Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и исследование трансгенных растений рапса (Brassica napus L.)

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Получение и исследование трансгенных растений рапса (Brassica napus L.)"

На правах рукописи

'ТУ

РАЛДУГИНА Галина Николаевна

ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ РАПСА (Вптка пари* Ь.)

(03.00.12 - физиология растении)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

->

Раоота выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН

Официальные оппоненты

Ведущая организация

- доктор биологических наук Г.А.Романов

кандидат биологических наук И.Д.Никнфорова

ВИР РАН г.Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится " " и.. л_1997 I

[1 /О часов на заседании диссертационного совета по присуждению уч ион степени кандидата бологнческих наук ( К 002.45.01) при Циститу ([иппологии растений РАН по адресу: 127276, Москва Н-276, ул. Бота и ческая,35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фпзн логин растении им.К.А.Тимирязева РАН.

Автореферат разослан Ае-ол д/>я 1997 р.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

М.И.Азарко!

ОВЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальности проблемы. К настоящему времени остро стоит проблема создания культурных растении с улучшенными питательными свойствами, устойчивых к действию различных природных факторов, в том числе и патогенов.

Одном из важных сельскохозяйственных культур является рапс (Нга.ч.чка- пари.ч Ь.уаг.пари.н), который наряду с подсолнечником, соей и хлопком служит источником как пищевого, так и технического масла. Кроме того, рапс - ценная кормовая культура, содержащая большое количество легкоусвояемых белков. От других масличных растении рапс выгодно отличается способностью расти в зонах умеренного климата, где у других подобных сельскохозяйственных культур семена не вызревают.

Важность этой культуры настоятельно требует создания новых сор-11)1!, устойчивых к действию различных патогенных факторов и, в частности, насекомых. В современном сельском хозяйстве для уничтожения насекомых в качестве альтернативы химическим средствам используются биологические инсектициды - белки, вырабатываемые бактерией ПасШих 11тп11к1епх1х (дельта-эндотоксины). Эти соединения являются высоко специфичными для насекомых и совершенно безвредны для человека и теплокровных животных. Коммерческое использование этих препаратов офанпчепо их высокой стоимостью, а также их нестабильностью в полевых условиях.

Важной задачей является создание сельскохозяйственных растений и, п частности, рапса, самих вырабатывающих эти белки.. Широкие возможности в защите растеши"! открывает генетическая инженерия, методы которой позволяют включать чужеродные гены в геном растении. Для трансформации растении наиболее широкое распространение получили векторы, сконструированные на основе природной системы переноса генов почвенной бактерии АцгоЬааегиип ште/аейепх.

В нашей стране работы по получению трансгенных растений рапса были начаты в нескольких научных центрах, однако, к настоящему времени все они свернуты. За рубежом такие исследования активно проводятся в ряде крупных фирм, патентующих своп методы, что делает их практически недоступными. С другой стороны, многочисленные литературные данные достаточно противоречивы,' что также не позволяет воспользоваться разработанными в них методами трансформации растений. Все это делает актуальным разработки надежных и воспроизводимых методов регенерации и трансформации растений рапса доступных не только

для широкого круга исследователей, но и для специалистов с/х производства

Цели и задач» исследования. Целью настоящей работы являлось получение устойчивых к насекомым трансгенных растении рапса, способными экспрессировать чужеродные гены дельта-эндотоксина.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать методы регенерации рапса для получения высокой частоты регенерации побегов;

- исследовать различные сорта рапса с целью изучения их способности к регенерации и трансформации;

- подобрать условия трансформации эксплантов;

- доказать включение переносимого гена в геном растения;

- показать экспрессию введенных функциональных генов в трансгенных растениях;

- доказать наследуемость встроенных генов у самоопыленных растений и у их гибридов с нетрансгенамн;

- показать возможность клонального размножения полученных форм растений.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований разработаны методы регенерации рапса, позволяющие с высокой эффективностью получать побеги па эксплантах, полученных из различных органов растений разнообразных генотипов. Впервые в мире показана возможность использования фитогормона абсцпзовой кислоты (АБК) для резкого повышения эффективности побегообразования у рапса и доказана универсальность использования ее в качестве индуктора побегообразования для эксплантов семядолей проростков. Впервые в нашей стране получены трансгенные растения ярового рапса, несущие гены дельта-эндотоксина и прсП. С помощью блот-шбридизации РНК показано, что в трансгенных растениях происходила экспрессия введенных генов дельта-эндотоксина на уровне образования транскрнптов. Впервые для В.парик при помощи нескольких методов доказана наследуемость интродуциро-ванных чужеродных генов вплоть до 2 поколения. Показано, что свойства полученных трапсгенных форм растений сохраняются в процессе размножения при индукции побегообразования на эксплантах семядолей, что свидетельствовало о возможности их клонального размножения.

Практическое значение работы. Разработанные методы регенерации н трансформации позволяют создавать и размножать новые формы ярового рапса - ценнейшей масличной и кормовой культуры. Полученные

трансгенные растения могут служить материалом для различных селекционных программ.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на II п III съездах Всероссийского общества физиологов растении (Минск, 1990 г. и Санкт-Петербург, 1993 г.), на II Международной конференции "Биология культивированных клеток растении и биотехнология" (Алма-Ата, 1993), на Международном симпозиуме "Физиология абсцизовой кислоты" (Пущино-на-Оке, 1993), на II и III Российских симпозиумах "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино-на-Оке, 1993, 1994), па I, II и III Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (1991, 1992 и 1993 гт), на Росснско-Германском рабочем совещании по проблемам молекулярной биологии и биотехнологии растений (Москва, 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертационая работа состоит из введения и пяти глав: обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

Материалы диссертации изложены на ^-¿страницах машинописного текста, содержат 27 таблиц и 24 рисунка. Библиография содержит 223 источника, из которых зарубежной литературы - 208.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты нсследопапия. Работу проводили на нескольких сортах ярового рапса отечественной и зарубежной селекции. Исходные стерильные растения получали из семян и поддерживали черенкованием. В качестве эксплантов использовали различные части растении: сегменты стебля in vitro, пшокотили или семядольные листья проростков различных возрастов. Частоту регенерации определяли в процентах как отношение эксплантов, регенерировавших побеги, к общему числу высаженных эксплантов.

Питательные среды. Для культивирования in vitro растений и клеточных культур использовали агарпзованные среды, содержавшие минеральные компоненты по Мурасиге и Скугу, сахарозу и регуляторы роста в различных концентрациях. При этом: 1) для поддержания и размножения пробирочных растений, а также для получения проростков применяли среды только с ауксином а-нафтилуксусной кислотой (НУК) - 0,1 мг/л;

2) для получения первичных каллусных культур - среды с НУК (2 мг/л), кппетнном (4 мг/л) и 2,4Д (2,4-дихлорфенокснуксусная кислота) - 0,1 мг/л; 3) для регенерации растении из каллусов - среды с кинетмном, пн-долилуксуснон кислотой (ИУК) и абсцизовон кислотой (АБК); 4) для регенерации растений из семядольных листьев - НУК, БАП (6-бензиламинопурнн) и АБК. Для инициации каллусообразования среда была дополнена 3% сахарозой; среды для морфогенеза и поддержания роста растений содержали 1% сахарозу.

Бактериальные штаммы. В работе использовали A.tumefaciens, производную нопалинового штамма С58 с "обезоруженной" плазмидой pGV3850 на основе вектора рАР2034 с укороченным вариантом гена дельта-эндотоксииа (Bt) из промышленного штамма B.thuringiensis var. kurstaki HD-1-Dipel, стоящего под контролем различных промоторов: 1) бактериального промотора Г, кодирующего первый путь биосинтеза окто-гшна [штамм tl]; 2) промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты (CaMV) [штамм 35Stl]; 3) под контролем тандема промоторов 35S CaMV и Г [штамм 35S(2x)tl]; 4) 35S промотора с дуплицированной последовательностью энхансера из того же вируса [штамм 35SEtl]. Конструкции созданы в Институте молекулярной генетики РАН В.В. Евстратовой и В.М. Андриановым [Евстратова и др., 1990]. В качестве селективного гена в этих конструкциях применяли ген nptll под контролем NOS-промотора.

Эксперименты по трансформации проводили методом кокультиви-рования эксплантов с суспензионной культурой агробактерии. Для инокуляции брали 2-х суточную культуру агробактерии, находившуюся в стационарной фазе роста. Частоту трансформации определяли в процентах как отношение эксплантов, регенерировавших побеги на селективной среде, к общему числу имеющихся эксплантов.

Анализ растенип-трансформантов, контрольных растений, а также их потомков проводили несколькими методами: 1) по росту в селективных условиях на среде, содержавшей канамнцин (Км); 2) методами молекулярной биологин: присутствие встроенных генов Bt и nptll определяли блот-гибридизацией ДНК по методу Саузерна, а также с . помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР); наличие в растительном материале I'll К - траискрнптов определяли Нозерн-методом; экспрессию встроенною teiia nptll определяли по активности фермента неомицинфосфотрансфера-зы по методу Angenon et al.[1987]; 3) с помощью генетического анализа растений-регенерантов, который проводили методами классической генетики: самоопыления, скрещиваний с исходными формами и с растениями

определенных генотппов н изучения признаков растении, полученных после этих процедур.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ РАЗДЕЛ I. РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ РАИСА in vitro 1.1.Зависимость регенерации от различных факторов

Как известно, на каллусообразованне и морфогенез влияет множество различных условий. Нами была проверена зависимость каллусо- и органогенеза рапса от состава и концентрации регуляторов роста в среде культивирования эксплантов, а также от генотипа и вида экспланта.

Каллусообразованне на различных эксплантах зависело главным образом от состава среды вне зависимости от генотипа и вида ткани эксплантов.

Органогенез, находясь под гормональным контролем, зависел в значительной степени от генотипа и вида экспланта. Из испытанных в пилотных опытах 5 сортах ярового рапса (Ольга, Лидер, Нора, Ханна и Яр-вэлон) наиболее интенсивное образование побегов на эксплантах интакт-иых сегментов стебля наблюдали в опытах с сортом Ольга. При этом наибольшее влияние на побегообразование оказывал ауксин.

Изучение влияния ауксина проводили на эксплантах из различных тканей: гипокотнля и стебля 6-8 недельных растений in vitro. Экспланты после каллусогенеза были перенесены на среду, содержавшую различные количества ИУК (табл.1). Наибольшая частота побегообразования была при концентрации ИУК 0,01 мг/л на эксплантах сегментов стебля (СС) размером 5-10 мм. В отсутствии ауксина морфогенез не инициировался.

Таблица 1.Частота органогенеза ярового рапса сорта Ольга в зависимости от ткани экспланта и от концентрации ИУК

Частота органогенеза (%)

Эксилант Органогенез концентрация ИУК (мг/л)*

0,2 0.1 0.01

ИСГ побеги 0,9±0,2 0 0

корни 18,8+4.5 15,2±7,4 4.5±1,2

СС побеги 6.3+2.4 0 12,5±5,8

5-10мм корми 15.7+5.3 0 0

СС побеги 0 4,3+1.7 2,3+0,8

1- 2мм корни 0 12,4+3.2 33,8±6.2

ИСГ- сегменты пшокотнля СС - сегменты стебля

В пилотных опытах, используя в среде для органогенеза ИУК, нам не удавалось получить побегообразование на эксплантах семядолен; заменив ее на ПУК в среде побегообразования, нам удалось получить побеги и па семядольных эксплантах.

Образование побегов прежде всего зависело от возраста проростков (Рнс.1). Оно происходило лишь на семядолях, срезанных с 3- и 5- дневных проростков; семядоли с 7-дневных проростков в этих условиях побеги не образовывали, а формировали только корни; при этом частотота побегообразования зависела от концентрации гормонов в среде.

Рис.1. Частота органогенеза (%) на эксплантах семядолен проростков разных возрастов сорта Вестар без прекультивирования.

1 2 3 4 5

1 234 5

1 2 3 4 5

3 5 7

позрагт прорт-ткоп (дни)

Общее число экашаитои в каждом варианте - 30-45 а - эксплаиты с побегами; 6 - эксплаиты с корнями концентрация ршуляторов роста и среде:

1 - МУК 1 мг/л. БАП 2 мг/л; 2 - НУК 1 мг/л. БАП 4 мг/л; 3 - НУК 1 мг/л, БАП 4 мг/л; 4 - НУК 2 мг/л. БАП 4 мг/л; 5 - НУК 2 мг/л. БАП 8 мг/л

Рядом исследователей было показано, что для многих растений успешный процесс регенерации на различных эксплантах связан с необходимостью предварительного каллусогенеза с последующим переносом па среду, индуцирующую органогенез. Нами было проверено влияние на органогенез предварительного культивирования эксплантов семядолей на

среде с гормонами или без них (Рнс.2). При этом было выяснено, что прекультивпрованне, как правило, пнгибировало побегообразование, хотя и с некоторыми исключениями, в зависимости от возраста проростков и содержания регуляторов роста в среде. Прекультивпрованне 3-дневных проростков на среде с гормонами значительно снижало частоту побегообразования после 4 дней и почти полностью ингибнровало его после 7 дней (Рис. 2а). Прекультивпрованне на среде без гормонов сохраняло способность к побегообразованию при некоторых сочетаниях регулятов роста в среде органогенеза (Рис. 26). Прекультивпрованне семядолей с 5-дпевных проростков на среде без гормонов почти полностью ингибнровало образование побегов (Рис. 2г), тогда как инкубирование их на среде с гормонами в отдельных случаях почти не снижало побегообразование.

Рис.2. Частота органогенеза (%) на эксплантах семядолей проростков разных возрастов после прекультивировання на среде для каллусогенеза

80

60

40

Л 20

X 0

и.

о

X

ГЧ и 80

О 60

О 40

с л 20

X 0

80

60

40

20

0

1.2345

1 2345 4

Экспланты с 3-х дневных проростков

Г)

т

12345

А

80604020 -0-

.12144

Г

12345 .1 2345

Экспланты с 5-дневных проростков 80 ■ 6040 -20' ' ^ ■ 1 л(_1111.1

12345 12345 12345

Экспланты с 7-дневных проростков "8060 -40200-

1

1_I 1.^1 I

1 2144

1 2345

С

■ ■

12345

"7 '

я ■ '

12.345 10

Шт

12345 4

время предварительного культивирования, сут

12345 7

12345

1 2345 10

(Ушке число эксплаптов в каждом варианте - 45-48

а. п. д - ирскультивировамис па срсдс с гормонами (НУК 2 мг/л, кимстин 4 мг/л. 2.4Д - 0.1 мг/л); б, г, с - прекультнвнровапне на среде без гормонов: концентрация рауля-горов роста в срсдс: 1- НУК 1 мг/л, БАП 2 мг/л; 2 - НУК 1 мг/л, БАП 4 мг/л; 3 - НУК 1 мг/л, БАП 4 мг/л; 4 - НУК 2 мг/л. БАП 4 мг/л; 5 - НУК 2 мг/л, БАП 8 мг/л

' ' ' '

Д

(Рис. 2в). На эксплантах семядолен 7-дневных проростков наблюдали появление побегов только после прекультивнровання, но побеги, образовавшиеся в этих условиях, часто были внтрнфицированы и не обладали апикальным доминированием. (Рис. 2 д, е)

Подобная зависимость образования побегов от возраста согласуется с результатами, полученными другими исследователями для многих видов растении. Способность к регенерации побегов на семядольных эксплантах значительно уменьшалась с увеличением возраста проростков, исчезая к 7

- 15 дню. Действие прекультивнровання на органогенез, по-видимому, обусловлено ограниченным временем чувствительности экспланта к гормону

- индуктору побегообразования.

1.2. Влияние А!>К па органогенез па различных эксплантах

Из литературы известно, что при действии стрессовых факторов (соли, осмотики), вызывающих стимуляцию морфогенеза, в тканях растении увеличивалось содержание эндогенной АБК. Нами было проверено действие экзогенной АБК на каллусные культуры, полученные из стебля растений in vitro различных сортов рапса (Табл.2.), а также на экспланты семядолей, срезанных с проростков сорта Вестар (Табл.3,4).

Таблица 2. Побегообразование из каллусов в зависимости от копц. АБК

Генотип

Частота гюбегообразоиання (%)

концентрация АБК (мг/л)

0 3 6 9 12 18

Ярюлон 0 9.8 ±3,2 5.4 ±2.3 0 0 3.3 +0,5

Омега 0 31,1±13,5 0 0 4,0 ±1,2 0

Эшшн - 0 2,1 +0,4 2,3 ±0,2 0 0 0

Вестар 37.5+5,4 0 0 0 3,0±0,5 0

1 lopa 12,2±4.1 0 4.0+0,9 5.3±1,9 0 0

Ханна - 10.6±4,7 0 0 0 0 0

Ольга 23,3±6,4 35,4±12,3 5,б±1.8 8.5 ±2,9 0 0

Топаз 3,7±0.7 7,4 ±2,7 12,0±2,5 8,3 ±3,4 0 0

Общее число эксиламтои » каждом варианте - 35-42

Действие АБК на органогенез из каллусов зависело от генотипа растений. Все испытанные нами сорта можно было подразделить на три группы. У первой группы (Вестар, Нора, Ханна) самое высокое побегооб-

разовапне происходило на среде без АБК. Сорта второй группы (Омега, Ярвэлон, Эввнн), наоборот, совершенно не образовывали побегов в отсутствие АБК. У третьей группы сортов побегообразование хотя и происходило без добавления АБК, но повышалось при увеличении ее концентрации в среде (Ольга, Топаз).

Изучая влияние АБК на образование органов на эксплантах семял-лен, мы исходили из предположения, что ее действие на органогенез будет более универсальным. Дейтвие фитогормона изучали на семядолях, срезанных с проростков различного возраста при культивировании их или непосредственно на среде, индуцирующей морфогенез (табл.3) или после предварительного культивирования на средах, индуцирующих каллусооб-разоваипе (табл.4).

Таблица 3. Органогенез на семядольных эксплантах ярового рапса сорта Нестар (без прекультивировання)

регуляторы роста

частота органогенеза (%)

НУК БАП АБК 3 5 7

п / к*

1 2 0 29/ 100 33 / 100 0/60

1 2 1 100/7 83 / 83 25 / 83

I 2 3 62/22 67/33 39/0

1 4 0 14 / 100 17 /100 0/52

I 4 I 9/5 67 / 67 25 /100

1 4 3 89/0 50/0 50 / 50

1 8 0 57/27 27 / 100 0/100

1 8 1 76/ 100 100/44 67/66

1 8 3 88/ 0 50/ 17 83 / 16

2 4 0 48 / 100 33 /100 0/100

2 4 1 54/27 40/79 0/100

2 4 3 48/0 50/50 65 / 35

2 8 0 13/84 . 0/100 0/100

2 8 1 62/24 60/39 0/71

2 8 3 38/0 17 / 0 50/39

общее число эксилаптов в каждом варианте - 45 - 48 (100%) н/к*- н - экспламты с побегами, к - эксплапты с корнями

Добавление АБК, как правило, вызывало побегообразование или значительно увеличивало его у эксплантов семядолей с проростков всех возрастов. Особенно сильно этот эффект наблюдался для 7-дневных про-

ростков, которые без добавления АБК побегов не образовывали. Добавление в среду АБК. снимало также и отрицательное действие предварительного культивирования эксплантов семядолей всех возрастов. В табл.4 приведены данные для одной из комбинаций регуляторов роста в среде.

Таблица 4. Органогенез на семядольных эксплантах проростков рамса сорта Вестар после прекультивпрования эксплантов

Регуляторы роста

Частота органогенеза (%)

время нрекул1.тнпироцапия(сутки

НУК БАП АБК 0 4 7 10

П/К* 11** V*** II V II V

З-диеимыс самядоли

2 8 0 13/84 4/77 0/100 0/53 0/38 0/48 0/93

2 8 1 62/24 55/22 58/29 18/35 7/29 0/27 29/28

1 8 3 37/0 64/49 42/0 44/13 42/20 29/18 0/15

¿-дневные семядоли

1 8 0 27/100 0/53 0/80 0/0 12/0 12/18 0/33

I 8 1 00/44 27/0 29/50 0/0 17/33 47/26 0/14

1 8 3 50/17 21/0 32/10 50/0 21/10 69/ 8 7/14

7-ДМСШ1ЫС семядоли

1 8 0 0/100 0/0 0/82 0/0 0/0 8/46 0/33

1 8 1 61/06 58/0 0/100 8/0 0/0 10/30 6/59

1 8 3 83/16 83/0 0/14 0/0 0/0 60/0 0/24

общее число эксплантов в каждом варианте - 45 - 48 (100%); и/к*- п - экспламты с побегами, к - экегшанты с корнями;

II** - среда прскультшшронапня с гормонами (НУК 2 мг/л, кин.4 мг/л, 2.4Д 0.1мг/л); V***- среда прскультнтиироиапия без гормонов

Разработанный нами способ регенерации побегов на эксплантах семядолей проростков рапса был проверен кроме того на сортах Ольга, .Броновскин и Твошира, значительно отличающихся от сорта Вестар по своему происхождению. Семядоли с проростков 5 дневного возраста были высажены на среду с различным содержанием БАП и НУК и с одним и тем же количеством АБК - 3 мг/л (Табл. 5). Добавление АБК способствовало значительному увеличению частоты побегообразования у всех генотипов. Таким образом, наше предположение об универсальности действия АБК на семядольные экспланты как гормона, способствующего значительному усилению побегообразования, оказалось верным.

Таблица 5. Органогенез на семядолях различных генотипов рапса

Pci-уляторы роста в Частота органогенеза (%)

среде (мг/л) генотипы

НУК БАП АБК Броиовский Ольга Твошира Всстар

П / К*

1 8 0 15 / 83 8 / 85 12 / 72 27 / ИХ)

1 8 3 75 / 100 10/0 37 / 13 50 / 17

2 4 0 21 /92 17/54 14 / 68 33 / 100

2 4 3 30/30 57/0 50/0 50 / 50

2 8 0 34/85 12/48 19 / 57 0/100

2 8 3 79/0 56/5 60/8 17/0

и/к*- м - эксплаитм с побегами, к - эксплаитм с корнями

1.3. Формирование побегов и фенотип растений

На эксплантах с зачатками побегов, перенесенных на среду без регуляторов роста, происходило формирование побегов и образование на них листьев. Число побегов на каждом экспланте зависело от генотипа и содержания гормонов в среде. В большинстве случаев более высокая частота побегообразования, наблюдавшаяся для определенного генотипа, коррелировала со средним числом побегов на эксплант.

Полностью сформировавшиеся побеги отделяли от экспланта и укореняли, а затем пересаживали в сосуды с почвой. Фенотип растении-регенерантов различных сортов рапса сначала отличался от фенотипа растении данного сорта, полученных из семян, но ко времени цветения эти различия нивелировались. Результаты проверки достаточно большого числа регенерантов (около 200 растений), полученных из различных экс-плантов нескольких генотипов, свидетельствовали о том, что у них не имелось сомаклональной изменчивости.

Подобно исследованиям, проведенным на других видах рода Brassica, мы также усановили зависимость частоты органогенеза от генотипа, вида экспланта, возраста растения, от которого взят эксплант, а также от состава и концентрации регуляторов роста, находившихся в среде культивирования. Из гормональных факторов существенное влияние оказывала аб-сцизовая кислота, присутствие которой в среде значительно стимулировало или инициировало побегообразование.

Разработанные нами методы регенерации различных генотипов B./iapus позволили получить растення-регенеранты в количествах, достаточных для проведения работ по генетической инженерии рапса.

РАЗДЕЛ II. ПОЛУЧЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ РАПСА.

11.1. Влияние антибиотиков на каллусо- и оргаиообразование на экс-плантах нетрансформированых растений

Изучение влияния антибиотиков канамнцина (Км) и клафорана (Кл) на образование каллусов и регенерацию побегов показало, что стеблевые экспланты рапса были высоко чувствительны к Км и почти не реагировали на Кл. Полное ингибирование каллусо- и побегообразования происходило при концентрации Км 50 мг/л. Растения обесцвечивались и не укоренялись при концентрации Км свыше 10 мг/л.

Добавление к среде в любых концентрациях Кл - антибиотика, использованного для подавления роста бактерий при культивировании экс-плантов, не оказывало влияния на процессы каллусо- и побегообразования. При совместном действии Км (в концентрации до 50 мг/л) с Кл образовавшиеся побеги были хлорофнллдефектны, как и в случае действия одного Км. В результате проведенных экспериментов мы пришли к выводу, что селективная среда должна содержать 50 мг/л Км и 500 мг/л Кл.

11.2. Трансформация растений

В качестве эксплантов для трансформации использовали сегменты стеблей (СС) растений in vitro. Образование трансформированных каллусов и побегов, зависело от различных факторов, таких как время первичной инокуляции эксплантов агробактерией, разведение агробактерии, предобработка эксплантов перед инокуляцией агробактерией, конструкции плазмиды, а также генотипа растения-донора эксплантов. Данные о зависимости частоты трансформации от различных факторов суммированы в табл. 7 и 8.

Частота образования каллусов на селективной среде зависела как от времени инкубирования эксплантов с агробактерией, так и от конструкции плазмиды, встроенной в агробактерию (Табл.7). Для всех, штаммов, (кроме tl), лучшим временем для каллусообразовання и регенерации побегов было инкубирование эксплантов в культуре агробактерии в течение 30 мин (для tl - 5 мин.) Но только при инокуляции эксплантов штаммом агробактерии 35S(2x)tl были получены зеленые растения-регенеранты, устойчивые к Км.

Таблица 7. Частота регенерации побегов на стеблевых эксплантах после проведения трансформации

агробактерия частота регенерации (%)

время ииокуляшш (мии)

5 15 30 60

ll 0 0 1,77±1,5** 0*** 0

35Stl 0 0 14,07±8,5** О*** 0

35S(2x)tl т* 8,33±4,8** 0*** 2.88+1.9** 0,91±0,4*** 0.98±0,4** 0

35SEU 0 0 4,9± 2,7** 0*** 0

-* - не проверялось;

** эксплапты с побетоПр.понаппем (белые или зеленые побеги); *** эксплапты, рстснернроианшнс зеленые побеги.

Одним из основных факторов, влияющих на получение трансформантов, был генотип растения, подвергаемого трансформации. Эксплапты СС нескольких сортов ярового рапса трансформировали агробактериеп со встроенной конструкцией 35Б(2х)с1. Результаты суммированы в табл. 8. В опытах с б сортами рапса, трансгенные растения удалось получить только у сорта Ольга, хотя у сорта Вестар частота регенерации побегов у контрольных растений была несколько выше, чем у сорта Ольга. Эти результаты хорошо согласуются с данными, полученными другими авторами -[СиегсЬе ее а1.,1987а, Со1г е1 а!.,1990; М11и ее а1.,1990], где частота трансформации менялась в зависимости от генотипа растения вне зависимости от их регенерационной способности.

Таблица 8. Зависимость трансформации от генотипа.

Генотип Частота (%)

экспланта* регенерации трансформации

Нора 12.2±3,4 0

Ханна 10,6±4,1 0

Ольга 23,3±8,6 0,9±0,4

Топаз 3,7±0,9 0

Вестар 37,5±12.4 0

Лидер 18.4±9,5 0

эксплапты - сегменты стебля пробирочных растений

11.3. Анализ растсннй-трансформантов

Растення-регенеранты, полученные после трансформации агробакте-рнен, содержавшей ген дельта-эндотоксина с двойным промотором [штамм 35S(2x)tl], были размножены черенкованием in vitro и их трансгенная природа была доказана несколькими способами. 11.3.1.Устойчивость к канамицину

Было показано, что ингнбированне роста трансформантов, как правило, происходило, начиная с концентрации антибиотика 100 мг/л. Все растения хорошо укоренялись при концентрации Км до 100 мг/л. Небольшие различия наблюдались между отдельными растениямн-трансформантами по способности обесцвечиваться при определенных концентранциях антибиотика. Одни оставались зелеными (N1, N6) даже при максимальной концентрации Км, использованной в опытах (200 мг/л), тогда как другие обесцвечивались уже при концентрации Км 100 -200 мг/л.

Н.3.2.0пределение активности NPTII

Растения, остававшиеся зелеными на среде с Км, тестировали на активность фермента неомицинфосфотрансферазы (NPT-II). В результате этого эксперимента было показано, что активность NPT-II присутствовала во всех проверенных образцах, хотя и проявлялась по-разному (Рис.З). Так, растения N1 и N6 показали сильную экспрессию гена этого фермента, а растение N3, которое обесцвечивалось при том же количестве Км, показало очень маленькую активность NPT-II.

Рнс.З. Определение активности неомнцинфосфосфотрансферазыН в ткани растений (NPT-тест)

2 3

4

5

6

7

8

I -положительный контроль (Е. coli трансформирована плазмндой-рТ219(2); 2.7 -ткань нстрапсформированного растения рапса; 3 - растение N1; 4 - растение N2; 5 -растение N3; 6 - растение N4; 8 - растение N6

И.3.2.Гнбридизация ДНК по Саузерну

Методом блоттннг-шбрпдизацин по Саузерну было показано наличие в каждой линии полученных трансгенных растений последовательностей ДНК, происходящих от 'П-плазмиды. На Рис.4 видно, что все клоны растеннй-трансформантов имели по три одинаковых сигнала разной интенсивности, которые соответствовали фрагментам ДНК размером 760 п.н., 630 п.н. и 600 п.н. По-видимому, трансформированные клетки несли не менее 2-х копий встроенного гена дельта-эндотоксина. Следовательно, интеграция векторной ДНК была обнаружена во всех полученных растениях.

Рис.4. Гибридизация по методу Саузерна геномной ДНК, выделенной из

Гибридизация с плазмидой р"Ш9(2. меченой 32Р ЛАТР; 1 - ДНК фага X, реетриии-роваиная Нтс1Ш; 9 - ДНК из 1 ютрансформнропа! шых растений; 2 - ДНК растения N4; 3 - ДНК растения N5: 4-ДНК растения N1; 5 - ДНК растения N2; 6 - ДНК растения N6; 7 - ДНК растения N3; 8 - ДНК из растения N7.

11.3.3. ПЦР анализ.

Встраивание генов прШ в растительный геном трансформированных растений было подтверждено с помощью ПЦР-анализа ДНК, выделенной из растений-трансформантов. Длина амплнфнцируемого фрагмента составляла около 600 нуклеотндов. На рнс.5, гае приведена фотография ам-плифицированной ДНК после электрофореза в агарозном геле, можно видеть четкие полосы, специфические для генов прШ.

Рис.5. Электрофореграмма продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК, выделенной из трансформированных растений рапса, со специфичными к гену прШ праймерами.

1, 7 - ДНК. лямбда-НтсИИ; 2 - ДНК из растения N1:3- ДНК из растения N4; 4, 9 - ДНК из нетрансформ. растения; 5 - ДНК из растения N3; 6 - ДНК из растения N2; 8 - плазмида рТ71912 .

П.ЗАИзучение экспрессии введенного гена дельта-эндотоксина в трансформированных растениях

Экспрессия гена дельта-эндотоксина была показана на уровне транскрипции при помощи Нозерн-аналпза РНК трансформированных растений. Результаты блот-гнбриднзации представлены на рис.б.

Рис.6. Радиоавтограф Нозерн блот-гпбрндпзацип РНК, выделенной из расте н и й -трансформанто в

1 2 3 4 5 Суммарная РНК растений-трапсформантов отгнб-

рпдизована с радиоактивно меченой плазмидой р"ГО912, содержавшей ген дельта-эндотоксина. «-2260 1 - РНК из пстрансформ. растения; 2 - РНК из 20011 расгсния N2; 3 - РНК из растения N3: 4- РНК из растения N5; 5 - РНК из растения N6

Транскрипция была обнаружена только у трансгенного растения N3, в котором присутствовали два транскрипта, различающиеся по молекулярному весу. Размер одного из транскриптов примерно соответствовал размеру усеченного встроенного гена эндотоксина и составлял около 2000 нуклеотндов. Экспрессия мРНК этого гена была намного слабее, чем ожидаемая, принимая во внимание использование 35Б промотора. РНК, выделенная из всех других растеннй-трансформантов, не гибридизовалась с плазмидой, содержащей ген В1. Возможно, инсерция этого гена в других растениях произошла там, где транскрипция каким-то образом ингибиро-валась.

Н.3.5. Фенотип растений-трансформантов

Фенотип всех трансгенных растений-регенерантов рапса, полученных нами, был идентичен. От контрольных растений-регенерантов трансген-

ные растения отличались строением цветков. У них наблюдалась гете-ростилия присущая различным генотипам рапсовых, но очень редко встречающаяся у использованного нами сорта Ольга (Рнс.7).

Рис.7. Строение цветков рапса

11.4. Изучение наследования встроенных генов

Наследование встроенных генов прШ и ВС изучали методами гибридологического анализа при выращивании проростков семян различных поколений на селективной среде, содержавшей 50 мг/л Км, и с помощью ПЦР ДНК, выделенной из проростков семян последующих поколений.

11.4.1. Гибридологический анализ растений-трансфор!мантов

После проведения самоопыления, а также прямых и обратных скрещиваний растений-трансгенов То с нетрансформирванными растениями разных сортов, только у одного из растений, имевшего около 50% фертильной пыльцы (N3), в результате принудительного самоопылении были получены 4 всхожих семени. Такая маленькая завязываемость семян могла быть связана с нарушением гормонального баланса растений-трансгенов.

Н.4.2. Гибридологический анализ трансгенных растений Тх

Трансгенные растения первого поколения, полученные из 4-х семян, были скрещены с контрольными растениями или самоопылены. Было проведено около 60 скрещиваний, в которых трансгенное растение являлось материнским, и 20 скрещиваний, в которых оно служило опылителем. При этом всхожие семена образовались почти во всех случаях самоопыления за исключением растения 4, гае все завязавшиеся семена были щуплыми.

При перекрестном опылении с нетрансгенными растениями всхожие семена образовались у растений 2, 3 и 4 в основном только при обратных скрещиваниях (Табл.9). На растении 1 при прямом скрещивании семена

1 - трансгеиное растение;

2 - нетрансформированное растение а - пестик; б - тычинки

Таблица 9.Гибридологический анализ растений первого поколения

скрсшноаппс

Растение Т| число полученных всхожих ссмяи

т.р. х сТ н.р. р п.р. х сС т.р самоопыление

1 *- (Тв.) - (Тв.) 13

- (Бр.) - (Бр.)

2 - (Тв.) 2 (Тв.) 7

- (Бр.) - (Бр.)

3 - (Тв.) 12 (Тв.) 16

4 (Бр.) 3 (Бр.)

4 - (Тв.) - (Тв.) -

0 (Бр.) 5 (Бр.)

В скобках обозначен гспотни пстраисформнровашюго растения:: Бр. - Броновский; Тв. - Твошира ; -* - семена не были получены

не завязались, а в случае обратного скрещивания семена хотя и завязывались, но были щуплыми и невсхожими. Полноценные всхожие семена образовались в условиях прямого скрещивания с сортом Броновский только на растении 3, во всех остальных скрещиваниях этого типа семена не завязались. Наблюдаемые факты свидетельствовали о явной несовместимости в большинстве случаев яйцеклетки трансгенного растения с мужской гаметой нетрансформированного растения, тоща как в случае обратных скрещиваний явления несовместимости не наблюдалось. Обе гаметы достаточно хорошо совмещались друг с другом только в случае самоопыления. Возможно, это явление связано с неравномерностью хромосомной ДНК трансгенных и нетрансгенных растений, образующейся за счет встраивания плазмидного участка ДНК.

П.4.4. Фенотип гибридов трансгенных растений Т2

В отличие от трансгенных растений ТО и растений первого поколения, гибриды Иг и растения Тг фенотипически не отличались от контрольных растении. Морфология их цветков и стручков была нормальной, и при самоопылении они завязали нормальное число всхожих семян, не отличающихся от семян контрольных растений.

П.4.5. Изучение наследования встроенных генов у растений Ъ

Растения второго поколения были исследованы на присутствие ин-тродуцированных генов с помощью ПЦР и при выращивании на селективной среде, содержащей Км. Эти результаты представлены в табл. 10 и

Таблица 10. Анализ наследования гена прШ у трансгенных растений Тт

число исследованных растений

скрещивание

РастЛ-! метод 9 т.р. х 3 н.р. £ н.р. х т.р самоопыление

♦тр. **нстр тр 1 метр тр | негр

1 ПЦР -- - 8 5

Км - 8 зел 5 бел

2 ПЦР - 1 1(Тв.) 6 1

Км - 1зел. 1 бел 6 зел. 1 бел

3 ПЦР - б 6(Тв.) 8 0

Км - б зел б бел 8 зел 0 бел.

3 ПЦР 4 0(Бр.) 0 3(Бр.) -

Км 4 зел 0 бел 0 зел 3 бел

4 ПЦР 0 5(Бр.) -

Км 0 зел 5 бел

ПЦР - анализ проводили методом амплификации с праймерами к гену прШ Км - тест на устойчивость к Км па селективной среде с 50 мг/л Км В скобках обозначен генотип пстрансф. растения: Бр. - Броновский; Тв. - Твоитра * тр. - проростки, несущие маркерный ген: *фпетр.- проростки без маркерного |ена; - семена не были получены

по ним можно сделать заключение, что встроенные гены передавались в потомстве, но наличие их в каждом растении зависело от направления скрещивания и от генотипа нетрансгенного растения, использованного в качестве одного из родителей. Результаты, полученные с помощью ПЦР, и теста на устойчивость к Км полностью совпали. Все растения, оставшиеся па селективной среде зелеными, содержали маркерный ген прШ, а те, в которых маркерный ген не присутствовал, полностью обесцвечивались.

Растения, в которых был обнаружен ген прШ, исследовали при использовании соответствующих пранмеров на наличие гена В1. Электрофорез амплифнцированных проб проводили на параллельных дорожках. На рис.8 видно, что в каждой пробе, где присутствовал ген Км-устойчнвостн, обязательно присутствовал и ген В1, то-есть гены наследовались сцеплен-но. Случаев расщепления указанных генов в исследованных растениях нами не обнаружено.

Рис.8. ПЦР-аналпз ДНК трансгенных растений рапса второго поколения

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1, 3, 5, 7, 9, 11 - амплификация с праймсрами к гену nptll;

2, 4 6, 8, 10, 12 - амплификация с праймсрами к гену Bt

I,2 - ДНК раст.1; 3,4- ДНК раст.2; 5,6 - ДНК раст.З; 7,8 - ДНК раст.4;

II,12 - раст.5; 9,10 - ДНК коптр.раст.; 13 - ДНК X-HindII;

14 - нла:1мила pTZ19t2 с Bl геном

РАЗДЕЛ III. РАЗМНОЖЕНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КЛОНИРОВАНИЕМ

Для доказательства того, что трансгенные растения могут быть размножены вегетативно, при этом не теряя интродуцированных генов, были получены побеги на эксплантах семядолей, срезанных с проростков 5-дневного возраста, выращенных из семян Т[ поколения.

Все полученные побеги были исследованы на наличие гена nptll, на устойчивость к Км и был проверен их фенотип, который не отличался от трансгенных растений Т2, полученных из семян.

Число устойчивых и неустойчивых к Км побегов, полученных на семядолях, соответствовало наличию или отсутствию в семенах встроенного гена nptll, определенного с помощью ПЦР (Табл.11). В некоторых случаях, несмотря на присутствие гена nptll, образовавшиеся побеги на селективной среде были мозаичны, что совпадало с данными, полученными для табака и люцерны Дейнеко с сотр.[1995]. Они объясняли подобную супрессию генной активности частичной инактивацией чужеродных генов вследствие метилирования.

Таблица 11. Клональное размножение трансгенных растений рапса и проверка полученных побегов на устойчивость к канамицнну

Раст. Т| Побеги, образовавшиеся на семядолях семян, полученных в результате скрещивания

£ т.р. х (? и.р 5 и.р. х сР т.р самоопьи1ение

1 побеги 80 и об

из них * 75 зел. 5 бел

80 пр1+ 0 пр1-

2 побеги 26($> Тв. х о*тр.) 120 поб

из них * 10 зел. 16 бел 112 зел 8 бел

14 при- 12 пр1- 116 при- 4 пр1

3 побега 55(у Тв'х (1>тР-) 7. ноб.

из них * 34 зел. 21 бел 7 зел. 0 бел

36 при- 19 прг- 7 при-

побеги 55(у тр.х с? Б р.). 56(^ Бр х о*тр.).

из них * 52 зел 3 бел 0 зел. 56 бел.

55 при- 0 пр1- 0 при- 56 пр1-

4 побеги 60(у Бр. х (Стр.)

из них * 0 зел 60 бел

0 пр1+ 60 пр1-

'"при выращивании побегов на среде, содержащей 50 мг/л Км; ир1+, пр1- - наличие или отсугствие гена прШ, покачанное при помощи ПЦР

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При использовании методов культуры тканей и генетической инженерии нам удалось получить трансгенные растения ярового рапса сорта Ольга, содержавшие встроенные гены дельта-эндотоксина (ген ВО и нео-мншшфосфотрансферазыН (ген прШ). Для этого нами были разработаны методы регенерации, с помощью которых можно было получать растенпя-регенеранты на эксплантах различных генотипов рапса. Проведенные эксперименты показали, что органогенез в значительной мере зависел от генотипа, вида экспланта, возраста растения, от которого взят эксплант, а также от состава и концентрации регуляторов роста, находившихся в сре-

де культнвнрования. Наиболее сильное влияние оказывала абсцпзовая кислота, добавленная на строго определенных стадиях регенерации.

Один из предложенных нами методов регенерации - получение растений-регснерантов на эксплантах семядолей, срезанных с проростков рапса, является универсальным за счет добавления в среду культивирования АБК, которая стимулировала процессы побегообразования (частота побегообразования повышалась в некоторых случаях до 100%).

Разработанные методы регенерации рапса с успехом были применены в экспериментах по трансформации растений с помощью агробакте-рпй. Проблема сверхчувствительности тканей растений рода Brassica к штаммам A.tumefacíais и связанное с этим снижение эффективности органогенеза была преодолена нами путем подбора оптимальных условий для инокуляции эксплантов. Наличие чужеродных генов в геноме растения и их экспрессия были доказаны различными методами.

Важной задачей на завершающем этапе работ по трансформации является подбор условий для последующего полового и вегетативного размножения трансгенных растений и сохранения в потомстве полученных новых свойств растения. Стабильность и сегрегация введенных генов проверялась нами при анализе трансгенных растений вплоть до второго поколения. Интродуцированные чужеродные гены наследовались сцепленно, чго свидетельствовало о том, что они встраиваются в один локус. Сохранение маркерных генов подтверждено также в случае размножения полученных форм i/i vitro не только методом черенкования, но и при регенерации побегов на семядольных эксплантах, срезанных с проростков, полученных из семян Ti поколения растений-трансформантов. Таким образом, с помощью разработанных нами методов регенерации и трансформации возможно получение трансгенных растений ярового рапса, сохраняющих интродуцированные гены в последующих поколениях.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы высокоэффективной регенерации рапса, позволяющие получать побеги на эксплантах из различных тканей растений; частота регенерации существенно зависела от генотипа и источника экс-планта. Наиболее высокой регенерационной способностью обладали экс-плаиты семядолей проростков рапса, частота регенерации которых зависела прежде всего от возраста проростков.

2. Показана возможность использования абсцизовои кислоты для резкого повышения эффективности побегообразования у рапса и доказана универсальность АБК как индуктора побегообразования.

3. Разработана система трансформации растении ярового рапса, эффективность которой в значительной мере зависела от генотипа экс-планта, конструкции плазмнды, концентрации шробактерпи и предобработки экспланта.

4. Получены трансгенные растения ярового рапса сорта Ольга, содержавшие и экспрессировавшие встроенные гены неомицинфосфотранс-феразы (nptll) и дельта-эндотоксина (Bt).

5. Изучено наследование ннтродуцированных чужеродных генов nptll и Bt вплоть до 2 поколения. Встроенные гены во всех полученных трансгенных растениях-потомках наследовались сцепленно.

6. Показано, что свойства полученных трансгенных форм растений рапса сохраняются в процессе размножения при индукции побегообразования, что свидетельствовало о возможности их клоналыюго размножения.

Список работ, опубликованным по материалам диссертации

1. Ралдупша Г.Н. Получение трансгенных растений рапса (Brassica napus L.), несущих гены устойчивости к насекомым // Тезисы докл.II съезда Всероссийского об-ва физиологов растений, Минск, 1990, С.112.

2. Ралдупша Г.Н. Получение трансгенных растений рапса, несущих различные гены устойчивости к насекомым //Тез. докл. I Всес. план.-отч. копфер. по напр. "Генная и клеточная инженерия", Москва, 1991, С. 12S.

3. Ралдупша Г.Н. Получение трансгенных растений рапса, несущих различные гены устойчивости к насекомым //Тез. докл. II Всес. план.-отч. конфер. по напр. "Генная и клеточная инженерия", Москва, 1992, С.185.

4. Raldugina G.N., Gorelova S.V., Sobolkova G.I., Gladkaja L.A., Kozhemyakin A.V., Belova T.A. Production transgenic plants of rapeseed (Brassica napus) using Agrobacterium tumefaciens// Abs.of Workshop on plant molekular biology and biotechnology, Moskovv, 1992, P. 12.

5. Ралдупша Г.Н., Соболькова Г.Н. Влияние абсцизовои кислоты на индукцию морфогенеза в каллусных культурах Brassica napus //3 съезд Всерос. Об-ва физиологов растений. С.-Петербург, 1993, С.34.

6. Ралдупша Г.Н., Горелова C.B., Гладкая Л.А., Кожемякин A.B. Получение трансгенных растении рапса, несущих различные гены устоичи-

пост к насекомым // Тезисы докл. III Всес. планово-отчетн. конфер. по паправл."Генная и клеточная инженерия", Москва, 1993, С.143.

7. Ralclugiim G.N., Sobolkova G.I., Gorelova S.V. Effects of abscisic acid он differentiation of shoots from different explains of Brassica napus L.// Abs. of Internat. Symp. Physiology of Abscisic Acid, Piishchino, 1993,

8. Ралдупша Г.Н., Горелова C.B., Соболькова Г.И., Кожемякин A.B., Белова Т.В. Получение трансгенных растений рапса (Brassica napus L.) с помощью Agrobacterium tumefaciens И Тезисы докл. II Российского симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 1993, С.42.

9. Соболькова Г.И., Ралдупша Г.Н. Факторы, влияющие на дифференциацию побегов из семядольных эксплантов Brassica napus L. III Международн. конф. "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология", Тезисы докл., Алмагы, 1993, т.1, C.7I.

10. Ралдугипа Г.Н., Соболькова Г.И. Гепотипнческие различия при действии абсцизовой кислоты на каллусные культуры Brassica napus Ь.//Физиолоп1я растений, 1994, т.41, N5, с.702-706

11. Ралдупша Г.Н., Соболькова Г.И. Факторы, влияющие на органогенез у семядольных эксплантов рапса// Физнолотя растений, 1995, т.42, N6, с.916-922

Р.56.