Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние эритропоэтина на процессы адаптации организма при токсическом воздействии

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние эритропоэтина на процессы адаптации организма при токсическом воздействии"

На правах рукописи

ГОРШКОВ Дмитрий Александрович

ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА НА ПРОЦЕССЫ АДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ

03.03.01 - физиология

2 2 (ШН 2012

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград-2012

005046141

Работа выполнена на кафедре фармакологии ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

Дубина Диляра Шагидуллаевна,

доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой фармакологии ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

Научный консультант:

Фельдман Бронислав Владимирович,

доктор биологических наук, доцент, заведующий кафедрой ботаники, фармакогнозии и фармтехнологий ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

Официальные оппоненты:

Краюшкин Сергей Иванович доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой амбулаторной и скорой медицинской помощи ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России

Бутова Ольга Алексеевна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой анатомии, физиологии и гигиены человека ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный университет» Минздравсоцразвития России

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Ставропольская

государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

Защита состоится 3 июля 2012 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.06 при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131, г. Волгоград, площадь Павших борцов, 1..

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан 30 мая 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор социологических наук, кандидат медицинских наук, доцент

М.Д.Ковалева

Общая характеристика работы

Одной из центральных проблем современной биологии и, в частности, физиологии является выяснение влияния антропогенных повреждающих факторов среды на центральную нервную систему и поведенческие реакции. Для решения этой проблемы и разработки новых эффективных способов повышения резистентности мозга к повреждающим воздействиям важное значение имеет понимание эндогенных механизмов, лежащих в основе адаптивных реакций организма. Экстремальные внешние воздействия приводят к структурным и функциональным нарушениям нейронов мозга, вследствие чего возникают такие патологии, как постгипоксическое состояние и постстрессовые тревожно-депрессивные расстройства. Эти патологические состояния отличаются высокой степенью распространенности, и частота их встречаемости продолжает неуклонно возрастать. Стресс, и в том числе, вызванный влиянием неблагоприятных экзогенных факторов, характеризуется комплексным воздействием на нейрогуморальные регуляторные механизмы и сопровождается выраженными изменениями поведения человека и животных (Селье Г., 1967; Айрапетянц М.Г., Вейн A.M., 1992; Симонов П.В., 1993; Хананашвили М.М., 1998). В связи с вышесказанным, поиск способов повышающих устойчивость мозга к стрессам, вызванным токсическим воздействием, является актуальной задачей нейрофизиологии (Рыбникова Е.А., 2010).

В последние десятилетия в Астраханской области произошло резкое ухудшение экологической обстановки, в том числе связанное, с загрязнением атмосферного воздуха продуктами Астраханского газоконденсатного месторождения (АГКМ) (Полунин И.Н. с соавт., 1999; Бучин В.Н. с соавт., 2007; Новиков А.В. с соавт., 2007). Серосодержащие продукты АГКМ являются мощным токсическим и стрессорным антропогенным фактором и влияют на жизненно важные биологические системы, к которым относится центральная нервная система и система эритропоэза (Ушанский В.Я. с соавт.,1985; Ерохин Е.Е.,1987; Даценко В.И. с соавт., 1988; Асфандияров Р.И. с соавт., 1995.; Хужахметова Л.К., 1998; Боев В.М., Сетко Н.П., 2001; Провалова Н.В. с соавт., 2003; Хужахметова Л.К., Сентюрова Л.Г., 2004).

К настоящему времени накоплены обширные сведения о комплексном влиянии эритропоэтина (ЭПО) на различные морфофункциональные системы организма человека. Во многих экспериментальных и клинических исследованиях показано, что ЭПО является мультифункциональным трофическим фактором, имеет несколько сайтов экспрессии, обладает специфической тканевой регуляцией, связанной с различными механизмами воздействия. Рецепторные белки, избирательно связывающиеся с ЭПО, найдены не только на мембранах клеток красного ростка костного мозга, но и на клетках миелоидного ряда, лимфоцитах, мегакариоцитах, а также на эндотелиальных, миокардиальных, гладкомышечных клетках и нейронах (Buemi М. et al., 2002). Кроме того, идентифицированы и другие участки (сайты) ЭПО продукции и, в частности, матка и головной мозг, в которых экспрессия ЭПО также имеет тканевую специфичность (Chikuma М. et al., 2000). При этом, несмотря на большое количество данных по адаптогенным и трофическим свойствам ЭПО,

лишь очень небольшое число работ посвящены изучению его влияния на процессы поведения (Ермоленко В.М., Николаев А.Ю., 1990; Провалова Н.В. с соавт., 2003; Захаров Ю.М., 2007). В доступной нам литературе отсутствуют сведения о влиянии ЭПО на структуру и функцию нейронов центральной нервной системы при токсическом воздействии серосодержащих поллютантов. В связи с этим изучение нейропротекторных свойств ЭПО при хроническом токсическом воздействии продуктами АГКМ и, в особенности, его влияния на поведенческие реакции, представляет собой актуальную научную задачу, решение которой имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение.

Цель исследования: оценить токсическое действие

сероводородсодержащего газа на поведенческие реакции и процессы свободнорадикального окисления белков и липидов и определить влияние эритропоэтина на интенсивность данного воздействия.

Задачи исследования:

1. С помощью тестов «Экстраполяционое избавление», «Приподнятый крестообразный лабиринт», «Условная реакция пассивного избегания», «Открытое поле» изучить изменение поведенческих реакций белых крыс при хроническом токсическом воздействии серосодержащих продуктов АГКМ.

2. Изучить количество эритроцитов, уровень гемоглобина, рН плазмы крови и структуру нейронов ЦНС белых крыс при хроническом токсическом воздействии серосодержащих продуктов АГКМ.

3. Изучить влияние хронического токсического воздействия продуктами АГКМ на перекисное окисление липидов и белков плазмы крови и тканей головного мозга белых крыс.

4. Изучить поведенческие реакции у подвергшихся хроническому токсическому воздействию продуктами АГКМ белых крыс на фоне введения эритропоэтина.

5. Изучить влияние эритропоэтина на количество эритроцитов, уровень гемоглобина, рН плазмы крови, окислительную модификацию белков и липидов плазмы крови и тканей головного мозга у животных при хроническом токсическом воздействии.

Научная новнзна исследования: Впервые проведено сравнительное изучение поведенческих реакций у интактных и подвергшихся хроническому токсическому воздействию серосодержащих поллютантов млекопитающих. Впервые изучен состав и количество эритроцитов, структура нейронов ЦНС, окислительная модификация белков и липидов плазмы крови и тканей головного мозга при хроническом токсическом воздействии различных концентраций серосодержащего газа АГКМ на фоне применения ЭПО. Впервые изучено влияние ЭПО на поведенческие реакции при хроническом токсическом воздействии различных концентраций серосодержащих поллютантов. Впервые показана возможность применения ЭПО в качестве адаптогена, способного корректировать метаболические процессы, эритропоэз и поведенческие реакции при хроническом токсическом воздействии.

Научно-практическая значимость.

адаптогена, способного корректировать метаболические процессы, эритропоэз и поведенческие реакции при хроническом токсическом воздействии.

Научно-практическая значимость.

В проведенном исследовании изучена ультраструктура нейронов ЦНС, динамика поведенческих реакций, состав форменных элементов крови и окислительная модификация белков и липидов в плазме крови и тканях головного мозга при хронической интоксикации, вызванный различными концентрациями серосодержащего газа.

Доказано корректирующее действие ЭПО на поведенческие реакции и процессы метаболизма и показана возможность его применения в качестве адаптогена при хроническом токсическом воздействии.

Проведенное исследование расширяет существующие представления о механизмах развития экологически обусловленных нарушений поведенческих реакций, процессов метаболизма и эритропоэза, и создает теоретическое обоснование применения ЭПО в качестве адаптогена, обладающего нейропротекторными и психотропными свойствами.

Полученные данные используются для преподавания соответствующих разделов нормальной и патологической физиологии, биохимии, экологии и охраны окружающей среды. Результаты исследования могут быть использованы в написании монографий, руководств по физиологии, токсикологии и патологической физиологии и служить в качестве методической основы для последующих исследований в этой области.

Положения, выносимые на защиту:

1. Выраженность изменения поведенческих реакций зависит от длительности воздействия и концентрации серосодержащих продуктов АГКМ.

2. ЭПО, применяемый в качестве адаптогена при хроническом токсическом воздействии серосодержащих продуктов АГКМ, оказывает активирующий эффект, улучшает ориентировочно-исследовательскую и когнитивную активность.

3. При хроническом токсическом воздействии различных концентраций продуктов АГКМ ЭПО, оказывает корригирующее влияние на состав и количество эритроцитов, окислительную модификацию белков и липидов плазмы крови и тканей головного мозга.

4. ЭПО не влияет на ультраструктуру нейронов ЦНС у животных подвергшихся хроническому токсическому воздействию серосодержащих продуктов АГКМ.

Апробация работы. Результаты работы доложены и обсуждены: На VIII межрегиональной научно-практической конференции «Лекарство и здоровье человека», 2009., Астрахань; на V Пироговской студенческой научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва, 2010; на VI Международной (XV Всероссийской) Московской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, 2011., Москва; на X Всероссийской Университетской научно-практической конференции молодых ученых по медицине, 2011., Тула; на 86-й научно-практической конференции врачей г. Астрахани, 2011.; на II международной научной конференции, посвященной 80-

летаю академика РАЕН, заслуженного работника высшей школы РФ, д.б.н., профессора Д.Л. Теплого, Астрахань, 2011.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Указатель литературы включает в себя 186 отечественных и 161 иностранных источников. Работа содержит 15 таблиц, 25 рисунков из которых 4 фотографии.

Материалы и методы.

Работа была выполнена на 242 белых беспородных крысах-самцах массой 210 ± 11,6 г, возрастом от полугода до года. При проведении исследования были соблюдены все требования «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных (ГОСТ 351000.3-96 и 51000.4-96). Перед началом эксперимента животные содержались в карантине (1 месяц) с обязательным клиническим обследованием и выбраковкой подозрительных на заболевание особей. Экспериментальные исследования были выполнены в соответствии с Приказами МЗ СССР № 755 от 12 августа 1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных», № 701 от 27 июля 1978 г. «О внесении дополнений в Приказ МЗ СССР № 755 от 12 августа 1977 г.», а также положениями «Хельсинской Декларации по вопросам медицинской этики» и «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1989). Проведение экспериментальных исследований было одобрено этической комиссии (протокол № 3 от 31 октября 2011 г).

Для изучения протективных и психотропных свойств ЭПО при воздействии различных концентраций сероводородсодержащего газа, использовался природный промышленный газ Астраханского месторождения. Моделирование патологии проводили при помещении крыс в атмосферу сероводородсодержащего газа в концентрации 3,07 + 0,09 мг/м3 и 30,12 ± 0,05 мг/м3 по сероводороду в течение 4 часов на протяжении пяти дней в неделю. Весь эксперимент включал два месяца непрерывной ингаляции природного газа. Все животные были поделены на девять групп: 1) контрольная; 2) группа, подвергавшаяся ингаляционному воздействию сероводородсодержащего газа в концентрации 3 мг/м3 в течение месяца без применения ЭПО; 3) группа, подвергавшаяся ингаляционному воздействию газа в концентрации 3 мг/м3 в течение месяца на фоне применения ЭПО; 4) группа, подвергавшаяся ингаляционному воздействию газа в концентрации 3 мг/м3 в течение двух месяцев без применения ЭПО; 5) группа, подвергавшаяся ингаляционному воздействию газа в концентрации 3 мг/м3 в течение двух месяцев месяца на фоне применения ЭПО; 6) группа, подвергавшаяся ингаляционному воздействию газа в концентрации 30 мг/м3 в течение месяца без применения ЭПО; 7) группа, подвергавшаяся ингаляционному воздействию газа в концентрации 30 мг/м3 в течение месяца на фоне применения ЭПО; 8) группа,

нормативных документов. В качестве наркотизирующего вещества использовался этаминал натрия в концентрации 40 мг/кг массы тела животного, который вводили внутрибрюшинно.

Изучение поведенческих реакций проводилось с помощью следующих тестов:

а) Тест «Экстраполяционное избавление» (Савченко Н.М. с соавт., 1988; Бондаренко H.A. с соавт., 1990; Кравченко Е.В. с соавт., 2007) использовался для изучения когнитивных функций, а также для оценки степени возбуждения и мнестических функций ЦНС при хроническом токсическом воздействии серосодержащих поллютантов. Регистрировалось время латентного периода подныривания.

б) Тест «Приподнятый крестообразный лабиринт»(Нап<11еу S.L., Mittani S. 1984) позволил оценить степень тревожности, возникающую в результате стресса, вызванного хроническим токсическим воздействием серосодержащего газа АГКМ. Регистрировалось время нахождения в закрытых рукавах лабиринта.

в) Тест «Условная реакция пассивного избегания» (Буреш Я. с соавт., 1991) позволил оценить влияние ЭПО на формирование и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях хронического токсического воздействия серосодержащим газом АГКМ. Регистрировалось время реакции пассивного избегания при электроболевом раздражении.

г) Тест «Открытое поле» (Айрапетянц М.Г. с соавт., 1980) заключался в оценке двигательного компонента ориентировочной реакции и эмоциональной реактивности животных. Регистрировалось: число пересеченных квадратов (горизонтальная двигательная активность); вставание на задние лапы и заглядывание в отверстия (ориентировочно-исследовательская активность); количество заходов в центральную зону; акты груминга и фекальных болюсов (эмоциональный и вегетативный фактор).

Изучение перекисного окисления липидов (ПОЛ) - по уровню малонового диальдегида проводилось по методике Ю.А. Владимирова, А.И. Арчакова (1972) в модификации Е.А. Строева, В.Г. Макарова (1987) в реакции с тиобарбитуровой кислотой. При определении окислительной модификации белков использовался модифицированный Е.Е.Дубининой с соавторами (1995) метод, основанный на цепи взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразоном (2,4-ДНФГ).

Определение количества эритроцитов, уровня гемоглобина и кислотно-основного баланса крови производилось общепринятыми методиками.

Ультраструктура нейронов сетчатки и пинеалоцитов у подвергшихся токсическому воздействию крыс изучена с помощью электронной микроскопии. Сетчатая оболочка глаза и эпифиз фиксировались по Палладе в течение часа. Предварительно глазное яблоко вскрывалось по лимбу, извлекались стекловидное тело и хрусталик. Дегидратация проводилась в восходящей батарее спиртов. После этого глазное яблоко разрезалось по секторам. Эпифиз и глазное яблоко помещались в смесь аралдит - спирт (1:1) на 1,5 часа при 37 С. Исследуемый материал ориентировали, а затем заливали в аралдит. На ультратоме LKB изготавливались ультратонкие срезы и после предварительного контрастирования Pb(N03)2 монтировались на бленды с формваровой подложкой (Serva, ФРГ). Просмотр и фотографирование препаратов проводили на

электронных микроскопах JEM-100 СХ и ЕМ-410 «Филипс». Полутонкие срезы

окрашивались метиленовым синим.

Статистическая обработка полученных количественных данных проводилась на персональном компьютере с помощью программ "Microsoft Office Windows 2007", "Microsoft Office Excel 2007". На первом этапе рассчитывали групповые показатели суммарной статистики - среднюю арифметическую величину (М) и ошибку средней (m). Достоверность различий между исследуемыми группами определяли с помощью t-критерия Стьюдента после проверки распределения на нормальность («Статистическая обработка результатов в медицинских исследованиях по критерию Стьюдента»), С. Кравченко, Краснодар, 2006). Статистически значимыми считали отличия, соответствующие величине ошибки

достоверности р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение.

Изучение когнитивных функций, во многом определяющих поведенческие реакции, проведенное с помощью теста «Экстраполяционное избавление» показало, что при действии серосодержащего газа в концентрации 3 мг/м у животных увеличивается время, необходимое для обучения. Если у интактных животных оно составляло 20,4 ± 4,26 сек, то через месяц токсического воздействия оно составляло 27,20 ± 2,13 сек. Через два месяца токсического воздействия время обучения сократилось до 22,0 ± 2,1 сек. Время воспроизведении данного теста через один и два месяца от начала эксперимента сокращается до 17,8 ± 4,59 сек и 18,2 ± 1,36 сек соответственно, в то время, как у интактных животных оно равно 19,4 ± 1,69сек. Полученные данные свидетельствуют о повышении степени возбуждения и тревожности при воздействии природного газа АГКМ. Введение ЭПО привело к сокращению времени, затраченного как на обучение, так и на воспроизведение. Максимальный эффект от введения ЭПО проявился через один месяц после его приема. Через месяц эксперимента время на обучение составило 19,0 ± 2,51 сек, через два месяца - 21,8 ± 2,91 сек. Время воспроизведения составило: -через месяц -12,8 ± 2,65 сек; -через два месяца -16,0 ± 1,95 сек. з

Воздействие серосодержащего газа с концентрацией сероводорода 30 мг/м приводило к удлинению времени, затрачиваемого, как на обучение, так и на воспроизведение. Если у интактных животных это время составляло 20,4 ± 4,26 сек и 19,4 ± 1,69 сек соответственно, то через месяц токсического воздействия, время обучения стало равным 32,8 ± 4,15 сек, а через два месяца - 44,6 ± 1,75 сек. Время воспроизведения через месяц и два месяца токсического воздействия составило 28,6 ± 4,32 сек и 39,6 ± 2,56 сек соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что природный газ АГКМ с концентрацией сероводорода 30 мг/м3 значительно снижает когнитивные и мнестические функции. Изменения в поведенческих реакциях более выражены через два месяца

токсического воздействия.

Введение ЭПО у животных, подвергшихся токсическому воздействию серосодержащих поллютантов с концентрацией сероводорода ЗОмг/м оказало лишь мало выраженный корригирующий эффект, незначительно сокращая время, затраченное, как на обучение, так и на воспроизведение.

Полученные данные согласуются с результатами теста «Условная реакция пассивного избегания». На фоне применения ЭПО латентный период захода в темный отсек на стадии воспроизведения значительно увеличивается (рис. 1).

сек 180 160 140 120 100 80

60 И"—..................................¿t***"'..........- ............................................. «®»30мг/м3

40 20 О

контроль 1 месяц 2 месяц

Рис. 1. Изменения латентного периода захода в темный отсек во время воспроизведения теста «Условная реакция пассивного избегания» на фоне хронического ингаляционного воздействия природным газом на фоне применения ЭПО.

Таким образом, в ходе проведенных экспериментов было обнаружено, что под действием ЭПО происходит улучшение когнитивной активности у животных, подвергшихся длительному стрессирующему воздействию природного газа.

Для определения ориентировочно-исследовательского поведения и уровня эмоционального реагирования нами была использована методика «Приподнятый крестообразный лабиринт» (Леушкина Н.Ф. с соавт, 2010). Одним из основных параметров, оцениваемых в этом тесте, является время нахождения в закрытых рукавах (табл. 1). По этому показателю можно определить противотревожные свойства ЭПО (Баришполец В.В., 2009). При определении времени нахождения в закрытых рукавах на фоне воздействия сероводородсодержащим газом была выявлена тенденция к нарастанию изучаемого параметра. Это может свидетельствовать об анксиогенном действии природного газа. Анксиогенные свойства природного газа проявляются и в тесте «Условная реакция пассивного избегания», что проявляется увеличением количества заходов в темный отсек как на стадии обучения, так и на стадии воспроизведения. На фоне применения ЭПО достоверных изменений во времени пребывания в закрытых рукавах в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» и в количестве заходов в темный отсек в тесте «Условная реакция пассивного избегания» нами обнаружено не было. Это свидетельствует о том, что ЭПО не снижает уровень тревожности при действии серосодержащими продуктами. Также с помощью теста «Приподнятый крестообразный лабиринт» мы исследовали наличие активирующего или угнетающего эффекта у ЭПО. При воздействии природным газом в концентрации 3 мг/м3 нами обнаружено увеличение суммарной двигательной активности животных, как через один, так и через два месяца от начала эксперимента (табл. 1). Полученные данные свидетельствуют о том, что токсическое воздействие серосодержащих поллютантов увеличивают уровень тревожности, не корригируемым ЭПО.

Обнаружено, что воздействие серосодержащего газа с концентрацией сероводорода 30 мг/м3 приводило к усилению двигательной активности. При ведении ЭПО суммарная двигательная активность животных еще больше увеличилась. Поскольку ранее нами было показано, что ЭПО не снижает уровень тревожности, то возрастание суммарной двигательной активности может быть расценено как проявление активирующего действия ЭПО. Это подтверждается данными, полученными в этом же тесте при изучении ориентировочно-исследовательской активности, которая снижается при действии природного газа и возвращается к контрольным значениям после введения ЭПО (табл. 1).

Наиболее часто при изучении поведенческих реакций применяется тест «Открытое поле», позволяющий изучить двигательный компонент ориентировочной реакции и эмоциональную реактивность животных (Буреш Я. с соавт., 1991).

Таблица 1.

Результаты, полученные в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» у животных, подвергшихся токсическому воздействию природным газом без и на

Параметры Время нахождения в закрытых рукавах Стойки в открытых рукавах Стойки в закрытых рукавах СОИА Показателя двигательной активности, количество заходов Суммарная двигательная активность

Открытые рукава Закрытые рукява Центральная зона

Контроль (и-7) 151,4 ± 6.48 1,5 ±0,4 3,00 ± 0,32 4,5 ± 0,6 0,75 ± 0,25 1,8 ± 0,24 1,6 ± 0,4 4,1 ± 0,35

Концентрация природного газ* 3 мг/м"1 по Серове зороду

1 месяц без ЭПО (п-7) 155,4 ± 10,32 0,75 ± 0,25* 2,0 ± 0,55* 2,75 ± 0,44 1,5 ± 0,5 2,2 ± 0,55 2,75 ± 0,63* 6,45 ± 1,68*

1 месяц с ЭПО ( п=6) 158,4 ± 6 ,39 0,96 ± 0,4 2,25 ± 0,25* 3,2 ± 0,5 1,5 ± 0,62 3,2 ± 0,36* 2,6 ± 0,44* 7,3 ± 1,2*

2 месяц без ЭПО (п=6) 156,0± 14,7 0,75 ± 0,25* 1,2 ± 0,5* 2,0 ± 0,35* 1,0 ± 0,37 2,45 ± 0,23 2,1 ± 0,4 5,55 ± 0,8

2 месяц с ЭПО (п=6) 160,0 ± 5,48 1,1 ± 0,3 1,7 ± 0,15* 2,8 ± 0,4 1,3 ± 0,25* 2,75 ± 0,56* 2,4 ± 0,3* 6,45 ± 0,5*

Концентрация природного газа 30 мг/м3 по сероводороду

1 месяц без ЭПО (п-О 163,8 ± 6,17 0,75 ± 0,25* 1,67 ± 0,33* 2,42 ± 0,56* 0,75 ± 025 2,8 ± 0,7 2,4 ± 0 ,58 5,95 ± 1Д*

1 месяц с ЭПО (п-6) 169,0 ± 5,62* 1,3 ±0,6 2,4 ± 0,75 3,7 ± 0,9 1,0 ± 0,3 2,8 ± 0,38* 2,62 ± 0,77 6,42 ± 1,35*

2 месяц без ЭПО (п-в) 171,0 ± 6,78* 0 1,25 ± 0,25* 1,25 ± 0,25* 0 3,1 ± 0,72* 2,3 ± 0,3 5,4 ± 0,5*

2 месяц с ЭПО (П-6) 172,0 ± 5,83* 1,2 ± 0,3 1,5 ± 0,29* 2,7 ± 0,29 0,75 ± 0,25 2,8 ± 0,4* 2,5 ± . 0,65 6,05 ± 1,15*

СОИА - суммарная ориентировочно-исследовательская активность

При токсическом

воздействии серосодержащими продуктами АГКМ с концентрацией Зи 30 мг/м3 двигательный компонент ориентировочной реакции возрастает, о чем свидетельствует увеличение количества пересеченных квадратов экспериментальными животными.

Одной из важных характеристик ориентировочно— исследовательского поведения является выход животных в центр открытого поля, характеризующего уровень тревожности. (Исмайлова Х.Ю. с соавт, 2007; Подковкин В.Г., Иванов Д.Г., 2009). При действии сероводородсодержащего газа с концентрацией 3 и 30 мг/м'3 отмечается увеличение уровня тревожности, что определяется уменьшением количества заходов в центральные квадраты и увеличением количества заходов в периферические. Применение ЭПО у животных во всех исследуемых группах привело к возрастанию уровня ориентировочно — исследовательской активности, о чем свидетельствует увеличение количества выходов животных в центральные квадраты (табл. 2).

Анализ ориентировочно— исследовательского поведения крыс в тесте «открытое поле» проводился по числу «вертикальных стоек», характеризующих мотивационную составляющую исследовательского поведения. (Хоничева Н.М. с соавт., 2001; Иванов Д.Г., Подковкин В.Г., 2010). Полученные данные свидетельствуют о том, что токсическое воздействие природного газа подавляет мотивационную составляющую ориентировочно-исследовательского поведения крыс. Процесс подавления ориентировочно-исследовательской активности более выражен через два месяца от начала эксперимента (табл.2). Так у контрольных животных количество стоек составило 4,7 ± 0,2, в группе животных с концентрацией газа Змг/м3 были обнаружены показатели 4,2 ± 0,26 и 3,9 ± 0,17 в первый и второй месяц соответственно без применения ЭПО. В группе с применением ЭПО - 4,5 ± 0,15 и 4,4 ± 0,22. В группе с концентрацией газа З0мг/м3 данный показатель составил 4,1 ± 0,27 и 3,75 ± 0,27 без применения ЭПО. А в группе с применением ЭПО - 4,6 ± 0,35 и 4,0 ± 0,32 соответственно. Введение ЭПО повышало ориентировочно-исследовательскую активность животных, о чем свидетельствует возрастание числа вертикальных стоек, вне зависимости от времени воздействия природного газа АГКМ и концентрации в нем сероводорода.

Еще одним показателем, характеризующим ориентировочно-исследовательское поведение, является норковый рефлекс крыс. Нами найдено, что токсическое воздействие природного газа с концентрацией, как 3 мг/м3, так и 30 мг/м3 увеличивает число заглядывания в норки, что свидетельствует о повышении уровня ориентировочно— исследовательской активности. Введение эритропоэтина оказывает модулирующее действие на ориентировочно-исследовательское поведение, уменьшая число заглядываний в норки, практически до контрольных значений (табл. 2).

Также важным показателем, характеризующим ориентировочно-исследовательское поведение является груминг, по числу которого можно судить о мотивационной составляющей поведения крыс. Природный газ уменьшает число актов груминга как в группе животных, подвергшихся токсическому воздействию продуктами АГКМ с концентрацией сероводорода 3 мг/м3, так и в группе с концентрацией газа 30 мг/м3. Введение эритропоэтина увеличивает число актов груминга, возвращая этот показатель к контрольным значениям, что свидетельствует о его способности влиять на поведенческие процессы (табл. 2). Таким образом, ЭПО усиливает ориентировочно — исследовательскую

активность, повышает мотивационную составляющую поведенческих реакции, обладает модулирующим и психостимулирующим действием.

Таблица 2.

Результаты, полученные в тесте «Открытое поле» у животных, подвергшихся

токсическому воздействию природным газом

Параметры Пересеченные центральные квадраты Пересеченные периферические квадраты Вертикальные стоики без опоры Вертикальные стойки с опорой Число заглядыва-ний в норку Частота актов груминга Число болюсов

Контроль п=9 10,6 ±2,2 16,7 ±2,8 2,6 ±0,12 4,7 ±0,2 5,8 ±0,24 3,0± 0,12 2,2 ± 0,37

Концентрация п риродного газа 3 мг/м3 по сероводороду

1 месяц без ЭПО п=7 8,3 ± 1,9 21,4 ±3,2 3,2 ± 0,27* 4,2 ± 0,26 6,3 ± 0,31 2,5 ± 0,23* 1,83 ± 0,45

1 месяц с ЭПО п=7 9,4 ±1,5 18,2 ± 2,5 3,0 ±0,18 4,5 ±0,15 6,1 ± 0,28 2,94 ± 0,18 2,17 ± 0,5

2 месяц без ЭПО 11=8 7,1 ± 1,3 23,7 ± 2,2* 3,75 ± 0,2* 3,9 ±0,17 6,5 ± 0,35 2,27 ± 0,2* 1,56 ± 0,32

2 месяц с ЭПО п=7 7,8 ± 1,4 22,6 ± 2,5* 3,48 ± 0,16* 4,4 ±0,22 6,27 ±0,3 2,5 ± 0,15* 1,75 ± 0,38

Концентрация природного газа 30 мг/м3 по сероводороду

1 месяц без ЭПО п=6 8,1 ±2,0 21,9 ±2,7 2,8 ±0,3 4,1 ± 0,27* 5,9 ± 0,31 2,43 ± 0,27 1,76 ± 0,28

1 месяц с ЭПО п=7 9,2 ± 1,7 20,4 ±1,9 2,5 ± 0,25 4,6 ± 0,35 5,7 ± 0,25 2,68 ± 0,16 1,92 ± 0,41

2 месяц без ЭПО 0=6 6,3 ± 1,2* 24,7 ± 1,5* 3,3 ± 0,16* 3,75 ± 0,27* 6,4 ± 0,22* 2,1 ± 0,34* 1,34 ± 0,17*

2 месяц с ЭПО п=8 7,6 ± 0,95 | 22,4 ± 2,1* 3,1 ± 0,18* 4,0 ± 0,32* 6,2 ± 0,26 2,6 ±0,17 1,67 ± 0,37

Примечание: * - разница с контролем достоверна при р<0,05

Серосодержащие продукты АГКМ вызывают в организме человека различные патологические процессы (в том числе гипоксию), что в свою очередь влияет на адаптивные реакции в центральной нервной системе. Развитие, вследствие токсического воздействия, гипоксии связано с уменьшением количества эритроцитов и содержания в них гемоглобина. Воздействие природного газа АГКМ с концентрацией сероводорода 3 и 30 мг/м3 вызывает у экспериментальных животных увеличение количества эритроцитов, при этом содержание гемоглобина по сравнению с контролем достоверно не изменяется (табл.3). Полученные данные свидетельствует о включении механизмов адаптации к гипоксии, связанных с активизацией процесса эритропоэза в красном костном мозге. Токсическое воздействие серосодержащего газа вызывает незначительное снижение уровня рН плазмы крови, что является свидетельством интенсификации, вследствие гипоксии, процессов анаэробного

гликолиза. Однократное применение эритропоэтина у животных, подвергшихся токсическому воздействию серосодержащих поллютантов не вызывало достоверных изменений количества эритроцитов, уровня гемоглобина и рН плазмы крови (табл.3).

Таблица 3.

Показатели крови крыс при хроническом

Эритроциты (хЮ12/л) Гемоглобин (г/л) РН

Контроль (п=15) 7,2 ± 0,25 148,0 ±5,4 7,41 ± 0,01

3 мг/м3 без ЭПО (п=11) 8,3 ± 0.48* 150,17 ±4,48 7,38 ± 0,02

3 мг/м3 с ЭПО (п=18) 8,55 ± 0,3* 149,75 ±3,49 7,37 ±0,02

30 мг/м5 без ЭПО (п=16) 8,27 ±0,11* 156,27 ±2,5* 7,27 ±0,01*

30 мг/м3 с ЭПО п=13) 8,15 ±0,16* 152,2 ±2,75 7,32 ± 0,02*

Примечание: * - разница с контролем достоверна при р<0,05

Одним из ведущих механизмов, обеспечивающих адаптацию организма к экзогенным токсическим воздействиям, является интенсификация процессов свободнорадикального окисления белков и липидов (Forster M.J. et al., 1996; Friguet В. et al., 2000). При определении содержания продуктов перекисной модификации белков найдено, что при действии сероводородсодержащего газа в концентрациях и 3 мг /мЗ, и 30 мг/м3 происходит достоверное увеличение содержания ТБК-продуктов как в сыворотке крови, так и тканях мозга, более выраженное при воздействии природного газа с большей концентрацией. У всех экспериментальных животных, подвергшихся токсическому воздействию эритропоэтин уменьшал содержание конечных продуктов окислительной модификации белка в плазме крови и в тканях головного мозга (рис. 1-2).

■ плазма

іфиші о-псань молгя

контроль 6« DITO с ЭПО

1)3 мг/м

ед. опт.пл./мг Ьелка

0,9 • у

0,8 • /

0,7 ' у

0,« •

0,3 • у f»rr ■ плазма

0,4- ет крови

0,3 У І □ткань

0,2 мозга

0,1 у" і L—

контроль ЬезЭПО сЭПО

2) 30 мг/м

Рис. 1 и 2. Показатели окислительной модификации белков в плазме крови и ткани мозга на фоне хронического ингаляционного воздействия природным

газом в концентрации 3 мг/м3 (рис.1) и 30 мг/м3 (рис.2) без и на фоне применения

ЭПО.

При изучении активности процессов липопероксидации у животных, подвергшихся воздействию природного газа с концентрацией сероводорода 3 и 30 мг/м3 нами было зарегистрировано нарастание уровня малонового диальдегида в плазме крови и тканях мозга. Введения ЭПО снижало уровень малонового диальдегида, причем снижение более выражено в тканях головного мозга по сравнению с плазмой крови (рис. 3-4).

3) 3 мг/м' 4) 30 мг/м3

Рис. 3 и 4. Показатели процессов липопероксидации в плазме крови и ткани мозга на фоне хронического ингаляционного воздействия природным газом в концентрации 3 мг/м3 (рис.3) и 30 мг/м3 (рис.4) без и на фоне применения ЭПО.

Таким образом, применяемый эритропоэтин обладает выраженным адаптогенным действием, влияя на процессы пероксидации липидов и белков как в плазме крови, так и в тканях головного мозга (табл. 4).

Таблица 4.

Показатели свободнорадикального окисления на фоне хронического ингаляционного воздействия природным газом без и на фоне применения ЭПО

Состояние окислительной модификации белков (ед.опт.пл./мг белка) Состояние процессов липопероксидации (ед. опт. пл./мг. лип)

Плазма крови Ткань мозга Плазма крови Ткань мозга

Контроль (п=15) 0,45 ± 0,03 0,37 ± 0,06 2,93 ±0,17 2,16 ±0,18

3 мг/м3 без ЭПО (п=И) 0,57 ±0,06* 0,67 ±0,03* 8,52 ±2,25* 9,85 ± 1,82*

3 мг/м3 с ЭПО (п=18) 0,44 ± 0,06 0,53 ±0,03* 7,29 ± 1,42* 6,07 ± 1,32*

30 мг/м3 без ЭПО (п=16) 0,79 ±0,01* 0,86 ±0,01* 11,51 ±3,35* 14,29 ±2,15*

30 мг/м3 с ЭПО (п=13) 0,68 ± 0,03* 0,72 ± 0,04* 10,57 ±2,43* 9,66 ± 1,5*

Примечание: * - разница с контролем достоверна при р<0,05

адаптации, а мелатонин способен уменьшать проявления оксидантного стресса, сопровождающего токсическое поражение центральной нервной системы (Арушанян Э.Б., 2005, 2006). При токсическом повреждении эпифиза продукция мелатонина снижается, что сопровождается нарушениями поведения и познавательной деятельности, развитием неврозов и депрессий (Арушанян Э.Б., 2000, 2004, 2006). В структуре эпифиза животных, подвергшихся токсическому воздействию продуктами АГКМ с концентрацией сероводорода 30 мг/м3 обнаружены незначительные дегенеративные изменения - дилатация сосудов, увеличение доли дегенерирующих клеток, снижение количества светлых пинеалоцитов. Отмечается некоторое уменьшение диаметра ядер и ядрышек секретообразующих клеток. В светлых пинеалоцитах наблюдается краевая конденсация хроматина, снижение содержания полисом в цитоплазме, уменьшаются размеры ГЭС, комплекса Гольджи. Содержание секреторных гранул в цитоплазме незначительно снижается. Аналогичные изменения происходят и в ганглионарных клетках сетчатки. Однократное введение ЭПО не влияло на измененную, вследствие хронического токсического воздействия, структуру клеток эпифиза и сетчатой оболочки глаза.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что при токсических воздействиях эритропоэтин улучшает ориентировочно-исследовательскую активность, обладает модулирующим и психостимулирующим действием, активирует когнитивные процессы, не влияя при этом на ультраструктуру нейронов.

Выводы

1. Хроническое токсическое воздействие продуктами АГКМ влияет на поведенческие реакции: угнетает когнитивные функции, повышает уровень тревожности, задерживает формирование памятного следа, снижает ориентировочно-исследовательскую способность. Выраженность изменений поведения коррелирует с концентрацией сероводорода в серосодержащем газе и временем токсического воздействия.

2. У животных, подвергшихся токсическому воздействию продуктами АГКМ с концентрацией 3 и 30 мг/м3, введение ЭПО улучшает формирование памятного следа на 27 и 33%, когнитивные функции на 18 и 7%, ориентировочно-исследовательскую деятельность на 15 и 47% соответственно, по сравнению с животными не получавшими ЭПО.

3. Серосодержащие продукты АГКМ с концентрацией сероводорода 3 и 30 мг/м3 по сравнению с контролем активируют процессы окислительной модификации белков в плазме крови в 1,26 и 1,51 раз и в тканях мозга в 1,75 и 1,94 раз соответственно. Процессы окислительной модификации липидов активируются при действии серосодержащих поллютантов АГКМ в тех же концентрациях в плазме крови в 3 раза, а в тканях мозга в 4 и 6 раз соответственно.

4. Введение эритропоэтина животным, подвергшимся токсическому воздействию продуктами АГКМ с концентрацией сероводорода 3 мг/м3 уменьшают уровень ПОБ в плазме крови на 23% и в тканях мозга на 21% .У животных, подвергшихся токсическому воздействию продуктами АГКМ с

концентрацией сероводорода 30 мг/м3 уровень ПОБ в плазме крови уменьшается на 14% и в тканях мозга на 17%. Введение эритропоэтина животным, подвергшимся токсическому воздействию продуктами АГКМ с концентрацией сероводорода 3 мг/м3 снижает уровень ПОЛ в плазме крови на 15%, в тканях мозга на 39%, а при концентрации сероводорода 30 мг/м3 уровень ПОБ в плазме крови уменьшается на 9% и в тканях мозга на 33%.

5.Хроническое токсическое воздействие продуктами АГКМ с концентрацией сероводорода 3 мг/м3 и 30 мг/м3 приводило к увеличению количества эритроцитов на 15% по сравнению с контрольной группой. Введение эритропоэтина животным, подвергшимся токсическому воздействию, приводило к еще большему увеличению количества эритроцитов при содержании сероводорода в продуктах АГКМ 3 мг/м3 - на 19% и при 30 мг/м -на 14% по сравнению с животными, не получавшими ЭПО, и не приводило к достоверному повышению уровня гемоглобина.

6. Хроническое токсическое воздействие продуктами АГКМ приводило к сдвигу рН плазмы крови в кислую сторону, более выраженное при концентрации сероводорода 30 мг/м3. Введение эритропоэтина способствовало ощелачиванию плазмы крови, хотя значения рН не возвращались к контрольным.

7. Хроническое воздействие серосодержащим газом с концентрацией сероводорода Змг/м3 не приводило к возникновению ультраструктурных изменений в пинеалоцитах и ганглионарных нейронах сетчатой оболочки глаза. Концентрация З0мг/м3 вызывала деструктивные изменения в пинеалоцитах и ганглионарных нейронах. Применение ЭПО не влияло на измененную, вследствие хронического токсического воздействия, структуру клеток эпифиза и сетчатой оболочки глаза.

Практические рекомендации.

1. Продемонстрированный в настоящем исследовании неблагоприятный эффект долговременного воздействия малых доз сероводородсодержащего газа на поведенческие реакции необходимо принимать во внимание при разработке нормативов предельно допустимых концентраций газа в производственных помещениях и санитарно-защитной зоне, прилегающей к газодобывающим и газоперерабатывающим предприятиям.

2. В комплекс мероприятий профилактических медицинских осмотров инженерно-технических работников газовой промышленности следует включать исследования степени окислительной модификации белков и липидов в плазме крови для определения степени структурных и функциональных изменений со стороны нервной системы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Горшков Д.А. Влияние эритропоэтина на психомоторную активность / А.К. Андреева, Д.Ш. Дубина, Б.В. Фельдман, Д.А. Горшков, А.Х. Галимзянова // Естественные науки*. - 2009. - №4(29). - С. 87-88.

2. Горшков Д.А. К оценке изучения анксиолитической и антидепрессивной активности препарата эритропоэтина / А.К. Андреева, Д.Ш. Дубина, Д.А. Горшков // Материалы VIII Межрегион, научно-практ. конф. «Лекарство и здоровье человека». - Астрахань, 2009. - С.7-9.

3. Горшков Д.А. Риск парентеральных инфекций у медицинских работников диализных отделений. Можем ли мы его уменьшить? Фармакоэпидемиологический анализ эритропоэтинов / А.Х. Галимзянова, И.В. Кладова, Д.Ш. Дубина, В.Н. Кивва, А.Х. Ахминеева, Д.А. Горшков, А.К. Андреева, Г.Р. Рахматуллина // Астраханский медицинский журнал*. - 2010. -№1. - С.105-113.

4. Горшков Д.А. Токсическое влияние сероводорода на ультраструктуру и белковый метаболизм нейронов сетчатой оболочки глаза млекопитающих / Д.А. Горшков // Вестник Росс. гос. мед. универ*. - 2010. - Спец. выпуск №2. - С. 476477.

5. Горшков Д.А. Влияние рекомбинантного препарата эритропоэтина на когнитивные функции / Д.А. Горшков, Д.Ш. Дубина, Б.В. Фельдман // Сб.материалов X Всеросс. университетской научно-прак. конф. молодых ученых по медицине.-Тула, 2011. -С.29-30.

6. Горшков Д.А. Изучение влияния различных концентраций серосодержащих поллютантов на некоторые психоэмоциональные характеристики / Д.А. Горшков // Вестник Росс. гос. мед. универ*. - 2011. Спец.

выпуск №1. - С.181.

7. Горшков Д.А. Особенности процессов липопероксидации при действии природного газа в сочетании с эритропоэтином / Д.А. Горшков // Сб. материалов конф. «Актуальные опросы современной медицины». Труды астраханской государственной мед. академии. - 2011. - Том 42. - С.63.

* - отмечены публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ АГКМ - АСТРАХАНСКОЕ ГАЗОКОНДЕНСАТНОЕ МЕСТОРОЖДЕНИЕ АОС - АНТИОКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА ПКЛ - ПРИПОДНЯТЫЙ КРЕСТООБРАЗНЫЙ ЛАБИРИНТ ПОЛ - ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ ПОБ — ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ БЕЛКОВ ЦНС - ЦЕНТРАЛЬНАЯ НЕРВНАЯ СИСТЕМА ЭПО - ЭРИТРОПОЭТИН ЭПО-Р - РЕЦЕПТОР К ЭРИТРОПОЭТИНУ ТБК -ТИОБАРБИТУРОВАЯ КИСЛОТА

ГОРШКОВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА НА ПРОЦЕССЫ АДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано к печати 24.05.2012. Тираж 100 экз. Заказ № 3235.

Отпечатано в типографии ГБОУ ВПО АГМА Минздравсоцразвития РФ 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121.