Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОЛУЧЕНИЕ ФОРМ ПШЕНИЦЫ TRITICUM AESTIVUM УСТОЙЧИВЫХ К ГРИБУ SEPTORIA NODORUM В УСЛОВИЯХ IN VITRO

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ПОЛУЧЕНИЕ ФОРМ ПШЕНИЦЫ TRITICUM AESTIVUM УСТОЙЧИВЫХ К ГРИБУ SEPTORIA NODORUM В УСЛОВИЯХ IN VITRO"

Д-ЫИ1

На правах рукописи

ЛЕТИ ДЖОС

ПОЛУЧЕНИЕ ФОРМ ПШЕНИЦЫ TRITICUM AESTIVUM УСТОЙЧИВЫХ 1СТРИБУ SEPTORIA NODORUM В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Специальность 03.00.23 — биотехнология

. . - Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

МОСКВА 1998

'C-L : >ли С с'

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной б.м технологии Московской сельскочо^киствеиноЛ академии им К. А Тимирязева

Научный руководитель — кандидат биологических наук Е. А. Калашникова.

Официальные оппоненты доктор биологических тук В. В. Мазин, доктор биологических наук Ю. JI. Гудков.

Ведущее учреждение — Институт физиологии раитиши РАН.

Защита диссертации состоится . 1999 г

i,, со

в >7 . час на заседании тиссертационного contra Д 120 Ь 07 в »Московской сельскохозяйственной академии itveini К Л. Тимирязева

Адрес. 127550, г. Москва И—550, ул Тимиоязевская, 49, отдел защиты диссертаций

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной н^уч ной библиотеке МСХА.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета — доктор биологических наук . / Е. Е Крастина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Значительным резервом повышения продуктивности зерновых культур является снижение потерь урожая от болезней, среди которых значительную опасность представляет септориоз.' На пшенице развивается 10 видов рода Septoria, из которых наиболее часто встречаются следующие: S.graminis, S.tritici, S.nodorum.

Заболевания пшеницы, возникающие в следствие поражения растений указанными ' грибами, , встречаются повсюду, но наибольший вред септориозы приносят ее посевам в южных странах ( в Индии, Румынии, Испании, Италии, южных районах Америки, Африки и т.д.). Значительное угнетение пшеницы септориозами отмечено при развитии болезни на ослабленных растениях, пораженных, например, ржавчиной, насекомыми и др.

S. nodonim - наиболее распространенный и опасный возбудитель септориоза у пшеницы, ячменя, овса, ржи, поражающий все надземные органы растений. Наиболее вредоносно поражение колосьев и зерен, поскольку ведет к потере урожая не только в год посева, но и на следующий год, так как у зараженных семян снижается энергия прорастания и полевая всхожесть.

Традиционные методы селекции позволяют создавать сорта пшеницы, обладающие устойчивостью к септориозу в той или иной степени, однако селекционный процесс, как известно, очень трудоемкий и весьма длительный.

Использование методов биотехнологии, в частности культуры изолированных клеток, тканей и органов растений, позволяет сократить сроки проведения селекции и повысить ее эффективность. Особое внимание заслуживает клеточная селекция, позволяющая в лабораторных условиях in vitro отбирать из многомиллионных каллусных клеточных популяций резистентные клетки, а затем из них получать целые растения. Работы в этом направлении ведутся с люцерной, картофелем, ячменем, томатами, свеклой и другими культурами.

Работы по клеточной селекции пшеницы на устойчивость к болезням, малочисленны и носят пока поисковый характер. Поэтому изучение влияния биотических факторов на рост клеток пшеницы и селекция устойчивых к болезням клеточных линий с последующей регенерацией измененных растений приобретает не только теоретическое, но и практическое значение.

центральная научная 0,5л; .отека Моск. сэуъсисхсо. академии им, К. А. |-;..,|..рязева

низ ш Щ

Цель и ¡адлчи исследования Целью данной работы было создание новых форм пшеницы устойчивых к грибу S nodonmi и изучение особенностей ответа клеточных популяций на присутствие в питательной среде культурального фильтрата данного гриба

Дая достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи

- оценить вклад физиологического состояния первичного экспланта в процесс формирования калл\сной ткани,

- изучить влияние состава питательной среды на процесс формирования каллусной ткани различных генотипов пшеницы,

- подобрать оптимальные условия культивирования гриба S nodorum с цетью получения культурального фильтрата обладающего определенной токсичностью,

- провести клеточную селекцию и отобрать устойчивые к культуральному фильтрату клеточные линии и получить из них растения-регенеранты,

- провести анализ, полученных растений

Научная новизна Впервые разработана и предложена система, позволяющая проводить клеточную селекцию пшеницы на устойчивость к грибу Septona nodorum Показано, что в ответ на присутствие в пиательной среде культурального фильтрата гриба существуют принципиальные различия в способности зрелых и незрелых зародышей формировать каллус Установлено, что среди исследуемых генотипов пшеницы встречаются сорта, которые по устойчивости к культуральному фильтрату гриба на клеточном уровне превосходят остальные изученные Впервые, проведена клеточная селекция пшеницы на устойчивость к грибу S nodorum и получены растения-регенеранты Методом RAPD анализа оценена устойчивость, полученных растении-регенерантов

Прдктическля значимость Полученные в результате работы новые формы пшеницы могут служить основой для создания новых сортов обладающих устойчивостью к грибу S nodorum Это вевою очередь по)волит сократить потери урожая от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды

Апробация рлботы Результаты исследования представлены на конференции Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве животноводстве и ветеринарии" (1496) на челду народных конференциях Регуляторы роста и развития растении (1497) Киология клеток растений in vitro, биотехнология и ^охранение генофонда (1997) 'Молекулярная генетика и биотехнология' (19^8) на симпозиуме в Вашингтоне "In vitro in

Biology"" (1997), а также на заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав: обзора литературы, объекты и методы исследования, результаты и обсуждения ( три главы ). а также выводов и списка литературы.

Материал диссертации изложен на 107 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц, 24 рисунка. Библиография содержит 153 источников, из которых 51 зарубежной литературы,

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили 8 генотипов яровой мягкой пшеницы, обладающих различной устойчивостью к септориозу. К устойчивой группе относятся - WW-15370, Gaterin temps, 81S-8,91S-10; среднеустойчивой - Московская-35, Энита; неустойчивой-Саратовская-29, Fortuna. Семена,всех изучаемых генотипов, были любезно предоставлены сотрудниками кафедры селекции и семеноводства полевых культур ТСХА.

В качестве первичного экспланта использовали зрелые и незрелые зародыши, а также семена. Каллусную ткань получали из зрелых и незрелых зародышей (14-16 день после цветения) пшеницы. Для работы использовали растения, выращенные в полевых условиях. Изолирование зародышей осуществляли только из зерновок, располагающихся в средней части колоса.

В работе придерживались принятых на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА принципов стерилизации растительного материала, питательных * сред, инструментов и посуды, изложенных в "Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии" (1996). Условия получения и культивирования каллусной ткани пшеницы. Для индукции и субкультивирования каллуса использовали модифицированную питательную среду Мурасига и Скуга. В качестве веществ ауксинового типа действия испытывали 2,4-Д в различных концентрациях ( 2 , 3, 4, 5 мг/л), а также в сочетании с цитокининами: кинетин. (0,5 мг/л), зеатин (0,5мг/л), 6-бензиламинопурин (БАП) (0,5 мг/л)

Культивирование проводили при температуре 27°С и постоянном освещении . Пересадки на свежую питательную среду осуществляли каждые 4 недели и су б кул ьти в и р о в ал и<гол ь ко морфогенный каллус. Интенсивность роста каллуса обозначали как относительный рост и

определял и , как отношение при роста кхллусэ к весу жспланта Вес жспланта обычно составлял 20-30мг Прирост биомассы в стрессовых условиях выражали как % к контролю те к росту каллуса данной линии на неселективной среде

Чистая культура гриба S nodonim была предоставлена нам Институтом фитопатологии (г Галицино) Гриб выращивали на модифицированной жидкой среде MS Токсичность КФ и гриба на агаре определяли на 14-ый день культивирования гриба по методике О А Берестецкого ( )

Клеточная селекция Клеточную селекцию проводили на агаризованных питательных средах, содержащих КФ в концентрациях 5, 10, 15. 20% В работе было применено 3 схемы селекции 1) 4 пассажа на селективном среде 1 пасслж без селективного фактора, 4 пассажа на селективной среде и регенерация растений 2) культивирование каллусов на селективно» среде с увеличением концентрации КФ от до 20°о при каждом с>бкультивировании ( 4 пассажа ) 1 пассаж бе! селективного фактора и повторное культивирование кал л\сон на се 1ективны\ средах с увеличением концентрации КФ от дс 20"о чередование культивирования каллусов на се icktiibihi\ и неселеетивных средах в те leime 6 пассакеи с последующей регенерацией растении

Выбранные схемы селекции оыли анрооироалны на ка.п\си\ полученных как из зрелых тлк и нефелпх прошипи 8 геногип > пшеницы

Совместное к\ льгивиров шие гриба Ь noduruni и к и псов полученных из зрелых иролышеп пшеници пропо 1или в течение 2 пассажей

Анализ растении регенер тгов v помощью 1<АРР че о,и Выделение ДНК из растении исходного сорт] и расгении-регенерантов проводили по модифицированной методике Eiiv\ards et al (1991) Амплификацию ДНК проводили по стандартной методике Полимеразную цепную реакцию проводили в лмплификаторе «Perken Emler» ( США ) для проведения реакции испольювали наборы реактивов «Promega» (США)

Для выявления полиморфизма использовали 11 различных праймеров Данные праимеры были выбранны в связи с тем, что ранее они использовались для выявления межсортового и внутрисортового полиморфизма у ячменя (HorJcum vulgare твердой пшеницы (Truicum durum)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Раздел 1. Зависимость каллусогенеза и морфогенеза пшеннцы от условий культивирования первичного экспланта.

1.1.Особенности каллусогенеза и морфогенеза различных генотипов пшеницы.

Необходимым условием использования культивируемых клеток для улучшения сельскохозяйственных культур является возможность регенерации из них растений. Поэтому на первом этапе работы особое внимание было уделено образованию каллусной ткани и зависимости этого процесса от генетических и физиологических факторов.

Зрелые и незрелые зародыши, 8 исследуемых генотипов пшеницы, культивировали на модифицированной питательной среде Мурасига и Скуга, содержащей 2,4-Д в концентрации 2 мг/'л (Табл.1).

- Таблица 1.

Зависимость каллусогенеза и морфогенеза от исходного генотипа (культивирование зрелых зародышей / незрелых зародышей

_на среде МС с 2,4-Д 2 мг/л)._____

| Генотип | ЧИСЛО ЗАРОДЫШЕЙ ( в % ) ОБРАЗУЮЩИХ

Каллус Морфогенный каллус Проросток

\VW-15370 30,0 / 28,3 0/11,6 50,0/45,0

ОЖепп 32,0/25,0 0/6,0 52,0/45,0

815 28,0 / 23,3 0/13,3 52,0/43,3

915 18,0/25,0 0 / 8,3 56,0/36,6

Московск-35 30,0 / 23,3 0 / 20,0 52,0 / 45,0

Энита 28,0 / 23,3 0/16,6 56,0/43.3

РогПта 20,0 / 23,3 0/11,6 52,0 / 38,3 .

Саратов.-29 32,0 / 25,0 0/18,3 60,0 / 46,6

Визуальные наблюдения показали, что под влиянием 2,4-Д ткани зрелого и незрелого зародыша начинают неорганизованно делиться, образуя каллусную ткань. Чаще всего каллусная ткань была неоднородной и состояла из рыхлых, оводненных участков и более плотных, структурированных тканей с выраженными меристематическими очагами .При сравнении морфологии каллусов, полученных из зрелых и незрелых зародышей пшеницы нами было отмечено, что каллусная ткань, полученная из незрелых зародышей

отличалась более плотной консистенцией Это было связано с тем что в такой ткани интенсивнее формировались меристечатические очаги ( от 6% до 20% в зависимости от генотипа ), в то время как в каллусной ткани из ¡релых мродышей этот npom.cc отсутствовал

Так как для зрелых зародышей не удалось получить высокоморфогенной каллусной ткани, то в последующей серии экспериментов была изучена зависимость этого процесса от условии культивирования

1.2. Изучение морфогснетичесних потенций ш vitro изолированных зрелых зародышей пшенины в зависимости от условий культивирования. В первой серии экспериментов было изучено влияние различных концентраций 2,4-Д на процесс каллусогенеза и морфогенеза

Было установлено, что все исстедуемые в работе генотипы пшеницы способны в той или иной степени образовывать каллус Причем визуальные наблюдения позволили выявить ряд закономерностей, которые проявлялись в самом процессе формирования каллусной ткани Как правило, этот процесс начинался с дедифференцировки нижних клеточных слоев зародыша, которые находились в непосредственном контакте с питательной средой Спустя 14 дней клетки зародышей полностью дедифференцировались и образовывалась во всех вариантах рыхлая, оводненная каллусная ткань светло-желтого цвета Одновременно с этим, в зависимости от концентрации 2,4-Д в питательной среде, можно было наблюдать рост меристематической части зародыша и формирование проростка

Установлено прямая зависимость между концентрации 2,4-Д в питательной среде и интенсивностью каллусогенеза с увеличением концентрации ауксина резко возрастет способность клеток зародыша к дедифференцировке Причем показно.что этот процесс зависит и от генотипа первичного экспланта Так, ¡ародыши сортов Московская-35, Саратовская-29, 81S, Gatenn, WW образовывали неморфогенную каллусную ткань во всех испытанных концентрациях 2,4-Д в 15-80% случаев, в то время как для сортов Fortuna, Энита, 91S этот показатель находился в пределах 10-38%

Одновременно с формированием неморфогенной каллусной ткани, в некоторых вариантах было отмечено образование морфогенных зон, дающих начало развитию побегам ( 2-10%)

Таким образом, результаты экспериментов позволили заключить, что использование 2,4-Д в концентрациях 2 и 3 мг/л являются оптимальными для культивирования зрелых зародышей с целью получения хорошо пролиферируюшей каллусной ткани Эти данные

-

полностью совпадают с результатами ряда авторов, которые изучали зависимость каллусогенеза картофеля, кукурузы и других культур от состава питательной среды по содержанию 2,4-Д ( Аветисов,1997, Cai Tishu and И, 1989, Mathias and all, 1986, О Нага, 1978).

Таблица 2.

Влияние сочетания 2,4-Д ( 2 мг/л) с различными цитокининами ( 0,5 мг/л ) на морфогенетический потенциал зрелых зародышей

пшеницы._

| Генотип | Вариант | ЧИСЛО ЗАРОДЫШЕЙ ( В% ) ОБРАЗУЮЩИХ |

каллус . морфогенный пророс побег с

каллус ток одновр.

Образ.ка

лл\са

WW- 1 35,7 7,1 26,1 38,0

15370 2- , 35,8 5,1 33,3 36,7

3 27,0 2,7 . 40,5 32.4 '

Gaterin 1 40,4 7,1 23,8 35,7.

2 36,5 4,8 26,8 - 36,5

3 32,4 2,7 40.5 27,0

8IS 1 43,9 7,3 22,0 ' 34,1

2 • 41,4 . 7,3 26,8 31,7

3 31,5 2,6 47,4 21,6

91S I 32,5 7,5 42,5 25,0

2 30,7 7,6 48,7 20,5

3 21,1 5,2 57,9 21.1

Москов. 1 33,3 . 10,4 27,0 39,5

35 2 31,9 8,5 29,7 38,2

3 31,7 7,3 34,1 34, i

Энита 1 32,6 8,6 32,6 34,7

2 34,1 7,3 34,1 39,0

3 32,5 2,5 42,5 25,0

Fortuna 1 32,4 5,4 35,1 32,4

2 29,7 5,4 43,2 27,0

3 27,2 3,0 51,5 21,2

Саратов 1 36,1 10,6 17,0 46,8

.-29 2 33,3 8,8 26,6 40,0

3 31,7 4,8 34,1 34,1

Примечание: * 1 - 2,4-Д + зеатин ; 2 - 2,4-Д + кинетин

3-2,4-Д+БАП

В другой серии экспериментов было изучено влияние сочетания 2,4-Д с различными цитокининами на процесс каллусогенеза и морфогенеза изолированных зрелых зародышей пшеницы Полученные результаты представлены в таблицах 2 и 3 Из данных представленных в таблицах четко видно, что на фоне постоянной концентрации цитокинина ( 0,5 чг/л ), но с повышением 2,4-Д от 2 мг/л до 3 мг/л во всех вариантах резко возрастает способность зародышей формировать морфогенную коллусною ткань Причем в варианте 2,4-Д 2 мг'п и цитокинин чисто морфогенных каллусов не превышает 2,5 - 10,6о/о В то время как в варианте с 2,4-Д 3 мг'л этот показатечь находился в преде пах 16 7 - 60 0%, что примерно в 6 - 8 раз выше предыдущего варианта

Таолица 3

Влияние сочетания 2,4-Д ( 3 мг/т) с различными цитокининами ( 0,5 мг/л ) на морфогенетический потенциал зрепых зародышей

пшеницы___

| Генотип | Вариант | ЧИСЛО ЗАРОДЫШЕЙ (В%) ОБРАЗУЮЩИХ

1 каптус морфогенныи проросток

каллус

\V\V- 1 70,0 60,0 40,0

15370 2 100 60,0 0

3 83 3 1о 7 1й 0

81Б 1 70,0 30 0 40 0

2 63 6 36 3 36 3

Москов - 1 47,1 42,8 42,8

35 60 0 40 0 40 0

Энита 1 66,6 33,3 33 3

2 75,0 50,0 25,0

3 71 4 28 < 28 5

РогТипа 1 83 3 33 3 16 6

2 80 0 60 0 20 0

Саратов - 1 80,0 40,0 20,0

29 2 80 0 40 0 20 0

Примечание * 1 - 2,4-Д * зеатин 2 - 2,4-Д - кинетин 3 - 2,4-Д - БАП

На наш взгляд, механизм такого стимулирования можно объяснить тем, что под действием ауксина активизируется

протонная помпа и связанная с ним источение клеточной стенки за счет эффекта "кислого роста", а также индукция синтеза ряда ферментов, которые могут вызывать частичный гидролиз клеточной стенки. Все это, в свою очередь, способствует более интенсивному проникновению цитокининов в клетку, а значит и оказывает непосредственное положительное влияние на процесс дифференциации. Из всех изученных цитокининов наибольшую активность проявили зеатин и кинетин. В этих вариантах наблюдалось формирование морфогенной каллусной ткани в 30 -60% случаев, в то время как в варианте с БАП этот показатель не превышал 16,7 - 28,5%.

Таким образом, установлено положительное влияние 2,4-Д в концентрации 3 мг/л в сочетании с зеатином или кинетином 0,5 мг/л на формирование морфогенной каллусной ткани. Поэтому такое сочетание гормонов мы выбрали за основное и использовали в последующей работе для получения каллуса, сохраняющего высокий морфогенетический потенциал на протяжении ряда субкультивирований и при клеточной селекции.

1.3. Изучение морфогенетических потенций in vitro изолированных незрелых зародышей пшеницы в зависимости от условий культивирования. '

Для . незрелых зародышей были также как и для зрелых зародышей проведены эксперименты по изучению влияния различных концентраций 2,4-Д, а также сочетания с различными цитокининами на процесс формирования каллусной ткани. Установлено, что присуствие 2,4-Д в питательной среде в концентрации 2 или 2,5 мг/л положительно влияло на способность изолированных незрелых зародышей образовывать каллусную ткань. Последующее культивирование первичной и пересадочной каллусной ткани, в этих условиях, приводило к формированию морфогенной каллусной ткани в пределах 30-52,5%, Причем этот показатель зависел от генотипических особенностей исследуемого объекта (Табл.4).

Так, каллусная ткань сортов Моековская-35, Энита и Сара"юоская-29 обладала повышенной морфогенетической активностью и через три субкультивирования этот показатель достигал 45-52,5%, в то время как для остальных генотипов он составлял 30-40% Прирост каллусной ткани также зависел от исследуемого генотипа, а в вариантах не отличался друг от друга ( Рис. 1 )

Спонтанное формирование растений-регенерантов (2,5%) было отмечено лишь в вариантах с присутствием 2,4-Д в концентрации 2

мг'т Поэтому данную концентрацию использовали в поспед\юших жспериментах по морфогенезу и в работах по клеточной апекиии Кльтивирование незрелых зародышей на питательной среде, содержащей 2,4-Д и один из изучаемых цитокииииов не приводило к значительному увеличению морфогенегическои активности и прироста первичной каллусной ткани Во всех вариантах исследования эти показатели зависели от генотипа но не различались по вариантам

Таким образом, для получения хорошо пролиферируюшеи каллусной ткани, целесообразно культивировать незречые зародыши на питательной среде МС, содержащей 2,4-Д в концентрации 2 мг ч, а для получения морфогенной каллусной ткани целесообразно дополнять питательную среду зеатином в концентрации 0,5 мг/л

Таблица 4

Характеристика каллусной ткани после трех субкультивирований

Генотип I Конц 2,4 Д КАЛЛУС, %

1 мг/л

неморфоге- морфогенн- растения -

нный ый регенераты %

WW-15370 2 17,5 40,0 0

2,5 20,0 32 5 0

Gatenn 2 15,0 37,5 2,5

2,5 20 0 40 0 0

81S 2 17,5 42,5 0

2 5 150 45 0 0

91S 2 25,0 35,0 0

2.5 27 5 30 0 0

московс -35 2 12,5 50,0 0

2,5 17 5 52 < 0

Энита 2 17,5 45,0 2 5

2.5 20.0 47 5 0

Fortuna 2 17,5 37,5 2,5

2,5 20 0 35,0 0

Саратов -29 2 22,5 47,5 0

2,5 25 0 50 0 0

-Y0-

, □ 2,4 О- 2 Мг/л , ■ 2.4 О -2,5 Мг/л '

Рис. 1. Зависимость прироста каллусной ткани от состава питательной среды.

1.4. Получение растений-регенерантов из каллусной ткани и последующая их адаптация к почвенным условиям.

Для получения растений - регенерантов каллусную ткань, из всех изучаемых вариантов, переносили на питательную среду МС, содержащую 2,4-Д 0,1 мг/л и зеатин 1 мг/л. Известно, что морфогенез в культуре клеток пшеницы идет двумя путями: или через соматический эмбриогенез, или через органогенез. В нашем случае, в этих условиях мы наблюдали образование меристематических очагов по всей поверхности каллусной ткани, которые в дальнейшем развивались в нормальные побеги (органогенез). Для укоренения сформировавшихся побегов использовали безгормональную питательную среду, содержащую 1/2 минерального состава солей по МС. Через 4 недели культивирования формировалась хорошо развитая корневая система, после чего осуществляли перенос растений - регенерантов в почвенные

. У/-

условия Приживаемость растений составила "'5-80% независимо от исследуемого генотипа Таким образом, проведенные исследования позволили разработать систему по получению хорошо проаиферирчющей морфогенной калтчснои ткани которая в дальнейшем была нами использована в работе по клеточной резекции на устойчивость к грибу Septona nodorum и lio метаболитам

Разлет 2 Влияние i рнбл Septoru nodorum и ею метаболитов на прорастание изолированных иродынап п имин пшеницы.

2.1. Влияние метаболитов гриба> nodorum на прорастание семян пшеницы .

Для получения КФ гриб S nodorum выращивали в жидко» питательной среде При гаком способе выращивания гифы гриба сплетались в 'клубки', образ\я при этом видимые визуально структуры шарообразной формы разных размеров Цвет питательной среды при этом изменялся на темно-коричневый Через 7 дней культивирования гриба S nodorum в жидкой цитате тьмой среде был получен культуральныи фильтрат, который в дальнейшем использовали в работе по определению его токсичности

Наши исследования показали, что КФ гриба S nodorum в различных разведениях оказывает в той или иной степени токсичное действие на прорастание семян пшеницы ( сорт Саратовская-29 ) ( Табл 5 )

Габ шца

Прорастание семян пшеницы на 7 и дневном КФ гриба

Вариант Средняя длина Средняя длина корней Токсичн

побега см см ость КФ

на 5-й

день %

День наблюдения

2-й 3-й 5-й 2-Й 3-й 5-й

контроль 041 1 68 7,46 1,24 3 09 7,66

В % к контролю

КФ 25% 134 1 145 8 121,8 107 3 91 3 75 6 1,6

КФ 50% 117,1 126 8 125 6 100 8 70 9 55 9 9 75

КФ 75% 87,8 92 8 95 5 69,3 51.7 40,4 32,4

КФ 100% 80 5 69 0 76 4 53,2 31 1 21 1 51,6

-/«г-

Однако следует отметить что даже при разведении 100% токсичность КФ составила всего лишь 51,6° о, а при разведениях 25 и 50% она была очень низкой соответственно 1,6 и 9,7% Последнее было обусловлено значитепыюй стимуляцией роста зеленой массы ( стебля ) в этих вариантах по сравнению с контролем на протяжении всего времени наблюдений (5-7 дней ) Объяснить указанное явление можно на основании уже существующих данных по S nodorum В частности в культуральной жидкости S nodonun были обнаружены 4 токсина, 2 из которых - охрацин и септорин-выделены и прошли испытания на семенах пшеницы, а 2 других до сих пор известны только в синтезированном виде ( Никутенко Т Ф , 1987) Экспериментально установлено, что охрацин и септорин в пониженных концентрациях ( 5 мг/л ) оказывают стимулирующее действие на рост корней и побегов Такое количество данных токсинов можно получить из 200 мл культурального фильтрата гриба Вероятно, выбранное нами разведение КФ содержало то минимальное количество токсинов, которое заметно усиливало прорастание семян и формирование более мощного побега по сравнению с контролем Определив экспериментально токсичность 7-и дневного КФ гриба на сорте Саратовская-29 аналогичная работа нами была проведена и на других генотипах пшеницы Полученные данные изображены на диаграмме (Рис 2) Из нее видно, что семена, испытанных генотипов пшеницы, проявили различную чувствительность к присутствию КФ гриба при прорастании Так, сорт Энита и гибрид 91S-10 оказались устойчивыми к КФ гриба ( токсичность 3,93° о и 6,54% соответственно). Fortuna, Московская-35, Саратовская-29 81S-15 - средне устойчивыми ( токсичность КФ 19,37 - 49,18% ), а сорт üatenn и гибрид WW оказались не устойчивыми к КФ гриба Для этих сортов токсичность КФ составила 71,24% и 95,3% соответственно

/

Устойчивость

. Генотип

Рис .2. Устойчивость различных генотипов пшеницы к КФ гриба.'

2.2. Определение токсичности КФ гриба Б. по<1огит на развитие изолированных зародышей пшеницы.

Исходя из первых полученных данных мы попытались определить токсичность КФ на изолированных зародышах и установить существует ли закономерность в действии КФ на формирование проростков из семян и изолированных зародышей (Табл. 6, рис. 3).

Результаты наблюдений показали, что с увеличением разведения КФ в питательной среде возрастает его токсичность, и при 75% разведении она достигает максимума - 90,5-100%. Также следует отметить, что с увеличением времени выращивания Б. пос1огшп в жидкой питательной среде, вероятно, увеличивается накопление токсинов в КФ. Так, достаточно высокая токсичность (67,3% ) у 14-дневного КФ даже при концентрации 25%. Наличие в питательной среде 11- и 14-дневного КФ в разведении 50% также было токсично для образования проростков из изолированных зародышей, в то время как 7-дневный КФ в той же концентрации был практически нетоксичен, а наоборот, стимулировал формирование более длинной корневой системы ( 2,9 см по сравнению с 1,9 см в контроле ).

Габ.иша 6

Прорастание изолированных зародышей пшеницы _ ( сорт Саратовская-!!')) _

Вариант Средняя длина побега, Средняя длина корней ,

см см

Время выращивания гриба в жидкой питательной _среде , дни_

7 11 14 7 11 14

Контроль 12,0 12,0 12,0 1,9 1,9 1,9

В % к контролю

КФ 25% 120 8 52,5 30,8 242,2 121,0 73,7

КФ 50% 84 2 20,8 8 3 152,6 15,8 5 3

КФ 75% 83 0,8 0,8 105 0 0

Концентрация Кф %

Рис 3 Зависимость токсичности КФ от его разведения и времени

выращивания гриба в жидкои питательной среде Иная картина наблюдалась при использовании 7-дневного КФ в разведении 25% В этом варианте на 20,8°о увеличивался рост побегов и на 142,1% - рост корней по сравнению с контролем

/

Полученные данные еще раз подтверждают тот факт, что токсины, входящие в состав КФ гриба Б. пос!огит, в малых концентрациях стимулируют рост. не только надземной, но и подземной частей проростков пшеницы,, , полученных из изолированных зародышей и семян. Таким образом, можно заключить, что при селекции пшеницы на устойчивость в Берюпа пос!огит целесообразно использовать 11 -и 14-дневные культуральные фильтраты в разведении от 20 до 35%, обеспечивающие 50% токсичность.

2.3,Определение токсичности патогенного гриба Б. побогиш ■ на развитие изолированных зародышей пшеницы. Как правило, клеточную селекцию на устойчивость растений к болезням проводят с использованием КФ гриба. Однако исследователям не всегда удается получить стерильный фильтрат, так как конидии, имеющие большой размер, быстро забивают бактериальный фильтр и культуральный раствор не проходит через него. Для многих видов грибов характерен быстрый рост конидий на агаре, что позволяет наблюдать быстрое зарастание питательной среды грибом. Для Э. по<1огиш это явление нехарактерно. В связи с этим нами были предприняты попытки определить возможность совместного культивирования гриба и изолированных зародышей на одной питательной среде.

Результаты, представленные в таблице 7, свидетельствуют о том, что с увеличением количества кусочков агара с грибом от 3 до 6 шт в одной чашке Петри их токсичность возрастает от 63,6 до 80,1%. Причем, независимо от количества Б. пос!огит в одной чашке, резко снижается рост побегов и корней по сравнению с контролем.

Таким образом, наличие 3 кусочков агара с грибом Б. пос1огит вполне достаточно для проведения работ по клеточной селекции пшеницы на устойчивость к данной болезни.

Раздел 3. Клеточная селекция пшеницы на

устойчивость к Септориозу. 3.1. Влияние культуралыюго фильтрата гриба Бер^па по(1огит на формирование каллусной ткани из незрелых зародышей различных генотипов пшеницы. , В работе было изучено влияние различных концентраций (разбавлений ) КФ гриба на процесс де дифференциации клеток незрелого зародыша различных генотипов пшеницы (таб.8).Было установлено, что с увеличением концентрации КФ в питательной среде уменьшается морфогенетический потенциал изолированных незрелых зародышей формировать морфогенный каллус. Причем для сортов Саратовская-29,Энита и гибрида изолированные

зародыши на питательной среде содержлщий КФ в концентрлци 250/о не были способны формировать морфогенныи каллус Исключение составили лишь генотипы 81S и PIS для которых данный показатель находился в пределах 15 8-26 3°о и не завесил от применяемой концентрации КФ

Можно предпол ожить,что различный баланс 1нд0генны\ гормонов у зародышей пшеницы разных генотипов позволяет им с различной интенсивностью образовывать кэллусную ткань, а также по -разному противостоять стрессу

Таблица 7

Прорастание изолированных зародышей пшеницы при воздействии на них гриба S nodorum культивируемого на агаре

Вариант ( кол-во кусочков агара с грибом .

шт)_

Контроль_

Средняя длина побега , см / % к контролю

14 4

6 9 47 Q 6,0 / 41,7 4 6/31 Q 4 0 / 27 8

Средняя длина корней см /% к контролю

10 1 ~ 2 4/28 7 20/198 12/1)9 0 9 / 8,9

Токсичность S nodorum %

63 6

64 6 77 9 80 1

Таблица 8

Влияние концентрации культурального фильтрата гриба Б nodorum на формирование каллусной ткани пшеницы

__( незрелые зародыши)_

| Генотип | Концентрация культурального фильтрата , %

0 10 15 20 25

WW 20,0 /60 0* 15,8/52,6 10,0/65,0 15,8/47 4 0/400

Gatenn 0/55 0 5 6 / 66 7 21 0/789 5,6 / 72,2 15 8/684

SIS 0/100 21.1/73,7 13,0/69,6 21,0/68 4 10.0/50,0

91S 44 4/55 5 26,3 /42,1 26,3 / 57,9 19,0 '61 9 15 8/42,1

Моек -35 38,1 /33,3 5 3 / 78,9 15,0/55,0 9 5/53,4 10 0/70,0

Энита 51,8/22,2 15 0/75 0 142/71 4 4,8 / 53,4 0/800

Fortuna 45,8 / 50 0 5 0/85 0 13,6/63 6 25,9/44,5 15,8/63,2

Сарат -29 41,0/41,0 0/42 1 143/57 1 13.8/51.7 0/700

Примечание: * в числителе число морфогенных каллусов, в знаменателе число неморфогенных каллусов, выраженное в % от общего числа посаженных зксплантов

3.1. Изучение влияния культурального фильтрата гриба на рост каллусной ткани пшеницы.

Влияние различных концентраций КФ на рост каллусных тканей изучали на тканях, которые находились в условиях in vitro 3 пассажа. В этом случае мы имели стабильно растущие каллусные ткани, способные формировать растения-регенеранты. Каллусную ткань культивировали на агаризованной питательной среде, содержащей ,

КФ в концентрациях 5, 10, 15 и 20% (таб.9).

Таблица 9. f

' 1

Прирост каллусной ткани, полученной из незрелых зародышей пшеницы, в стрессовых условиях.

| Генотип | Концентрация культурального фильтрата , %

5 10 15 20

WW-15370 - 91,6 74,6 70,5

Gaterin 91,4 87,4 54,1 69,9

81S - - 66,9 63,8

91S 89,7 > 80,9 74,6

Москов.-35 96,5 86,6 79,5 74,7

Энита - 85,1 82,6 78,8

Fortuna 92,3 79,0 68,7 65,3

Сарат.-29 92,8 75,2 61,4 58,3

Примечание: * данные приведены в % к контролю.

Установлено , что присутствие КФ гриба в питательной среде в пониженной концентрации (5%) не приводило к существенному снижению прироста каллусной ткани. Для всех изучаемых I

генотипов этот показатель уменьшался в среднем на 5 - 10% по сравнению с контролем. Это говорит о том, что при данной концентрации КФ, каллусная ткань сохраняет высокую пролиферативную активность. Вместе с тем, следует отметить, что в этом варианте морфогенетический потенциал клеток не отличался от контроля и составил 25 -30% .

При увеличении концентрации КФ гриба в питательной среде, снижался прирост каллусной ткани на 25 - 42% по сравнению с контролем в зависимости от исследуемого генотипа. Так,

максимальное уменьшение пролиферативной активности каллусной гкани нами было отмечено для сорта Саратовская-29, для которого этот показатель был ниже контроля на 42° о Уменьшение прироста каллусной ткани в се активных условиях происходило главным образом за счет частичной гибели каллусной ткани и уменьшения способности клеток к морфогенезу

Аналогичные результаты были нами получены и с каллусной тканью, полученной первоначально из зрелых зародышей Единственное отличие, которое было нами отмечено - >то способность каллусной ткани формировать растения-регенеранты В селективных условиях процент каллусов, способных к морфогенезу не превышал 5%

Несмотря на выявленные недостатки дальнейшую клеточную селекцию мы проводили на всех испытанных концентрациях КФ гриба 5 тропил применительно ко всем изучаемым генотипам пшеницы, независимо от физиологического состояния первичного экспланта

3.3. Клеточная селекция пшешшы на устойчивость к грибу Ь подпил Клеточную селекцию мы проводили по традиционным схемам начиная с нулевого или более поздних пассажей Основным принципом селекции было длительное культивирование клеток в стрессовых условиях Для исключения возможности отбора адаптированных линий, клетки способные расти в присутствии КФ возвращали в неселективные vcлoвия и затем продолжали селекцию Регенерацию растений из отобранных клеточных линий старались вести также в присутствии селектир>юшего фактора

Эти исследования были проведены как на калл\се, полученном из незрелых зародышей, так и на каллусной ткани, полученной первоначально из зрелых зародышей

В результате проведенной клеточной селекции нами были получены растения-регенеранты из всех, испытанных в работе генотипов пшеницы Полученные растения-регенеранты характеризовались формированием побегов правильной морфологии и мощной корневой системой, что позволило легко преодолевать адаптацию пробирочных растений к почвенным условиям

В таблице 10 представлены данные о числе полученных растений-регенерантов

Таблица 10.

■ Растения-регенеранты, полученные после клеточной селекции ■ (незрелые зародыши) ■■__

Генотип Схема селекции Число раст. реген. Шт.

Энита 4 (5%Sep) (0 Sep) 4 (5%Sep) 3

Москов.35 4(5%Sep) (0 Sep) 4 (5% Sep) 4 ( 10% Sep) (0 Sep) 4 (10 % Sep) 4 ( 15% Sep) (0 Sep) 4( 15 % Sep) 3 4 . 4 •

Fort una 4 (5%Sep) (0 Sep) 4 (5%Sep) 2

91S ( 10% Sep) ( 0 Sep) (10% Sep) (0 Sep) ( 10% Sep) (0 Sep )( 10% Sep) 4 ( 15% Sep) (0 Sep) 4( 15 % Sep) 2 3

Сарат.-29 (5% Sep) ( 0 Sep) ( 5% Sep) ( 0 Sep) ( 5% Sep) (0 Sep) ( 5% Sep) ( 0 Sep) ( 5% Sep) (0 Sep) 1

Gaterin (5% Sep) (10% Sep) ( 15% Sep) (20% Sep) (0 Sep) (5% Sep) ( 10% Sep) ( 15% Sep) (20% Sep) 2

81S 4 (5%Sep) (0 Sep) 4 (5%Sep) 3

Наряду с работами по отбору клеточных линий пшеницы, устойчивых к культуральному фильтрату гриба Б. по(1огит, нами была проведена работа по совместному культивированию каллусной ткани и патогена. В результате проведенной работы было установлено, что совместное выращивание возможно проводить лишь на протяжении трех пассажей, так-как более длительное культивирование приводило к интенсивному распространению гриба по всей поверхности каллусных тканей. В результате нам не удалось в этом случае провести длительную клеточную селекцию и получить растения-регенеранты.

Таким образом, нам удалось отобрать клеточные линии пшеницы устойчивые к культуральному фильтрату гриба БерЮпа по<1огшп и получить растения-регенеранты. Семена первого поколения были проверены на устойчивость к патогену (по прорастанию). В результате было установлено, что у отобранных семян повышалась устойчивость к КФ гриба на 10-15% по сравнению с исходным генотипом.

3 4. Выявление полиморфизма ДИК у регенератов пшеницы.

Для выявления геномного полиморфизма был проведен ИАРО анализ растений как исходного сорта московская-35, так и его стабильных регенерантов Я], И2, ИЗ , устойчивых к септориозу Для выявления полиморфизма использовали 11 различных праймеров Из всех используемых для ЯДРО анализа праймеров только один -Р12-выявлял полиморфизм V ДНК анализируемых растений

Рис 4 ИАРО спектры сорта Московская-35 и растений регенерантов, полученных при использовании праймера Р12

1-исходный сорт, 2- 3-К2, 4-ГО, растения регенеранты,

устойчивые к действию септории * - Обозначает полиморфные фрагменты

В результате проведенного анализа получены ЯАРО спектры ДНК сорта московская-35 и его трех регенерантов устойчивых к септориозу В 1ШРО спектрах были выявлены полиморфизные фрагменты отличающие у исходного сорта и растений-регенерантов

ВЫВОДЫ

1 Формирование каллусной ткани из 1релых и незрелых зародышей 8 генотипов пшеницы в нормальных и стрессовых условиях существенным образом )ависит от генотипа и физиологического состояния исходного растения Так незрелые зародыши сортов Московская-З4 и ')нита были способны формировать морфогенную каллу сную ткань на 10-) 5% больше чем остальные исследуемы с генотипы

2 Содержание 2 4-Д в концентрации 3 мг I и зеатина 0 5 мг 1 повышает в 2,5-3 раза морфогенетическую аетивность первичной и пересадочной каллусной ткани, полученной из зрелых зародышей

3 Для проведения клеточной селекции пшеницы на устойчивость к болезням целесообразно использовать 14-ти дневный культуральный фильтрат гриба ЬерГопа пос1ошт в концентрации 20% *

4. Изучение влияния культурального фильтрата гриба S.nodoruin на индукцию и пролиферацию каллуса выявило различия по чувствительности между испытанными генотипами.

5. В результате клеточной селекции пшеницы на устойчивость к септориозу получены устойчивые клеточные линии и растения-регенеранты.

6.Анализ растений-регенерантов RAPD методом выявил ■ полиморфизм ДНК у растений-регенерантов по сравнению с исходным сортом.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации :

1.Лети Джое, Е.А. Калашникова. Использование методов Биотехнологии в селекции пшеницы на устойчивость к Септориозу .//Тез. Конф. «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» .1996 . С.-22.

2. Лети Джое, Е. А. Калашникова. Влияние гормонального состава питательной среды на морфогенез пшеницы.// Тез. Докл четвертая Международная конференция «Регуляторы роста и развития растений» . 1997 , С.-304.

3. Лети Джое, Е .А. Калашникова. Влияние гриба Septona nodorum и его метаболитов на прорастание семян пшеницы.// Известия ТСХА. 1996. вып. 4.- С. 1-7.

4. Лети Джое, Е.А. Калашникова . Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к Септориозу. // Тез. докл.' VII Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранения генофонда». Москва .-1997.-С.317.

5. Лети Джое, Регунатан Пиллай, Е .А. Калашникова. Разроботка методов клеточной селекции пшеницы на устойчивость к Septoria nodorum. // Материалы международной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология», г. Минск. 1998. С.221-222.

6. Лети Джое., Е.А Калашникова. Влияние генотипа и условий культивирования зародышей яровой пшеницы на процесс каллусогенеза и морфогенеза.// Известия ТСХА .-1998 Вып. 3.-С.94-99.

7. Lethy Jose, Е.А. Kalashnikova. Utilization of biotechnological methods in selection of stability to Septona . // Congress on «In vitro biology». USA. 1997./Hottopics. P. 15.

8. Lethy Jose, E.A . Kalashnikova. Cellular selection of wheat resistance to glume blotch disease. // Congress on «In vitro biology». USA. 1998. / Hot topics . P. 16.

01ъеч 15 • - ! " ti-i Тирзх

Т "Г24- "III ^ * о \к ч \ Mii.-v^a 12Tuä J, Ti "Í i, »«за ач , 44