Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние фитогормонов на органогенез зеленых растений табака: нормальных и трансформированных

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние фитогормонов на органогенез зеленых растений табака: нормальных и трансформированных"

'.«"Ч Г' "г" Ъ ^

1. А 1 '' .■■ . 1

......

АКАДИЛ1Я Ш СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ МЗИОЛОШ РАСТЕНИЙ т-гин К.А.КМГРЯЗШ

На правах р7Ксшоп

'-УДК 581.143.6+581.192.7:581«154.57

КАМБУРАВАЛА Кднканачго Д.С. Ранавлра

ВЛИЯНИЕ СНТОГОШОНОВ НА ОРГАНОГЕНЕЗ ЗЕЛЕНЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА: НОГ.ШШХ Л 7РАНСФ0ЕМ?0ВАШШ

/03.00.12 - флзяология растений/

Автореферат диссертации па соисканий ученой степонл кандидата биологических науп

Москва - 5999%

Работа выполнена в Института физиологии растений еа:ыш К.А.ТвщрязоЕа АН СССР

ШучйШ руеоводйсль - доктор биологических наук*

профессор В.ЩКЬШМ

Научнйй КонЬу.&тсжт

СО рааДзлу hmoima - доктор биологических наук»

профессор Ю.ЛЛУТЮВ

0$с1:;1йЛЬ1Ша оппоненты: доктор биологических наук

В.В.МАЗИЕ

' доктор биологических наук

. • С.А.Г0С'1/1иСй51

Водуцсо учрезденио - Главный ботанический сад Ail СССР

Вадиа состоится " 6 " ср е&ра и л 1990 г. •в "¡0" чосоэ на оаседашш специализированного совета цо присуждению.ученой степени, кандидата биологических наук /К 002.45.01/ прл Института физиологии растений имени К,А.Тимирязева /Л СССР по адресу: I2627I, Москва, И-276, уд. Ботшшческая, дои 35,'

t • 0 диссертацией модно ознакомиться в библиотеке Института'" i,202CW}0ruB растений-им. К.А.Тимирязева АН СССР

Автореферат разослан "2Z" 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного ропота i щщпдат биологических наук

Д.И,Сергеева

'^eiimf

/ *3"

' \ 'Л 7 ОБЩАЯ XAPAKTEPJ1CTIKA РАБОТЫ

"Актуальность проблемы. Для выяснения путей гормональной регуляции роста и органогенеза растений, как правило, используется два основных подхода: исследование уровней эндогенных гормонов или изучение действия экзогенных регуляторов на ростовые процессы /Darfling, 1984 ; Чайлахяы» 1985 ; Кефели, 1988/. Однако экзогенные фитогормоны могут поступать не в те компартменты, в которых локализованы эндогенные. Поэтов и характер их действия может быть отличны?.! от влияния эндогешшх регуляторов. Во избеяание этого в последние года начали использовать ткани растений, трансформированных плазмидамн, несущими бактериальные гены синтеза гормонов /Шредер и др., 1987 ; Андрианов, 1988, Shell , 1987, Klee et al, 1987/. К таким бактериям относятся Agrobacteriun tunefaciena И A.rhizogenee. Их фитопатогешюсть связана с наличием в клетках агробактерий так называемых ti (tumor inducing^ Ri(Root inducing)- цлазмид, выэыва-miix опухолевый рост /гиперплазию/. Она возникает как следствие переноса и интеграции в ядерную ДНК расте1шя небольшого специфического фрагмента ДНК плазмвд агробактерий, непосредственно связанного с изменениями в гормональном обмене /Пирузян, Андрианов,1985 ; Пирузян, 1908 ; Akiyoshiot al, 1983/. Генетические карты Tin Ri плазмид схо.чи /Пирузян, Í988/. Онкогенность плазмид обеспечивается совместны;.! действием многих генов, расположенных в ео Т-ДНК (one) или вне Т-ДлК (vir), в области Т-ДНК находятся также гены, контролирующие синтез ауксина /гены I и 2/' и цитокинина /ген 4/ /Akiyoshi st_ al¿ 121.3; shell, I9B7; Kutácek, 1988/. В связи- о тем, что гены переноса /vir/ лежат вне Т-ДНК, ее центральную часть мокло заменить на чуяе-родные гены и в таком виде плазмида монет быть интегрирована в геном растения. Для получения из трансформированных клеток раотений-регеперантов необходимо предотвратить образование опухолеродных \ клеток, мешаддох нормальному морфогенезу. Поэтому для инфицирования пис зсго растения удобно использовать мутанты Ti-плазкяд о удаленной > ;1б-частью или исходные ЮТВД /Шелл и др. ,1985; ishikawa ац IrJoü/. '. .

В результате трансформации рабтитгиьныо клетки приобретает способность к гиперпродукции цитокинина и/или ауксина и становятся го-р:.-,илонсзависШ£ЫШ в условиях культуры in vitro (Van Onckolen et_al 1'; ¡Cine et al, 1?J7S Ishikawa et al, 1938). . ' \

Ране экспериментаторы шелл дело преимущественно с тканевые культурами такого типа ели so с растешшш-регенералташ, ыорфогенез которых ограничивался только побего-, или корнаобразованиеы (Shall, 1987} Morris",/936).

Представляется вахныы выяснение рсш гормонов цитокнншшв и ауксинов при получении нормального растения-рогенераыта, выяснение рсш каздого из отнх гормонов в индукции как поб егообраз овашш, так а рзаогенеза в культуре in vitro.

Цель и задачи работ». Цель нашего исследования состояла в шш-елэнки роли фитогорыонов в органогенезе растения табака, ьультивиру-еаого в условиях in vitro.

Дяя выяснения роли гормонов было использовано два подхода; I. Внесение в среду культивирования ауксинов и ццтокишшов_в различных соотношениях и 2. введение в геном клетки табака Ti- плаэмидо Agrobacteriua, в которую шшнен ген, ответственный за синтез цато-кашша. Варьирование уровней фитогорданов этими двумя способами ш-. яет позволить' подойти к решению вопроса о роли регуляторов роста в органогенезе растения.

Исходя из отого в задачи исследования входило следующее.

1. Регенерация in.vitro физиологически нормальных растении табака ПОСЛе Трансформации ИХ Векторной системой ПЛаЗШД Agrobaoterium, кеоущей ген 4 Т-ДНК.

2. Изучение физиологических особенностей растений-трансфоршптов в условиях продолжительной культуры in Vitro.

3. Введение в культуру каллусных тканей растений-трансформангов и нэучошо способности етой культуры к органогенезу в связи с гормональным обеспечением среды.

4. Определение уровней цатокшшна, ауксина и абсцпзовой кислоты ■ /АЕК/ у трансгенных растений. -

5. Определение ИУК-оксидазной активности в корнях и листьях трано-форщантоа.

6. Выявление уровня хлорогеновой кислоты у растений табака после трансформации.

Научная иопцзна и практическая значимость работн. Новизна ра-Аохн заключается в комплексном исследовании происходящих при транс-форслацаи растительных клеток пзизнений в содеряании цитокшшпов, ИУК, ЛШ в хдорогеновой кислоты..

-sB целом, обнаружено, что экспрессия гена 4 Т-ДНК Ti-плазмздц Agrobíicteriun приводит к значительному изменению гормонального статуса растений. Это выразилось в сельном возрастании содержания но только цнтокиюшов, но п ауксинов и сшкешш уровня ЛЕС.

Впервые показано возрастание уровня хчорогоновоЛ кислоту в л:?.стьлх, а тшгаэ снижение шстивностп НУК-оксидазы п листьях л 'в корнях трзнсгешшх растснш! табака. Установлена способность изолированных клзток трансгешпгх регенерантов к гор.усионезавлскп>му росту

В УСЛОВИЯХ КуЛЪТурЫ in vitro.

Показано, что клеточные культуры, полученные in vitro от трансгешшх растений, отличает высокая способность к образовании вегетативных почек, из которых з определенных условиях горконазьпо-го обеспечения г.гагут с^оргяфоваться укореняг^юся побега.

Полученные данные позеолялт лучпе понять «¡упкцпи йзтогор.'.'.о:юп в процессах роста н г,:орфогенега. Предлат.ешплэ в настопцегл псолёда-результаты н выводы :,'огут быть использованы з дальнейпзх пс-следоггип'.ях рсгуллторной роли гена, контролирухцего синтез гормона п ролл ачо.7.гл1.11ого количества цитокпнжа в регуляция ростовнх про- . цсссоз у еь'селх растешь'!.

Апробация тботн. Основано результаты работу были долоззнп на заседании круглого стала "Регулятор!! роста растений", Москва,1587 ; иа Мзгззузовской конфорснцп:! по биотехнологии, г.!.'осква|1933; "na научных кон^орешпук Университета Другбн Народов нк,П.Лу?.!уибц /Москва, 2СУ7, 1988, 1989/ п молодых ученых физиологов /Цуютю.ЗШЗ/ ; на расширенных заседаниях лаборатория природных'п спптеткпосгах регуляторов ПФР АН СССР, кафедры гекетяка я селоэдза, кафедра ботаника л физиологии растений сельскохозяйственного факультета УДН.

Публ::!:ягли. По темо дассерташш спубггговапо 3 рэбегтте-

Структура, л сб7.оч__л"ссорта.ттт171. Дяссертацпогпая работа состоит пэ введения, обзора литературы, списания объектов п штодоз ясслз-дованпя, ззложеняя результатов п их обсуждения, заяппкпя, выволол п списка цитируемой литературы, Диссертация гглозспа иа страницах машинописного текста, содеряге -8 таблиц, /рясуттоз $ список литературы вклпчаот fó'Q лотлзнЬяялпа, яз шк iУ О на зко-стршпшх языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДУ ИССЛВДОВАНИЙ

Объекты исследований и условия их выращивания. В работа исполь-оовали растения табака n. tabacum сорта Сачюун двух генотипов -нормальные /контроль/ и трансгенше. Растения вырастали асептически в условиях культуры in vitro в факторостатной камере фитотрона MP АН СССР при постоянном освещении, температуре 26°С, влажности 7в колбах или цробирках на твердой безгормональной среде Мураси-гв и Скуга /¡¿С/, включающей мезоинозит (100 мг/л), витамин Bj (0,4 ИГ/д), Сахарозы, 0.8$ агара (Hurashige, Skoog , 1962).

Процедуры по трансформации растений проводили совместно с с£от~ рудниками Института молекулярной генетики АН СССР, г.Москва. Диски из свежих листьев стерильно растущего нормального растения табака эараясали штаммом Agrobacterium , несущим рекомбинантную плазшду со встроенным бактериальным геном синтеза цитокшина - ген 4 Т-ДНК (Horeoh et el, 1985). Инфицированные листовые диски помещали на сроду Цурасигв и Скуга, дополненную антибиотиками канамицином /селективный фактор/ и клафораном /антибактериальный фактор/ и бензиладе-ынном /индуктор побегообразования/ в концентрации 50 иг/л, 500 иг/л и I кг/л соответственно.

Визуально различимые побеги пересеивали затем на сроду для корнеобразовашш, сохраняя тот ке состав антибиотиков. Для доказательства трансформации регенеранты в возрасте 3-4 недель подаерга-«ел тесту ыа определение активности неомицивдосфотрансферазы II (NPT II-TCCT)/HorBch et al, 1985/ ц блоттинг гибридизации по Саузе-рену. Вопросы, связаннее с конструированием оригинальной плазмиды _рК5-5Тп4 подробно излояены в статьях /Пирузян," Андрианов,1985 ; Юоибов и др.,1986/.

■ Активность ендогешшх щггокининов определили с помощью амара-нтус-теста (Amaranthus caudatus L. /НазИН И др., 1976/. УСЛОВИЯ громатогра^аи: бумага Ленинградская средняя ; система растворителей саопропанол : аммиак ; вода 10 : I : I . Для очистки экстракта использовали ионно-обыенную хроматографию на колонке с Dowex w 80 И, размзр частиц 200 - 400 ыеш. Метод основан на стимуляции образования бетацишшш. в присутствии ь -тирозина в проростках ширица. Кон-цэнтрацЕю бетациашшов определяли при л*540 им на спектрофотометре Speool 221 /ГДР/.'

/птлпнссть ауксттноп я ингибиторов определяли по стандартней ггатодикэ Дефялз и др., 1973/. С этой целью водзув фазу, катучегщуп пз отанольного экстракта свезесобраяпых иля лпофзлпзпровашпд: листьев и корней нормальных л Т 4 растений, фракционировали о<сг;еп-ш.г! от перекисей диэтяловшл эфпрсц п разделяли па хро:яатографлчсс- , кой бумага Лешшградская средняя в система растворителей пзозроыа--пол : a¡.2sióK : вода 10 i-I : I . Об активности ауксинов а знгпбп-торсп судила по росту отрезков колеоптелой ппэнзци Альбздуы 43 в олсатах соответствувдих зон хрокатограюг /Бояркин, 1962/.

Уровень своболной АЖ определяли а лпефялпзпровашшх Л1Гот:;ях нереальных и • трансгеншх растений методом ГЖХ з сочзтаншт о тоипо-слойной п колоночной хроматсгргЛлей. Прародоуп AES ддсятп^щпроЕаля на хроматографа Газогсром 1109 с детектором слектрснного захвата /Кислтш, Кефола, 1981/, определяя количество за метилового сТлра. &рпкции, ccoTBSTOTBjTxcTS объему удергтгпагагс AEÍ, Eirsapicsara а тогл азота п мотилироЕслп раствором дпазс^зтапа. Колонка 3 z 2000 г.', Хроиосорбу 00 - ЮО мез с S,» лддкой фазой 07-17. Тешоратурз детектора 240°С, коленка 230°С, пняептора 220°С. Скорость газа-носи- ■' тел л азота для продувки детектора G0 wi/tsm, в колонке 30 ivt/ism., Время удерживания 6,6 иш. /рис.1/.

К г.'сушсу:_______:................. ^ .'

12 10 8 6 4 Т~0 12*40 5 8 6 4 2 0".

Вреул выхода кпн. Время выхода мая. . ;•«

?иc.I.Xpoi.-aTorpaw.',a кетшшрованной АБК:стандартной /А/ в прз-родной из листьев табака /Б/. ■'■■■.»

2-54

-а-

Опраделоние ИУК-оксидазной активности. С этой цельв навеску из листьев дли корней растирали и 0,02 Ы иа-фосфатном буфере, рЯ 6,1 и центрифугировали при 4000 и 13000 б по 10 мин. на цзн-■¿рпфуге К-24 /ГДР/. Сунерлатант очищали на колонке с софадексоы-0-25 02 ыизкомолекуляриого ингибитора. Реакционная смесь содег^лла ; 2 ш 0,2 М фосфатного буфера /р!1 6,1/, I ш I МипС12 , I ия I !,.' 2,4-Д, 2 ш I Ы ИУК и'4 ид ферментного препарата. Через 0,5 ; 3,6 1 е 10 ьаш. из смеси брани пробы по I ш, смепшвали с 2ш реактива '• Сачъковского и измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре Спекал 221 щт А - 530 ш. Концентрация ПУК рассчитывали по калибровочной кривой с известной концентрацией ИУК /от 5 до 40 икг/щ/. ИУК-оксвдазную активность рассчитывали в мкг ИУК, окисленной в мин. на мт,белка /Гамбург■ 1966/.

Хлорогеновую кислоту выделяли с помощью двумерной хромато-■ графин на бумаге в смесях растворителей: 1-2. направление - бутанол-уксусная кислота-вода, 4:1:1; 2™ направленно - 15^ уксусная, кислота.'Зону, соответствующую по синтетической хаоро-геновой кислоте, элшровала 36^ этанолом. После снятия УФ-спектрол содержание хлорогеновой'кислоты определяли по экстинции при л

»330 ни п рассчитывали по концентрационной кривой. Дарборы,1976 ; Еоф, Шарядов, 1905/.

■Статистическая обработка результатов рентой. Достоверность . различий ыазду вариантами в работе рассчитывали по критерию Оишера-Р. /Урбах, 1963/.

■о-

РЕЗУЛЬТАТЫ И IIX ОБСУлДИЗШ

Характеристика поста нормальных и тртнсгещщх тостс:т:1 табагл л теультурз in vitro. Т 4 растения визуально нэ отлтпатлсь or контрольных, Енрапшваемцх п тех пе условиях. Следует от,\:ет::гь, чтр трансгенниз растения, в которое 6:1.1 введен бактериальный ген '\„ обычно трудно укоронягтя-п не растут,, оставаясь карлика:.::! (aim ot nl, 1936 ; shall , 1987). Примзнсзше орипшальной векторной гшаз-гглда роХ5-Тп4 позволило получить физиологически нормальнее растонка о нормально растуцзй надземной частью а хорошо развито!!! корневой системой. В генемз такого растения /Т 4/ работал гон 4, находятся' под контроле?.! собственного промотора. /Юсибов п др., 1989/. За 3-4 недоля после черенкования формгровалось хороао развитез растеньица" с корневой системой. Листья л стебля имели темио-зеленуи скрзску, пря длительном шрацивашт на свету зеленоватый отгонок приобретали горня.

Поскольку клетки, изолированны? из трансгсшшх растет;:!, спо-ссCat к горюиоиезаатс:с.:очу росту /Вутенко, IS85.; Шфузли, IS33/ была поставлена задача проворить это свойство у 7 4 растс;пгй поолэ дпдицфзрхнздлрстзкя.

>{нлутау-1я кя.тлуоогзнеза. Для индукции клстоиш?: дзлзнлЗ у. сксп-.'•олтоп табака нормального и трансформированного тгаоп ::с::ользова*л основную среду .'.iypaciire л Cry г а с различны.! сочетанием ауксинов п ' ■ цитохгнпнов или без них /таблица I/.

Проделанная работа позволила выявить следущое. На безгормо пплъной cp-эде /МС 0/ дедпффзренцирозка стеблогах тканой из контро- ■ льнше растений практически но происходила, Нмбольпзй кзллусогспез /00,.« от тлела зксштантов/ контрольных растений наблэдзли, ейлд зке-планты поменалл на сроду с 2,4-Д п к:шстпнс.м в различном сочетании:, 2 мг л 0,2 мг ; I от к 0,5 ?т ; I мг л 0,1 мг соответственно Д'С 2, "С 3, U0 4/. Индукция каллусогенеза у стеблевых эксплантов Т 4 растений была обнаружена только при введении в среду I иг 2,4-Д ПОД мг кинотина Д'С 4/./таблица 2/. У контрольных растений пздукцая • . • коллусогенеза была наибольшей в возрасте 3-4 недоль, у болео старше растущих без пересадки -8-9 недель'контрольных рартениЗ, дедпфйо- .. ренцировку с образованном гетерогенного каллуса практически но наб- . лвдает. В отличие от контрольных Т 4 растения сохраняли внеокув

о ►î

е> О.

Jpf

'•Ш

о

»■3

1 Ч -

I ! » +

' î ' 1

« I I . СГ|

ÎÎ

+ +

+ + »

I I I

-м

' * »

» •

О

g

■ß

Hi

w

со

(BB^OtnMJMHO

О О О О О {-Н 'М M N О jOCOOOOOOOOO

I

■tí

г,

►3

в

to

£

СО О M О О О О ООО ООО О О О О О О'о

ОООММООООО

Оооооооооо

I

оооооооооо

OÎWWOOHOIMOIO

tu H!

оооооооооо

ООО иГсл о о о о о

I

СЛСОМ|КОМОД

• » •< •• ** •• •• •• •• «I

ммммииимм

to-

ca

о о н

о

б CD

s

а>

-л-

алтивность к индукции калдусоббразования болео продолжительный период вырайдаагая - до 8-10 недель, хотя с возрастом частота кадлу-согенеза и у них зилэтяо снижалась. Таким образом для индухгщн ка-длусогонзва оксплантов I 4 и нормального типа табака требуемо сочетания фптогормоиов окапаюсь различит. Оптимальной для обоих типов тканей, получен-¡лх из стеблешх оксплантов, оказалась срзда, содз]пэдйа 1,0 мг/л 2,4-Л п 0,1 .\т/л кпнетлна /IX 4/. Листовые ~ зкспланты оболх тшоз растопий обладали цзшяоЗ способностью з каз-лусогенезу. Поэтому дальнейшая работа проводилась па каллусах только стеблезого происхождения.

Действие гормонов па рост каллуса. -Дд-Т выявления влияния гор-молов на рост дедиффэрешщювашюй тзиши каллусные культуру нормального и Т 4 типа пзресагивали на среду LIO: а/ без флтогормоноп ; б/ полную /3,0 мг/л ПУК п 0,6 мг/л яннетшш/ j в/ дефицитную по c.-jit-елну, но с гашетянсм /0,2 мг/л/ j г/ доктрину» по цнтекпнзиу, но с ПУК-/3,0 от/л/.

Б таблице 3 продстсвлонц дашшв, характорнзук.^ю реет нормальнее н Г 4 каллус них гкалоЛ на средах с фитогормонамл Д!С+/'нлп без :ипх /IX-/.

Таблица 3

?ост стеблевого каллуса нормальпиз '/контроль/ п трансфор^прэвашшх /Т 4/ растений <т-?йапа иа среде с гормопа-п /-.'Сг/ или без них /;!С-/,

Pacieine ~ t 1 Среда t ! ..,,, . , , .„■„. , ........——--- 1 Сирая масса каллуса, г

j свет • j темнота

Контроль !'С + 4,5 ± 0,9 4,Э^ 0,8

ÜQ - 0,3 - 0,002 0,0*

Т 4 1!С + 5,3 ± 1,4 • 4,8 ± 0,9

НО - 4,4 ± 0,9 3,4 ± 0,7

На основании получениях данных мо-но саилотзть, что для роста нормальной каллусной ткани как па свету, так и в темноте требовалось присутствие в среде ПУК /3,0 иг/л/ п кпнетпна /0,6 мг/л/. В отличив от нормальной ткапи трэнсгонная характеризовалась активным ростом не то.лько на полной среде, но и в отсутствие $лтогор,*лопоз.

Эта тенденция сохранялась и на свету, и в теиаоге. На среде только с одним кз гормонов нормальная каллуснач ткань в темноте росла гораздо хуже, особенно, осли отсутствовал кипеткн. На свету в услот::хх дефицита по ауксину iyai cQTOiunmity рост нормального каллуса такко йил ослаблен, но иногда появлялись единичные корни.

Органогенез клл'Тусжпг |ультур табака коглпяьчого к трпжурор-стропаннэго тяга набЛЕпали при длительной культивировании их на свету.

ИорФогенотическиз потенции культивируемых in vitro клеток к тканей растений рсалисуйтсл только в спределэшглх условиях и оапп-сят, а частности, ст состава регуляторов роста /ауксинов к цитога-юшог/ б среде. Одним кз подходов к исследованию гормональной регу-лвдд еткх процессов ).:ог.от бить сравнение направленности органого-носа в сащснгости от обеспеченности сред:» экзогенными аукснна.ун л цзт0:а1шша:.с:. С стой ноль» mi пассировали норг/лльнуэ к трансгокцуп каллуснуи ткань на сроду "С, варьируя состав гормональных добавок: I, ЛУК и кянстнн, 3,0 п 0.G ш/и соответственно ; П. бес ауксина, с KuiieTEHca /0,2}0,6 иг/л/ i U, с ауксааоа /2,4-Д г И7К/. без пестика j ХУ. боа фатогормонов.

В глеео нормальной каллусной ткани, растущей на безгормопаль-uoS сродо шш только в присутствии ауксинов,, образовывались сдипгсч-ига корни, часто с отрицательным геотропизмом. Введение г. преду кк-иетпла благоприятно асазывалось на форлфоваюш побегоаодобных структур,

Пиблвдснае оа типом органогенеза каллуса транс^орт-антов покакало слсдувдае. При пассирования ого на свету акт;ншоо образованно

НОбйГОПОДОбШХХ Структур ПРОИСХОДИЛО И В ОТСУТСТВИИ (¡ЛТОГОрМОПОВ.

Обогедошю среда юшепшом усиливало эту морфогенную реакцню.

Корневой органогенез в выбранных 'условиях гормонального обеспс ченпя сроды бил гораздо слабое } чаде всего появлялись едлшгшко корни, оообонно осли в сроде присутствокш •укспн.

Как уже отмечалось, нормальная шшлуснан ткань в темноте росл: только на среде, донолнонпой рогуллюржл и в ьвде дедилеренцнро-ванной ткани.

В трансгонном каллусс, растуце;.: ь темлото на среде с клиетл-«Ю4# особенно в первых циклах ищ П1.;'.:,сшкя, o5H-ijy::;aKMH наличие побегонодобиых структур» И условии тш-.-.е мушли слабое

образозанив побзгоподобных структур на бсзгориональной' средо.

Taiciu образом, клеточные культуры Т 4 типа обладали явнш нрз-гс^цеством в реатазащга ¡.горфогеноткчесгах потенций отого растения в культуре in vitro . Напрашивается выгод, что эти события были вызваны усилешшм синтез см цнтокинпна под влиянием чужеродного гзна и измененная вследствие этого гормонального обмена.

Регуляторы роста.п траисгентпс п иориальннх растениях табака. Для выяснения влияния чужеродного rsna синтеза цигоканнна на накопление отого ¿чтогормона клеткаш! растения-регензранта определяла уровень евдогешшх цнтокннинов в листьях н в корнях Т 4 и контрольных растения табака /таблица 4/. Из таблицы 4 следует, что корни п листья контрольных растений не различались по уровиа цлтоюшинов в них.' В то :se время у трапс^орулнтов наблюдали существенные различия по содержания цитокшшнов в листьях /0,06/ и корнях /0,02/ мхг-зкз. кннетина в расчоте naif скрой кассы. Интересен йо;ст, что наряду с возрастанием активности щтокпшшов в листьях транфоргоштоз /в пять раз/, з корнях Т 4 растений выявлены лслъ следы этого фнтогормона.

Таблица 4

Активность эндогенных цитокшншов в нормальных /контроль/ я три I c-i ор -про г.з н! aix /Т 4/ растениях табака /ют-э!ш кинетика'г~^

сырой uaccii/

' Растений ■ • Активность

ЦЗТОЕНШШОВ

Контроль Лист 0,16 ± 0,01

Корень 0,14 ± 0,01 .

Т 4 Лист 0,86 ± 0,03.

Корець 0,02 - 0,004 ' ■

Моано предположить, что трансформация ццтокшинового гена связана с перераспределением ццтокяшшов молду листом и корнем. Эти данные нанял подтверждение при определения содержания цитокшшнов катодом ВЭДХ, приведенном сотрудн^са'п лаборатории совместно с чешскими коллега™. Изучите • содержания другого гормона - АБК - показало, что трансформация табака по гену синтеза цптокшшыа вызвала снижение содержания АБК в листьях Т-4 рЯйтениЗ в 1,5 раза в расчета

на I г сухой цасс'а /таблица 5/.

Таблица 5

Содеряаннз АГК в листьях норлильшх /контроль/ и

трансгешшх /Т 4/ растений табака

Растение Содержание ЛЕК, нг'г~А сцро& массы

Контроль 75,7 + 4,5

Т 4 45,5 + 1,8

Известпо, что ауксины наряду с цлтокишшама являвтся вааюШя:-кя фактора'"! регуляции ростовых цроцоссов у растений /Полевой,1£82. Кулаови, IS73 /. Сил но только нообходиш при ку лидировании растительных клеток, но л определяет направленность органогенеза ±п vitro /Бутеико, 1985/.

В owiu*: с DTEM представляло хштерзе определение уровня эндогенных ауксинов^ Ресультаты, подучешшо о помоги колеоптклыюго теста /таблица 6/, били впоследствии подтверждены истодом

Таблица 6

Активность ИУК в нормальных /контроль/ п трансгонных /Т 4/ растениях табака

Растсиио Орган ИУК, ыкг-»кл.г~А сырой ьм.ссы

Контроль листья 20,0 i 2,0

корни следы

Т 4 листья 210,0 ± 9,0

корни следы

Из литературы известно о взаимосвязи г,'.езду содержанием цптокп-ШШОВ И ИУК /Д,'.штривва И др., IS85 Jlshikawn at al ., Ii'bii/. Наш

данные позволяют предположить существование зависимости мехлу накоплением ИУК в листьях трансгешшх растений и ;унерлридукцией цито-кининов. Ещо одной причиной увеличения содерт-анил iD'K под дествием используемой плазмидной системы мояет бить присутствие в ней вирулентной 1!г-плазюи^. Пакостно, что частота совместного независимого переноса двух различии/. T-";iiC при йгрос::к?ер::«:ыюй ;:ц.;<!1ад:и мо.т.ст быть высока.

UocncuiJjy еидер.^.ико -JK в , ьум/. тыиихх часто сглзкиаот

о ауксин-оксидазой, окислядцей ее, представляло интерес изучение активности этого фермента. Оказалось, что в листьях, и оообенно, в корнях трансгешшх растений активность ауксин-оксидазы значительно нияе чем в тех до тканях нормальных растений /Таблица 7/.

Таблица 7

Активность ИУК-оксвдази в нормальных /контроль/ и'трансгеши|х А 4/ растениях табака /цкгИУК.цшГ^.иг болка"*/

Растение Орган ИУК-оксадаэная активность

Контроль Лист 34,4 + 2,2

Корень 62,1 + 15,2

Т 4 Лист 24,1 +3,9

Корень 32,2 ± 3,1

Известно, что в опытах in vitro кофейная кислота молот действовать как ингибитор ИУК-оксвдази н протектор ЙУК. Кромо того, аук-синоксндазная активность мозот подавляться хлорогеновой кислотой / Within], Gentile 1061; Gruef et al, 1977;Goodwin ¡3933/

которая представляет собой сложный эфир кофейной и хинной кислот /Запромето'в, 1987/. Содеряшто хлорогеновой кислоты оказалось значительно шк(| в листьях нормальных /0,12 ~ 0,01 мкг*г-^/, чем в Т 4| растениях / ¡0)44 - 0,02 шсг'г"*/. Примечательно, что схоаая ситуа- I цяя была выявлена при пассировании нормального цитокшшнчувствите-льного каллуса табака /Филонова, 19Б5/. С повышением концентрации кинетина в питательной среде в ткани накапливалась хлорогеновая кислота. Это указывает на возможную взаимозависимость мезду уровнем цнтокииннов и содержанием хлорогеновой кислоты в тканях табака. ■

■ ЗАХЯШЕШШ

%

Еведешю Оактериальнрго гена синтеза цитокинина в геном высшего растения сопровождается повышением эндогенного уровня не только ци— токиынна, но и ауксина. Последнее может быть связано со снижением

октивности ауксин-оксидааы, которое в своп очередь, мояет определяться как и в опытах in vitro , повышением содержания в трансформированной ткани ингибитора ИУК-оксвдазы / в данном случае - хлоро-геиопой кислоты/. Интересен тшспе факт снижения АШ под действием цвтокшшнового гона. Все это мозог бить причиной большей способности трапсгекных тканей к росту каллуса н органогенезу при его ¡суль-тавнровзн;ш /образовании побегов и побогоподсбных структур/, а также определять гормононезависшшй характер роста тканей трансгсшшх растений в условиях изолированной культуры.

ШВОДЫ

1. Регенерлнты /Т 4/, иалучешшо в результате трансформации стерильно растущая растений табака системой плазшд агробактерий со встроенным гоном синтеза цитогашпна /ген 4 Т-ДНК/, обладали хо-розо растуцпк побегом и развитой корневой системой.

2. Независимо от типа исходного раетешш экзогенные ч-итогормоны необходимы для индукции образования каялусных тканей, но в различных сочетаниях. Рост образовавшихся из стеблевых эксплаатов нор-шишх каллусних тканой зависел от гормональной обеспеченности Среда, В темноте без гормонов ткань погибала. Дли со оптимального роста требовались ПУК и гашетин.

3. Каллусние культуры Т 4 тина отличались гормононеэавнси:.и;.м ростом D длительной то.'ыювой 1;ультуре. Они тмехе хорошо , осли на полной щпмельноП сродо.

4. Выявлен силышй побогообразущи!! о^юкт каллусной ткани Т 4 на безгормоналыюй среде при ВЫ| iqntiwuu: на свету. Экзоге;шый ци-тегсшг.н /кннстин/ eue более усиливал побегообразуюцее свойство тшш.

5. Листья Т 4 растений характеризуются повк...шшм уровнем цитоглиш-нов и ауксинов. По содершшию утих гормонов в корнях различий мэаду двумя типами растений не выявлено. Установлено более низ-г.оэ содержание свободной ЛЕК в листьях трано}юр:.:аптов, чем контрольных раотепий.

, 6i 1 4 растениям свойственны нонижоннгш активность ИУК-оксидазы,

особенно а корнях. Содержание хлорогоновой кислоты вше в листьях трансгенных растений.

, Таким образом, в результате экспрессии гена 4 бактериальной Т—ДНК в клетках высшего растения происходило изменение уровней гормсноз различных классов. Могшо предположить существование зависимости кегду суп;риродукцией цатокшшна под влиянием чуно-родного гена и изменением содержания шшх гормонов /ауксинов п АБКД

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1, Камбуравала Р, Трансформация растений табака и цитокя-ншш,// Материалы научной конференции молодых ученых, U.: Изд-во УДИ. 1988. С,33-34.

2, Кефели В,И., Макарова Р.В,, Камбуравала Р., Андрианов В.ЫМ Пирузян Э,С,, Юсибов В,М. ^язнологическне особенности растений 'табака до и после трансформации клеток.// Тезисы докладов иа иездународной конференции "Биология культивируе1шх клеток и биотехнология", Новосибирск, 1508, С, 196, '■'

3, Kefeü V.l., Makarova U.V., Kamburawala R., Pirusian E.3., Andrianov V.M., Jusibov V.M. Phytohormones and phenolica in transformed tobacco plants, VI Congress of FESPP. Split. Jugoslavia. 1983. Abatr. N. 602.

f. ,