДНК-фрагмента

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Характеристика объекта и разработка условий исследования

3.1.1. Выбор и характеристика праймеров

3.1.2. Оценка генетической однородности растений трех сортов 50 Т. аеяНуит

3.1.3. Выбор объекта исследования

3.1.4. Криосохранение каллусов Т. аеьг^ит

3.2. Исследование стабильности растительного материала после криосохранения методом дегидратации

3.2.1. Первая серия опытов

3.2.2. Вторая серия опытов

3.2.3. Уровень изменчивости растительного материала Т. аеяНуит после отдельных этапов криосохранения методом дегидратации

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оценка вариабельности ДНК-маркеров в каллусной ткани пшеницы (Triticum aestivum L.) после криосохранения"

В настоящее время в качестве самого надежного способа долговременного сохранения генетических ресурсов рассматривается хранение культивируемых тканей растений при температуре жидкого азота (-196°С). Криогенное хранение позволяет исключить вероятность потери ценных образцов и сократить материальные затраты на поддержание коллекций (Engelmann, 2004; Pañis, Lambardi, 2005).

Криосохранение тканей растений, культивируемых in vitro, включает несколько стадий: введение в культуру, подготовку к замораживанию, замораживание, криогенное хранение, оттаивание, восстановление роста и регенерацию растений. Существует вероятность того, что каждый из перечисленных этапов может оказывать влияние на генетическую стабильность растительного материала, поскольку из-за воздействия физических, химических и физиологических факторов живые клетки могут находиться в состоянии стресса и в результате этого в их геноме возникать различные отклонения.

Данные о сохранении стабильности генома культивируемых тканей растений после процедуры криосохранения довольно противоречивы. Во многих работах показана генетическая стабильность объектов после криосохранения выполненного с помощью целого ряда методик (Harding, 2004; Pañis, Lambardi, 2005). Многие ученые сообщали о том, что при исследовании образцов после хранения в жидком азоте не было обнаружено изменений на различных уровнях организации (Harding, 2004; Pañis, Lambardi, 2005). Однако в ряде исследований после полной процедуры криосохранения были выявлены изменения последовательностей ДНК, но они не позволили выяснить какие именно этапы криосохранения могут оказывать дестабилизирующее влияние на геном.

Более детальные исследования были посвящены оценке генетической стабильности растительного материала, восстановленного после отдельных этапов замораживания в жидком азоте с применением медленного замораживания в сочетании с обработкой криозащитными веществами (Aronen et al., 1999; Urbanova et al., 2006) и витрификации в растворах криопротекторов с последующим быстрым погружением в жидкий азот (Kaity et al., 2008; Sanchez et al., 2008). В этих исследованиях после предварительного культивирования растительных тканей не было выявлено появление каких-либо вариаций. Однако изменения спектров ампликоиов были зарегистрированы на последующих этапах криосохранения. В случае использования метода медленного замораживания к появлению < генетической изменчивости приводила обработка растительного материала раствором криопротекторов (Aronen et al. 1999), а в случае метода витрификации обработка витрифицирующим раствором (Kaity et al., 2008). Кроме того, отклонения в геноме также регистрировали «после этапа замораживания в жидком азоте подготовленных тканей (Urbanova et al., 2006; Kaity et al., 2008; Sanchez et al., 2008).

При криосохранении растительного материала весьма перспективно применение метода дегидратации, поскольку он позволяет исключить использование дорогостоящих программных замораживателей и токсичных криопротекторов, способных вызывать дестабилизирующее воздействие на геном растений (Aronen et al., 1999; Kaity et al., 2008). Однако характер воздействия отдельных этапов данного метода на генетическую стабильность тканей и органов растений, культивируемых in vitro, не изучен.

В своем исследовании мы решили оценить влияние отдельных стадий процедуры криосохранения, выполненной методом дегидратации, на стабильность ДНК растительного материала. В качестве объекта исследования нами была выбрана каллусная ткань яровой формы Т. aestivum, поскольку она обладает большим и сложно организованным геномом.

Целью диссертационной работы было изучение влияния отдельных стадий процедуры криосохранения каллусов мягкой яровой пшеницы (ТгШсит аехйчит Ь.), выполненного методом дегидратации, на стабильность ДНК восстановленного растительного материала.

В связи с этим был поставлен ряд задач:

1. Выбрать ДНК-маркеры для оценки генетического полиморфизма и осуществить подбор условий для проведения ПЦР.

2. Получить исходный растительный материал, однородный по ряду ДНК-маркеров.

3. Оценить влияние отдельных этапов процедуры криосохранения на жизнеспособность и морфогенетический потенциал каллусов яровой пшеницы.

4. Определить уровень изменчивости ДНК-маркеров каллусов и полученных из них растений-регенерантов после каждого из этапов криосохранения.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Соловьева, Александра Ивановна

выводы

1. Впервые показано, что каллусы яровой пшеницы (ТгШсит аезйуит Ь.) способны восстанавливать свой рост после криосохранения по протоколу дегидратации. Ни один из этапов криосохранения не вызывал снижения жизнеспособности тканей.

2. Обнаружено, что восстановленные после криосохранения каллусы не утратили способности к регенерации растений, хотя частота формирования морфогенных структур достоверно снижалась на этапе дегидратации, дальнейшие замораживание в жидком азоте и оттаивание существенно не влияли на этот показатель.

3. Впервые проведена оценка влияния этапов криосохранения по протоколу дегидратации на генетическую стабильность восстановленного растительного материала. После этапа дегидратации были обнаружены единичные изменения генома, частота которых составила 0.58%. Остальные стадии криосохранения не вызывали изменений ДНК-маркеров.

4. Регенераты, восстановленные из каллусов, подвергавшихся отдельным этапам криосохранения, полностью сохраняли стабильность по ряду проанализированных ДНК-маркеров.

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.б.н. Долгих Юлии Ивановне за всестороннюю помощь, понимание и поддержку, к.б.н. Высоцкую Ольгу Николаевну за помощь в освоении практической и теоретической сторон криосохранения, постоянное внимание к работе и поддержку, к.б.н. Осипову Екатерину Сергеевну за оказанное содействие в освоении методов выявления полиморфизма и анализа ДНК-фрагментов, д.б.н. Попову Александру Сергеевичу за ценные консультации, а также всем сотрудникам лаборатории генетики культивируемых клеток и группы криосохранения Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН за доброжелательное отношение и дружескую атмосферу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы показана возможность применения протокола дегидратации для успешного криогенного хранения каллусов яровой пшеницы (ТгШсит ае$И\>ит Ь.) и получения из них растений. Результаты работы подтвердили возможность использования 1881*.- и КЕМАР-методов для оценки стабильности растительного материала пшеницы, восстановленного после криосохранения.

В ходе экспериментов установлено, что дегидратация является критическим моментом исследованного протокола. Она приводит к существенному снижению способности каллусных тканей пшеницы к морфогенезу и регенерации растений, а также может вызывать вариации в геноме восстановленных каллусов. Отмеченная частота вариаций в ДНК каллусов в целом по опытам составила 0.58%. У регенерантов, восстановленных из каллусных тканей, которые подвергали как отдельным стадиям криосохранения, так и полной процедуре подготовки и замораживания в жидком азоте, изменения не были выявлены. Вероятно, такой результат связан с низкой частотой появления вариаций.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соловьева, Александра Ивановна, Москва

1. Брик А.Ф., Календарь Р-Н, Стратула 0:Р. Сиволап Ю.М. (2006) IRAP-REMAP-анализ сортов ячменя^ одесской! селекции. Цитология и генетика, 40, 24-33.

2. Волкова JI.A., Горская HiBi, Попов A.C., Пауков В.Н., Урманцева BlB.1986) Сохранение основных характеристик мутантных клеточных штаммов диоскореи после хранения при сверхнизких температурах. Физиология растений, 33, 779-787.

3. Высоцкая О.Н., Попов A.C., Данилова С.А. (20076) Криосохранение незрелых зиготических зародышей пшеницы. Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке. Тезисы докладов II Вавиловской конференции, Санкт Петербург (ВИР), с. 160.

4. Дерябин-А.Н., Синькевич М.С., Дубинина И.М., Бураханова Е.А., Трунова

5. Т.И. (2007) Влияние Сахаров на развитие окислительного'стресса, вызванного гипотермией (на примере растений картофеля, экспрессирующих ген инвертазы дрожжей). Физиология растений, 54, 39-46.

6. Донец Н.В., Мусин С.М., Попов A.C. (1991) Стабильность состава полиморфных белков растений картофеля, полученных из меристем после криогенного хранения. С.-х. биология, №3, 76—83.

7. Плохинский H.A. (1978) Математические методы в биологии. М.: Из-во МГУ,. 265 с.

8. Попов. А.С. (1988). Криоконсервация клеток растений: В сб: Методы культивирования клеток под ред. Пинаева Г.П: М.: Нау ка, с. 70-77.

9. Тихонова ВЛ. (1999) Долговременное: хранение семян,. Физиология растений, 46, 467-476.

10. Трунова Т.И. (1972) Сахара как один из факторов^ повышающих морозостойкость растений, Известия АН СССР, Сер. биол., № 2, 185-189.

11. Туманов И.И. (1979) Физиология закаливания и морозостойкости растений: М.: Наука, 352 с.

12. Чересиз G.B., Юрченко Н.Н., Иванников А.В., Захаров И.К. (2008) Мобильные элементы.и стресс. Вестник ВОГиС, 32,216-241.

13. Ahuja S., Mandal B.B., Dixit S;, Srivastava P.S. (2002) Molecular, phenotypic and biosynthetic stability in Dioscorea floribunda plants derived from cryopreserved shoot tips. Plant Sci., 163, 971-977.

14. Ai P., Luo Z. (2005) Cryopreservation of dormant vegetative buds adn genetic stability of regenerated plantlets in persimmon. Acta Hortic., 685, 85-92.

15. Albani M;C., Wilkinson M.J. (1998) Inter simple sequence repeat polymerase chain reaction for the detection of somaclonal variation. Plant Breed., 117, 573—575.

16. Aronen T.S., Krajnakova J., Haggman H.M., Ryyiianen L.A. (1999)* Genetic fidelity of cryopreserved embryogenic cultures of open-pollinated Abies cephalonica.• Plant'Sci., 142; 163-172.

17. Atmakuri A.R., Chaudhury R:, Malik S.K, Kumar S. (2009) Mulberry biodiversity conservation through cryopreservation. In Vitro Cell Dev.- Pl., 45, 639649.

18. Bachiri Y., Bajon C., Sauvanet A., Gazeau C., Morisset C. (2000) Effect of osmotic stress on tolerance of air-drying and cryopreservation of Arabidopsis thaliana suspension cells. Protoplasma, 214, 227-243.

19. Bajaj Y.P.S. (1980) Freeze-preservation of plant cells-a novel approach to the conservation of gemplasm. In: Genetics and Wheat Improvement, Gupta A.K. (ed) New Delhi: Oxford & IBH, pp. 141-149.

20. Bajaj{ Y.P.S. (1982) Induction and cryopreservation of genetic variability in rice. International rice tissue culture planning conference, Los Banos, Philippines, pp. 99— 111'.

21. Bajaj Y.P.S. (1983) Cryopreservation of germplasm of cereals Progress and prospects. In: Proc. 6th Int. Wheat Genet. Symp., Sakamoto S. (ed) Kyoto: Kyoto Univ, pp. 565-574.

22. Bajaj Y.P.S. (1984) The regeneration of plants from frozen pollen embryos and zygotic embryos of wheat and rice. Theor. Appl. Genet., 67, 525-528.

23. Bajaj Y.P.S. (1995) Cryopreservation of germplasm of cereals (wheat, rice, and maize). In: Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 32. Cryopreservation of Plant Germplasm I, Bajaj Y.P.S. (ed.) New Delhi: Oxford & IBH, pp. 217-235.

24. Bayliss M:W. (1980) Chromosomal variation in plant tissue in culture. Int. Rev. Cytol., 11, 113-143.

25. Benson E.E. (1990) Free radical damage in stored plant germplasm. Rome: International Board for Plant Genetic Resources, pp.128.

26. Benson: E.EV. Johnston J;,. Muthusamy J:, Harding K. (2006) Physical and engineering perspectives of in vitro-plant cryopreservation. In: Plant tissue culture engineering, vol 6, Gupta S., Ibaraki Y. (eds.) Verlag: Springer, pp. 441-476.

27. Benson E.E., Lynch P.T., Jones. J. (1992) Variation in free- radical damage in rice cell suspensions with different embryogenic potentials. Planta, 188, 296-305.

28. Benson E.E., Wilkinson M., Todd A., Ekuere U., Lyon J. (1996) Developmental competence and ploidy stability in plants regenerated from cryopreserved potato shoot-tips. Cryoletters, 17, 119-128

29. Berjak P., Pammenter N.W. (2008) From Avicennia to Zizania: seed recalcitrance in perspective. Ann Bot., 10, 213-218.

30. Bi R.M1, Kou M., Chen» L.G.,. Mao S.R., Wang H.G. (2007) Plant regeneration through callus initiation from mature embryo of Triticum. Plant Breed., 126, 9-12.

31. Blakesley D., Mazrooei S.A., Bhatti M.H., Henshaw G.G. (1996) Cryopreservation of non-encapsulated embryogenic. tissue of sweet potato (Ipomoea batatas). Plant Cell Rep., 15, 873-876.

32. Blakesley D., Mazrooei S.A., Henshaw G.G. (1995) Cryopreservation of embryogenic tissue of sweet potato (Ipomoea batatas): Use of sucrose and dehydration for cryoprotection. Plant Cell Rep., 14, 259-263.

33. Butenko R.G., Popov A.C., Volkova L.A., Chernyak N.D., Nosov, A.M. (1984) Recovery of cell cultures and their biosynthetic capacity after storage of Dioscorea deltoides and Panax ginseng cells in liquid nitrogen. Plant Sci. Lett., 33, 285-292

34. Castillo N.R.F., Bassil N.V., W. Sugae, Reed B.M. (2010) Genetic stability of cryopreserved shoot tips of Rubus germplasm. In Vitro Cell Dev. PL, 46,246-256.

35. Caswell K.L., Kartha K.K. (2009) Recovery of plants from pea and strawberry meristems cryopreserved for 28 years. Cryoletters, 30, 41—46.

36. Cella R., Colombo R., Galli M.G., Nielsen E., Rollo F., Sala F. (1982) Freeze-preservation of rice cells:A physiological study of freeze-thawed cells. Physiol. Plant., 55, 279-284.

37. Chambers G.K., MacAvoy E.S. (2000) Microsatellites: consensus and controversy. Comp. Biochem. Physiol, 126,455-476.

38. Chang Y., Barker R.E., Reed B. M. (2000) Cold acclimation improves recovery of ciyopreserved grass (Zoysia andLolium sp.). Cryoletters, 21, 107—116.

39. Ghannuntapipat C., Sedgley M.',. Collins G. (2003) Changes in- methylation and structure of DNA from almond tissues during nr vitro culture and cryopreservation. J. Amer. Hort. Sci., 128; 787-935.

40. Chen T.H.H., Gusta KV. (1983) Abscisic acid-induced freezing resistance in cultured plant cells. Plant Physiol, 73, 71-75.

41. Chen T.H.H., Kartha K.K., Gusta L.V. (1985) Cryopreservation of wheat suspension culture and regenerable callus. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 4,101-109.

42. Chlyah H., Karim R., Hsaine M., Chlyah A. (1990) Improvement of somatic embryogenesis in wheat by segmentation of cultured embryos. In: Plant Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol 13, Bajaj Y.P.S. (ed) Heidelberg: Springer-Verlag, pp. 88-97.

43. Cho J.S., Hong S.M., Joo S.Y., Yoo J.S., Kim D.I: (2006) Cryopreservation of transgenic rice suspension cells producing recombinant hCTLA4Ig. Appl. Microbiol Biotechnol., 73, 1470-1476.

44. Condello E., Palombi M.A., Tonelli M.G., Damiano C.; Caboni E. (2009) Genetic stability of wild pear (Pyrus pyraster, Burgsd) after cryopreservation by encapsulation dehydration. Agr. Food Sci., 18, 136-143.

45. Cornejo J.; Wong V.L., Blech A.E. (1995) Cryopreserved callus: a source of protoplast for rice transformation. Plant Cell Rep., 14,210-214.

46. Cote F., Goue O., Domergue R., Panis B., Jenny C. (2000) In-field behavior of banana plants (Musa AA sp.) obtained after regeneration of cryopreserved embryogenic cell suspensions. Cryoletters, 21, 19-24.

47. Crowe J.H., Crowe L.M. (1986) Stabilisation of membranes in anhydrobiotic organisms. In: Membranes, Metabolism, and Dry Organism, Leopold A.C. (ed.) Cornell University, New York: Comstock Publishing Associates, pp. 188-209.

48. Crowe J.H., Crowe L.M., Carpenter J.F., Rudolph A.S., Wistrom C.A., Spargo B.J., Anchordoguy T.J. (1988) Interactions of sugars with membranes. Biochim. Biophys. Acta, 947, 367-384.

49. Delporte F., Mostade O., Jacquemin J.M. (2001) Plant regeneration through callus initiation from thin mature embryo fragments of wheat. Plant Cell Tiss. Org. Cult,. 67, 73-80:

50. Devavallee I., Guillaud J., Beckert M., Dumas C. (1989) Cryopreservation of immature maize embryos after freeze-hardening the ear and in vitro. Plant Sci., 60,' 129.

51. Diettrich B., Popov. A.S., Pfeiffer Bi, Neumann D., Butenko R., Luckner M.1982) Cryopreservation of Digitalis lanata cell cultures. Planta Med., 46, 82-87.

52. Dixit S., Mandal B.B., Ahuja S., Srivastava P.S. (2003) Genetic stability assessment of plants regenerated from cryopreserved embryogenic tissues of Dioscorea bulbifera L. using RAPD, biochemical and morphological analysis. Cryoletters, 24, 77-84.

53. Dixit-Sharma S., Ahuja-Ghosh S., Mandal B.B., Srivastava P.S. (2005) Metabolic stability of plants regenerated from cryopreserved shoot tips of Dioscorea deltoidea — an endangered medicinal plant. Scientia Hort., 105, 513-517.

54. Dumet D., Engelmann F., Chabrillange N., Duval1 Y. (1993) Cryopreservation of oil palm (Elaeis gidneensis Jacq.) somatic embryos involving a desiccation step. Plant Cell Rep., 12, 352-355.

55. Eapen S., Rao (1985) Factors controlling callus induction, growth and plant regeneration in breadwheat (Triticum aestivum L). Proc. Indian Acad. Sci. Plant Sci., 94, 33-40:

56. Eksomtramage T., Paulet F., Noyer J. L., Feldmann P., Glaszmann J. C. (1992) Utility of isozymes in sugarcane breeding. SugarCane, 3, 14-21.

57. Engelmann F. (1992) Cryopreservation of embryos. In: Reproductive Biology and Plant Breeding, DatteeY., Dumas. C., Gallais A. (eds.) Berlin: Springer Verlag, pp. 281-290.

58. Engelmann F. (1997) In vitro conservation methods. In: Biotechnology and Plant Genetic Resources: Conservation and Use, Ford-Lloyd B.V., Newburry J.H., Callow J.A. (eds.) Wellingford: CAB International, pp. 119-162.

59. Engelmann F., Gonzalez Arnao M.T., Wu Y., Escobar. R. (2008) The development of encapsulation dehydration. In: Plant Cryopreservation: A Practical Guide, Reed B.M. (ed.) New York: Springer, pp. 59-75.

60. Fabian A., Jager K., Darko E., Barnabas B. (2008) Cryopreservation of wheat (Triticum aestivum L.) egg cells by vitrification. Acta Physiol. Plant., 30, 737-744.

61. Fang J.-Y., Wetten A., Adu-Gyamfi R., Wilkinson M., Rodriguez-Lopez C. (2009) Use of secondary somatic embryos promotes genetic fidelity in cryopreservation of cocoa (Theobroma cacao L.). Agr. Food Sci., 18; 152-159.

62. Fedoroff N., Banks J.A., Masson P. (1989) Molecular genetic analysis of the maize Suppressor-mutator elements epigenetic developmental regulatory mechanism. Genome, 31, 973-979.

63. Fernandes P., Rodriguez E., Pinto G. Roldan-Ruiz I., Loose M., de Santos C.2008) Cryopreservation of Quercus suber somatic embryos by encapsulation-dehydration and evaluation of genetic stability. Tree Physiol., 28, 1841-1850.

64. Finkle B.J., Ulrich J.M. (1979) Effects of cryoprotectants in combination on the survival of frozen sugarcane cells. Plant Physiol., 63, 598-604.

65. Finkle B.J., Ulrich J.M. (1982) Cryoprotectant removal as a factor in the survival on frozen rice and sugarcane cells. Cryobiology, 19, 329-335.

66. Fretz A., Jahne A., Lorz H. (1992) Cryopreservation of embryogenic suspension culture of barley (Hordenm vulgare L.). Bot. Acta, 105, 140-145.

67. Fretz A., Lorz H. (1995) Cryopreservation of in vitro cultures of barley (Hordeum vulgare L. and H. murinum L.) and transgenic cells of wheat (Triticum aestivum L.). J. Plant Physiol., 146, 489-496.

68. Fukai S., Goi M., Tanaka M. (1991) Cryopreservation of shoot tips of Caryophyllaceae ornamentals. Euphytica, 56, 149—153.

69. Fukai S., Goi M., Tanaka M. (1994) The chimeric structure of the apical dome of chrysanthemum (Dendranthema grandiflornm (Ramat.) Kitam. is affected by cryopreservation. Sci. Hortic.-Amsterdam, 57, 347-351.

70. Gagliardi R.F., Pacheco G.P., Carneiro L.A., Vails J.F.M., Vieira M.L.C., Mansur E. (2003) Cryopreservation of Arachis species by vitrification of in vitro-grown shoot apices and genetic stability of recovered plants. Cryoletters, 24,103-110.

71. Gnanapragasam S., Vasil I.K. (1990) Plant regeneration from a cryopreserved embryogenic cell suspension of a commercial sugarcane hybrid (Saccharum sp.). Plant Cell Rep., 9, 419-423.

72. Gnanapragasam- S., Vasil I.K. (1992a) Cryopreservation of immature embryos, embryogenic callus and cell suspension cultures of gramineous species. Plant Sci., 83, 205-215.

73. Gnanapragasam S.~, Vasil I.K. (1992b) Ultrastructural.changes in suspension culture cells of Panicum maximum during cryopreservation: Plant Cell Rep., 11; 169-174.

74. Gonzalez-Arnao^M.T., EngelmannF. (2006) Cryopreservation of plant germplasm, using the encapsulation-dehydration technique: Review and case study on sugarcane. Cryoletiers, 27, 155-168.

75. Gonzalez-Arnao M.T., Engelmann F., Huet C., Urra C. (1993) Cryopreservation of encapsulated apices of sugarcane: effect of freezing procedure and histology. Cryoletters, 14, 303-308.

76. Gonzalez-Arnao M.T., Urra C., Engelmann F., Ortiz R., de la Fe C. (1999) Cryopreservation of encapsulated sugar cane apices: effect of storage temperature and storage duration. Cryoletters, 20, 347-352.

77. Gupta M., Chyi Y.S., Romero-Severson J., Owen J.L. (1994) Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple sequence repeats. TheorAppl Genet, 89, 998-1006.

78. Haggman,H., Ryynanen L., Aronen T., Krajnakova J. (1998) Cryopreservation of embryogenic cultures of Scots pine. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 54, 45-53.

79. Hahne G., Lorz H. (1987) Cryopreservation of embryogenic callus cultures from barley (Hordeum vulgare L.). Plant Breed., 99, 330-332.

80. Haliloglu K. (2002) Wheat immature embryo culture for embriogenic callus induction. J. Biol. Sci., 2, 520-521.

81. Halperin W. (1986) Attainment and retention of morphogenetic capacity in vitro. In: Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vasil I.K. (ed.) New York: Academic press, pp. 3-47.

82. Hao Y.J., Deng X.X. (2002) Occurrence of chromosomal variations and plant regeneration from long-term-cultured citrus callus. In Vitro Cell Dev.-PL, 38, 472476.

83. Hao Y.J., Liu Q.L., Deng X.X. (2001) Effect of cryopreservation on apple genetic resources at morphological, chromosomal, and molecular levels. Cryobiology, 23, 4653.

84. Hao Y.J., You C.X., Deng X.X. (2002a) Effects of cryopreservation on developmental competency, cytological and molecular stability of citrus callus. Cryoletters, 23, 27-35.

85. Hao Y.J., You C.X., Deng X.X. (2002b) Analysis of ploidy and the patterns of amplified fragment length polymorphism and methylation sensitive amplified polymorphism in strawberry plants recovered from cryopreservation. Cryoletters, 23, 37-46.

86. Harding K. (1994) The methylation status of DNA derived from potato plants recovered from slow growth. Plant Cell Tiss. Org., 21, 31-38.

87. Harding K. (2004) Genetic integrity of cryopreserved plant cells: a review. Cryoletters, 25, 3-22.

88. Harding K., Benson E.E. (1994) A study of growth, flowering, and tuberisation in plants derived from cryopreserved potato shoot-tips: implications for in vitro germplasm collections. Cryoletters, 15, 59-66.

89. Harding K., Staines H. (2001) Biometric analysis ofphenotypic characters of potato shoot-tips recovered from tissue culture, dimethylsulphoxide treatment and cryopreservation. Cryoletters, 22, 255-262.

90. He G. , Shu L., Liao L., Yin X., Sheng L., Wang X. (1998) Somatic cell cryopreservation and protoplast regeneration of important disease-resistant wild rice Oryza meyeriana Baill. Sci. China Ser. C, 41, 393-399.

91. Heine-Dobbernack E., Kiesecker H., Schumacher H.M. (2008) Cryopreservation of dedifferentiated cell cultures. In: Plant Cryopreservation: A Practical Guide, Reed B.M. (ed.) New York: Springer,, pp. 141-176.

92. Helliot B., Madur D., Dirlewanger E., De Boucaud M.T. (2002) Evaluation of genetic stability in cryopreserved Prunus. In Vitro Cell Dev.-PI, 38, 493-500.

93. Henry Y., Marcotte J.L., De Buyser J. (1996) The effect of aneuploidy on karyotype abnormalities in wheat plants regenerated from- short and longterm somatic embryogenesis. Plant Sci., 114, 101-109.

94. Hitmi A., Sallanon H.', Barthomeuf C. (1997) Cryopreservation of Chrysanthemum cinerariaefolium vis. cells and its impact on their pyrethrin biosynthesis ability. Plant Cell Rep., 17, 60-64.

95. Hoekstra F.A., Golovina E.A., Buitink J. (2001) Mechanisms of plant desiccation tolerance. Trends Plant Sci., 6, 431-438.

96. Hong S, Yin M, Shao X, Wang A, Xu W. (2009) Cryopreservation of embryogenic callus of Dioscorea bulbifera by vitrification. Cryoletiers, 30,4 64-75.

97. Huang C.N., Wang. J.H., Yan* O.S., Zhang X.Q., Yan Q.F. (1995) Plant regeneration from rice (Oryza sativa L.) embryogenic suspension cells cryopreserved by vitrification. Plant Cell Rep., 14, 730-734.

98. Huang C.N., Wang. J.H., Yan Q.F., Yan O.S., Zang S.O. (1995) Rapid establishment and cryopreservation of embryogenic cell suspension cultures of barley (Hordeum vulgare L). Sci Agric. Sin., 28, 21-27.

99. Huang C.N., Yan Q.F., Wang J.H., Yu Z.Y., Du Y. (1992) Stadies of cryopreservation of barley (Hordeum vulgare L.) immature embryos. Bull. Sci. Technol., 8, 209-212.

100. Ipser J. (1993) Effect of dimethylsulfoxide on methylmethanesulfonate induced chromosomal aberrations in Crepis capillaris cultivated in vitro. Biol. Plantarum, 35, 137-139.

101. Ishikawa M., Suzuki M., Nakamura T., Kishimoto T., Robertson A.J., Gusta

102. V. (2006) Effect of growth phase on survival of bromegrass suspension cells following cryopreservation and abiotic stresses. Ann. Bot., 97, 453-459.

103. Ishikawa M., Tandon P., Suzuki M., Yamaguishi-Ciampi A. (1996) Cryopreservation of bromegrass (Bromus inermis Leyss) suspension cultured cells using slow prefreezing and vitrification procedures. Plant Sci., 120, 81-88.

104. Jain S., Jain R.K., Wu R. (1996) A simple and efficient procedure for cryopreservation of embryogenic cells of aromatic Indica rice varieties. Plant Cell Rep., 15, 712-717.

105. Jian L.C., Sun D.I., Sun L.H. (1987) Studies on factors cryopreservation of sugarcane callus. ACTA Bot. Sin., 29, 123-131.

106. Johnston J.W., Benson E.E., Harding K. (2009) Cryopreservation induces temporal DNA methyl ation epigenetic changes and differential transcriptional activity in Rides germplasm. Plant Physiol. Biochem., 47, 123-131.

107. Jokipii S., Ryynanen L., Kallio P.T., Aronen T., Haggman H. (2004). A cryopreservation method maintaining the genetic fidelity of a model forest tree, Populus tremida L. x Populus tremuloides Michx. Plant Sci., 166, 799-806.

108. Kaeppler S.M., Phillips R.L. (1993) Tissue culture-induced' DNA methylation variation in maize. PNAS, 90, 8773-8776

109. Kaity A., Ashmore S.E., Drew R.A. (2009) Field performance evaluation and genetic integrity assessment of cryopreserved papaya clones. Plant Cell Rep., 28, 1421-1430.

110. Kaity A., Ashmore S.E., Drew R.A., DuIIoo M.E. (2008) Assessment of genetic and epigenetic changes following cryopreservation in papaya. Plant Cell Rep., 27, 1529-1539.

111. Kalendar R., Grob T., Regina M., Suoniemi A., Schulman A. (1999) IRAP and REMAP: two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques. Theor. Appl. Genet., 98, 704-711.

112. Kalendar R., Tanskanen J., Immonen S., Nevo E., Schulman A.H. (2000) Genome evolution of wild barley (.Hordeum spontaneum) by BARE-1 retrotransposon dynamics in response to sharp microclimatic divergence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6603-6607.

113. Karp A. (1995) Somaclonal variation as a tool for crop improvement. Euphytica, 85, 295-302.

114. Kashkush K., Feldman M., Levy A.A. (2003) Transcriptional' activation of retrotransposons alters the expression' of adjacent genes in wheat. Nat. Genet., 33, 102-106.

115. Kobayashi T., Niino T., Kobayashi M. (2005) Simple cryopreservation protocol with an encapsulation technique for tobacco BY-2 suspension cell cultures. Plant Biotechnol., 22, 105-112.

116. Koster K. (1991) Glass formation and desiccation tolerance in seeds. Plant Physiol, 96, 302-304.

117. Kumar A., Bennetzen J.L. (1999) Plant retrotransposons. Annu Rev. Genet, 33, 479-532.

118. Kuriyama A., Watanabe K., Ueno S., Mitsuda H. (1989) Inhibitory effect of ammonium ion on recovery of cryopreserved rice cells. Plant Sci., 64, 231-235.

119. Langis P., Steponkus P.L. (1990) Cryopreservation of rye protoplasts by vitrification. Plant Physiol, 92, 666-671.

120. Lee P., Chen T.H.H., FuchigamiL.H. (1991) Changes in the translatable RNA population during abscisic acid induced freezing tolerance in bromegrass suspension culture. Plant Cell Physiol, 32, 45-56.

121. Leroy X., Leon K., Branchard M. (2000) Plant genomic instability detected by microsatellite-primers. Electron J. Biotechn., 3, 140-148.

122. Leroy X., Leon, K. (2000) A rapid method for detection of plant genomic instability using unanchored-microsatellite primers. Plant Mol. Biol Rep., 18, 283.

123. Liu Y.G., Liu L.X., Wang L., Gao A.Y. (2008) Determination! of genetic stability in* surviving apple shoots following cryopreservation by vitrification. Cryoletters, 29, 7-14.

124. Liu Z.L., Han F.P., Tan M., Shan X.Hi, Dong Y.Z., Wang X.Z.,,Fedak G.,

125. Lu T.G., Sun C.S. (1992) Cryopreservation of millet (Setaria italica L.). J. Plant Physiol., 139; 295-298.

126. Lu T.G., Sun C.S. (1995) Cryopreservation of foxtail millet (Setaria italica L.). In: Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 32. Cryopreservation of Plant Germplasm I, Bajaj Y.P.'S. (ed.) New Delhi: Oxford & IBH, pp.236-244.

127. Lynch P.T., Benson E .E., Jones J., Cocking E.C., Power J.B., Davey M.R. (1995) The embryogenic potential of rice cell suspension affects their recovery following cryogenic storage. Euphytica, 8, 347-349.

128. Maio J.J.D., Shillito R.D. (1989) Cryopreservation technology for plant cell cultures. Journal of Tissue Culture Methods, 12, 163-169:

129. Malik S.M., Rasid H., Yasmin T., Minhas N.M1 (2004) Effect of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid on callus induction from mature wheat (Triticum aestivum L.) seeds. Int. J. Agri. Biol., 6, 156-159.

130. Mandal B.B., Ahuja-Ghosh S., Srivastava P.S. (2008) Cryopreservation of. Discorea rotundata Poir. A comparative study with, two cryogenic procedures and assessment of regenerants by RAPD analysis. Cryoletters, 29, 399-408:

131. Manninen O., Kalendar R., Robinson J., Schulman A.H. (2000) Application of BARE-1 retrotransposon markers to map a major resistance gene for net blotch in barley. Mol. Gen. Genet., 264, 325-334.

132. Mannonen L., Toivonen L., Kauppinen V. (1990) Effects of long-term preservation on growth and productivity of Panax ginseng and Catharanthus roseus cell cultures. Plant Cell Rep., 9, 173-177.

133. Marassi M.A., Scocchi, A., Gonzalez, A.M. (2006) Plant regeneration,from rice anthers cryopreserved by an encapsulation/dehydration technique. In Vitro Cell Dev.-Pl., 42,31-36.

134. Marin M.L., Gogorcena Y., Ortiz J., Duran, V.N. (1993) Recovery of whole plants of sweet orange from somatic embryos subjected^ to freezing thawing treatments. Plant Cell Tiss. Org., 34,5 27-33.

135. Martin C., Cervera M.T., Gonzalez-Benito M;E. (2009) Somaclonal variation after cryopreservation. How to detect it?: AFLPs vs. RAPDs, Cryoletters, 30, 87.

136. Martin C., Gonzalez-Benito M.E. (2005) Survival and, genetic stability of Dendranthema grandiflora Tzvelev shoot apices- after cryopreservation by vitrification and encapsulation-dehydration. Cryobiology, 51, 281-289.

137. Martin C., Gonzalez-Benito M.E. (2006) Sequence comparison in somaclonal variant of cryopreserved Dendranthema grandiflora shoot apices. Cryobiology, 53, 424.

138. Martinez-Montero Mi, Lorenzo J.C., Ojeda E., Quinones J., Quinones J., Mora N., Castillo R. (2006) Methodology for the cryopreservation of calli with embryogenic structures for the culture of sugarcane. Biotecnoloiia Aplicada, 23; 360375.

139. Martínez-Montero M., Martinez J., Engelmann F. (2008) Cryupreservation of sugarcane somatic embryos. Cryoletters, 29, 229-242.

140. Martinez-Montero M.E., González-Arnao M.T., Borroto-Nordelo C., Puentes-Díaz C., Ehgelmann F. (1998) Cryopreservation of sugarcane embryogenic callus using a simplified freezing process. Cryoletters, 19, 171-176.

141. Martinez-Montero M.E., Ojeda E., Espinosa A., Sanchez M., Castillo R. (2002) Field performance of sugarcane (Saccharum sp.) plants derived from cryopreserved calluses. Cryoletters, 23, 21-26

142. Mikulai A., Tomiczak K., Rybczynski; J-J; (20-l:l)i Cryopreservation enhances embryogenic capacity of Gentiana cruciata (L.) suspension culture and maintains (epi)genetic uniformity of regenerants. Plant Cell Rep:, 30; 565-574.

143. Mix-Wagner G. (1999) The conservation of potato cultivars. Potato Res., 42, 427-436.

144. Mohanty S;, Panda M.K., Subudhi E., Nayak S. (2008) Plant regeneration from callus culture of Curcuma aromatica and1 in vitro detection of somaclonal variation throughicytophotometric analysis. Biol. Plantarum, 52, 783-786.

145. Monk M. (1990) Variation in»epigenetic inheritance. Trends Genet., 6, 110-114.

146. Motawei M.I;, Al-Doss A.A., Moustafa K.A. (2007). Genetic diversity among selectedf wheat lines differing in heat tolerance using molecular markers: J. Food Agric. Environ., 5, 180—183.

147. Mott* R.L., Cordts l.M;,. Larson A.M. (1985) Nitrogen? and: growth regulators effect on shoot and root growth of soy been1 in vitro. Tissue Cult. Forest, and Agr. Prospr. 3rd Tenn., New York, London, pp. 336-337.

148. Moukadiri O., Lopes C.R., Cornejo M.J. (1999) Physiological and genomic variations in rice cells recovered from direct immersion and storage in liquid nitrogen: Physiol. Plant., 105, 442-449.

149. Nagaraju Ji, Kathirvel Mi, Kumar R.R., Siddiq E:A., Hasnaim S.E. (2002) Genetic analysis of traditional and evolved Basmati and non-Basmati rice varieties by using fluorescence-based ISSR-PCR and SSR markers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99,5836-5841.

150. Nair D.S., ReghunathB.R. (2009) Cryoconservation and regeneration of axillary shoot meristems of Indigofera tinctoria (L.) by encapsulation-dehydration technique. In Vitro Cell Dev. -PL, 45, 565-573.

151. Paulet F., Engelmann F., Glaszmann, J.-C. (1993) Cryopreservation of apices of in vitro plantlets of sugarcane (Saccharum sp. hybrids) using encapsulation/dehydratation. Plant Cell Rep., 125, 525-529.

152. Peredo E.L., Arroyo-Garcia R., Reed B.M., Revilla MiA. (2008) Genetic and epigenetic stability of cryopreserved and cold-stored hops. (Humulus lupulus L.). Cryobiology, 57, 234-241.

153. Peredo E.L., Folgado R.} Revilla M.A., Arroyo-García R. (2009) Genetic and epigenetic stability of Humulus lupulus after in vitro. Acta Hort., 848, 115-124.

154. Pinker L, Halmagyi A., Olbricht K. (2009) Effects of sucrose preculture on cryopreservation by droplet-vitrification of strawberry cultivars and morphological stability of cryopreserved plants. Cryoletters, 30, 202-211.

155. Pontaroli A.C., Camadro E.L. (2005) Somaclonal variation in Asparagus officinalis plants regenerated by organogenesis from long-term callus cultures. Genet. Mol. Biol., 28,' 423-430.

156. Popova E., Kim H.H., Paek K.Y. (2010) Cryopreservation of coriander (Coriandrum sativum L.) somatic embryos using sucrose preculture and air desiccation. Sci. Hortic. Amsterdam, 124, 522—528.

157. Powell W., Morgante M., Andre C., Hanafey M.,.Vogel J., Tingey S. Rafalski A. (1996) The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Mol. Breeding, 2, 225-238.

158. Queen R.A., Gribbon B.M., James C., Jack P., Flavell A.J. (2004) Retrotransposon-based molecular markers for linkage and genetic diversity analysis in wheat. Mol. Gen. Genomics, 271, 91-97.

159. Rakoczy-Trojanowska, M., Bolibok H. (2004) Characteristics and a comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants. Cell. Mol. Biol. Lett., 9; 221-238.

160. Reaney, M. J.T., Gusta L.V. (1987) Factors influencing the induction of freezing tolerance byabscisic acid in cell suspension cultures of Bromus inermis Leyss and Medicago sativa L. Plant-Physiol., 83; 423-427.

161. Redway F.A., VasilV., Vasil K.I. (1990) Characterization and regeneration1 of wheat (Triticum aestivum L.) embryogenic cell suspension cultures. Plant Cell Rep., 8, 714-717.

162. Reed, B. M. Schumacher, L. Wang, N. D Achino, J., Barker, R. E. (2006) Cryopreservation of bermudagrass germplasm by encapsulation dehydration. Crop Sci., 46,6-11.

163. Rey H.Y., Faloci M., Medina R., Dolce N., Mroginski L., Engelmann F.2009) Cryopreservation of in vitro grown shoot tips and apical meristems of the forage legume Arachispintoi. Cryoletters, 30, 347-358.

164. Rostiana O., Niwa M., Marubashi W. (1999) Efficiency of inter-simple sequence repeat PCR for detecting somaclonal variation among leaf-cultureregenerated plants of horseradish. Breed. Sci., 49, 245-250.

165. Ryynanen L., Aronen T. (2005) Genome fidelity during short- and long- term tissue cultured and. differentially cryostored meristems of silver birch (Betula penduld). Plant Cell Tiss. Org., 83, 21-32.

166. Sakai A., Kobayashi S., Oiyama I. (1990) Cryopreservation of nucellar cells of navel orange (Citrus sinensis Osb. var. brasiliensis Tanaka) by vitrification. Plant Cell Rep., 9, 30-33.

167. Sala F., Cella R., Rollo F. (1979) Freeze-preservationof ricecells grown in suspension culture. Physiol Plant., 45, 170-176.

168. Salaj T., Matusikova I., Panis B., Swennen R., Salaj J. (2010) Recovery and characteristics of hybrid firs (Abies alba x A. cephalonica, Abies alba x A. numidica) embriogenic tissues after cryopreservation. Cryoletters, 31, 206-217.

169. Sano H., Kamada I., Youssefian S., Katsumi M., Wabiko H. (1990) A single treatment of rice seedlings with 5-azacytidine induces heritable dwarfism and undermethylation of genomic DNA. Mol. Gen. Genet., 220, 441-447.

170. Schwartz D., Dennis E. (1986) Transposase activity of the Ac con- trolling element in maize is regulated by its degree of methylation. Mol. Gen. Genet., 205, 476-482.

171. Scocchi A., Faloci M., Medina R., Olmos S., Mroginski L. (2004) Plant recovery of cryopreserved apical meristem-tips of Melia azedarach L. using encapsulation/dehydration and assessment of their genetic stability. Euphytica, 135, 29-38.

172. Sisunandar, Rival A., Turquay P., Samosir Y., Adkins S.W. (2010) Cryopreservation of coconut (Cocos nucifera L.) zygotic embryos does not induce morphological, cytological or molecular changes in recovered seedlings. Planta, 232, 435-447.

173. Skyba M., Urbanova M., Kapchina-Toteva V., Kosuth J., Harding K, Cellarova E. (2010) Physiological, biochemical and molecular characteristics of cryopreserved Hypericum perforatum L. shoot tips. Cryoletters, 31, 249-260.

174. Smulders M. J. M., Rus-Kortekaas W., Vosman B. (1995) Tissue culture-induced DNA methylation polymorphisms in repetitive DNA of tomato calli and regenerated plants. Theor.Appl. Genet., 91, 1257-1264.

175. Sopalun K., Thammasiri K, Ishikawa K. (2010) Vitrification-based cryopreservation of Grammatophyllum speciosum protocorms. Cryoletters, 31, 347357.

176. Sowa S., Oleszczuk S., Zimny J. (2005) A simple and efficient method for cryopreservation of embryogenic triticale calli. Physiol. Plantarum, 27, 237-243.

177. Sugawara Y., Sakai A. (1974) Survival of suspension-cultured sycamore cells cooled to the temperature of liquid nitrogen. Plant Physiol., 54, 722-724.

178. Surenciski, M. R., Dematteis, Mi, Flachsland, E.A. (2007) Chromosome stability in cryopreserved germplasm of Cyrtopodium hatschbachii (Orchidaceae). Ann Bot. Fenn., 44, 287-292.

179. Tan M.P. (2010) Analysis of DNA methylation of maize in response to osmotic and salt stress based on methylation-sensitive amplified polymorphism. Plant Physiol. Biochem., 48,21-26.

180. Tanhuanpaa P., Kalendar R., Schulman A.H., Kiviharju E. (2007) A major gene for grain cadmium accumulation in oat (Avena sativa L.). Genome, 50, 588-594.

181. Tanino, K., Weiser C.J., Fuchigami L.H., Chen T.H.H. (1990) Water content during abscisic acid induced freezing tolerance in bromegrass cells. Plant Physiol., 93, 460-464.

182. Touno K., Yoshimatsu K., Shimomura K. (2006) Characteristics of Atropa belladonna hairy roots cryopreserved by vitrification method. Cryoletters, 27, 65-72.

183. Turhan H., Baser I. (2004) Callus induction from mature embryo of winter wheat (Triticum aestivum L.). Asian J. Plant Sci., 3, 17-19.

184. Turner S.R., Krauss S.L., Bunn E., Senaratna T., Dixon K., Tan B., Touchell D.H. (2001a). Genetic fidelity and viability of Anigozanthos viridis following tissue culture, cold storage and cry ©preservation. Plant Sci., 161, 1099-1106.

185. Turner S.R., Senaratna T., Touchell D.H., Bunn E., Dixon K.W., Tan B. (2001b) Stereochemical arrangement of hydroxyl groups in sugar and polyalcohol molecules as an important factor in effective cryopreservation. Plant Sci., 160, 489497.

186. Ulrich J.M., Finkle B.J., Moore P.H., Ginoza H. (1979) Effect of a mixture of ciyoprotectants in attaining liquid nitrogen survival of callus cultures of a tropical plant. Cryobiology, 16, 550-556.

187. Urbanova M., Kosuth J., Cellarova E. (2006) Genetic and biochemical analysis of Hypericum perforatum L. plants regenerated after cryopreservation. Plant Cell Rep., 25; 140-147.

188. Vannini G. L., Poli F. (1983) Binucleation and abnormal chromosome distribution in Euglena gracilis cells treated with dimethyl sulfoxide. Protoplasma, 114; 62-66.*

189. Volk G.M., Harris J. L., Rotindo K.E. (2006) Survival of mint shoot tips after exposure to cryoprotectant solution components. Cryobiology, 52", 305-308!

190. Walters C., Touchell D:H., Power P., Wesley-Smith, J., Antolin, M.F. (2002) A cryopreservation protocol for embryos of the endangered species Zizania texana. Cryoletters, 23, 291-298.

191. Wang J. H. Bian H.W., Zhang Y.X., Cheng H.P. (2001) The dual effect of antifreeze protein on cryopreservation of rice (Oryza sativa L.) embryogenic suspension cells. Cryoletters, 22, 175—182.

192. Wang J.H., Huang C.N. Cryoprecervation of Hordeum (Barley). In: Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 50. Cryopreservation of Plant Germplasm II, Towill L.E., Bajaj Y.P.S. (eds.) New Delhi: Oxford & IBH, 2002. pp. 120-135.

193. Wang Q., Gafny R., Sahar N., Sela L, Mawassi M., Tanne E., Perl A. (2002) Cryopreservation of grapevine (Vitis vinifera L.) embryogenic cell suspensions by encapsulation-dehydration and subsequent plant regeneration. Plant Sei., 162, 551558.

194. Wang Q., Valconen J.P.T. (2009) Improved recovery of cryotherapy-treated shoot tips following thermotherapy of in vitro-grown stock shoots of raspberry (Rubus idaeus L.). Cryoletters, 30, 171-182.

195. Wang Z., He Y. (2009) Effect of cryopreservation on the development and DNA methylation patterns of Arabidopsis thaliana. Life Sei. J., 6, 55-60.

196. Wang Z.Y., Legris G., Nagel J. Potrykus I., Spangenberg G. (1994) Cryopreservation of embryonic cell suspensions in Festuca and Lolium species. Plant Sei., 103, 93-106.

197. Ward A.C.W., Benson E.E., Blackhall N.W., Cooperbland S., Powell W., Power J.B., Davey M.R. (1993) Flowcytometric assessments of ploidy stability incryopreserved' dihaploid Solarium tuberosum and wild Solanum species. Gryoletters, 14, 145-152.

198. Watanabe K., Kuriyama A., Kawai F.,, Kanamori. M. (1999) Effect of cryoprotectant treatment and- post-thaw washing on the survival-, of cultured1 rice (Oryzasativa L.) cells after cryopreservation. Gryoletters, 20; 377-382.

199. Watanabe.K., Steponkus P.L. (1995) The vitrification of Oryza sativa L. cells. Gryoletters, 16, 255-262."

200. Wilkinson? T., Wetten A., Fay M.F. (1998) Cryopreservation; of Cosmos atrosanguineus shoot< tips by a modified encapsulation/dehydration method.-Ciyoletters, 19,293-302.

201. Wilkinson T., Wetten A., Prychid C., Fay M.F. (2003) Suitability of cryopreservation for the long-term storage of rare and endangered plant species: a case history for Cosmos atrosanguineus. Ann. Bot., 91,65-74.

202. Withers L.A. (1978) The freeze-preservation of synchronously dividing cultured' cells of Acer pseudoplantanus L. Cryobiology, 15, 87-92.

203. Withers L.A., King P; J. (1979) Proline A novel cryoprotectant for the freeze-preservation of cultured cells of Zea mays L. Plant Physiol., 64, 675-678.

204. Withers L.A., Street H.E. (1977) Freeze preservation of cultured plant cells. III. The pregrowth phase. Physiol. Plant., 39, 171-178.

205. Wm Y., Zhao Y., Engelmann F., Zhou- M. (2001) Cryopreservation of kiwi shoot tips. Cryoletters, 22, 277-284.

206. Yamuna G., Sumathi V., Geetha S.P., Praveen K., Swapna N., Nirmal B.K. (2007) Cryopreservation of in vitro grown shoots of ginger (.Zingiber officinale Rose.). Cryoletters, 28, 241-252.

207. Zale J:M., Borchardt-Wier H., Kidwal K.K., Stebar C.M. (2004) Callus induction and plant regeneration from mature embryos of a diverse set of wheat genotypes. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 76, 277-281.

208. Zarghami R., Pirseyedi M., Hasrak S., Sardrood B.P. (2008) Evaluation of genetic stability in cryopreserved Solanum tuberosum. Afr. J. Biotechnol., 1, 2798

209. Zhang Y.X., Wang J.H., Bian H.W., Zhu M.Y. (2001) Pregrowth-desiccation: a simple and efficient procedure for the cryopreservation of rice (Oryza sativa L.) embiyogenic suspension cells. Cryoletters, 22, 221-228.

210. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. (1994). Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, 20, 176-183.2802.