Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клеточная селекция пшеницы Triticum aestivum на устойчивость к УФ-Б

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Клеточная селекция пшеницы Triticum aestivum на устойчивость к УФ-Б"

/\~31635

На правах рукописи

ЛАПШИН Петр Владимирович

КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ПШЕНИЦЫ ТгШсит аевйтот НА УСТОЙЧИВОСТЬ К УФ-Б

специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 2001

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Научный руководитель-акад РАСХН, докт биот наук, проф B.C. Шевелуха.

Официальные оппоненты, доктор сельскохозяйственных наук В.А. Высоцкий; кандидат биологических наук И.Г. Тараканов.

Ведущая организация НИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАН

Защита диссертации состоится " _£_ " 2001 г в

" ta " часов на заседании диссертационного совета Д220 043 10 в Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Адрес 127550, Москва, И-550, ул Тимирязевская, 49, сектор защиты диссертаций

С диссертацией -<i i ознакомить • центральной научной библиотеке МСХА

Автореферат ра_> _ 2001 г.

Ученый с диссертациош кандидат биох г _

i i

Г.И. Карлов

, Актуальность проблемы. В связи с усиливающимся антропогенным влиянием на атмосферу показано ухудшение состояния озонового слоя. Как следствие этого, на поверхности земли увеличивается уровень излучения в диапазоне длин волн от 280 до 320 нм. Это излучение лежит в ультрафиолетовой области спектра и относится к его "среднему* или "Б*-участку. Это излучение обозначается как "УФ-Б" (UV-B).

УФ-радиация является мощным стрессовым фактором для живых систем, так как вызывает фотохимические превращения. Все живые организмы и растения чувствительны к ультрафиолетовому облучению и реагируют на УФ радиацию. Ультрафиолетовое излучение индуцирует самые разнообразные повреждения у растительных организмов, прежде всего в ДНК, вызывает окислительный стресс, в результате которого образуются радикалы, вызывающие повреждения всех структур и молекул клетки. Все химические компартменты могут быть мишенью для ультрафиолета, что влечет'за собой физиологические нарушения и анатомические изменения у растений Нарушения в ДНК могут быть причиной повышенного уровня мутаций, что может негативно сказываться на сохранении генофонда живых организмов.

Пшеница является главной зерновой культурой культурой в сельском хозяйстве большинства развитых стран и с ней издавна проводится работа по селекции традиционными методами. Использование биотехнологических методов по отношению к этой культуре может существенно ускорить селекционный процесс в силу реализации -свойственной растительной клетки тотипонент-ности.

Работ по изучению поведения клеток in vitro под воздействием УФ-Б в доступной литературе мало , поэтому проведение исследований в этом

направлении имеет как теоретическое, так и практическое значение."

Цель и задача исследования. Целью данной работы было получение клеточной линии пшеницы, обладающей повышенной резистентностью к ультрафиолетовому облучению в диапазоне длин волн от 280 до 320 нм, с использованием методов клеточной селекции in vitro, а также изучение биохимических и морфофизиологических характеристик полученных линий

Для достижения поставленной цепи необходимо было решить

следующие задачи:

НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА Моск. се.пь;:<сжоз академии

ü,tirt ГPA/ibHAiT

Инв. NaÄ

• получить хорошо растущую стерильную каплусную культуру пшеницы на агаризованной питательной среде

• изучить зависимость каллусогенеза от влияния УФ Б излучения

• определить влияние различных доз УФ Б на пролиферацию каллуснои ткани

• провести клеточную селекцию на устойчивость к воздействию ультрафиоге товым излучением области Б

• Изучить воздействие УФ-Б на синтез фенольных соединений в каллуснои культуре а также на морфофизиологические и цитохимические хзрактери стики полученных тканей

Научная новизна Разработана схема селекции а каллуснои культуре на устойчивость к ультрафиолетовому излучению с использованием искусственного источника излучения Впервые получены и охарактеризованы линии яро вой мягкой пшеницы Г aestivum сорта Таежная и линии Фотос обладающие повышенной устойчивостью к УФ-Б Показано влияние УФ Б облучение на рост каллуснои ткани яровой мягкой пшеницы Т aestivum сорта Таежная и линии Фотос Показано влияние УФ Б на такие биохимические и морфофизиологиче ские показатели каллусной культуры как содержание растворимых фенольных соединений размеры клеток параметры клеточной стенки содержание свободных аминокислот

Пра1стичвская значимость Показана принципальная возможность селекции на каллуснои ткани к УФ-излучению при использовании искусственного ис точника радиации Предложенная технология клеточной селекции на устойчивость к ультрафиолетовому излучению с использованием искусственного ис точника излучения может быть использована на каллусной культуре высших растений для отбора толерантных к ультрафиолетовому облучению клеточных культур Устойчивые клеточные линии сельскохозяйственных растении могу-быть использованы для получения растении ренерантов способных произрас тать в неблагоприятной экологической обстановке что может представлять интерес для сельского хозяйства

Апробация работы Материалы работы докладывались на Международ ных конференциях 'Молекулярно-генетические маркеры растении (Ялта 1996) 'Биология клеток растении т vitro биотехнология и сохранение гено

фонда" (Москва, ИФР РАН, 1997), на IV съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений - наука III тысячелетия» (Москва, ИФР РАН, 4-9. октября 1999); на ежегодных семинарах отдела Биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН, на заседаниях Кафедры сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им. К.А Тимирязева. -

■ • Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы и 2 переданы в печать. I ■ • ,

Объем и структура работы. ■ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части,, включающей описание материала ■ и методов работы, обсуждение проведенных экспериментов, выводов, заключения, списка цитируемой литературы. ■ ..■-...Материалы. диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста, содержат 40 таблиц, 36 рисунков и фотографий Библиография содержит 135 источников, из которых зарубежных авторов 63 . --,.».'.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследований являлись два генотипа яровой мягкой пшеницы (Triticum aestivum) - сорт "Таежная" и линия "Фотос". " - ■

• Для инициации каллуса использовали зрелые и незрелые зародыши Зрелые зародыши изолировали из семян, которые предварительно оставляли в воде на 16-24 часа для набухания. Не зрелые зародыши изолировали из незрелых зерновок пшеницы на 14 - 16-й день после цветения растений Экс-плант помещали щитком вниз на поверхность модифицированной агаризован-ной питательной среды Мурасиге-Скуга (Murashige, Scoog, 1962) с 2,5 мг/л 2,4-Д и 10 мг/л AgNOj в чашки Петри диаметром 9 см по 12-18 штук. Для субкультивирований использовали эту же среду. -.

В качестве источника УФ-Б радиации использовали лампу ДРЛФ-400 с удаленной внешней колбой, являющейся эквивалентом бактерицидной ртутной лампы высокого давления ПРК-2 (ДРТ). При селекции клеточных пиний использовали стеклянные фильтры "Anumbra", не пропускающих излучение ниже 280 нм. Измерение уровня пропускания ультрафиолетового излучения проводили на 3 спектрофотометрах Specord. Первичный и пересадочный каплус облучали непосредственно в чашках Петри на протяжении всего периода культивирова-

ния В работе использовали интенсивности 1 66 1 ti 0 74 О 55 О 46 и 0 39 Вт/м2 по УФ-Б что соответствовало расстоянию 25 4С 50 60 70 и 80 см от пампы Интенсивность излучения регулировали изменением расстояние чашек с культурами от лампы Время облучения составляло по 2 часа каждый день а середине 16-ти часового фотопериода облучения белым светом интенсив ностью 5 KLx Контрольные варианты были изолированы от лампы стеклом у которого кривая пропускания начиналась с 380нм

Прирост биомассы каллуса анализировали путем индивидуального взвешивания каплусных агрегатов в стерильных условиях на торсионных весах в момент очередного пассирования Результаты оценивали в конце каждого пассажа по количеству образовавшихся каллусов из первичного экспланта и го их массе которая учитывалась индивидуально для каждого экспланта

Для изучения морфологии клеток каллусные ткани замораживали ис пользуя для этого микротом криостат и готовили тонкие срезы которые сразу же окрашивали малахитовым зеленым (Прозина М Н 1960) Размеры клеток и толщину клеточных стенок анализировали на микроскопе ' Ergavali (Германия) С помощью окуляр микрометра

Определение суммы фенольных соединении проводили с помощью ре актива Фолина-Дениса (Запрометов 1971) по оптическои плотности которая оценивалась спектрофотометрированием при 725 нм Содержание амино кислот определяли при помощи Автоматического анализатора аминокислот ААА-339М (Чехия)

Хроматографические исследования для разделения полифенолов ис пользовали хроматографию в тонком слое целлюлозы (Ferak толщина слоя 0,25мм) в системе Н бутанол — уксусная кислота — бутанол (49 12 28 по объ ему) Идентификацию выделенных соединений проводили на основе их флуоресценции в УФ-свете по качественной реакции с рядом специфических реактивов (хлорное железо и красная кровяная соль) (по Запрометову 1971) Все эксперименты с культурой каплусных тканей проводили в 3 биогоги ческих и 4 аналитических повторностях Повторяемость а опытах 50 200 крат ная На рисунках и в таблицах приведены средние арифметические значения определений между повторностями и их стандартные ошибки Статистическая обработка данных проводилась по методу малых выборок (Амарин и др 1975)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 - МорФоФизиологическая характеристика двух генотипов яровой мягкой * ршеницы Triticum aestivum - сорта Таежная и линии Фотос в условиях in vitro

В качестве объекта исследования были выбраны два генотипа яровой мягкой пшеницы: сорт Таежная и линия Фотос, отличающиеся по своим реакциям в условиях in vitro. В частности эти генотипы имеют существенные различия по метаболизму гормонов (Копертех Л.Г.. 1995). Так каляусные ткани, полученные из незрелых зародышей линии Фотос имели в своем составе больше цитокининов, а каллус, инициированный из эксплантов сорта Таежная - больше ИУК.АБК. ' . -

Каллусные культуры яровой мягкой пшеницы T.aestivum сорта Таежная и линии Фотос разных оттенков желтого цвета, состоят из компактных агрегатов, иногда образуют сравнительно плотные глобулы с выраженной внутренней структурой. Каллусные агрегаты могут отличаться по внешним признакам, которые зависят от условий культивирования, возраста культуры (количества прошедших пассажей), индивидуальной массы каллусных агрегатов, а также присутствия и соотношения регуляторов роста и элементов питания в среде культивирования. .

' Для обоих' использованных нами генотипов яровой мягкой пшеницы (сорта Таежная и линии Фотос), характерна высокая интенсивность" каллусооб-разования из первичного экспланта: 92,3% для линии Фотос и 96.7% для сорта Таежная при использовании зрелых зерновок и 96,3% и 98,8% соответственно при использовании незрелых (табл. 1).

' ' Таблица 1 Интенсивность каллусогенеза и масса первичного каллуса у яровой мягкой пшеницы сорта Таежная и пинии Фотос

Генотип Тип экспланта Интенсивность каллусообразова-ния. % Средняя массе каллуса в чашке, мг

.Линия. Фотос Зрелые зародыши .. 92.3% ^ 159416,7

Незрелые зародыши 96.3% , .... 84.6+6.55

Сорт Таежная Зрелые зародыши 96,7% 145±17,в

Незрелые зародыши 98.8% 112.6t4.3l

Установлено, что при уменьшении концентрации 2,4-Д при культивировании каллусных тканей пшеницы с 2,5 мг/л до 1 мг/л каллусная ткань была бо-

лее оводненнои наблюдалось формирование каллусов способных к ризогене зу с отсутствием проявлений признаков стеблевого органогенеза Количество ризогенного каллуса составляло 47 1t2 2% у линии Фотос и 38±1 8% у сорта Таежная

Показано что формирование каллуснои ткани способной к морфогенезу зависит от возраста культуры т е от количества пассажей прошедших с мо мента введения экспланта в культуру in vitro Так в течение 6 субкультивирова ний уровень стеблевого морфогенеза уменьшался с 15 9-ЧЭ 8% до 7 8+0 4% у линии Фотос и с 41 3±2 2% до нуля у сорта Таежная Это коррелирует с лите ратурными источниками (Карабаев МК 1991 Копертех Л Г 1995) Каллусная ткань становится мелкоагрегированной грязно желтого цвета рассыпчатой состоящей из малосвязанных между собой глобул различного сравнительно небольшого диаметра - от 0 5 до 3 мм Более крупные из таких ггобул часто покрыты корнями

При использовании в качестве первичного экспланта для калпусогенеза незрелых зародышей с частотой до 60% наблюдалось развитие дифференцированного побега из зародыша семени Его развитие влияет не только на массу каллусной ткани но и на ее способность к регенерации Наличие проростка существенно уменьшает способность каллуснои ткани к регенерации от 24% до 6% у каллусных тканей линии Фотос и от 27% до 15% у сорта Таежная

Нами была изучена зависимость интенсивности регенерации неоргани зованно растущей каллуснои ткани от концентрации сахарозы в среде культивирования Увеличение содержания сахарозы а среде с 20 r/n до 30 r/n приводит к увеличению образования каллуса имеющего глобулярную структуру с 64±3 04% до 86±4 1% из которого в дальнейшем дифференцировались мери стемы При использовании для стимуляции морфогенетических процессов пи тательной среды с уменьшенным в 10 раз содержанием NH«NOj (до

0,165 г/л) увеличивает количество морфогенного каллуса у сорта Таежная на 28%, но у линии Фотос такого эффекта не обнаружено

У каллусных агрегатов с зонами стеблевого органогенеза, наблюдалось формирование побегов с морфологически нормальными листьями Первоначально единичный каллусный агрегат формирует большое количество таких побегов, но большая их часть прекращает развитие на разных стадиях и до

величины 3-4 см в длину развивается только 2-5 побегов на 1 каллус. Примерно на этой стадии, когда длина листьев достигает 3-5 см, такие каллусные агрегаты пересаживали на безгормональную среду. При достижении листьями длины 10-15 см, растения высаживали в почву. Растения-регенеранты при высадке в почву демонстрировали приживаемость, близкую к 100% и в дальнейшем цвели и образовывали семена. Однако в большинстве случаев наблюдалась низкая фертильность (63,4% у линии Фотос и 42,1% у сорта Таежная), меньшее количество зерен в колосе (39% от контроля у Фотоса и 42% у Таежной) и низкая масса зерновок (масса 1000 зерен: 21,031.0,63 г - Фотос и 246110.67 г Таежная). ' * \

Таким образом установлена зависимость интенсивности регенерации растений из неорганизованной растущих тканей сорта Таежная и линии Фотос от наличия дифференцированного побега у первичного каллуса; количества сахарозы, NH^NOa и 2,4-Д в среде культивирования. Показано, что наличие проростков подавляет морфогенетические потенции у каллусной ткани сорта Таежная и линии Фотос; увеличение содержания сахарозы индуцирует перестройку структуры каллусного агрегата; NH4NO3 и 2,4-Д также влияют на интенсивность регенерации из каллуса. .

2. Клеточная селекция пшеницы Т. aeslivum сорта Таежная и линии Фотос на . устойчивость к повышенному уровню УФ-Б

2.1. Влияние УФ-Б на пролиферацию каллусных тканей

Одна из наиболее сильных сторон культуры in vitro в создании технологий для сельского хозяйства является возможность, на основе сомаклональных вариаций, или индуцированных мутаций в условиях in vitro, отбора в жестких селективных условиях генотипов, характеризующиеся искомыми признаками (Долгих Ю.И., Шамина 3.Б., 1991). , ,

В нашей работе мы ставим задачу получения клеточной линии пшеницы, устойчивой к повышенным дозам УФ-В. На первом . этапе, исследовалось действие УФ-Б на процесс каллусообраэования, интенсивность роста и регене-рационную способность неорганизованно растущей каллусной ткани двух генотипов яровой мягкой пшеницы Т. aestivum: сорта Таежная и линии Фотос.

В опытах с использованием 1 66 и О 74 Вт/м' по УФ Б оценивали количество образовавшихся каллусов из первичного эксппанта в конце 0 пассажа и их массу Облучение проводили с расстояния 25 и 50 см от пампы

Ультрафиолет негативно влияет как на интенсивность каллусогенеза так и на массу первичного каллуса (табл 2) причем разные генотипы продемонстрировали заметное различие в реакции на УФ-Б Интенсивность каллусообразования значительно уменьшается у линии Фотос (от 100% в кон троле до 38% при дозе 0 74 Вт/м2 и до 36% при дозе 1 66 Вт/мг) Процессы кап лусообразования у сорта Таежная оказались менее подвержены действию УФ Б (от 94% в контроле до 92% при 1 66 Вт/м2 и до 77% при 0 74 Вт/мг) Негативное воздействие УФ Б отражается на массе каллусов обоих генотипов ко торзя убывает при увеличении дозы УФ-Б Так при 1 66 Вт/м7 масса

неорганизованно растущей ткани линии Фотос составляла в среднем 51 2% от контроля а у сорта Таежная - 45 0% А при 0 74 Вт/м2 65 3% и 64 2% соотает ственно

Таблица 2

Формирование каллусов из зрелых зародышей пшеницы линии Фотос а уело виях действия УФ Б радиации и их рост

Уровень облучения V® Б

1 66 Вт/м' 0 74 Вт/м контроль

Генотип Интенсиеност ь каллусообр % средняя масса каллу се, МГ Интенсивность каллусообр % Средня» масса каллу са, мг Интенсивность каллусообр % Средняя масса кал пуса, мг

Линия Фотос 35 2 62 ±2 39 38 2 79±3 04 ЮО 12114 65

Сорт Таежная 76 7 54±2 08 91 9 ?7±2 97 94 3 120 «-4 62

Таким образом протестированные генотипы пшеницы отличаются по ре акции на действие УФ-Б У линии Фотос наблюдается значительное снижение интенсивности каллусообразования тогда как масса уменьшается не з"ачи тельно, как у сорта Таежная В тоже время у Таежной интенсивность каллусо образования в присутствии УФ-Б осталась довольно высокой но масса образовавшихся калусов была ниже чем у линии Фотос при одинаковой дозе УФ Б (рис 1)

«№» »Б радиации

Кастро» ОГ4 0г»а7

I Смкияа ии« «имте* мг ««га« 2 Смп" масс« мялчс* м 1ием* |

— МН1ВИСИ»Н0С1а «ИИДУСОСДРФЗО»»*«*. % ДВТОС_ИКГНКИаиОСТ» ВИАИУТПЛЯрЩ! «ГЧ« % Тимниа |

Рис 1 Формирование каллусов из эксплантов пшеницы линии Фотос и сорта Таежная в уело виях действия УФ-Б радиации и их рост

При дальнейшем культивировании каллусных тканей в присутствии УФ-облучения наблюдали постепенное прекращение роста каллусных агрегатов В табл 3 приведены данные по приросту каллуснои ткани инициированной из незрелых зародышей которые подвергались облучению в тех же условиях в течение 2 субкультивировании Данные приведены на конец 0 и I пассажа Из таблицы видно что каллусная ткань без облучения и при облучении интенсивностью 0,74 Вт/мг по УФ-Б сохраняет жизнеспособность и имеет индекс роста порядка 2,1-2 6 В то время как каллусы облученные с интенсивностью 1 66 Вт/м* прекращают рост в течение первого месяца культивирования а в течении второго месяца культивирования эта ткань уже не растет Также из таблицы следует что каллусная ткань сорта Таежная характеризовалась несколько большей скоростью прироста массы и более высоким индексом роста чем пиния Фотос

Таблица 3

Рост каллусной ткани линии Фотос в условиях действия УФ Б радиации

Генотип Длительность облучения Уровень облучения УФ Б

1,66 Вт/м* 0,74 8т/м' контроль

Средняя масса каллуса мг Индекс роста Средняя масса каллу са, мг Индекс роста Средняя масса кал луса, мг Индекс роста

Линия Фотос 1 месяц 51 0±1 96 61 8±2 38 100 0+3 85

2 месяца 48 2±1 86 1 0 131 8+5 07 2 1 223 8+8 62 22

Сорт Таежная 1 месяц 46 9±1 81 83 0±2 43 | 110 014 24

2 месяца 40 5±1 56 □ 9 152 615 88 | 2 4 281 0±Ю82 26

При дальнейшем культивировании выяснилось, что выбранные дозы оказались летальными для обоих генотипов - наблюдалось только образование первичного каллуса из тканей эксппанта.В последующих пассажах без облучения УФ-Б прироста каппусной массы не наблюдалось, хотя по внешнему виду каллусы сохраняли характерный для живой ткани светло-желтый цвет и консистенцию. Кроме того присутствие УФ-Б полностью блокировало морфогенети-ческие процессы в неорганизованно растущей ткани.

2.2. Отбор устойчивых к УФ-Б линий пшеницы Т. аевГмит сорта Таежная и пинии Фотос

По результатам предыдущих экспериментов были несколько изменены условия селекции — уменьшена общая доза и введена более дифференцированная шкала по УФ-Б. Использовали следующие интенсивности УФ-Б: 1,11; 0,74; 0,55; 0,46 и 0,39 Вт/м* {что соответствовало расстоянию 40, 50, 60, 70 и 80 см от лампы). Было выяснено, что доза 1,11 и 0,74 Вт/м2 UV-B оказывала летальное действие на каллус сорта Таежная: после месяца культивирования при облучении сохранили рост 22,7% экспланта, после второго месяца - 0% (рис 2). . , - „

2 пассажа jnacta;ra Таежная

2пзсеажэ згасса*э Фотос

Рис. 2. Влияние различных доз У Ф-Б-обл учения на росту каллусных культур яровой мягкой пшеницы Т. аеБН^лнп сорта Таежная и линии Фотос

При дозе О 55 Вт/м* после 3 субкультивировании были выделены 1 * 2% жизнеспособных колоний которые имели высокий прирост биомассы Линия Фотос оказалась менее подверженной действию UV-B Даже при дозе 111 Вт/мг наблюдался некоторый прирост массы (27 6% после 1 месяца и 18 9% -после второго)

Результаты оценивали в конце каждого пассажа по количеству образовавшихся каллусов из первичного экспланта и по их массе которая учитывалась индивидуально для каждого экспланта что позволипо выделить клеточные линии ведущие свое происхождение от одного первичного эксппанта

Таким образом в результате облучения в течение трех последовательных субкультивирований для линии Фотос удалось выделить несколько клеточных линий способных сохранять рост на уровне контроля в присутствии УФ Б -облучения (линии отобранные при интенсивности облучения О 55 Вт/м* далее обозначаются буквой "В" и порядковым номером и линии а полученные при О 39 Вт/мг - буквой Н") Эти линии в дальнейшем выращивали без УФ Б-облучения и во время этого периода анализировали их морфозиологические и биохимические характеристики

3, Характеристика клеточных линий пшеницы, устойчивых к действию УФ Б радиации

Морфо-физиопогическа оценка клеточных культур пшеницы устойчивых к УФ-Б радиации показала что полученные в результате селекции в условиях УФ Б каллусные культуры пшеницы состоят из клеток паренхимного типа Па ренхимные клетки крупные по размеру с хорошо развитой вакуолью которая занимает большую часть клетки (2/3) Цитоплазма зернистая занимает при стенный слой ядро мелкое Это свидетельствует о том что клетки находятся 8 стадии растяжения

Измерение индекса роста каллусной ткани полученных пиний не показало существенного отличия как в контрольной популяции так и между линиями

Исследование роста клеточных линии пшеницы устойчивых к действию УФ Б радиации показало что отсутствуют резкие различия по этому показателю у отобранных линии по сравнению с контролем и это может быть вызвано длительным временем прошедшим после прекращения стрессового воздеи

ствия и тем, что селекция к УФ не оказала влияния на ростовые характеристики отобранных линий.

Сравнение размеров клеток не выявило существенных различий в этом показателе у контрольных вариантов и линий, полученных в результате селекции. При этом мы обнаружили различия в толщине клеточных стенок, зависящее от дозы УФ-Б (табл. 4). Из таблицы следует, что у линий, полученных в результате селекции при более высокой дозе, клеточная стенка примерно на 9% больше, чем у линий, полученных при низкой дозе, и на 17% толще по сравнению с контролем.

- ..........Таблица 4

Размеры клеточных стенок (в мкм) устойчивых к УФ-Б линий яровой мягкой пшеницы Т. аезНуит линии Фотос

Вариант Размер клеточных стенок среднее

контроль 7,03±0,27 7,03

Н1 7,83±0.31 7.67

Н2 7,50±0,29

84 8.6910.34 • 8.43

В5 8.27±0.Э2

, В7 8,34±0,32

Исходя из этих данных мы можем предположить, что УФ-Б вызывает изменения в морфологии клеток, главным образом отражающееся на формировании их клеточных стенок, в сторону утолщения

Помимо паренхимных клеток в структуре каллусов наблюдалось формирование меристематических очагов, состоящих из меристематических клеток округло-овальной формы, с густой цитоплазмой, крупным ядром и тонкой клеточной стенкой. Линии Н1 и Н2, полученные при низкой дозе формировали больше меристематических клеток, которые располагались как очагами, так и одиночно, в отличии от других изученных клеточных линий.

В большинстве линий встречаются группы трахеидальных элементов (рис. 3). В участках, где обнаружены трахеидальные элементы, клетки более вытянутые. Трахеидальные элементы встречаются как на начальной стадии формирования, так и в виде сосудистых пучков.

Рис 3 Трахеидальные элементы а устойчивых к УФ Б линиях А) Линия В5 окрашивание малахи товым зеленым Б) Линия Н1 окрашивание флорглюцином

По-скольку мы обнаружили изменения в толщине клеточных стенок у от селектированных линий а одним из основых веществ оболочек клеток является лигнин (полимер фенольной природы) мы решили проверить его наличие в каллусных культурах Установлено что лигнин образуется в клеточных культурах В основном он накапливается в неравномерно утолщенных стенках парен химных клеток и в трахеидальных элементах При этом в оболочках клеток ре акция на лигнин отмечалась как частичным так и полным их окрашиванием (рис 4) Присутствие липчина можно отметить и в уголках клеток причем в некоторых участках лигнификация довольно сильная Наши данные свидетельствуют о том что в различных линиях каллусных культур пшеницы отмечается не одинаковая реакция на лигнин В контрольном варианте она встречается крайне редко В случае линий полученных при селекции реакция на лигнифи-кацию значительно больше При этом наибольшее образование лигнина характерно для линий Н2 и В5

Рис. 4. Реакця на лигнин у линии Н2 (окрашивание фпоргпюцином).

Было определено содержание свободных аминокислот в отобранных линиях пшеницы. Показано существенное варьирование их количественного состава между изученными линиями. В тоже время что содержание большинства аминокислот в отселектированных штаммах в 1,5-2 раза выше, чем в контроле, также отмечено более высокое их содержание у штаммов, полученнх при низкой дозе УФ излучения. Так содержание аланина, у-аминомасляной кислоты и арнитина было в 3 раза выше у линии Н1 по сравнению с контролем, а содержание треонина, глутамина, тирозина, фенилаланина, орнитина во всех изученных линиях мало отличалось от контроля. Изменения в содержании свободных аминокислот свидетельствуют об изменениях на биохимическом уровне, которые связаны с действием УБ-Б на неорганизованно растущие клеточные культуры.

Известно, что в защите клеток от повреждающего действия УФ-Б участвуют фенольные соединения. Это их действие обусловлено способностью к поглощению к коротковолновой части спектра.

Определение содержания фенольных соединений в каллусных культурах пшеницы выявило различия в количестве синтезируемых фенолов Наиболее низкое их количество характерно для контрольных вариантов. Во всех случаях у культур, подвергнутых действию УФ-Б, содержание фенольных соедений было в 5-7 раз выше (рис. 5). Наибольшее накопление фенольных соединений отмечено у линии В5.

Рис 5 Содержание суммы растворимы* фенольных соединений в каллусных «ультурах попу ченных в результате селекции к УФ-Б радиации

Изучение качественного состава синтезируемых фенольных соединении на основании данных тонкослойной хроматографии показало что в каллусных культурах состав этих веществ довольно близок {рис 6) В большинстве случаев в составе фенольного комплекса присутствуют 4-5 соединении Большее разнообразие этих веществ наблюдается у линии 80/2 и 60/5 Вариант 80/1 60/4 и 60/7 несколько беднее по составу фенольных соединении Судя по предварительным данным эти вещества относятся к фенол карбоновым кислотам - наиболее распространенным в растениях представителям этих веществ Наши данные показывают что каллусные культуры полученные в результате селекции к УФ-Б отличаются лишь по количеству синтезируемых в них фенольных соединении тогда как их качественный состав во всех случаях оди наков

CD

О о

О

о

CD о

СГ с з

О G>

О "

О

сгэ

С1ГЭ

о о

о

о

СГТЭ

сз

о

к на В5 В7 Н1

Рис 6 Хроматограмма этанольных экстрактов различных линий каллусных культур пшеницы Проявление смесью хлорного железа « краской кровяной соли

' выводы

1. Показана зависимость каллусогенеэа пшеницы от типа первичного экс-планта, гормонального состава и количества элементов питания среды культивирования, •.

2. Показана зависимость морфогенетических процессов каллусной ткани пшеницы от облучения УФ-Б радиацией, генотипа, происхождения первичного экслланта, гормонального состава среды • _ '. '

3. Показано влияние генотипа исходного экслланта на каллусогенеэ, морфогенез и чувствительность к УФ-облучению. Фотос показал большую устойчивость к стрессовому воздействию, чем Таежная.

4. - Разработана схема клеточной селекции пшеницы на устойчивость к УФ-Б с

использованием искусственного источника излучения. •

5. Показана возможность'получения клеточной культуры пшеницы, сохраняющей способность к неорганизованному росту в присутствии УФ-Б

6. Установлена зависимость роста клеточных культур пшеницы от интенсивности и длительности воздействия УФ-Б радиации, а также от генотипа исходного экспланта.

7. УФ-Б радиация вызывает изменения в морфо-физиологических (размеры клеток, параметры клеточной стенки) и биохимических (содержание фе-нольных соединений, лигнина, изменения в баллансе аминокислот) характеристиках каллусных культур пшеницы, что может быть использовано для селекции новых линий пшеницы, обладающих устойчивостью к данному фактору. ' -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Бутенко Р Г Копертех Л Г Коппель Л А Лапшин П В Получение со макпональных и трансгенных клеток и растении пшеницы устойчивых к ультрафиолетовому излучению Межд конф *Молекулярно-генетичеа<ие маркеры высших растении" Ялта 1996 год

2 Lapshin Р V Zagorska N A Butenko R G Dimitrov В D Effec's of UV-B rays on proliferation of wheat callus culture/ Genetics and Breeding 1999 №29 3 7

3 Лапшин П В Загоскина H В Бутенко Р Г Влияние УФ-Б радиации на пролиферацию каллусной культуры пшеницы VI съезд физиологов растении России "Физиология растении - наука III тысячелетия* Москва ИФР 1999 год

4 Лапшин П В Трошенкова Н В Дубравинз Г А Загоскина Н В Бутенко Р Г Морфофизиологичесхие характеристики каллусных культур пшеницы устойчивых к действию УФ-Б радиации Сборник "Труды кафедры с/х био технологии МСХА" 2 том 2001

5 Лапшин П В Бутенко Р Г Шевелуха В С Клеточная селекция пшеницы на устойчивость к УФ-Б радиации Известия ТСХА 2001 №2 136 144

Объем 1,0 печ л

Зак 324

Тираж 100экз

AHO «Издательство МСХА» 127550, Москва, yi Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лапшин, Петр Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. УЛЬТРАФИОЛЕТОВАЯ РАДИАЦИЯ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ

1.1.1. Поступление солнечного излучения к земной поверхности

1.1.2. Факторы влияющие на баланс УФ-радиации в атмосфере

1.1.3. Искусственные источники УФ-Б излучения.

1.2. ВЛИЯНИЕ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ РАДИАЦИИ НА РАСТИТЕЛЬНЫЕ ОРГАНИЗМЫ.

1.2.1. Действие УФ-Б радиации на уровне целого растения.

1.2.2. Действие УФ-Б радиации на уровне тканей и органов растений.•.

1.2.3. Действие УФ-Б радиации на клеточном уровне.

1.2.4. Действие ультрафиолета на уровне генома.

1.3. КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ ЗЕРНОВЫХ ЗЛАКОВ IN VITRO И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В СЕЛЕКЦИИ

1.3.1. Морфогенез в культуре клеток злаков.

1.3.2. Сомаклональная изменчивость каллусных тканей в культуре злаков in vitro.

1.3.3. Клеточная селекция у растений к абиотическим стрессорам.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Условия стерилизации экспланта.

2.2.2. Питательные среды.

2.2.3. Условия культивирования.'.

2.2.4. Условия селекции.

2.2.5. Биохимические исследования.

2.2.6. Морфо-физиологические исследования.

3. МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ДВУХ ГЕНОТИПОВ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ В УСЛОВИЯХ IN VITRO.

3.1. ПРОЛИФЕРАЦИЯ КАЛЛУСНЫХ ТКАНЕЙ ПШЕНИЦЫ СОРТА ТАЕЖНАЯ И ЛИНИИ ФОТОС

3.2. МОРФОГЕНЕТИЧЕСКАЯ СПОСОБНОСТЬ КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУР ПШЕНИЦЫ СОРТА ТАЕЖНАЯ И ЛИНИИ ФОТОС

4 . КЛЕТОЧНАЯ СЕЛЕКЦИЯ ПШЕНИЦЫ СОРТА ТАЕЖНАЯ И ЛИНИИ ФОТОС НА УСТОЙЧИВОСТЬ К УФ-Б.

4.1. РАСЧЕТ УСЛОВИЙ ОБЛУЧЕНИЯ УФ-Б

4.2. ВЛИЯНИЕ УФ-Б НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ КАЛЛУСНЫХ ТКАНЕЙ ПШЕНИЦЫ СОРТА ТАЕЖНАЯ И ЛИНИИ ФОТОС

5. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ ПШЕНИЦЫ, УСТОЙЧИВЫХ К ДЕЙСТВИЮ УФ-Б РАДИАЦИИ.

5.1. М0РФ0-ФИЗИ0Л0ГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

5.2. БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

Введение Диссертация по биологии, на тему "Клеточная селекция пшеницы Triticum aestivum на устойчивость к УФ-Б"

Воздействие ультрафиолетовой радиации на растительные объекты приковывает пристальное внимание ученых в связи с усиливающимся антропогенным влиянием на атмосферу и ухудшением состояния озонового слоя, который защищает землю от губительного действия ультрафиолетовой радиации. Установлено снижение концентрации озона над Южным и Северным полюсами, имеются данные об озоновых дырах у Южного полюса. Снижается концентрация озона и над Северным полушарием: резкое уменьшение озонового слоя показано над тропиками Африки, Южной Америки, над водами Антарктики и экваториального пояса.

В результате уменьшения озонового слоя на поверхности земли увеличивается уровень излучения в диапазоне длин волн от 28 0 до 320 нм. Это излучение лежит в ультрафиолетовой области спектра и относится к его "среднему" или "Б"-участку. Это излучение обозначается как "УФ-Б" (UV-B).

Возможное истощение озонового слоя может повлечь за собой большее распространение раковых заболеваний кожи, болезней глаз (катаракты), ослабление защитных функций иммунной системы человека. Установлено, что уменьшение концентрации озона в атмосфере на 5% вызывает увеличение заболеваний раком кожи на несколько десятков тысяч случаев (данные американских ученых) [33] . Кроме того, в слое глубиной до 2 м от поверхности моря не сможет развиваться фитопланктон, являющийся первым звеном пищевой цепи и необходимым элементом для выживания большинства видов морских животных, а также резко ухудшатся процессы воспроизводства и роста растений суши.

УФ-радиация является мощным стрессовым фактором для живых систем, т.к. вызывает разнообразные фотохимические превращения. Все живые организмы и растения чувствительны к ультрафиолетовому облучению и реагируют на УФ радиацию. Ультрафиолет индуцирует не только прямые повреждения ДНК, но и вызывает окислительный стресс, в результате которого образуются радикалы, вызывающие повреждения всех структур и молекул клетки. Все химические компартменты могут быть мишенью для ультрафиолета. И, как следствие, это влечет за собой физиологические нарушения и анатомические изменения. Нарушения в ДНК могут быть причиной повышенного уровня мутаций, что может негативно сказываться на сохранении генофонда живых организмов.

Все поднятые вопросы имеют большое значение для сельского хозяйства. Пшеница является главной зерновой культурой в сельском хозяйстве большинства развитых стран. С ней издавна проводится работа по селекции традиционными методами. Использование биотехнологических методов по отношению к пшенице может существенно ускорить селекционный процесс в силу реализации свойственной растительной клетки тотипонентности и связанной с этим возможности рассматривать неорганизованно растущую культуру клеток как колонию независимых одноклеточных организмов. В неорганизованно растущей культуре, единицей, на которую оказывается селекционное давление, является одиночная клетка, а не целый организм с его половыми клетками, как в традиционной селекции. В традиционной селекции действие мутагенов направлено на половые клетки или на апекальные меристемы, и последующий отбор из них желаемых форм. В неорганизованно растущей культуре соматические клетки, составляющие каллусную (суспензионную) ткань, благодаря свойству тотипотент-ности, могут сами быть объектами селекции, сохраняя принципиальную возможность последующей регенерации из любой клетки популяции целого растения. Поскольку селекционное давление направлено на единичную клетку и она теоретически в состоянии дать начало целому растению, время существования клетки от предыдущего деления до последующего может расматриваться как время существования одного поколения, и в неорганизованно растущей культуре составляет 2-4 суток в зависимости от вида, сорта и условий культивирования, в то время как традиционная селекция оперирует времением жизни поколения по времени жизни растения — от прорастания семени до созревания плодов, что в условиях климата средней полосы занимает целый вегетационный сезон.

Очевидным преимуществом клеточной селекции in vitro является сокращение площадей на проведение работ и со-ответсвенно трудозатрат. При обычной норме высева на квадратном метре посева размещается около 150 растений зерновых культур и на 1 гектаре, соответственно 1,5 млн растений. Это же количество клеток in vitro занимает одну чашку Петри [141].

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось получение клеточных линий пшеницы, обладающих повышенной резистентностью к ультрафиолетовому облучению в диапазоне длин волн от 28 0 до 320 нм, с использованием методов клеточной селекции in vitro, а также изучение биохимических и морфофизиологических характеристик полученных линий.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• получить хорошо растущую стерильную каллусную культуру пшеницы на агаризованной питательной среде;

• изучить зависимость каллусогенеза от влияния УФ-Б излучения;

• определить влияние различных доз УФ-Б на пролиферацию каллусной ткани;

• провести клеточную селекцию на устойчивость к воздействию ультрафиолетовым излучением области "Б";

• Изучить воздействие УФ-Б на синтез фенольных соединений в каллусной культуре, а также на морфофизиоло-гические и цитохимические характеристики полученных тканей.

Научная новизна. Разработана схема селекции в каллусной культуре на устойчивость к ультрафиолетовому излучению с использованием искусственного источника излучения. Впервые получены и охарактеризованы линии яровой мягкой пшеницы Т. aestivum сорта Таежная и линии Фотос, обладающие повышенной устойчивостью к УФ-Б. Показано влияние УФ-Б облучения на рост каллусной ткани яровой мягкой пшеницы Т. aestivum сорта Таежная и линии Фотос. Показано влияние УФ-Б на такие биохимические и морфо-физиологические показатели каллусной культуры как содержание растворимых фенольных соединений, свободных аминокислот, размеры клеток и параметры клеточной стенки .

Практическая значимость. Показана принципальная возможность селекции каллусной ткани к УФ-излучению с помощью искусственного источника радиации- Предложенная технология клеточной селекции может быть использована на каллусной культуре других высших растений для отбора толерантных к ультрафиолетовому облучению клеточных культур. Устойчивые клеточные линии сельскохозяйственных растений могут применяться как исходный материал для получения растений-ренерантов, способных произрастать в неблагоприятной экологической обстановке, что может представлять интерес для сельского хозяйства.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на Международных конференциях: "Молекулярно-генетические маркеры растений" (Ялта, 1996) ; "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, ИФР РАН, 1997), на IV съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений - наука III тысячелетия» (Москва, ИФР РАН, 4-9 октября 1999); на ежегодных семинарах отдела Биологии клетки и биотехнологии ИФР РАН, на заседаниях Кафедры сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии им. К.А.Тимирязева.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Лапшин, Петр Владимирович

выводы

1. Показана зависимость каллусогенеза пшеницы от типа первичного экспланта, гормонального состава и количества элементов питания среды культивирования.

2. Показана зависимость морфогенетических процессов каллусной ткани пшеницы от облучения УФ-Б радиацией, генотипа, происхождения первичного экспланта, гормонального состава среды.

3. Показано влияние генотипа исходного экспланта на каллусогенез, морфогенез и чувствительность к УФ-облучению. Фотос показал большую устойчивость к стрессовому воздействию, чем Таежная.

4. Разработана схема клеточной селекции пшеницы на устойчивость к УФ-Б с использованием искусственного источника излучения.

5. Показана возможность получения клеточной культуры пшеницы, сохраняющей способность к неорганизованному росту в присутствии УФ-Б.

6. Установлена зависимость роста клеточных культур пшеницы от интенсивности и длительности воздействия УФ-Б радиации, а также от генотипа исходного экспланта.

7. УФ-Б радиация вызывает изменения в морфо-физиологических (размеры клеток, параметры клеточной стенки) и биохимических (содержание фенольных соединений, лигнина, изменения в баллансе аминокислот) характеристиках каллусных культур пшеницы, что может быть использовано для селекции новых линий пшеницы, обладающих устойчивостью к данному фактору.

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключение этой работы хочу выразить искрению благодарность сотрудникам Института физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН, без участия которых эта работа была бы невозможной:

- Раисе Георгиевне Бутенко за постоянное внимание, идеи, помощь и поддержку при выполнении работы;

Александру Борисовичу Бургутину за неоценимые консультации в ходе проведения экспериментов и подготовке печатных материалов.

- Михаилу Всеволодовичу Добровольскому за помощь в создании установки для облучения и расчете ее параметров .

- Наталье Викторовне Загоскиной за возможность осуществления биохимического и морфо-физиологического анализа клеточных линий и участие при подготовке печатных материалов.

А также сотруднику кафедры с/х биотехнологии МСХА им.К.А.Тимирязева Елене Анатольевне Калашниковой за поддержку на всех этапах подготовки и проведения работы и моральную поддержку.

заключение

Ухудшающаяся экологическая обстановка на планете заставляет обращать на себя внимание исследователей. Нарушение баланса компонентов атмосферы приводит к изменению спектрального состава и уровня солнечного излучения на земной поверхности. В результате растительные организмы часто оказываются неприспособленными к изменяющимся условиям. Это, в частности, касается такой культуры, как пшеница, которая широко применяется в производстве продуктов питания.

Поэтому применение современных методов биотехнологии, в частности клеточной селекции in vitro, на такой важной сельскохозяйственной культуре как пшеница, может иметь большое значение для экономики.

Проведение клеточной селекции на неорганизованно растущей каллусной ткани двух генотипов яровой мягкой пшеницы Т. aestivum - сорте Таежная и линии Фотос, с использованием искусственного источника ультрафиолетового излучения, показало принципиальную возможность успеха такой работы.

Методом индивидуального отбора в популяции неорганизованно растущей ткани, отобраны 13 клеточных линий, ведущих свое происхождение от индивидуальных первичных эксплантов. Отобранные клеточные линии сохраняли рост на уровне контроля в течение длительного времени как под воздействием УФ-Б, так и без него.

Полученные клеточные линии имели существенные отличия по биохимическим показателям, в частности по содержанию веществ фенольной природы. Эти изменения регистрировались на протяжении длительного времени после прекращения стрессового воздействия, что может свидетельствовать о генетическом характере изменений в отобранных на устойчивость в УФ-Б излучению клеточных линиях.

Была продемонстрирована зависимость чувствительности к УФ-Б от генотипа исходного экспланта. Из двух протестированных генотипов пшеницы удалось отобрать устойчивые клеточные линии только у одного из них, что свидетельствует о необходимости индивидуального подхода к селекции применительно к каждому выбранному виду или сорту растений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лапшин, Петр Владимирович, Москва

1. Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза М.,Мир,1978, 4 61с.

2. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М, Наука, 1964, 272с.

3. Бутенко Р.Г., Джардемалиев Ж.К., Гаврилова Н.Ф. Кал-лусообразующая способность эксплантов из разных органов различных сортов озимой пшеницы. Физ. раст., 1986, 33, 2, 350-356.

4. Гапоненко А.К., Маликова Н.И., Охрименко Г.И., Сози-нов А. А. Получение сомаклональных линий у злаков (Тг. aestivum L. , Hordeum vulgare L.). Докл. АН ССС, 1985, 283, 1471-1475.

5. Гапоненко А.К., Мунтян М.А., Маликова Н.И., Созинов А. А. Регенерация растений различных генотипов пшеницы Tr. aestivum L. in vitro. Докл. АН СССР, 1984, 278, N5, 1231-1235.

6. Долгих Ю.И., Шамина З.Б. Современные представления о причинах и механизмах сомаклональной изменчивости. Молекулярные механизмы генетических процессов. М, Наука, 1991, 123-127.

7. Гущин Г. П. Общее содержание атмосферного озона и спектральная прозрачность атмосферы. JI., Гидрометео-издат, 1987г. 109с.

8. Э.Жалилова Ф.Х. Влияние УФ-Б радиации на содержание фи-тогормонов и рост мутантных линий арабидопсиса. Авто-реф. канд. биол. наук. Москва, 1993, 17с.

9. Ю.Жалилова Ф.Х., Ракитина Т.Л., Леасов П.В., Кефели В.И. Действие ультрафиолетовой радиации (УФ-Б) на рост и выделение этилена из трех генетических линий Arabidopsis thaliana. Физ.раст.,1993, 40(8), 764-769.

10. Загорска Н.А., Шамина З.Б. Способность к регенерации в культуре тканей разного происхождения. Культура изолированных органов, тканей и клеток растений, М., Наука, 1970, с.1027-1033.

11. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и методы их исследования. М., Наука, 1971, 185с.

12. Канаш Е.В. Изменение продуктивности и содержания пигментов у растений фасоли при ультрафиолетовом стрессе. В кн. "Фотосинтез и продуктивность растений", ВАСХНИЛ, 1990, Саратов, 86-89.

13. Канаш Е.В., Савин В.Н., Осипов Ю.А. Изменение роста и продуктивности растений ячменя при облучении ультрафиолетовой радиации в различные периоды онтогенеза. Физ. раст., 1988, т.35, вып.4, 726-729.

14. Карабаев М.К., Джардемалиев Ж.К., Дарканбаева Г.Т., Бутенко Р. Г. Генетические особенности каллусообразования и регенерации растений в культуре клеток пшеницы и эгилопса. С/х биотехнология, 1991, N3, 69-74.

15. Карабаев М.К. Культивируемые клетки пшеницы и кукурузы: физиологические и биотехнологические аспекты. Ав-тореф. дис. докт. биол. наук, Алматы, 1994, 380с.

16. Кучеренко Л.А. Биологические особенности риса в культуре in vitro и создание на их основе биотехнологии получения исходного селекционного материала. Автореф. дисс. докт. биол. наук, Краснодар, 1991, 230с.

17. Лютенко B.C., Юсухно Т.В., Пастернак Т.П. Количественная оценка способности к каллусообразованию и регенерации трех сортов яровой пшеницы. Совр. мет. и подходы в селекции растений, 1991, 71-76.

18. Мамадриконов А.Ш. Влияние УФ радиации на рост ячменя и транспирацию листьев растений в условиях высокогорий Памира. Изв. АН Тадж. ССР, 1988, Отд. биол. наук, 3, 45-49.

19. Роун Ш. Озоновый кризис. М., Мир., 1993, 317с.3 0.Сидоров В. А. Биотехнология растений. Клеточная селекция, Киев, Наукова Думка, 1990, 280с.

20. Суханов В.М., Папазян Н.Д. Условия получения каллусов и регенерантов в культуре зрелых зародышей пшеницы. Апомиксис и цитоэмбриология растений, 1983, 124-130.

21. Тимощенко А.С., Казуто О.Н., Гордеева Е.Е. Количественные определения путресцина в растительном материале в присутствии свободных аминокислот. Физ. раст., 1980, т.27, V6, с.1308-1314.

22. Филиппов Ю.В. Вобликова В. А. Озонный щит земли М., Знание 1980, 62с.

23. Упельниек В.П., Новосельская А.Ю., Шутка А.Е.,Талиба Г., Метаковский Е.В. Анализ изменчивости электфоре-тических спектров запасных белков зерна у регенерантов пшеницы. Генетика, 1991, 27, N9, с. 1597-1603.

24. Халилов Р.И., Ахмедов И.С. О некоторых особенностях действия УФ света на активность Н+ помпы плазматических мембран клеток растений. Материалы 1-й Респ. биохим. конф., Баку, 1990, с.125.

25. Халилов Р.И., Хомутов Г.Б., Тихоново А.Н. Влияние ультрафиолетового облучения на структурнофункциональные характеристики тилакоидной мембраны. Физ. раст., 1993 40(3), 373-378.

26. Шамансуров С., Акназаров О.А. Влияние УФ-радиации на рост различных органов растений (фасоль). Изв. АН Тадж ССР, 1988, Отд. биол. наук, 33, 41-44.

27. Шульгин И.А. Лучистая энергия и методы ее измерения в светокультуре растений. Учебно-методическое пособие, М., Изд. МГУ, 1962, 60с.

28. Шульгин И.А. Солнечная радиация и растение. Л., Гидрометеоиздат, 1967, 130с.

29. Шульгин И.А. Солнечная радиация и фотоморфогенез зеленого растения. Автореф. докт. биол. наук, 1970, 230с.

30. Шульгин И.А. Растение и солнце Л., Гидрометеоиздат, 1973, 270с.

31. Шульгин И.А., Забиров Р.Г., Щербина И.П., Толибеков Д. Т. О роли ультрафиолетовой радиации высокогорных районов в строении побега и продуктивности пшеницы. Биол. науки, 1990, N7, 107-118.

32. Acosta M., Casas J.L., Arnao M.B. Hydroperoxide and ehtylene formation coupled to 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid oxidation catalyzed by perixidase. Physiol. Plant., 1990, 79(2), 35-39.

33. Ahloowallia B.S. Somatic embrioids in monocots. Their genetics and genetic stability. Rev. cytol.* and biol. veg. bot., 1991, 14, N3-4, p.223-235.

34. Barnes P.W., Flint S.D., Cadwell M.M. Morphological responses of crop and species of different growth forms to ultraviolet-B radiation. Am. J.' Bot., 1990, 77, 1354-1360.

35. Beggs C., Shneider-Ziebert U., Wellman. UV-B radiation and adaptive mechanisms in plant. Photoch. Photobiol., 1986, 3, 243-255.

36. Beggs C.J., Stolzer-Jehle A., Welman E. Isoflavonoid formation as an indicator of Uv-stress in bean (Phaseolus vulgaris L.) leaves. Plant Physiol., 1985, 79(4), 630-634.

37. Beggs C., Wellman E. Analysis of light-controlled anthocyanin formation in coleoptiles of Zea mays L. The role of UV-B, blue and far-red light. Photochem. Photobiol., 1985, 41(2), 481-486.

38. Bornman J.F. UV-radiation as an environmental stress in plants. J. Photochem. Photobiol., 1991, 8(3), 337341.

39. Bornman J.F. Target sites of UV-B radiation in photosynthesis of higher plants. J. Photochem. Photobiol., 1983, 4(2), 145-148.

40. Borman J.F., Bjorn L.O., Akerlund H.E. Action spectrum for inhibition by ultraviolet radiation of photosystem II activity in spinach thylakoids. Photobiochem. Photobiophys., 1984, 8, 305-313.

41. Bruns В., Hahlbrock K., Schafer E. Fluence dependece of the ultraviolet-light-induced accumulation of chalcone synthase mRNA and effects of blue and far-red light in cultured parsley cells. Planta, 1986, 169, 393-398.

42. Butenko R.G., Niciforova I.D., Chernov V.A. Growth and morphogenesis in cell culture of spring wheat ander stress conditions and selection of tolerant cell lines. Postdamer Forschunger Reicher Heft 57 (Potsdam). 1988, p.9.

43. Caldwell M.M. Solar UV irradiation and the growth and development of higher plants. Photophysology, 1971, 6, 131-177.

44. Caldwell M.M., Gold W.G., Harris G., Ashuurt C.W. A modulated lamp system for solar UV-B (280-320nm) supplementation studies in the field. Photochem. Photobiol., 1983, 37, 479-485.

45. Caldwell M.M., Teramura A.H., Tevini M. The chaiging solar ultraviolet climat and the ecological consequences for higher plants. Ecolog., 1989, 4, 363367 .

46. Carman J.G., Jefferson N.E., Campbell W.F. Induction of embryogenetic Tr. aestivum in calli. II Quantification of organic addenda and other culturevariable effects. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 1987, 10, p. 115-128.

47. Chang D.C., Campbell W.F. Responses of tradescantia stamen hairs and pollen to UV-B irridation. Environ. Exp. Bot., 1976, 16, 195-199.

48. Chin J.C., Skott K.J. Studies on the formation of roots and shoots in wheat cultures. Ann. Bot. (Gr. Brit.), 1977, 41, N173, 473-481.

49. Cieminis C.G.K., Ranceliene V.N., Prijauskiene A.J., Tiunaitiene N.V., Rudzianskaite A.M., Jancys Z.J. Chromocome and DNA damage and Their repair in Higher plants irradiated with short-wave ultraviolet light. Mutat. Resp., 1987, 181, 9-16.

50. Galiba G., Yamada Y. A novel method for increasing the frequency of somatic embryigenesis in wheat tissue culture by NaCl and Kcl supplementation. Plant Cell Reports, 1988, 7, N1, p.55-58.

51. Dangl J.L., Hauffe K.D., Lipphardl S. et al. Parsley protoplasts retain differential responsiveness to UV light and fungal elisitor. EMBO J., 1987, 6, N9, p2551-2556.

52. Dudits D., Nemet G., Haudi Z. Study of callus growth and organ formation in wheat (Tr. aestivum) tissue cultures. Can. J. Bot., 1975, 53, 957-963.

53. Ensminger P.A., Schafer E. Blue and ultraviolet-B light photoreceptors in parsley cells. Photochem. Photobiol., 1992, 55, 437-447.

54. Feinbaum R.L., Ausubel F.M. Transcriptional regulation of the Arabidopsis chalcone synthase gene. Mol. Cell Biol., 1988, 8(4), 1985-1992.

55. Flint S.D., Caldwell M.M. Influence of floral optical properties on the ultraviolet radiation enviroment of pollen. Am. J. Bot., 1983, 70, 1416-1419.

56. Frederick J.E., Lubin D. The budget of biologically active ultraviolet radiation in the earthatmosphere system. Ecology, 1988, 44, 342-347.

57. Frederick J.E., Snell H.E., Haywood C. Solar ultraviolet radiation at the earths sufase. Photochem. Photobiol., 1989, 50(8), 443-450.

58. Gold W.G., Caldwell M.M. The effects of ultraviolet-B radiation in terrestrial ecosystems. Phys. Plant., 1983, 58, 435.

59. Gosch-Wackerle G., Avivi L., Galun E. Induction callus and differentiation of callus from immature rachises, seeds and embryos of Triticum. Z. Pflanzenphysiol., 1979, 91, N3, 267-278.

60. Green A.E.S., Cross K.K., Smith L. A. Improved analytical characterization of ultravioleet skylight. Photochem. Photobiol., 1980, 31(1), 59-65.

61. Hashimoto Т., Shichijo C., Yatsuhashi H. Ultraviolet action spectra for the induction and inhibition of anthocyanin synthesis in broom sorhum seedlings. Photochem. Photobiol. В., 1991, 11(4), 353-363.

62. Janes L.V., Кок B. Photoinhibition of chloroplast reaction. Kinetic and action spectra. Plant Physiol., 1966, 41, 1037-1042.

63. Kornberg W., Baker A. DNA replication. Mol. Biol., 1992, 45, 771-791.

64. Krishnamutri M., Tlaskal J. Fuji desease resistant Saccharum officinarum var. Pindar subclones from tissue cultures. Proc Int Soc Sugarance Technol., 1974, 15, p. 130-137.

65. Larkin P.J., Skowcroft W.R. Somaclonal variation a novel sourse of variability from cell cultures for plant improvement. Thepr. Appl. Genet., 1981, 60, N4, 197-214 .

66. Lercari В., Sodi F. , Sbrana C. Comparison of photomorphogenic responses to UV-light in red and white cabbage (Brassika oleracea L.). Plant Phys., 1989a, 90(1), 345-350.

67. Li J., Lee T.M.O., Raba R., Amundson R.G., Last R.L. Arobidopsis flavonoid mutant are hypersensitve to UV-B irradiation. Plant Cell, 1993, 5, 171-179.

68. Lindoo S.S., Seeley S.D., Caldwell M.M. Effects of ultraviolet-B radiation stress on the Abscisic Asid status of Rumex patientia leaves. Phys. Plant., 1979, 45(1), 67-75.

69. Liu M.C., Yeh H.S. Regeneration of NaCl-tolerant sugarcance plants from callus re-initiation from precelected differentiated shoots. Proc. Nat. Sci. Counc. Rep. (China, Taiwan), 1984, 8, 11-18.

70. Lu Wen-Liang. Study of the direct regeneration of spiklets and pistil like structures from callus derived from glumella and lemma explants of wheat. Acta biological experimentalis sinica, 1992, 25, N1, 10-13.

71. Lu C., Vasil I.K., Ozias-Akins P. Somatic embriogenesis in Zea mais. Theor. Appl. Genet., 1982, 63, 109-112.

72. Maddock S.E., Lancaster V.A., Risiott R., Franklin J. Plant regeneration from cultured immature embryos and inflorescenses of 25 cultivars of wheat (Tr. aestivum). J. Exp. Bot., 1983, 34, 915-926.

73. McLennan A.G. DNA damage repair and mutagenesis. DNA replication in plants. Mol. Biol., 1987, 44, 543.

74. Meury J.,Robin A. A high-affinity site for glutathione in the cytoplasm of Escherichia coli andits possible role in potassium retention. J. of Biochemis., 1985, 148: 113-118.

75. Mirecki R.M., Teramura A. Effects of ultraviolet В irradiance on soybean. The dependence of plant sensivity on the photosynthetic photon flux density during and after leaf expansion. Plant Phys., 1984, 74(3), 475-483.

76. Morisson R.S., Whitaker K.J., Evans D. Somaclonal variation: Its genetic basis and prospects for crop emproevementio Proc. of 27th Annu. Meet. Phytochem. Soc. Nat. Amer. Tampa, 1988, 1-18.

77. Murashige Т., Scoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol plantarum, 1962, v. 15, 473-497.

78. Murphy T.M. Membranes as targets of ultraviolet radiation. Phys. Plant., 1983, 58, 381-388.

79. Murphy T.M. Effects of broad-band ultraviolet radiation on hydrogen peroxide formation by cultured rose cells. Phys. Plant., 1990, 80(1), 63.

80. Murphy Т., Hamilton C. A strain of Rosa Damascena Cultured Cell Resistant to Ultraviolet Light. Plant Physiol, 1979, 64, 936-941.

81. Nabors M.W., Heyser J.N., Dykes T.A., De Mott K.J. Long duration, high frequency plant regenerant from cereal tissue culture. Planta, 1983, 157, N5, 385-391.

82. Nedunchezhian N., Kulandaivelu G. Evidence for the ultraviolet-B (280-320nm) radiation induced structural reorganization and damage of photosystem II polypeptides in isolated chloroplast. Phys. Plant., 1991, 81(4), 558-562.

83. О'Нага J.F., Street Н.Е. Wheat callus culture. The initiation growth and organogenesis of callus, derived from various explant sourses. Ann. Bot. (Gr. Brit.), 1987, 42, N181, 1029.

84. Ozias-Akins P., Vasil I.K. Plan regeneration from cultured immature embryos and fluprescences of Tr. aestivum L. (wheat): Evidence for somaticembriogenesis. Protoplasma, 1982, 110, N2, 95-105.

85. Pang Q., Hays J.B. UV-B-inducible and temperature-sensitive photoreactivation of cyclobutane pyrimidine dimers in Arabidopsis thaliana. Plant. Phys., 1991, 95, 536-543.

86. Pang Q., Hays J.B. UV-B-inducible and temperature-sensitive photoreactivation of cyclobutane pyrimidine dimers in Arabidopsis thaliana. Plant. Phys., 1991, 95, 536-543.

87. Peak J.J., Peak J.G. Use of action for identifying molecular targets and mechanisms of action of ultraviolet light. Phys. Plant., 1983, 58, 360-366.

88. Quaite F.E., Sutherland B.M., Sutherland J.C. Action spectrum for DNA-damage in alfalfa lowers predicted impact of ozone depletion. Natire, 1992, 358, 576-578.

89. Redway F.A., Vasil V., Lu D., Vasil I.K. Identification of callus tipe for long-term maintenance and regeneration from commercial cultivars of wheat (Tr. aestivum L.). Theor. Appl. Genet., 1990, 79, 609617 .

90. Robberecht R., Caldwell M.M. Leaf epidermal transmittance of ultraviolet radiation and its implication for plant sensitivity to ultraviolet-radiation induced injiry. Oecologia, 1978, 32, 277-287.

91. Sears R.G., Decard J., Tissue culture variability in wheat: Callus induction and plant regeneration. Crop Sci., 1983, 22, 546-550.

92. Scoog F., Miller C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro. Symp. Soc. Biol, 1957, 11, 118-131.

93. Scowcroft W.R., Ryan S.A. Tissue culture and plant breeding, Plant Cell Culture Technology, Oxford: Blackwell Sci Publ., 1986, p.67-95.

94. Shepard J.F., Bidney D., Shaning E. Potato protoplasts in crop emproevement. Science, 1980, 208, N4439, p.17-24.

95. Shimada Т., Yamada Y. Wheat plant regeneration from embrio cell cultures. Jap. J. Gen., 1979, 54, N5, 379385.

96. Schulze-Lefrt P., Becker-Andre M., Schulz W., Hahllbrock K., Dangl J.L. Functional architecture of light-responsive chalcon-synthase promoter from parsley. Plant Cell, 1989, 1, 707-714.

97. Sillivan J.H., Teramura A.H., Ziska L.H. Variation in UV-B sensitivity in plants from 3000 m elevational gradient in Hawaii. Am. J. Bot., 1992, 79, 737-743.

98. Sisson W.B., Caldwell M.M. Atmospheric ozone depletion reduction of photosysthetic and growth of a sensitive higher plant exposed to enhanced UV-B radiation. Exp. Bot., 1977, 28(104), 691-697.

99. Skirvin R.M., Janick J. "Velvet Rose" pelargonium a scented geranium. Hort. Sci, 1976, 11, p.61-62.

100. Teramura A.H. Effects of ultraviolet-B radiation on growth and yield of crop plants. Phys. Plant., 1983, 58, 415-427.

101. Teramura A.H., Silivan J.H. Soybean growth responses to enhanced levels of ultraviolet-B radiation under greenhouse condition. Am. J. Bot., 1987, 26, 8995.

102. Teramura A.H., Murali N.C. Intraspecific differences in growth and yield of soybean exposed to ultraviolet radiation under greenhouse and field conditions. Environ. Exp. Bot., 1986, 26, 89-95.

103. Tevini M. The effects of UV radiation on plants. J. Photochem. Photobiol., 1988, 2, 401-403.

104. Tevini M., Braun J., Fieser G. The protective function of the epidermal layer of rye seedlings against ultraviolet-B radiation. Photochem. Photobiol., 1991, 53(3), 329-333.

105. Tevini M., Teramura A.H. UV-B effects on terrestrial plans. Photochem. Photobiol., 1989, 50, 479-487.

106. Tevini M., Iwanzik N., Thoma U. Some effects of enhanced UV-B irradiation on the growth and composition of plans. Planta, 1981, 153, 388-394.

107. Tevini M., Steinmuller D. Influence of light, UV-B radiation, and herbicides on wax biosynthesi of cucumber seedlings. Plant Physiol., 1987, 131, 111-121.

108. Toyoda H., Chatani K., Matsuda Y, Hirai H. Efficient isolation of tobacco mosaic virus-resistant somaclones regenerated from infected tobacco callus tissue. Abstr. 1st Int Congr of Plant Mol Biol. 1985, p.61.

109. Tyrell R.M., Pidoux M. Endogenous glutathione protects human skin fibroblasts against the cytotoxisaction of UV-B, UV-A and near-visible radiation. Photochem. Photobiol., 1986, 44, 561-564.

110. Vasil I.K. Somatic embriogenesis and plant regeneration in cereals and grases. Plant Tissue Culture, 1982m Prog. 5-th Int. Congr. Plant Tissue and Cell Culture, Tokyo and Lake Yamanaka, Yuly 11-16, 1982, 101-104.

111. Vasil I.K. Developing cell and tissue culture systems for improevement of cereal and grass crops. Plant Physiol., 1987, 128, 193-218.

112. Vogt Т., Gulr P.G., Reznik H. UV-radiation dependent flavonoid accumulation of Citrus laurifolius. Z. Naturforsch, 1991, c42(l-2), 37-42.

113. Vu C.V., Allen L.H., Garrard L. Effects of supplemental UV-B radiation of growth and leaf photosynthetic reactions of soybean (Glycine max). Physiol. Plant, 1981, 52, 353.1. A'ri

114. Т'ЬбТДДРСТВЕГЛ^ ->.<•,Т//У1Щl-'OJ,