Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние факторов криоконсервирования на генетический аппарат эмбрионов мыши

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние факторов криоконсервирования на генетический аппарат эмбрионов мыши"

г- од

3 1 ^Л Ж

Нац1ональна Академ1я Наук Укра1ни 1нститут проблем крюб!олог11 1 кр10медицини

На правах рукопису

Петрушко Марина Павл1вна ВБЛМВ ФАКТОР 1В КР1ОКОНСЕРВУВАННН НА ГЕНЕТИЧНИИ АПАРАТ

агор I он I в мши

03.00.02 - Кр1Об!ОЛОГ1Я

АВТОРЕФЕРАТ дисертацП на здобуття вченого ступеня кандидата б1олог!чних наук

Харк1в - 1994

Робота шконана в 1нститут1 проблем кртбюлогп" i крюмедицини Нац1онально8 Академ!i Наук Укра1ни

академш HAH Украши, доктор медичних наук, професор, лауреат Державних премий СРСР та Укра'1'ни B.I. Грщенко

доктор медичних наук, професор, лауреат Державноi преми СРСР Т.М. Юрченко

доктор б10Л0Г1чних наук Г.Ф. Жегунов

Харшвський зооветеринарний 1нститут

Захист В1дбудеться " 1994 року о годин:

на заспдашп спбЦ1ал1зованси ради Д 016.60.01 при 1нститут1 проблем кр!обшлог! i i крюмедицини HAH Укра5ни (3I00I5, XapKiB-I5, вул. Переясл1вська, 23). 3 дисертац!ею мохна ознайомитися в 6i блютещ 1нституту проблем кр!об!олог1 i i крюмедицини HAH Укра!'ни.

Автореферат роз желаний У/" 1994 року.

Вчений секретар спещал1зовано1 ради, доктор медичних наук,

професор А.М.Гольцев

Науковий квр i вник:

0фщ1йн1 опоненти:

Пров 1дна установа:

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальность проблеми. Нэзважаючи на вэлику к1льк1сть д0сл1дкань не завжди вдавться одержати високий р!вень збере-жэння репродуктивних кгптин шсля заморозкування - BiflirpiBy. Особливо це стосуеться ооцит1В та eMöpioHiB (Leitio S.P., 1974, Wittingham D.G., 1974). Тому дождинки придичяють увагу виясненню мэхан!зм i в крюушкоджень, серед яких важливу роль В2Д1грають ушкодження генэтичного апарату (Glenister Р.Н., 1987. Mohr L.R., 1987), HKi можуть бути причиною зниження застосування в медицин! засоб!в штучного зашпднен-ня, а також зашпднення in vitro, оск1лыси вони передбача-ють використання кр ! оконсэрвованих репродуктивних кл!тин та ембрiон1в (Cohen J., 1985, Mihaeli О., 1990, Гриценко B.I., 1992).

Метою досл!дження було вивчення впливу факторiв Kpio-консервування на генетичний апарат ембрiонiв мши.

Для виконання поставлено! в роботi мети необх1дно було розв'язати ряд завдань:

- вивчити морфолог!ю eMöpioHiB миш! п!сля екв!л1брац!i з розчинами крiопротекторiв р1зно! концентрацП при р!зних температурах i п!сля крюконсервування;

- вивчити процес дробления ембр1он1в миш! в культур1 при тих самих експериментальних умовах;

- досл1дити вплив на хромосомний апарат та к1нетику д1лення кл!тин ембр!он¡в мипп розчишв кр!опротектор!в при р!зних температурах i р!зних способах крюконсервування;

- з'ясувати результата трансплантат'! кр1оконсервова-них ембр1он!в.

Наукова новизна одержаних результатis. Проведенi доел iflK9HHH ДОЗВОЛИЛИ ВСТЭНОВИТИ, ЩО 9КВ1Л1браЦ1Я GMdpiOHIB

миш, як i знаходяться на стад1 i морули, при 37 °0 та шдвищешп концентрац i i нр!опротектора, веде до зниження м^тотичного ¡ндексу, накопичення метафаз, зСНльшення к1лъко-cTi дегенеративних юптин з шкнотичними ядрами, збишшвння патолог ill М1Тозу та аберантних хромосом.

Показано, що bkbiЛ1брац1я ембрюшв в розчинах крюпро-текторхв в дгапазон! температур В1Д о до ю °С не викли-кае перел1чвних вище патолог¡чних smih в генетичному апарат] ембрюшв мишi, таким чином, е оптимальною умо'вою екв1лтбра-цп цього бюоб'екту для наступного заморожування.

Встановлено, що pi3Hi засоби кр1оконсервування неодна-ково впливають на виживання ем0р1он!в миш. Крали результата можуть бути досягнеш при повгльному заморожуванш пгд за-хистом 1,5 М ДМСО. При цьому виявлено, що оценка життездат-hocti smopiohib мили niсля заморожування т1льки по морфоло-Г1чних тестах е недостатньою, оск!льки не враховуе стан ге-нетичного апарату ембрюшв. Тому для об'бктив1защi оц1нки бюлог1чних властивостей ембрюшв необх1дне додаткове залу-чення цитологiчних TecTiB, KOTpi характеризують величину мiтотичного tндексу, стан метафаз та ядерних компонентов

кл1тини.

Новим у роботi е також встановлення кореляцп Mix частотою виникнення патолоПй м1тозу, хромосомних аберащй та гост1МПлантафйною загибеjuhd трансплантованих ембр1ошв, що перенесли крюконсервування.

Теорвтичне та практичне значения робота. Теоретично

. значений 'робота полягае в тому, що встановлено факт впливу кр(опротектор1В I- засоб!в крIоконсервування на процеси прол1ферац1I та морфогенетичну перебудову ядерного апарату на стад II ранього ембрюгенезу миш.

Вперше встановлено, що оптимальним температурним штер-валом для пошрэдньо! еквШОрацп ембрюнш миш перед за-морокуванням в 0-ю °С. При цих температурах усуваеться не-гативний вплив розчшпв кр1опротектор!в на життездатшсть ембршшв, що дозволяв ввести коректировки в юнукш засоби крIоконсервування ембртошв з метою тдвицення ¡х ефектив-

ност1.

Положения про те, що екз*л1бращя ембрюшв миш на стадп морули, з розчинами крюпротекторш при температур! 37 °С, швидке (300-400 °С/хв.) заморожування шд захистом 3 М сахарози та 2 М гл!царину та пов1льне (0,3-0,5 °С/хв) заморожування з 3 М ДМСО веде до зниження м1тотичного ¿ндек-су, накопичення метафаз, зб1льшення Н1Лькост1 дегенеративних нл1тин з шкнотичними ядрами, з0:льшення патолог1чних проя-В1В М1Т0зу та аберантних кл!тин дозволяе рекомендувати вико-ристання невеликих концентратй крюпротекторхв в склад! крIоконсервангIв, а такой внести коректировки в гснуюч! спо-соби кр!оконсервування ембртшв з метою тдвищення 1х ефек--тивностI.

Виявлення кореляцп ши П1двшденням частота патолог14-нйх прояв!в миозу, хромосомних аберацШ та ембрюнальною загибеллю дав шдставу рекомендувати цитогенетичний анал!з стану ембрюшв, як об'вктивну оценку IX яиттездатност1.

Няуков: результата, що виносяться на захист отримаш

дисортантом осоОксто. У публ! кащях, що надрукован1 у cniB-авторствг дисертанту належить. постановка вкспвртвнпв i за-гальна частина обговорення результата.

Алробац1Я роботи. Матертали робота доповiдалися та обговорювалнся на XXIII конферэнц11 молодих вчених lIIKiK (XapiciB, 1993), М1кнародн1й конфэренц!i по шзькотемператур-нШ бюлоги' (БелыЧя, Левей, 1994).

ПублшацП. Головш положения дисертацп викладеш в 4 друкованих роботах.

ООсяг та структура роботи. Дисертащя викладена на 113 • еторносах машинописного тексту, складаеться з вступу, огляду Л1тератури, опиоу матер!ал1в та ыетод!в досл!джень, власних результата роботи, обговорення та висновкiв. Miстать 3 таблиц i та 21 малинок.

Список використащи л1тератури мютить 160 наймэнувань.

МАТЕР1АЛИ И МЕТОДИ Д0СЛ1ДЖЕННЯ В робот i використовували ембрюни миш лшгй OBWA, balb, в якоси псэвдовагiтних рецшпешмв використовували самок jiihi i icr.

Для одержання достагньо i гилькост! перед ¡мпланташйних вмОршшв овулящ» стимулювали гонадотропшом сироватки же-peOoi кобили (СЖК) та лвдським хорiогонiчним гонадотропшом (лХГ), вводячи IX за да та 24 години, в1дпов1дао, перед спариваниям У к1лбк0ст1 2-5 мО. _

В робот1 було використано С1лып 2000 ембрюшв. Ембр1они на стадп морули вимивали з яйцеводу та poriB матки на трет1й день ваптност1,

Для СИлылост! машпуляцШ з вибрионами використовували

фосфатно-буферне сэредовище, що Mi стило 20 % шактивоважп сироватки плод1в корови.

Старил13ацт серэдовищ проводили пропусканиям через ф^льтри з Д1аметром пор 0,22 мкм.

Ембрюни культивували в скляних К1льцях диаметром 7 мм, як! були приклеен! до дна чашки Петр1 сШконовою герметизу-ючою пастою, при 37 °С, в атмосфер! 5 % С02(Березовська О.П., 1978).

В якост! крiопротэкторiв використовували розчини 1 М глщерину, 1,5 М та з М ДОСО.

Швидке заморожування проводили в полютероловИ! соло-минц1 шляхом 3-х хвилинно1 еквШбрацп ембрюн1в в розчиш 3 М сахарози та 2 м глщерину з наступним швидким зануренням в р1дкий азот. ÜOBiJibHe заморожування зд1йснювали шляхом ек-в1лгбрацП ембрюшв при ю °С в 1,5 М розчиш ДМСО, totim повально (3i швидкiстю 0,3 °С/хв) охолоджували, при -6° проводили сид1нг, шсля чого охолоджували до - 40 °0 3i швидкIстю 0,5 °0/хв (Wood Ы.1., Par-rant I., 1984). Ампули збер1гали в р1дкому азот1 10 Д1б.

Ф1ксацш eMöpioHiB здШснювали за методами Тарковського (Taroowsoi A.K., 1966) та Дибана (Дибан А.П., 1978).

Препарата фарбували за Романовсышм-Пмза.

Форми патологi i М1Тозу визначали зпдно класиф1кац] i Алова (Алов I.A., 1975).

Деконсервоващ ембрЮни трансплантували псэвдоваг i тним рецишентам. За добу до припущених пологiв самок забивали та по числу хивих, загиблих еморюшв та М1сць ¡мшшнтац! i ро-били висновок про ембрюнальну смерти ють.

а V .

Одержанг дан1 обробл&ш статистично. Результата представлен; як середне значения при 95 56-му довхрному штервал!.

РЕЗУЛЬТАТМ ДОСЛI ДЖЕННИ ТА^1Х ОБГОВОРЕННЯ ВПЛИВ Р03ЧИН1В КРIОПРОТЕКТОРIВ НА ГЕНЕТИЧНИЙ АПАРАТ ЕМБРЮН1В МШИ. Як В1домо, ембртни миш усп!шно переносять заморожування тальки на раншх стад!ях дсимшюнтащйного розвитку (Zeilmakerd.fi., 1984). Крюконсервування ембрюшв мши на стад1I морули-бластоцисти засноване на попередньому додаванн; до них розчишв крюпротектор1в при шмнатшй температур1 (Кавах М., 1980, Тгоипвоп А., 1986). Проте б!ль-шост1 д0сл1дник1в не вдалося досягнути високого збереження цього виду КЛ1ТИН, в1Д1гр1тшс шеля крюконсервування. Бла-стомери морули та бластоцисти знаходяться на рЮних стад!ях шп тинного циклу, тому, вшшв факторов крюконсервування не-однаково'може в!дбитися на збереженн! ембрЮшв.

Нами встановлено (Мал.1), що витримування кл!тин при температур! 3? °0 без додавання розчишв кр1опротектор1В не зм!нюе цикли Д1лення. Виявлено, що го хв. еквШСращ I ембрюшв при 37 °С у середовшц з 1 М глщерином, знижуе IX здатшеть розвиватися" в культур!. Загибл] ембрюни характе-ризувались потемшнням цитоплазми, зб1льшенням в об'еш дея-ких бластомер1В. Шсля екв1л1брац1I ембрюшв при 37 °С у розчиш 1,5 М ДЙСО к1льк!сть життездатних - була на р1вш 46,5 %• Доведения концентратI ДМСО до 3 М ще б!льш зменшило к1льк1сть ембрюшв, здатних дробитися в культур!.

Таким чином, еквШбращя ембрюшв миШ з ДМСО в най-

01льш високШ концентрац! i, ведэ до того, що т!льки в 26,6 ± 6,65 % випадеив вони збер!гають здатшсть до подаль-шого дглення. Зокрема у ембрюшв, що зупинилисл в розвитку, В1Дм1чено фрагментами, порушення симетричност1 бластоме-piB та ПОТ9МНiння цитоплазми.

Мал. 1. Життездатнють ембрюшв миш1, шсля еквшбраци в розчинах Kpiопротектор1 в при piSHHX температурах: 1. 'Контроль, 2. 1М глицерин, 3. 1,5М

ДМСО, 4. ЗМ ДМСО.

3 одержаних виде даних можна зробити висновок, що ДМСО

в концентращi 1,5 та особливо 3 М П1сля еквШбрацп ембрi-OHiB при 37 °С викликае виракенг fx ушкодшння, що погоджу-еться з експериментальними даними, отриманими на ¡нших типах КЛ1 ТИН (Asthwood-Srnith M.I,, 1985).

Зниження температуря експозицп контрольних ембргошв до 22 °С сприяло тому, що теля культивування in vitro життездатними залишалися 96,6 ± 3,4 % ембр!ошв. Доведения розчшпв глщэрину та ДМСО до I та 1,5 М концентрацi i, В1д-пов 1 дно, при Ц!й самШ температур! icTOTHo не вшшнуло на здатнють ембрюшв розвиватися в культур!. Збмьшення концентрац! i ДМСО до 3 М виклинало втрату життездатност1 у 57,4 ± 4,9 % ембрюшв. Отже культивування ембрюшв в роз-

чинах кр1опротекторIв при температур] 22 °С створюе пом1тно меншу цитотоксичну д!ю на юптини. .

Шсля 20—хвилинноI еквШбрацп ембрюшв при температур! 10 °0 в середовищ 3 М ДМСО, розвиваеться до 82,2±1,1 % КЛ1ТИН, поргвняно 3 93,2 ± 0,6 % в контрол1. 3 цього випли-вае, що зниження температури еквШбращ I ембрюшв в середовищ! кр1опротектор¿в до вказаного значения практично вик-лючае негативний 1х вплив на здатшсть ембрюшв до подаль-шого розвитку.

Експонування ембр1он1в в розчинах кр I опротектор I в при о °С шдвищило ¡¡х подальшу спроможнють розвиватися в культур!. Тому екв1л1брац1Ю ембрюшв, що знаходяться на стад и морули в розчинах 1М глщерину, 1,5 М ДМСО та 3 М ДМСО най-б!льш доц]льно проводит в д1апазон1 температур о-ю °С. При цьому сл1д враховувати, що ¡нкубашя ембр1он1в в середо-довищах з 1 II розчином глицерину та 1,5 М ДМСО б1лыа ефек-тивна, пороняно з з М розчином ДМСО. Отже, ембр1они на ста-д!1 морули ели крюконсервувати з використанням невисоких концентращй кр1опротектор!в.

Анал1з кл1тин, як1 дтляться, показав, що ¡х еквШбрацгя в середовищах без кр1опротекторIв при температурах 0-ю °С, приводить до зб1льшення величини м!тотичного Iндексу (Табл. 1). Проте шедя додавання в розчини кр1опротектоторIв к1лък}стъ кл1тин, що д1ляться, знижувться ДО Р1ВНЯ контролю.

Анал13 цитологIчних препарат1в показав, що зниження температури еквШбращ! В1Д Ю до о °С, а також додавання розчинт кр!опротекторIв у середоввде'еквШбрвцп веде до блокування метафази м1тозу.

ТаОлиця 1

Величина мIтотичного щцэксу та сп1ВВ1Дношення фаз М1-тозу в кл1 тинах ембрюшв миш, теля 20-ти хв. еквШбращ I в розчинах крюпротекторШ при знихених температурах ( % }.

т °с Нр1опро-тектор Профаза Метафаза Анафаза + тело-фаза М1тотичний ¡ндекс

0 без к-ра 14,0±Ь,2 83,1±5,2 2,9±0,8 9,7Ю,3

I М глщерин 30,Ы6,7 63,Э±9,0 5,5+0,5 8.3Ю,4

I,ь м досо 5.0±0.5 95.0±0.5 95.Ы0. 8.3+0,5

з м дасо 5.0±0.5 95.±0.5 О.ОЮ.О 6,4±0,6

10 без к-ра 11.3+6.6 83.8+9.9 5.5Ю.5 8,6+0,4

1 М глщерин 24.015.7 62.6+7.8 13.3±5.0 5,3+0,6

1,5 М ДМСО 20.418.2 73.Н9.1 6,5+0.3 5,1+0,6

3 М ДМСО О.ОЮ.О 97.7+2.3 2.310.3 5,5Ю,5

22 без к-ра 27.012.0 64.6+10.4 8.310.3 5,310.6

I М глщерин 10.0+6.7 80.0±8.I 10.016.7 4,210.5

1,5 М ДМСО 26.8ИI.1 62.911I.9 10.И5. 3.7Ю.9

з м дасо 5.5Ю.5 95.5Ю.5 О.ОЮ.О 3.610.4

37 без к-ра 27.5±1.8 42.7+2.6 30.8+2.4 5.710.4

I М глщерин 24.948.3 49.9+12.4 29.216.7 4.810.5

1,5 М ДМСО 9.316.3 81.5±8.4 9.314.6 3.410.8

3 М ДМСО 10.416.9 79.2И0.3 10.216.9 3.4Ю.9

Кл1тини, експонован! при температур! 37 °С, як1 знахо-

дилися на стадН м1тозу, розшдалялися по фазах м1тотичного

дIлення таким чином: 27,4 ± 1,7 £ блаетомергв знаходяться у профаз!, 42,7 ± 2,6 Я - в метафаз! та 30,а ± 2,4 % -в анафа-31. Якщо еквШбращя з I М розчином глицерину практично не змшюв дане сп1вв1даошення, то при 1,5 М та, особливо, 3 М концентрацп ДМСО, зб!льшувться шлыисть юптин, що знахо-дяться на стад!1 метафази 1 зменшуеться к1льк1сть кл!тин на стад!I анафази.

Доведения концентрацп розчину глщерину та ДМСО до I та • 1,5 М, В1дпов1дао, практично не впливав на сшвв!дношвння фаз м!тозу. Проте еквШбрашя ембр!он!в в розчин! 3 М ДМСО веде до виникнення кл!тинного блоку на стадп метафази.

Цитолог I чне досл1дження з'ясувало, що еквШОращя ембрюшв при температур! 10 °С шдвшцуе шлыисть кл!тин, що знаходяться на стади метафази, зокрема, додавання крш-протектор1в практично не впливае на характер розпред(лення фаз м!тозу. ¡нкубащя кл!тин при о °С ще б!льш ¡шчбуе д!-лення кл!тин на стад!г метафази.

Проведений наш анал!з форм патологШ м1тозу (Мал. 2) дозволив встановити той факт, "> част!ше всього зустр!чають-ся патологII м1Тозу, пов'язан! з ушкодженням хромосом, та вар!анти, обумовлеш пошкодженням м!тотичного апарату.

В контрольних трупах ембр!он!в, експонованих в ¡нтерва-л: температур в!д О до 37 °С, наш виявлен1 кл1тини т!льки з одолею формою патолог!чного д1лення - К-м!тозом, що в нвйсПльш поширеною формою патолог!чного м!тозу та характеризуемся затримков аОо блокадою розвитку шптин на стад!I метафази у зв'язку з дезоргашзащею 'м!тотичного апарату.

В^дсутшстъ достов!рних в!дм1н мгх частотою виникнен-

ня патолог 1чних форм М1тозу у контрольных трупах при р1зних температурах св1дчить про однотиповий вплив знижених температур на мIтотичний апарат.

Цитогенетичний анал1з показав, що ¡нкубац!я в середови-Щ1 при 37 °0 з 1 М глщерином та 1,5 М ДМСО приводила до зсмльшення к1лькост1 ем0р1он1в з атиповим станом хромосом. Щ зм1ни проявлялись в основному в вигляд1 злипання окрэмих хромосом в метафаз!. Доведения розчину до 3 М концентрат 1 дасо викликало аналог1чний ефект: В1д злипання окремих хромосом до утворення компактно! маси, в як1й окрем1 хромосоми неможливо було розр1энити.

Екв1Л1брац{я ембрюшв в розчинах крюпротектор1в при температурах 22, ю та о °С практично не вплинула на збмь-шення к1лькост! аберантних хромосом.

В контрольна груш ембрюшз, експонованих при 37 °С, не в1ДМ1чалося утворення шкнотичних ядер (Мал. 3). При еквШбраци з 1 М розчином глщерину к1лыпсть шкноз1В практично не зб1льшувалась. Доведения концентрат I ДМСО до [.5 М приводило до того, що спостер1гався резкий стрибок в зб1льшенш к1лькост1 пшноз1в - 19,7 ± 4,356, а доведения до 3 М приводило до зб1льшення к1лькост! шкнотичних ядер. Пе-ребування ембрюшв в. середовищ! того к крюпротектора у вказан!й концентраф1, але при о та 10 °С, не викликало утворення ШКН031В.

Механизм утворення шкнотичногс стану ядра, можливо, обумовлений р1зною д1ею ДМСО та глщерину на б:лковий цито -скелет та мембрани, як1 обумовлюють лх структурну 1нтегра-Ц1Ю. Осхп льют ДМСО модифжуе структуру об'емжн та зв'яза-

ы

41

21 -

1 -

-19

I 1 ' I 1 ' I 11 I 1 ' I

1 1

/

/

i i i ,i i

a

¿гЩ

♦5

35 25 15 5 -5

! ' ' 1 ' ! • * - ......; г.4

; : 1

: .....J!_____2

:

ЧJ j ( \ ьЙ

: /1 ■н А. i

гг

jr

Tl'C)

Иал.2. Частота патолог!( «Птозу та • Иал.Э. Винлкнеяня п1кнотичша umbd у хромосомшп авврлц1Я п1оля вкв1л10рацИ з 9M(3pi0HiB мин! п1сдя екв!л!воаиГ I а созчинами 1сп!огтт*1Тйктпп1й tr™. ^uuusin ________

aoi води (BiJioyc A.M., 1994), то внасл1Док цього може В1дбу-тися поруиення функцп та структуру, опорних ниток ядерного матер ¡алу, що в свою чергу, приводить до дисощащ i хроматину. При гIпотэрмiчних умовах (О - ю °С) токсична Д1Я ДМОО проявляемся в меншй Mipi i в цих умовах нативна структура белкового цитоскелэту в деяшй Mipi збер1гаеться. Додавання в середовищэ ¡нкубащi глицерину практично не викликае зб!лыиення ядерного матерiалу за рахунок його меншо i ток-сичностi, пор¡вняно з ДМСО.

ВПЛИВ КР1ОКОНСЕРВУВАННЯ НА ГЕНЕТИЧНИИ АЛАРАТ ЕМБР10Н1В МИШ В домпдах використовували TaKi режими кршконсерву-вання: швидкий, в середовили, що Mi стило сахарозу - 3 М та глицерин - 2 М; пов1Льний з 1,5 та 3 М ДМОО.

Шсля деконсервацп було В1ДМ1чено р1зне виживання ем-OpioHiB, заморожених по вказаних вице програмах (Мал. 4)'. У випадку швидкого заморожування виявлено 4,0 ± 2,5 * морфолог iчно аномальних ембрюшв, половину з яких складали еморюни з погемшнням цитоплазма та порушенням симетричного

розташування бластомер^в. Решта ембрiонiв мали круглу форму, штактну zona pelluoida, правильно1 форми бластомери, котр1 щ1Льно прилягають один до одного, та св1тлу др1бнозернисту цитоплазму.

Шсля деконсерващ i ембр10шв, заморожених пов1льно, з використанням 1,5 М Д?ЛСО, 71,1 ± 4,8 % юл тин були морфоло-ri4Ho ¡нтактними. Решта ембр¡он¡в мала упильнеш та фрагмен-товаш бластомери, аномальний стан zona pelluoida, темну цитоплазму.

Шсля крiоконсервування з 3 М ДМСО - 44,1 ± 3,4 % ем-OpiOHiB мали нормальну морфологin, тод1 як процент морфоло-Г1чно аномальних був досить високим - 55,а ± 3,4 %■ Причому, в б1льпий частин! ембр1он1в стан бластомер(в був атиповим. В 53,3 % випадюв ембр1они дегенерували, у 26,7 % cnocTepira-ли фрагментами бластомер^в, в гоч& - була роз ¡рвана zona pelluoida.

Цитолог¡чний статус ембр1он:в, що перенесли Kpiоконсервування , був piгний. EM6pioHH, заморожен! швидко, мали ч!тк1, щ1лън1 ядра, хроматин р(вном1рно розпред!лений по luoiQHHi ядра. Ядерце, якщо воно о дне, займав центральна положения в ядр{, AeflKi ядра мають к1лька ядарець.

Ембр1они, що перенесли пов(льне заморожування шд захистом 1,5 М ДМСО, Mi стили менш базоф1лып ядра. Him HanreHt та Шсля пгоидкого охолоджування. Ядерця ч:тко виражен1, к1льк1сть п1кнотичних ядер б!льша, шж у контроль

Шсля заморожування з э М ДМСО зменшуеться базоф1Ль-HicTb ядер. Проте сл(д в1дм1тити збйльшення площини ядер порiвняно з контролем. ИПдсутшсть профарбованост! ядер,

може св1дчити про повну деконденсацш хроматину *. При даному способ! кр!оконсервування зустр!чалися ембрюни з великою шльк1стю п1кнотичних ядер.

М1тотичний 1нд9кс ембрюШв, заморожених швидким способом, складав 4,43 ± о, 53 Л, що було нижче, шж в йонтрол! (Мал. 5). Шсля заморожування з 1,5 М ДОСО м1тотичний ¡ндекс ембр1он1в дор1внював 5,4 ± 0,8 %, та був нижче контрольного р 1 вня. Заморожування з 3 М ДМСО приводило до подальтого зменшення м1Тотичного ¡ндексу, який складав 1,76 ± 0,7 %■

<15%

95

75

55

25

1 Г

10°/

п-1-1-Г

1

1 2 3 4 Мал.5. Зм1на кптатичного |вдексу

Ыал.4. МорфолоПчна ц|л!сн1оть ембр1 он1в мша), ир перенесли кр!оконсервування р|зшши способами: 1-Швидкий з ЗЫ сахароза

та ги глЩерином, 2-Повиышй з 1.5Ы ДМСО, сахарозою та 2М глтерином, 2-Ш1 3-Пов1лымйз ЗМ ДМСО. . 1,5м ДМСО, 3-Пов!лъниЯ з ЗМ ЛЫСО,

4-Коитрода.

Величина м1тотичного ¡ндексу при цьому режимI заморожування була нижчою, Н1ж шсля двох вищеназваних методхв кршконсер-вування. Заморожено-в1д1гр1Т1 ембр1они розр1знялися по к1ль-кост! шкнотичних ядер (Мал. 6). Шсля швидкого заморожування з 1,5 М ДМСО - к1льк1сть шкноз1в була на тому ж р1вш. К1льк4сть таких дегенеративних ядер значно зростала ' при пов1льному заморожуванш амбр¡он¡в у середовищ! з з М ДМСО:

е

6

2

51,2 ± 9,8 % вс1х кл1тин були шкнотичними.

Цитогенетичний анализ ембрюшв, ¡до перенесли кр:окон-сарвування р1зними способами (Мэл.7), дозволив встановити.що швидкий СП0С16 заморожування в середовиц1 з 3 М сахарозою та 2 М глщерином ¡ндукув збьтапекня к!лькост1 патологччних мхтоз1в, ЯК1 пов'язаш з патолог¡ею м1тотичного веретена: шшшкпдП, асиметричних м1тоз!В, багатожшосних М1тоз1в. У ембрюшв, що заморожен! пошлина з використанням Э М ДМСО, зб1льшувалася юльшсть шптин 13 злшганвям окремих

52

32

12

1

1-I-Г

з

4

ЗЗЙ1

23

13

-7

1

ч-1-Г

3

4

Мал.6. Частота Еиникнення гйкнатичша Иал.7. Частота 7.ромосомнш айе|ьац1й ядер р ембрЮнах мш«1, що перегасли та патологи н1тозу з ембр!онэх мши, що

крЮконсервування р!знимн спосоОаш: перенесли крI оконоервуваная р1зж®а

1-Швидаий з ЗМ сахарозой та 2М глШерином, способами: Г-Швадкяя з ЗМ сахарозою та ¿м

2-Пов1льни8 э 1.5М даоО,3-Пов(льот? з. ЗМ гл1цэржюм, 2-Поэ1льний э 1,5« ЯКО, ДМСО, 4-Нонтролъ. з-ГЫЛлывй 3 ЗМ ДОСО. 4-Контроль.

хромосом до повного IX злипання. Шсля повIльного заморожування шд захистом розчину 1,5 М ДМСО частота порушень м1тозу та хромосомних аберащй була пор1вняна з контрольною (в даних випадках зустр1чалися К-м1този, а також бластомери з анеушкидним набором хромосом).

3

ТРАНСЕЛАНТАДIЯ ДЕКОНСЕРВОВАНЖ ЕМБР10Н1В МИШ1

Нео0х!дн1сть анал1зу перед- та пост1мплантащйно1 заги-бел1 ембрюшв була обумовлена т:бю обставиною, що повна транскрипщя eмбpíoнaльнoгo геному починаеться 31 стад11 шзньо! бластоцисти (Дибан А.П., 1978). Тому особини з аномалами геному гинуть, як правило, одразу ж шсля 1мплантац1I.

Пэредбачалося доц^льним вивчиги характер ембрюнально! загибел1 ембрюшв, трансплантованих теля крюконсервування та ю-добового збер!гання в р!дкому азот1 (Табл. 2).

Таблиця 2.

Р1вень ембрюнально! смертности трансплантованих ембр:-он!в, що перенесли низъкотемпературну консервацш.

Режим

охолод-

жвння

юлькють ембрюшв

шлыпсть м1сць

¡мплантац!1

ЮЛЬКЮТЬ

кивих ембрюШв

Р1внь загибелI ембрюшв,

_V* )

до |шсля

1мплантад11

Швидкий з ЗМ сахарозою та 2 М глицерином

п0в1льний з 1,5 Ы

дмсо

п0в1льний з 3 М ДМСО

Контроль

12

18

18

30

II

26

10

26

58,3

38,9

50

13,3

16,7

5,6

5,5

О

Як бачимо, шлыисть живих ембрЮшв в контрольной грутп

5

3

8

9

складала 86,6 %. Зокремв, р1веяь пере Д1мпл ант ацИйю! заги-бел1 ембрюшв дор1вшовав 15,3 %, що може бути пов'язане з методикою перенесения ембрюшв в матку, оскглыот внасл1док прокола матки, ендометр1й виробляе простагланд1ни, що зшо-

n

б1гають ¡мплантаци зародив (Межевана Л.М., 1990). Найб1льш висока загибель ембрюшв в1дбувалася за рахунок пiдвищення пост ¡мплантац iftio'i загибелк Так, якщо в контрольна rpyni виживаняя ембрюшв було на високому piBHi, то при резнях засобах повального заморожування ця величина досягала 5,5 %, а шсля швидкого заморожування - складала - 16,7 %.

Як в¡домо, значна частина абортiB обумовлена хромосом-ними аберащями (Баранов B.C., 1988). Вiдшчений взаемо-зв'язок Mix високим р¡Вием частота патолог!й в генетичному материал! та високою постiмплантацiйною загибеллю вмбр¡онiв, заморожених швидко, шдтвержуе biphictb наших bhchobkib про вшшв даного способу кр i оконсервування на генетичний апарат ембрюшв.

Шсля заморожування ембртшв з використанням повiльних швидкостей шд захистом 1,5 М ДМСО, 55 % ембрюшв були живими, a pi вень ембрюнально! смертности складав - 45 % за рахунок niдвищення перед1мплантаЩйно1 загибелк lli сля заморожування з 3 М ДМСО к!льк1сть живих ембрюшв знижувалася до 51 %, також за рахунок шдвищення перед 1 мплантацiitaoi загибелi.

Отже, якщо шсля трансплантат i ембрюшв, що перенесли повiльне заморожування, вони не ¡мплантуються, то шсля швидкого заморожування вони гинуть шсля ¡мплантац!i.

Пор1внюочи одержанI дан! з попередшми матер1алами, мокна зробити висновок, що зб}льшення дол! втипових форм М1тозу та патоморфоло1ччного стану хромосом супроводжуеться зростанням 'пост1мплантацIйноI загибел1 . трансплантованих ембрюшв.

В зв'язку з цим, вважаеться дощльним продовжити дос-л1дження в даному напрямку, здШснивши фенотишчний та цито-генэтичний анал13 потомства, одержаного шсля низькотемпера-турного консервування.

Таким чином, проведен! дослгдження з'ясували, ¡до крш-протектори та сам процес заморокування-в1д!гр1ву частково приводить до патоморфолог^чних та цитогенетичних порушень в клгтинних структурах ембршшв миш, що виражаеться у зни-жешп прол1феративно! активности, в метафазному блоц1,'в патолог] 1 м1тоз!в та вираженому шкноз1 ядер деяких кл г тин, що слгд враховувати при закладщ даного бюоб'екту в низькотем-пературш банки.

ВИСНОВКИ

1. Додавання розчшпв крюпротектор1в ДОСО та глщерину до ембр10Н1в мши на еташ шдготовки до крIоконсервування доц1льно проводити при температурах о - ю °С, так як в таких умовах стушнь ушкодження генетичного апарату найменш виражений.

2. ЕквШбращя ембрюшв мши, що знаходяться на ста-дй' морули при 37 °0 з розчином 3 М ДМСО, веде до зниження м1тотичного ¡ндексу, накопичення мет.афаз, зб^льшення юль-кост! дегенеративних шитин з Шкнотичними ядрами, зб1льшен-

ня кiлькост i прояв i в патологий М1ТОЗУ-

3- При ощнщ зберэження деконсервованих ембр i он i в нвобх i дно застосовувати комплексной шдаид, що включав поряд з морфо-функцюнальними засобами оцпнси цитогенетичш, якi дозволяюгь визначати стан генетичного апарату.

4. Встановлен взаемозв'язок Mía частотою виникнення патологiчних míto3íb, дромосомних аберацгй та ембртональною загибеллю ембр юн i в миш i, трансплантованих п i сля декон-сервац!i. '"

5. Pi3Hi способи крюконсервування виявляють неодноти-повий вплив на пролгферацш та морфогенетичш процеси у ран-ньому ембрюгенезг мил i. Новiльне заморожування з 1,5 М ДМСО найменш впливае на життбздатнють eMöpioHiB, що дозволяе рекомендувати даний cnociö заморожування для довгостроко-вого зберггання ембрюшв -миш.

СПИСОК Р0Б1Т, 0ПУБЛ1КОВАНИХ ПО TEMI ДИСЕРТАЦП

1. Петрушко М.П. Влияние эквилибрации с криопротектора-ми, культивирования и замораживания на морфо-фушшдональные особенности эмбрионов мыши. // В сб. науч. тр. "Фундаментальные и прикладные проблемы криобиологии" - Харьков. - 1993.-с.102-105.

2. Петрушко М.П. Влияние криопротекторов на жизнеспособность эмбрионов мыши. // Проблемы криобиологии, 1994. -N.4. - с.56.

3. Грищенко В.И., Петрушко М.П., Чуб H.H. Морфофункцио-нальные и цитогенетические характеристики эмбрионов мышей после эквилибрации с растворами криопротекторов. // Проблемы криобиологии. - 1994. - N.4. - С. 56 - 57.

4. GrisoherikoV.I., Petrushko M.P., Kalugin Yu.V., Luoiako N.A. The effect of oryopreservation faotors on some morphological and genetic characteristics of mouse embryos. //Proo.Int.Meet.Soo.Low Temp.Biol..Leuven, Belgium. - 1994--p.5.

Петрушко М.П. "Влияние факторов криоконсервирования на генетический ашарат эмбрионов мыши". Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 - криобиология. Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной Академии Наук Украины, Харьков, 1994.

В работе изучалось влияние температуры эквилибрации, криопротекторов и способа замораживания на морфофункшю-нальные, морфогенетические характеристики и пролиферацию эмбрионов мыши, находящихся на стадии морулк. Полученные данные свидетельствуют о том, что добавление криозащитных сред к эмбрионам, находящимся на стадии морулы следует проводить в диапазоне температур 0-10 °С, при использовании небольших концентраций криопротекторов. Показано, что разные способы криоконсервирования оказывают различное влияние на генетический ашарат эмбрионов мыши. Рекомендовано наряду с морфофункиональным методом оценки сохранности эмбрионов, перенесших криоконсервирование, использовать и цитогенетичес-кие, позволяющие определять состояние генетического аппарата.

Petrushko М.Р. The influence of oryopreservation factors on the genetio apparatus of murine embryos. Manuscript. Thesis of the Candidate of Biological Sciences with the speciality in oryobiology, Institute for Problems of Oryobiology and Oryomedioine of the National Academy of Soienoes of the Ukraine, Kharkov, 1994.

The influence of the equilibration temperature, type of

oryoproteotant and method of freezing on the morphofunotio-nal, morphogenetio oharaoteristios and proliferation of murine embryos, at the stage of morula were studied in this work.

The data.obtained testify to the faot that addition of the solutions of oryoproteotants to the embryos at the stage of morula should be oonduoted within a temperature range of 0-10°C. It has been Bhown that different methods of oryopreservation differently affeot genetic apparatus of murine embryos. The work reoommends to combine morphofunotional method of evaluation of the survival of embryos, exposed to oryopreservation procedure, with oytogenetio studies, allowing to assess the state of the genetio apparatus.

Ключовi слова: крюконсервування, кргопротектор, ембр!-

они МИШ, мiтотичний 1НД9КС, метафазш пластинки, трансплан-татя.

Вгдповтдальний за випуск - ГРИЦЕНКО B.I.

Шдпис. до друку 27.09.94 р. Формат 60 х 84 I/I6. Папхр тип. Друк офсетний. Усл. др. арк. 1,0. Тираж 100 екз. Зам. 43.

Беэкоштовно.

Ротапринт ФПНТ HAH Украгни, 3I0I64, пр-кт Лен хна, 47