Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние эритропоэтина на поведение и гомеостаз белых крыс в норме и при стрессогенных воздействиях

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние эритропоэтина на поведение и гомеостаз белых крыс в норме и при стрессогенных воздействиях"

005044283

На правах рукописи

Андреева Анна Константиновна

ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА НА ПОВЕДЕНИЕ И ГОМЕОСТАЗ БЕЛЫХ КРЫС В НОРМЕ И ПРЙ СТРЕССОГЕННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 МАЙ 2012

Астрахань - 2012

005044283

Работа выполнена на кафедре фармакологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: Дубина Диляра Шагидуллаевна

доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой фармакологии ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

Научный консультант: Фельдман Бронислав Владимирович

доктор биологических наук, доцент, заведующий кафедрой ботаники, фармакогнозии и фармтехнологии ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России

Официальные оппоненты: Котельников Андрей Вячеславович

доктор биологических наук, доцент, профессор кафедры гидробиологии и общей экологии ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный технический университет»; Лазько Марина Владимировна доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой зооинженерии и морфологии животных ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет»

Ведущая организация: Южный научный центр Российской академии

наук. Институт аридных зон, г. Ростов-на-Дону

Защита диссертации состоится «29» мая 2012 года в 10.00 часов на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1, ауд. 101.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета.

«г/сР

Автореферат разослан «¿¿сР » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Ю.В. Нестеров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Многочисленными исследованиями было установлено, что различные виды анемий, возникающие как осложнение заболеваний, обусловлены изменением уровня в организме эндогенного цитокина - эритропоэтина, являющегося гемопоэтиче-ским гормоном, ответственным за пролиферацию, дифференциацию и угнетение апоптоза в чувствительных к нему клетках кроветворной ткани (Жетишев P.A., 2000; Павлов А.Д. и др., 2001; Зак К.П. и др., 2002). Чувствительность соматических клеток к эритропоэтину связана с наличием на их мембранах специфических рецепторных белков. Продукция эритропоэтина у человека осуществляется главным образом перитубулярными и тубулярными клетками почек (Yang C.W. et al., 2003; Vesey D.A. et al., 2004). Однако 10-15% эритропоэтина плазмы крови имеет внепочечное происхождение (Erslev A.J. et al., 1989).

В работах последних лет появились данные о синтезе эритропоэтина и экспрессии эритропоэтиновых рецепторов эпоцитами (Зак К.П., 2002), гепатоцитами, окружающими венозные сосуды печени, печеночными макрофагами, ядросодержащими эритроидными клетками костного мозга (Bauer С., 1995), клетками центральной нервной системы (Элмах-ди X., 2010; Chikuma М. et al., 2000), в тканях женской репродуктивной системы (молочные железы, матка), плаценте, эмбриональных тканях (Бурлев В.А. и др., 2001; Демихов В.Г. и др., 2002). При этом активация функции клеток вызывает усиление продукции эритропоэтина и экспрессии его информационной РНК. Действие эритропоэтина на эритропо-этин-чувствительные ткани, как кроветворную, так и некроветворные, проявляется активацией в них антиапоптозных программ и процессов клеточной пролиферации (Захаров Ю.М., 2007; Goodnough, L.T. et al., 2000).

Долгое время вид заместительной терапии не мог быть осуществлен, так как отсутствовала доступная лекарственная форма эритропоэтина. Относительно недавно, благодаря развитию ДНК-технологии стало возможным в неограниченных количествах производство синтетических рекомбинантных препаратов эритропоэтина для широкого применения в клинической практике (Морщакова Е.Ф., 2007). Наиболее часто в качестве заместительной антианемической терапии применяют эритропоэтин - альфа.

Известно, что помимо стимуляции процесса эритропоэза эритропоэтин обладает некроветворной функцией, выраженность которой обусловлена именно воздействием на головной мозг (Захаров Ю.М., 2007; Melli G. et al., 2006). В литературе имеются данные, что после введения эритропоэтина улучшаются процессы восприятия информации, способность к запоминанию, повышается интеллект и внимание. Кроме того, терапия эритропо-этином положительно воздействовала не только при вторичных энцефалопатиях, возникающих как осложнение различных заболеваний (Ehrenreich Н., Siren A-L., 2001), но и при первичных заболеваниях нервной системы, а именно при паркинсонизме, боковом амио-трофическом склерозе и ряде других (Gimenez L.F., Scheel P.J., 1994).

Однако в современной научной литературе практически отсутствуют или существуют противоречивые сведения, сам ли эритропоэтин улучшает когнитивные способности, либо это происходит на фоне лечения анемий. Поэтому вопрос, каким образом эритропоэтин влияет на нервную систему, принимая во внимание широту применения и значимость данного препарата, остается открытым, перспективным и актуальным.

Цель исследования: оценить влияние эритропоэтина на поведение и гомеостаз белых крыс в норме и при различных видах стресса.

Задачи исследования:

1. С применением стандартных тестов (ОП, УРПИ, ТЭИ, ПКЛ, ТПП) провести сравнительное изучение поведенческих реакций у животных, получавших эритропоэтин в норме и при различных видах стресса.

2. Определить дозу (1000 ЕД/кг и 2ООО ЕД/кг), оказывающую наиболее выраженное влияние на поведение белых крыс.

3. Провести сравнительное изучение влияния эритропоэтина и нейромодулирующих средств на обучение и память (пирацетам), уровень эмоционального реагирования (диа-зепам) и состояние уровня поведенческой депрессии (мелипрамин).

4. Изучить показатели форменных элементов крови и коагуляционного звена гемостаза у животных после введения эритропоэтина в различных дозах.

Научная новизна. Впервые изучено влияние эритропоэтина на поведение белых крыс в норме и при различных видах стресса. Выявлено, что эритропоэтин оказывает выраженное влияние на обучение, память, двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность, обладает противотревожным и слабым антидепрессивным эффектами. Впервые проведена сравнительная оценка изменения поведенческих реакций на фоне введения эритропоэтина и нейромодулирующих средств (пирацетама, диазепама, мелипрамина), влияющих на память, мышление, уровень эмоционального и депрессивного реагирования. Впервые определена эффективная доза эритропоэтина, оказывающая наиболее выраженное влияние на поведенческие реакции. В результате осуществленного корреляционного анализа была выявлена взаимосвязь между показателями эффектов на фоне введения эритропоэтина.

Теоретическое и практическое значение работы. Работа утверждена на заседании Ученого совета Астраханской государственной медицинской академии (Протокол №17 от 28 мая 2009 года).

В диссертации показано влияние эритропоэтина на поведение и гомеостаз белых крыс в норме и при стрессогенных воздействиях. Полученные данные указывают на перспективность дальнейшего исследования эритропоэтина, обладающего выраженным противотревожным, стимулирующим, слабым антидепрессивным эффектами, выраженным влиянием на обучение и память в физиологических тестах. Теоретически и практически важными являются полученные в работе факты, указывающие на то, что эффекты эритропоэтина коррелируют с дозой.

Положения о влиянии эритропоэтина на поведенческие реакции являются теоретической основой для дальнейшего углубленного изучения. Это имеет немаловажное значение для фундаментальной физиологии и практической медицины.

Материалы диссертации включены в курсы лекций по нормальной физиологии, патологической физиологии и фармакологии Астраханской государственной медицинской академии и Астраханского государственного университета. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эритропоэтин, наряду с антианемическими свойствами, оказывает выраженное действие на обучение и память, двигательную активность и уровень эмоционального реагирования в поведенческих тестах ОП, УРПИ, ТЭИ, ПКЛ.

2. По уровню влияния на обучаемость и память эритропоэтин превосходит «эталонный» препарат сравнения - пирацетам, а по выраженности эмоционального реагирования -диазепам.

3. Эритропоэтин в тесте принудительного плавания по Порсолту и тесте экстраполяци-онного избавления (ТЭИ) обладает слабо выраженным антидепрессивным эффектом. По активности данного эффекта уступает препарату мелипрамин.

4. Эритропоэтин в дозе 2000 ЕД/кг оказывает наиболее выраженное влияние на поведение белых крыс.

5. Внутрибрюшинное введение эритропоэтина в дозах 1000 ЕД/кг и 2000 ЕД/кг не изменяет показатели форменных элементов крови и коагуляционного звена системы гемостаза.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 12 печатных научных работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Основные результаты диссертационного исследования доложены и обсуждены на: VIII Астраханской межрегиональной научно-практической конференции «Лекарство и здоровье человека», Астрахань, 2009; 86-й итоговой научно - практической конференции сотрудников академии, врачей города и области «Актуальные вопросы современной медицины», Астрахань, 2009; III Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009», посвященном 160-летию академика И.П. Павлова, Санкт-Петербург, 2009; XI Международной конференции «Актуальные проблемы современной науки», Самара, 2010; V Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Клязьма, 2010; V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва, 2010; 88-й итоговой научно-практической конференции сотрудников академии, врачей города и области «Актуальные вопросы современной медицины», Астрахань, 2011. Положения диссертации были доложены на расширенном межкафедральном заседании при Астраханской государственной медицинской академии.

Структура и объем диссертации. Диссертация написана по классическому типу и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, глава материалов и методов исследования, 3 главы результатов собственных исследований и их обсуждения, научно-практические рекомендации, выводы, 4 приложения. Материал диссертации изложен на 160 страницах компьютерного текста, иллюстрирован 18 таблицами и 44 рисунками. Список литературы содержит 257 источников, из них 91 - отечественных и 166 - зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 600 белых беспородных крысах - самцах массой 180-220 г, из которых гематологические исследования проведены на 30. Все животные содержались в стандартных условиях вивария с естественным световым режимом на полнорационной сбалансированной диете (ГОСТ Р 50258-92) и свободным доступом к воде и пище. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 351000.3-96 и 51000.4-96) и Приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997г.).

Настоящее исследование одобрено локальным этическим комитетом, протокол заключения № 4 от 21.10.2009г.

В настоящем исследовании изучено влияние эритропоэтина на поведение и гомеостаз белых крыс в норме и при стрессогенных воздействиях в дозах 1000 ЕД/кг и 2000 ЕД/кг (Воронина Т.А. и др., 2000; Румянцев А.Г. и др., 2003), который вводился за 18 часов до эксперимента. В качестве сравнения было выбрано нейромодулирующее средство пираце-там, оказывающее положительное влияние на обучение и память в дозе 200 мг/кг за 30 минут до проведения экспериментов. Контрольные группы животных были интактными. Для определения эмоционального состояния животных использовался диазепам 1 мг/кг, а ме-липрамин 16 мг/кг вводился для изучения состояния депрессивности за 1 час до экспериментов. Все вещества вводились однократно внутрибрюшинно.

В работе использовались стандартные методические подходы, соответствующие изложенным в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых веществ» - Фармакологический государственный комитет, МЗ РФ, Москва, 2005.

Изучение влияния эритропоэтина на поведение животных проводилось с помощью следующих физиологических тестов:

1.Тест «открытое поле» (ОП) (Буреш Я. с соавт., 1991; Hall C.S., 1936) позволяет оценить изменения в поведении, двигательной и ориентировочно - исследовательской активности, а также уровень эмоционального реагирования животных (Кременевская С.И. и др., 1991; Калуев A.B., Макарчук Н.Е., 2000; Козловский В.Л. и др., 2008).

2.Тест «условная реакция пассивного избегания» (УРПИ) (Буреш Я. с соавт., 1991; Воронина Т.А., Островская Р.У.,2000) основан на защитно - оборонительной реакции пассивного типа, направленной на прекращение контакта с вредящим агентом. Тест позволяет оценить влияние различных веществ на способность к обучению, формированию, сохранению и воспроизведению памятного следа через различные интервалы времени (Арушанян Э.Б., 2005).

3.Тест «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) (Калуев A.B., 1999; Pellow S et al., 1985) дает возможность оценить степень выраженности эмоциональной реакции страха и тревоги, двигательную активность, скорость ориентировочных реакций (Воронина Т.А., Островская Р.У., 2000).

4.Тест «экстраполяционного избавления» (ТЭИ) (Воронина Т.А., 2000; Арушанян Э.Б., 2003) является комплексной экспериментальной моделью для оценки когнитивных функций: обучаемости и памяти, а также поведенческого типа эмоционально - стрессовой реакции. В основе теста лежит постановка перед животным экстраполяционной задачи, решение которой зависит от способности строить план поведения, предвидеть результат поведенческих реакций в новых условиях (Буреш Я. с соавт., 1991). Кроме того тест дает возможность оценить степень выраженности у животных поведенческой депрессии (Андреева Н.И., 2005; Козловский В.Л. и др., 2008).

5.Тест принудительного плавания по Порсолту (ТПП) (Андреева Н.И., 2000; Porsolt et al., 1979) позволяет оценить изменения двигательной активности животных, указывающих на выраженность депрессивного компонента в поведении.

До проведения воздействия стрессирующего фактора у всех экспериментальных и контрольной групп животных, а также через 1, 7, 14 и 30 суток эксперимента производился забор крови из хвостовой вены. В крови определяли показатели системы эритрона: количество эритроцитов, лейкоцитов, содержание гемоглобина, гематокрита, вычисляли среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците, СОЭ, а также подсчитывали лейкоцитарную формулу согласно методам, описанным В.В. Меньшиковым с соавт. (1987). Подсчет форменных элементов крови производился в камере Горяева.

Для подсчета количества эритроцитов применялся 3,5% раствор NaCl, количества лейкоцитов - 3% раствор уксусной кислоты. Уровень гемоглобина (НЬ) определялся с помощью стандартного набора гемоглобинцианидным методом на фотоэлектроколориметре «КФК-3». Величина гематокрита (Ht) определялась по унифицированному методу по от-счетной шкале с помощью микроцентрифуги МГЦ-8. Повторно показатели периферической крови оценивали через 1,7, 14 и 30 суток эксперимента.

Для оценки состояния коагуляционного звена системы гемостаза использовали следующие общепринятые тесты: протромбиновое время (ПВ) и протромбиновый индекс (ПТИ) (Меньшиков В.В. с соавт., 1987). Контрольных и опытных животных умерщвляли путем одномоментного декапитирования на фоне внутрибрюшинного введения этаминала натрия в дозе 50 мг/кг. Протромбиновое время определялось в термостате с прозрачными стенками ТПС «АМТЕО» с помощью стандартного набора (набор тромбопластина с кальцием - НПО «РЕНАМ»), Исследование повторяли и вычисляли средний результат. При этом значение протромбинового времени рассчитывалось по формуле:

ПВ100% = ПВк/ПОк,

где ПВк - протромбиновое время контрольной плазмы; ПОк - протромбиновое отношение контрольной плазмы.

Протромбиновый индекс рассчитывали по формуле:

ПТИ= ПВюогУПВб х 100%, где ПВ100% - протромбиновое время 100%-го свежего пула донорской плазмы в секундах; ПВб- протромбиновое время плазмы в секундах.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась методами описательной статистики, сравнения зависимых и независимых выборок с помощью t- критерия и корреляционного анализа (коэффициент корреляции Пирсона). Для оценки нормальности эмпирических распределений использовался критерий Колмогорова-Смирнова. Обработка данных проводилась с использованием программы STATISTICA, версия 6.0 (StatSoft, Inc. (2001), www. statsoft. com). Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Данные о влиянии эритропоэтина на двигательную, ориентировочно-исследовательскую и эмоциональную активность животных представлены в табл. 1.

Следует отметить, что в опытных группах после введения эритропоэтина в дозах 1000 ЕД/кг и 2000 ЕД/кг достоверно повышалась ориентировочно-исследовательская и двигательная активность по количеству пересеченных квадратов, стоек с опорой и заглядываний в отверстия. Кроме того, повышалось количество стоек без опоры, заходов в центральную зону ОП, уменьшалось число актов груминга и фекальных болюсов - проявлялся противо-тревожный эффект. Результаты теста ОП позволяют сделать выводы о наличии стимулирующего и противотревожного эффектов при введении эритропоэтина в различных дозах по сравнению с группами контроля и пирацетама. По выраженности данных эффектов эри-тропоэтин превосходил нейромодулирующее средство пирацетам. Введение эритропоэтина в дозе 2000 ЕД/кг оказывало более выраженное влияние на поведение животных.

Таблица 1

Значение показателей поведения и уровня тревожности животных в тесте открытого поля после введения эритропоэтина и пирацетама (п = 30, М±т, при ___р<0,05) __

Показатели Контроль Пирацетам 200мг/кг ЭПО ЮООЕД/кг ЭПО 2000ЕД/кг

Кв 14,0±1,75 13,7±2,42 25,2±2,50 26,5±4,19

СО 5,9±0,96 4,7±0,93 5,5±0,85 7,1±0,69

СБ 1,5±0,48 2,4±0,54 5,4±0,75 6,6±1,06

ЗО 3,8±0,76 5,6±0,54 7,1±1,Ю 12,4±2,01

гР 1,1±0,23 2,0±0,26 0,9±0,23 0,9±0,35

д 1,6±0,27 1,1±0,28 0,9±0,23 0,6±0,22

м 1,0±0,26 0,6±0,16 0,6±0,22 0,2±0,13

ц 1,1±0,23 3,0±0,65 4,0±0,98 8,4±1,02

Обозначения: ЭПО - эритропоэтин, Кв - пересеченные квадраты, СО - вертикальные стойки с опорой, СБ - вертикальные стойки без опоры, ЗО - заглядывания в отверстия, Гр - акты груминга, Д- акты дефекаций. М- акты мочеиспусканий, Ц- количество заходов в центральную зону.

Поиск корреляционных связей между количеством пересеченных квадратов и заходов в центральную зону ОП выявил умеренную прямую положительную зависимость между введением пирацетама г = 0,57 (р<0,05) и эритропоэтина в дозе 2000 ЕД/кг г = 0,74 (р<0,05), что указывает на наличие у них стимулирующего эффекта.

Нами установлена прямая положительная связь между показателями количества актов груминга и заходов в центр ОП в контрольной группе - г = 0,59 (р<0,05). Однако после введения эритропоэтина 2000 ЕД/кг выявлена обратная зависимость г = -0,64 (р<0,05). Данный факт свидетельствует о том, что после введения эритропоэтина у животных наблюдается эмоциональный комфорт, характеризующий противотревожную активность, при этом контрольные животные находились в состоянии стресса.

Результаты теста «приподнятый крестообразный лабиринт» подтвердили наличие у эритропоэтина противотревожного эффекта, поскольку достоверно увеличивалось количество выходов и продолжительность времени, проводимого животными в открытых рукавах лабиринта, а также количество стоек и свешиваний с края рукавов по сравнению с одноименным показателем животных в контрольной группе в 2 раза. Кроме того, количество выходов животных в открытые рукава лабиринта и общее число переходов между ними (суммарная двигательная активность) после введения эритропоэтина в различных дозах превышали данные показатели контрольной группы в 2 раза, что согласуется с результатами теста открытого поля и подтвердили выявленное стимулирующее влияние данного ци-токина на двигательную активность животных. По выраженности противотревожного эффекта эритропоэтин превосходил нейромодулирующее средство диазепам. В дозе 2000 ЕД/кг наблюдался более выраженный эффект (табл. 2).

Таблица 2

Значение показателей повеления животных в тесте ПКЛ после введения _ эритропозтина и диазепама (п = 30, М±т, при р<0,05)_

Показатели Контроль Диазепам 1мг/кг ЭПО ЮООЕД/кг ЭПО 2000ЕД/кг

Всо 24,3±6,51 44,5±10,89 46,3±9,36 48,5±6,91

КЗсо 1,1 ±0,23 2,0±0,33 2,2±0,25 2,5±0,43

Вто 154,9±9,81 118,2±13,25 122,2±10,19 12б,5±9,46

КЗто 1,8±0,20 2,2±0,53 2,3±0,26 2,4±0,43

Вцз 6,5±3,81 17,3±5,64 15,5±4,77 12,5±2,71

КЗцз 1,0±0,26 1,8±0,51 2,0±0,30 2,4±0,62

КСсо 0±0 1,1±0,41 2,2±0,13 2,3±0,79

КСто 6,5±0,70 3,5±0,73 4,3±0,75 4,2±0,39

ЧС 0,2±0,13 0,7±0,21 , 1,2±0,42 2,2±0,49

Обозначения: ЭПО - эритропоэтин, Всо,то,цз - время в светлом, темном отсеке и центральной зоне; КЗсо, то,г/з - количество заходов в светлый, темный отсек и центральную зону; КСсо,то — количество стоек в светлом и темном отсеке; ЧС - число свешиваний с края открытых рукавов.

Была установлена умеренная статистическая взаимосвязь времени пребывания в открытых рукавах ПКЛ и показателя числа свешиваний в группе, получавших диазепам г = 0,47 (р<0,05) и выраженная прямая корреляционная связь в группе эритропозтина 2000 ЕД/кг г = 0,86 (р<0,05). Это доказывает, что после введения эритропозтина у животных происходит снижение уровня тревожности и фобических реакций (страха высоты и авер-сивного ярко освещенного пространства открытых рукавов), который наблюдается в группе позитивного контроля.

Статистически значимая прямая положительная связь была установлена между количеством заходов в закрытые рукава ПКЛ и стоек в них у животных группы эритропозтина 2000 ЕД/кг г = 0,55 (р<0,05) и обратная взаимосвязь после введения диазепама г = - 0,57 (р<0,05), что свидетельствует о повышении двигательной и ориентировочно-исследовательской активности в группе животных, получавших эритропоэтин.

Осуществляя сравнительный анализ в тесте условной реакции пассивного избегания у животных, получавших перед обучением эритропоэтин в дозах 1000 ЕД/кг и 2000 ЕД/кг, нами было выявлено, что латентный период первого захода в темный отсек был достоверно больше, а количество заходов - меньше, чем у животных контрольной группы на всех этапах воспроизведения (через 1, 7, 14, 30 суток после обучения), что говорит о положительном влиянии эритропозтина в различных дозах на обучаемость и память. Эритропоэтин достоверно превосходил по выраженности эффекта нейромодулирующее средство пирацетам. В дозе 2000 ЕД/кг наблюдался более выраженный эффект эритропозтина (табл. 3).

Таблица 3

Значение показателей обучаемости животных в тесте УРПИ после введения эритропоэтина и пираиетама (п = 30, М±т, при р<0,05)_

Группы ЛП Вто Всо КЗ

Обучение

Контроль 25,5±3,37 5,4±0,79 149,1±3,26 1,0±0

Пирацетам 200мг/кг 26,0±6,09 3,4±0,4 150,6±6,02 1,0±0

ЭПО 1000 ЕД/кг 33,5±10,36 4,0±0,58 142,5±10,24 1,0±0

ЭПО 2000 ЕД/кг 70,5±18,23 4,6±0,70 104,9±18,04 1,0±0

Воспроизведение через 1 сутки

Контроль 3,0±2,33 15,8±15,25 161,2±15,93 0,2±0,13

Пирацетам 200мг/кг 0±0 0±0 180,0±0 0±0

ЭПО 1000 ЕД/кг 0±0 0±0 180,0±0 0±0

ЭПО 2000 ЕД/кг 0±0 0±0 180,0±0 0±0

Воспроизведение через 7 суток

Контроль 5,0±3,33 12,4±11,96 163,1±14,43 0,2±0,13

Пирацетам 200мг/кг 0±0 0±0 180,0±0 0±0

ЭПО 1000 ЕД/кг 0±0 0±0 180,0±0 0±0

ЭПО 2000 ЕД/кг 0±0 0±0 180,0±0 0±0

Воспроизведение через 14 суток

Контроль 5,5±2,41 4,0±1,80 170,5±4,04 0,4±0,16

Пирацетам 200мг/кг 1,5±1,07 1,2±1,0 177,3±2,04 0,2±0,13

ЭПО 1000 ЕД/кг 0±0 0±0 180,0±0 0±0

ЭПО 2000 ЕД/кг 0±0 0±0 180,0±0 0±0

Воспроизведение через S0 суток

Контроль 10,0±6,28 1,5±0,67 168,5±6,78 0,4±0,16

Пирацетам 200мг/кг 3,0±2,13 3,5±2,99 173,5±5,06 0,2±0,13

ЭПО 1000 ЕД/кг 1,5±1,5 0,5±0,5 178,0±2,00 0,1 ±0,1

ЭПО 2000 ЕД/кг 0±0 0±0 180,0±0 0±0

Обозначения: ЭПО - эритропоэтин, ЛП - латентный период первого захода в темный отсек,

Вто - время в темном отсеке, Всо - время в светлом отсеке, КЗ - количество заходов в темный

отсек.

В тесте «экстраполяционного избавления» в группах животных, получавших эритро-поэтин в дозах 1000 ЕД/кг и 2000 ЕД/кг, скорость решения экстраполяционной задачи (латентный период подныривания) в период обучения превосходила одноименный показатель контрольной группы, что говорит о положительном влиянии на обучаемость и память, характеризующих состояние когнитивной функции. Уменьшение данного показателя при воспроизведении через 1 сутки после обучения отмечалось во всех опытных группах, однако в 3 раза по отношению к контролю оно было у животных, получавших эритропоэтин в дозе 1000 ЕД/кг (рис. 1), что подтверждает наличие данного эффекта, который у эритропоэтина выражен в большей степени, чем у нейромодулирующего средства пирацетама.

г«7ПТЭИ»У* ?«Г7ЛТЭИ!

24ППТЭИ» 24Г11ТЭИ1

а б

Рис. 1. Значение показателей латентного периода подныривания у животных на этапе воспроизведения в ТЭИ после введения эритропоэтина, по горизонтали - показатели теста, по вертикали - значения показателей, сек. Обозначения: а) в дозе 1000 ЕД/кг, б) в дозе 2000 ЕД/кг.

Необходимо отметить, что латентный период двигательной активности в группах животных, получавших эритропоэтин в различных дозах, на этапе обучения навыку избавления был меньше показателя контрольной группы. На этапе воспроизведения через 1 сутки после обучения в группе, получавших эритропоэтин в дозе 1000 ЕД/кг, наблюдалось увеличение одноименного показателя и уменьшение в опытной группе эритропоэтина 2000 ЕД/кг по сравнению с показателем группы контроля, что является критерием их обученно-сти рефлексу избавления из аверсивной ситуации.

Под влиянием однократного введения эритропоэтина время иммобилизации (поведенческий коррелят депрессии) на различных этапах исследования достоверно увеличивалось, а количество прыжков (активных попыток избежать угрожающей ситуации) на этапе обучения не изменялось. На этапе воспроизведения количество прыжков в группе эритропоэтина 1000 ЕД/кг уменьшалось, а в дозе 2000 ЕД/кг возрастало по сравнению с показателями животных группы контроля, что говорит о наличии слабого антидепрессивного эффекта у эритропоэтина и требует дальнейшего изучения в более специфическом тесте. В дозе 2000 ЕД/кг эритропоэтин оказывал более выраженный эффект (табл. 4).

Таблица 4

Значение показателей поведения животных после введения эритропоэтина и пираце-

тама на различных этапах исследования в ТЭИ (п = 30, М±т, при р<0,05)

Группы ДА КП ВИ ПП

Обучение

Контроль 153,7±3,25 4,3±0,86 2,8±1,17 23,5±3,08

Пирацетам 200мг/кг 153,7±5,97 4,3±0,76 3,0±1,12 27,5±8,84

ЭПОЮОО ЕД/кг 144,5±8,71 4,3±0,86 3,0±1,12 32,5±8,67

ЭП02000 ЕД/кг 140,8±5,99 4,4±0,87 14,5±2,29 24,7±6,00

Воспроизведение через 1 сутки

Контроль 160,1±2,14 2,4±0,43 2,2±0,87 17,7±2,07

Пирацетам 200мг/кг 162,3±5,61 1,4±0,37 2,2±0,87 15,5±5,26

ЭПОЮОО ЕД/кг 170,8±1,32 1,8±0,39 2,9±0,57 6,3±1,07

ЭПОЮОО ЕД/кг 153,0±2,40 3,8±0,74 16,5±1,07 10,5±1,97

Обозначения: ЭПО - эритропоэтин: ДА - латентный период двигательной активности: КП -

количество прыжков: ВИ- время иммобилизации: ПП- время подныривания.

Была выявлена сильная положительная корреляционная связь между латентным периодом подныривания при обучении и воспроизведении в группе контроля и пирацетама г = 0,92 (р<0,05). После введения эритропоэтина 2000 ЕД/кг связь ослабевала г = 0,56 (р<0,05). Это свидетельствует о том, что на фоне введения эритропоэтина у животных увеличивается скорость ориентировочнь" реакций и они быстрее избегают аверсивной ситуации.

Нами установлена прямая положительная взаимосвязь времени иммобилизации при обучении и воспроизведении в группе контроля г = 0,64 (р<0,05) и обратная корреляционная связь в группе введенного эритропоэтина 1000 ЕД/кг. Данный факт указывает на наличие слабого антидепрессивного эффекта у эритропоэтина.

В тесте принудительного плавания по Порсолту в опытных группах эритропоэтина у животных достоверно снижался латентный период активного плавания и увеличивалось время иммобилизации, что согласуется с результатами ТЭИ и подтверждает наличие слабого антидепрессивного эффекта. В дозе 2000 ЕД/кг эритропоэтин оказывал ярко выраженное действие (рис. 2).

в г

Рис 2. Значение показателей поведенческой депрессии у животных после введения эритропоэтина в тесте принудительного плавания по Порсолту, по горизонтали - показатели теста, по вертикали - значения показателей, сек.

Обозначения: а) латентный период активного плавания после введения эритропоэтина в дозе 1000 ЕД/кг, б) латентный период активного плавания после введения эритропоэтина в дозе 2000 ЕД/кг, в) время иммобилизации после введения эритропоэтина в дозе 1000 ЕД/кг, г) время иммобилизации после введения эритропоэтина в дозе 2000 ЕД/кг.

Таблица 5

Значение показателей поведения жнвотных в тесте по Порсолту после введения _эрнтропоэтина и мелипрамина (п ~ 30, М±ш, при р<0,05)_

Группы ВИ ЛП

Мелипрамин 16 мг/кг 3,3±0,47 176,7±0,47

ЭПО 1000 ЕД/кг 16,0±1,25 164,0±1,25

ЭПО 2000 ЕД/кг 24,0±2,45 156,0±2,45

Обозначения: ЭПО - эритропоэтин, ВИ - время иммобилизации, ЛП - длительность активного плавания.

Нами была проведена попытка оптимизировать набор физиологических тестов для выявления влияния эритропоэтина на поведенческие реакции. Для выявления степени обученное™ и памяти пригодными считаются тесты экстраполяциоиного избавления и условной реакции пассивного избегания, для выявления стимулирующего и противотревожного эффектов - тесты открытого поля и приподнятого крестообразного лабиринта.

В плане комплексного исследования эффектов эритропоэтина интерес представляло изучение гематологического характера цитокина. В группе животных введение эритропоэтина в дозе 1000 ЕД/кг оказывало разнонаправленное действие на показатели гемоглобина и эритроцитов в динамике через 1,7, 14 и 30 суток после первоначального исследования. Уровень гематокрита в крови опытной группы животных в динамике не изменялся по сравнению с 30 днем исследования, когда наблюдалось повышение данного показателя (табл. 6).

Таблица б

Значение гематологических показателей группы животных, получавших эритропоэтин в дозе 1000 ЕД/кг в динамике (п = 10, М±ш, при р<0,05)_

Группа Значения показателей

Hb RBCxlO" Ht

Контроль 148±2 5,08х10и±0,1хЮ" 44±1

ЭПО 1000 ЕД/кг через ¡8 часов

146±3 | 4,79х1012±0,2х1012 | 44±1

Воспроизведение через 1 сутки

147±4 1 4,89х10"±0,01х101'! | 44±1

Воспроизведение через 7 суток

14б±4 | 4,58х10и±0,2х10и | 44±1

Воспроизведение через 14 суток

153±4 | 5,08x10*^0,1x10" | 46±1

Воспроизведение через 30 суток

164±2 | 5,96x10^0,ОбхЮ12 | 49±1

Обозначения: ЭПО - эритропоэтин, Hb — гемоглобин г/л; RBC - эритроциты, хі&^/л; Ht — гематокрит.

Необходимо отметить, что в опытной группе животных, получавших эритропоэтин в дозе 1000 ЕД/кг, динамика содержания в крови лейкоцитов, палочкоядерных и сегментоя-дерных нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов, лимфоцитов не изменялась как на всех этапах исследования, так и по сравнению с показателями крови животных группы контроля (табл. 7).

Таблица 7

Значение показателей лейкоцитарной формулы группы животных, получавших эри_тропоэтин в дозе 1000 ЕД/кг в динамике (п = 10, М±ш, при р<0,05)_

Группа Значения показателей

\УВСх107л EOS NEUfn/я) NEU(c/h) LYM MON

Контроль 14,86x10^0,4x10'' 3±0,1 2±0,1 27±1 64±1 _, 4±1

ЭПО 1000 через 18 часов

ЕД/кг 15,02х10ч±0,7х109 3±1 2±0 22±1 70±2 4±1

Воспроизведение через 1 сутки

15,1x10^0,7x10" 2±0 3±1 22±1 67±1 4±1

Воспроизведение через 7 суток

14,1х109±0,6х101' 3±1 , 1±0 30±2 62±2 3±1

Воспроизведение через 14 суток

15,1х10"±0,6х10" 3±1 2±0 28±2 62±1 4±1

Воспроизведение через 30 суток

15,8х10"±0,4х109 4±0 2±0 28±1 64±1 3±0

Обозначения: ЭПО - эритропоэтин, WBC — лейкоциты, х109/л, EOS - эозинофилы, NEUfn/я) -палочкоядерные нейтрофилы, NEUfc/я) - сегментоядерные нейтрофилы, LYM - лимфоциты, MON - моноциты.

В группе животных, получавших эритропоэтин в дозе 2000 ЕД/кг уровень гемоглобина, эритроцитов и гематокрита повышался по сравнению с данными показателями животных контрольной группы. Аналогичные результаты крови получены и в динамике через 1, 7, 14 и 30 суток (табл. 8).

Таблица 8

Значение гематологических показателей группы животных, получавших

эритропоэтин в дозе 2000 ЕД/кг в динамике (п = 10, М±т)

Группа Значения показателей

НЬ RBCxlO12 Ht

Контроль 148±2 З.ОЗхЮ'^ЛхЮ12 44±1

ЭПО 2000 ЕД/кг через 18 часов

15б±2 | 5,38х10"±0,1х101/ | 47±0

Воспроизведение через 1 сутки

161±3 | 5,45х10"±0,2х10" | 48±1

Воспроизведение через 7 суток

158±3 | 5,81х10'^±0,1х10и | 47±1

Воспроизведение через 14 суток

162±1 | бЛЗхЮ'^ОДхЮ" | 49±0

Воспроизведение через 30 суток

174±2 | 6,77х10"±0,09х10|': | 52±0

Обозначения: ЭПО — эритропоэтин, НЬ - гемоглобин г/л: RBC- эритроциты, х10и/л; Ht - гематокрит.

Кроме того, в опытной группе животных с дозой 2000 ЕД/кг аналогичные данные динамики наблюдались между нейтрофилами, лейкоцитами, эозинофилами, моноцитами и лимфоцитами по сравнению с результатами контрольной и опытной группы эритропоэтина 1000 ЕД/кг (табл. 9).

Таблица 9

Значение показателей лейкоцитарной формулы группы животных, получавших эри_тропоэтин в дозе 2000 ЕД/кг в динамике (п = 10, М±ш, при р<0,05)_

Группа Значения показателей

\УВСх10"/л ЕОЭ NEU(n/a) 1 NEU(cAi) LYM MON

Контроль 14,86x10ч±0,4х 10у 3±0,1 2±0,1 1 27±1 64±1 4±1

ЭПО 2000 через 18 часов

ЕД/кг 14,6х10ч±0,5х10" 3±1 1±0 ] 25±2 67±2 4±1

Воспроизведение через 1 сутки

15,4x10^0,3x10" 3±0 2±0 1 23±2 69±2 4±1

Воспроизведение через 7 суток

16,1x10^0,6х10ч 4±1 2±0 1 27±1 62±1 г 5±1

Воспроизведение через 14 суток

16,4x10^0,4x10" 4±1 2±0 1 28±1 61±1 Г 5±1

Воспроизведение через 30 суток

17,0x10^0,4x10" 4±0 2±0 1 26±2 64±2 4±1

Обозначения: ЭПО - эритропоэтин, WBC - лейкоциты, xl<?/n, EOS - эозинофилы, NEUfn/я) -палочкоядерные нейтрофилы, МЕЩс/я) - сегментоядерные нейтрофшы, LYM - лимфоциты, MON - моноциты.

Нами была предпринята попытка сравнения доз эритропоэтина с целью выявления наилучшего гематологического эффекта. Было показано, что после введения эритропоэтина животным в дозе 2000 ЕД/кг наблюдалось достоверное увеличение количества гемоглобина, эритроцитов и гематокрита по сравнению с показателями группы эритропоэтина 1000 ЕД/кг (рис. 3).

Аналогичные данные были получены и при исследовании показателей крови через 30 суток после введения эритропоэтина в дозах 1000 ЕД/кг и 2000 ЕД/кг. Так, через 30 суток после введения эритропоэтина в дозе 2000 ЕД/кг наблюдалось увеличение не только показателей гемоглобина, эритроцитов, но и гематокрита по сравнению с одноименными показателями введенного цитокина в дозе 1000 ЕД/кг (рис. 4).

а б

Рис. 3. Значение показателей крови после введения эритропоэтина в дозах 1000 ЕД/кг и 2000 ЕД/кг, по горизонтали - показатели крови в группах, по вертикали - значения показателей крови. Обозначения: а) НЬ - гемоглобин, б) ЯВС - эритроциты.

а б

Рис. 4. Значение показателей периферической крови через 30 суток после введения эритропоэтина в дозах 1000 ЕД/кг и 2000 ЕД/кг, по горизонтали - показатели крови в группах, по вертикали - значения показателей крови. Обозначения: а) уровень гемоглобина, б) количество эритроцитов.

ПВ в опытных группах животных, получавших эритропоэтин в различных дозах, было в пределах физиологической нормы. На 7-е сутки ПТИ снижался, а к 14-м суткам наблюдалась тенденция к стабилизации этого показателя, тем самым свидетельствующая об отсутствии отрицательного действия на параметры коагуляционного звена гемостаза, что, очевидно, связано с физиологическими особенностями эритропоэтина (табл. 10).

Таблица 10

Результаты показателей коагуляционного звена системы гемостаза _у животных после введения эритропоэтина в динамике_

Группы ПВ, сек ПТИ, % ПВд, сек

Контроль 1 12,7 103 13,1

ЭПО ЮООЕД/кг через 7 суток

13,0 100 13,1

через 14 суток

12,6 103,9 13,1

Контроль 11 12,9 100,9 13,1

ЭПО 2000ЕД/кг через 7 суток

13,4 97,7 13,1

через 14 суток

12,8 102,3 13,1

Обозначения: ЭПО - эритропоэтин, ПВ.сек тромбиновый индекс, в процентах, ПВд.сек. - - протромбиновое время, в секундах, ПТИ, % - про-протромбиновое время донора, в секундах.

ВЫВОДЫ

1. Эритропоэтин оказывает влияние на процессы, протекающие в головном мозге -обучение и память, подтвержденные тестами УРПИ и ТЭИ, тревожность, двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность - тестами ОП и ПКЛ, степень депрессии - тестами ТЭИ и ТПП по Порсолту, как в норме, так и при различных видах стресса.

2. Эритропоэтин в дозе 2000 ЕД/кг оказывает более выраженное влияние на поведение белых крыс по сравнению с дозой 1000 ЕД/кг.

3. Эритропоэтин обладает более выраженным влиянием на обучение и память по сравнению с пирацетамом, а также более выраженным противотревожным эффектом по сравнению с диазепамом. По выраженности антидепрессивного эффекта уступает мелипрамину.

4. При введении эритропоэтина в дозах 1000 ЕД/кг и 2000 ЕД/кг количество форменных элементов крови и показатели коагуляционного звена гемостаза сохраняются в пределах нормальных физиологических значений.

5. Выявлена прямая положительная корреляционная связь между показателями стимулирующего, противотревожного эффектов, обучения, памяти, и обратная - между данными антидепрессивного эффекта на фоне введения эритропоэтина.

6. Оптимальными тестами для выявления влияния эритропоэтина на поведенческие реакции являются: открытое поле, тест экстраполяционного избавления, условная реакция пассивного избегания, приподнятый крестообразный лабиринт.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Андреева А.К. Влияние эритропоэтина на психомоторную активность / Д.Ш. Дубина, Б.В. Фельдман, Д.А. Горшков, А.Х. Галимзянова // Естественные науки. - 2009, №4 (29).-С. 87-88.

2. Андреева А.К. Оценка влияния препарата эритропоэтина на уровень тревожности и обучаемости экспериментальных животных // Материалы V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва, 2010. - С. 453-454,

3. Андреева А.К. Эритропоэтины-биологические эффекты и перспективы фармакологических исследований / А.Х. Галимзянова, Д.Ш. Дубина, А.К. Андреева // Естественные науки. - 2009, №3 (28). - С. 158-163.

4. Андреева А.К. Риск парентеральных инфекций у медицинских работников диализных отделений. Можем ли мы его уменьшить? Фармакоэпидемиологический анализ эритропоэтинов / А.Х. Галимзянова, И.В. Кладова, Д.Ш. Дубина, В.Н. Кивва, А.Х. Ахминеева, Д.А. Горшков, Г.Р. Рахматуллина, А.К. Андреева // Астраханский медицинский журнал. - 2010, №1. - С. 105-113.

5. Андреева А.К. Эритропоэтины: новые возможности с позиции доказательной медицины / И.В. Кладова, В.Н. Кивва, Д.Ш. Дубина, А.Х. Галимзянова, Г.Р. Рахматуллина, А.К. Андреева // Астраханский медицинский журнал. - 2009, №1. - С. 15-29.

6. Андреева А.К. Исследование ноотропной активности препарата эритропоэтина в аспекте «доза-эффект» // Тезисы докладов III международного молодежного медицинского конгресса «Санкт-Петербургские научные чтения». - Санкт-Петербург, 2009.

7. Андреева А.К. К оценке изучения анксиолитической и антидепрессивной активности препарата эритропоэтина / Д.Ш. Дубина, Д.А. Горшков // Материалы VII Астраханской межрегиональной научно-практической конференции «Лекарство и здоровье человека», Астрахань, 2009. - С. 7-9.

8. Андреева А.К. Ноотропная активность эритропоэтина-альфа / Д.Ш. Дубина // Труды Астраханской государственной медицинской академии. - Т. 40 (ЬХ1У). - Астрахань, 2009. - С. 76.

9. Андреева А.К. Психостимулирующая активность эритропоэтина и динамика изменения показателей крови / Д.Ш. Дубина // Материалы V Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Клязьма, 2010. - С. 19-20.

10. Андреева А.К. Изучение нейропротективных свойств эритропоэтина / Д.А. Горшков, Д.Ш. Дубина // Труды Астраханской государственной медицинской академии. - Т. 41 (ЬХУ). - Астрахань, 2010. - С. 108-109.

11. Андреева А.К. Использование грызунов в практике лабораторных экологических исследований / С.Н. Егоров // Труды XI Международной конференции «Актуальные проблемы современной науки». - Ч. 14. - Самара, 2010. - С. 7-9.

12. Андреева А.К. Влияние эритропоэтина - альфа в различных дозах на показатели крови млекопитающих / Д.Ш. Дубина // Труды Астраханской государственной медицинской академии. - Т. 42 (ЬХУ1). - Астрахань, 2011. - С. 62.

- С. 299.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОП

пкл

ТЭИ

тпп

УРПИ

пв пти нь Ні

открытое поле

приподнятый крестообразный лабиринт

тест экстраполяционного избавления

тест принудительного плавания по Порсолту

условная реакция пассивного избегания

протромбиновое время

протромбиновый индекс

гемоглобин

гематокрит

Подписано в печать 20.04.2012 Заказ № 2690. Тираж 100 экз. Уч.-изд.-л. 1,2. Усл.-печ. л. 1,0.

Издательский дом «Астраханский университет»

414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 20а Тел. (8512) 48-53-47 (отдел маркетинга), 48-53-45, 48-53-44, факс: (8512) 48-53-46. E-mail: asupress@yandex.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Андреева, Анна Константиновна, Астрахань

61 12-3/1265

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «АСТРАХАНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

АНДРЕЕВА АННА КОНСТАНТИНОВНА

ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА НА ПОВЕДЕНИЕ И ГОМЕОСТАЗ БЕЛЫХ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ СТРЕССОГЕННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

03.03.01 -Физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -доктор медицинских наук, профессор Д.Ш. Дубина

Научный консультант -доктор биологических наук, доцент Б.В. Фельдман

Астрахань - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................6

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................12

1Л. Эритропоэз: клеточные и молекулярные механизмы.................12

1.2. Гормон эритропоэтин. Структура, синтез, биологическая роль... Л 6

1.3. Негемопоэтические свойства эритропоэтина...........................24

1.4. Рекомбинантные препараты эритропоэтина.............................28

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................40

2.1. Экспериментальные животные...............................................40

2.2. Методы изучения влияния эритропоэтина на поведенческие реакции крыс.....................................................................................42

2.3. Изучение влияния эритропоэтина на поведение и двигательную активность (тест открытого поля, тест приподнятого крестообразного лабиринта)................................................................................49

2.4. Изучение влияния эритропоэтина на уровень эмоционального реагирования (тест приподнятого крестообразного лабиринта, тест открытого поля)....................................................................................................50

2.5.Изучение влияния эритропоэтина на обучение и память (тест экстра-поляционного избавления, тест условной реакции пассивного избегания) ......................................................................................50

2.6. Изучение влияния эритропоэтина на уровень поведенческой депрессии животных (тест принудительного плавания по Порсолту, тест экст-раполяционного избавления)......................................................51

2.7. Изучение гематологических показателей эритропоэтина..............51

2.7.1. Изучение показателей форменных элементов крови..................51

2.7.2. Изучение коагуляционного звена системы гемостаза................52

2.8. Методы статистической обработки данных...............................53

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА III. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭРИТРОПОЭТИНА НА ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ КРЫС...................................................................54

3.1. Влияние эритропоэтина на психоэмоциональный статус млекопитающих..................................................................................54

3.2. Влияние эритропоэтина на когнитивную и мнестическую функцию млекопитающих......................................................................60

3.3. Влияние эритропоэтина на уровень поведенческой депрессии животных...........................................................................................................67

ГЛАВА IV. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ДОЗ ЭРИТРОПОЭТИНА В СРАВНЕНИИ С НЕЙРОМОДУЛИРУЮЩИМИ СРЕДСТВАМИ (ПИРА-ЦЕТАМОМ, ДИАЗЕПАМОМ, МЕЛИПРАМИНОМ)...............................71

4.1. Изучение влияния различных доз эритропоэтина на поведение животных в сравнении с нейромодулирующими средствами..................71

4.2. Изучение влияния различных доз эритропоэтина на поведенческие реакции животных...................................................................86

4.3. Результаты корреляционного анализа показателей эффектов эритропоэтина в поведенческих тестах......................................................96

ГЛАВА V. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ДОЗ ЭРИТРОПОЭТИНА НА ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ........................................102

5.1. Влияние эритропоэтина на количество форменных элементов крови.......................................................................................102

5.2. Влияние эритропоэтина на состояние коагуляционного звена системы гемостаза........................................................................110

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................112

Выводы.......................................................................................123

Научно - практические рекомендации...............................................124

Список литературы.......................................................................125

Приложения................................................................................154

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БОЕ-Э - Бурстобразующая эритроидная единица костного мозга

ВИ - Время иммобилизации

ВНД - Высшая нервная деятельность

КОЕ-Э - Колониеобразующая эритроидная единица костного мозга

ОП - Тест «Открытое поле»

OAK - Общий анализ крови

ПВ - Протромбиновое время

ПКЛ - Тест «Приподнятый крестообразный лабиринт»

ТПП - Тест «принудительного плавания» по Порсолту

ПТИ - Протромбиновый индекс

СОЭ - Скорость оседания эритроцитов

ТЭИ - Тест «экстраполяционное избавление»

УРПИ - Тест «условная реакция пассивного избегания»

ХПН - Хроническая почечная недостаточность

ЦНС - Центральная нервная система

ЭПО - Эритропоэтин

ЭПО-Р - Рецептор для эритропоэтина

EOS - Эозинофилы

Hb - Гемоглобин

Ht - Гематокрит

LYM - Лимфоциты

MON - Моноциты

NEU - Нейтрофилы

RBC - Эритроциты

rhEPO - Рекомбинантный эритропоэтин

WBC - Лейкоциты

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Многочисленными исследованиями было установлено, что различные виды анемий, возникающие как осложнение заболеваний, обусловлены изменением уровня в организме эндогенного цитокина - эритропоэтина (ЭПО), являющегося гемопоэтическим гормоном, ответственным за пролиферацию, дифференциацию и угнетение апоптоза в чувствительных к нему клетках кроветворной ткани (Жетишев P.A., 2000; Павлов А.Д. и др., 2001; Зак К.П. и др., 2002). Чувствительность соматических клеток к эритропоэтину связана с наличием на их мембранах специфических рецепторных белков. Продукция эритропоэтина у человека осуществляется главным образом перитубулярными и тубулярными клетками почек (Yang C.W. et al., 2003; Vesey D.A. et al., 2004). Однако 10-15% эритропоэтина плазмы крови имеет внепочечное происхождение (Erslev A.J. et al., 1989).

В работах последних лет появились данные о синтезе эритропоэтина и экспрессии эритропоэтиновых рецепторов эпоцитами (Зак К.П., 2002), гепато-цитами, окружающими венозные сосуды печени, печеночными макрофагами, ядросодержащими эритроидными клетками костного мозга (Bauer С., 1995), клетками центральной нервной системы (Элмахди X., 2010; Chikuma М. et al., 2000), в тканях женской репродуктивной системы (молочные железы, матка), плаценте, эмбриональных тканях (Бурлев В.А. и др., 2001; Демихов В.Г. и др., 2002). При этом активация функции клеток вызывает усиление продукции эритропоэтина и экспрессии его иРНК. Действие эритропоэтина на эритропо-этин-чувствительные ткани, как кроветворную, так и некроветворные, проявляется активацией в них антиапоптозных программ и процессов клеточной пролиферации (Захаров Ю.М., 2007; Goodnough, L.T. et al., 2000).

Долгое время вид заместительной терапии не мог быть осуществлен, так как отсутствовала доступная лекарственная форма ЭПО. Относительно недавно, благодаря развитию ДНК-технологии стало возможным в неограниченных количествах производство синтетических рекомбинантных препаратов эри-тропоэтина для широкого применения в клинической практике (Морщакова Е.Ф., 2007). Наиболее часто в качестве заместительной антианемической терапии применяют эритропоэтин - альфа.

Однако, помимо стимуляции процесса эритропоэза эритропоэтин обладает некроветворной функцией, выраженность которой обусловлена именно воздействием на головной мозг (Захаров Ю.М., 2007; Melli G. et al., 2006).

В литературе имеются данные, что после введения ЭПО улучшаются процессы восприятия информации, способность к запоминанию, повышается интеллект и внимание. Кроме того, терапия ЭПО положительно воздействовала не только при вторичных энцефалопатиях, возникающих как осложнение различных заболеваний (Ehrenreich Н., Siren A-L., 2001), но и при первичных заболеваниях нервной системы, а именно при паркинсонизме, боковом амио-трофическом склерозе и ряда других (Gimenez L.F., Scheel P.J., 1994). Однако, несмотря на широту применения и значимость эритропоэтина, до настоящего времени остаются открытыми ряд вопросов:

1) с какими механизмами связан когнитивный эффект эритропоэтина -прямым влиянием на нейроны мозга; улучшением показателей периферической крови при воздействии эритропоэтина на клетки созревающего эритрона и, как следствие этого, ускорением процессов метаболизма на клеточном и тканевом уровнях, или какими - либо иными;

2) какова эффективная доза эритропоэтина, оказывающая наиболее выраженное влияние на функции головного мозга;

3) как изменяются гематологические показатели после введения эритропоэтина и как долго сохраняется эффект заместительной терапии.

Целью настоящего исследования является оценка влияния эритропоэти-на на поведение и гомеостаз белых крыс в норме и при различных видах стресса.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи исследования:

1) С применением стандартных тестов (ОП, УРПИ, ТЭИ, ПКЛ, ТПП) провести сравнительное изучение поведенческих реакций у животных, получавших эритропоэтин в норме и при различных видах стресса.

2) Определить дозу (1000 ЕД/кг и 2000 ЕД/кг), оказывающую наиболее выраженное влияние на поведение белых крыс.

3) Провести сравнительное изучение влияния эритропоэтина и нейромоду-лирующих средств на обучение и память (пирацетам), уровень эмоционального реагирования (диазепам) и состояние уровня поведенческой депрессии (ме-липрамин).

4) Изучить показатели форменных элементов крови и коагуляционного звена гемостаза у животных после введения эритропоэтина в различных дозах.

Научная новизна исследования заключается в том, что впервые изучено влияние эритропоэтина на поведение белых крыс в норме и при различных видах стресса. Выявлено, что эритропоэтин оказывает выраженное влияние на обучение, память, двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность, обладает противотревожным и слабым антидепрессивным эффектами. Впервые проведена сравнительная оценка изменения поведенческих реакций на фоне введения эритропоэтина и нейромодулирующих средств (пи-рацетама, диазепама, мелипрамина), влияющих на память, мышление, уровень эмоционального и депрессивного реагирования. Впервые определена эффективная доза эритропоэтина, оказывающая наиболее выраженное влияние на поведенческие реакции. В результате осуществленного корреляционного ана-

лиза была выявлена взаимосвязь между показателями эффектов на фоне введения эритропоэтина.

Теоретическое и практическое значение работы.

Работа утверждена на заседании Ученого совета Астраханской государственной медицинской академии (Протокол №17 от 28 мая 2009 года).

В диссертации показано влияние эритропоэтина на поведение и гомео-стаз белых крыс в норме и при стрессогенных воздействиях. Полученные данные указывают на перспективность дальнейшего исследования эритропоэтина, на обучение и память в физиологических тестах. Теоретически и практически важными являются полученные в работе факты, указывающие на то, что эффекты эритропоэтина коррелируют с дозой.

Положения о влиянии эритропоэтина на поведенческие реакции являются теоретической основой для дальнейшего углубленного изучения. Это имеет немаловажное значение для фундаментальной физиологии и практической медицины.

Материалы диссертации включены в курсы лекций по нормальной физиологии, патологической физиологии и фармакологии Астраханской государственной медицинской академии и Астраханского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Эритропоэтин, наряду с антианемическими свойствами, оказывает выраженное действие на обучение, память, двигательную активность и уровень эмоционального реагирования в поведенческих тестах ОП, УРПИ, ТЭИ, ПКЛ.

2) По уровню влияния на обучаемость и память эритропоэтин превосходит «эталонный» препарат сравнения - пирацетам, а по выраженности эмоционального реагирования - диазепам.

3) Эритропоэтин в тесте принудительного плавания по Порсолту и тесте экстраполяционного избавления (ТЭИ) обладает слабо выраженным антиде-

прессивным эффектом. По активности данного эффекта уступает препарату мелипрамин.

4) Эритропоэтин в дозе 2000 ЕД/кг оказывает наиболее выраженное влияние на поведение белых крыс.

5) Внутрибрюшинное введение эритропоэтина в дозах 1000 ЕД/кг и 2000 ЕД/кг не изменяет показатели форменных элементов крови и коагуляционного звена системы гемостаза.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: VIII Астраханской межрегиональной научно-практической конференции «Лекарство и здоровье человека», Астрахань, 2009; 86-й итоговой научно-практической конференции сотрудников академии, врачей города и области «Актуальные вопросы современной медицины», Астрахань, 2009; III Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009», посвященном 160-летию академика И.П. Павлова, Санкт-Петербург, 2009; XI Международной конференции «Актуальные проблемы современной науки», Самара, 2010; V Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Клязьма, 2010; V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва, 2010; 88-й итоговой научно-практической конференции сотрудников академии, врачей города и области «Актуальные вопросы современной медицины», Астрахань, 2011. Положения диссертации были доложены на расширенном межкафедральном заседании при Астраханской государственной медицинской академии.

По теме диссертации опубликовано 12 печатных научных работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация написана по классическому типу и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, гла-

ва материалов и методов исследования, 3 главы результатов собственных исследований и их обсуждения, научно-практические рекомендации, выводы, 4 приложения. Материал диссертации изложен на 160 страницах компьютерного текста, иллюстрирован 18 таблицами и 44 рисунками. Список литературы содержит 257 источников, из них 91 - отечественных и 166 - зарубежных.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эритропоэз: клеточные и молекулярные механизмы.

Известно, что эритропоэз представляет собой постоянный и непрерывный процесс образования и восстановления клеток эритрона, главной функцией которых является снабжение тканей кислородом, и состоит из ядросодер-жащих эритроидных клеток костного мозга, ретикулоцитов костного мозга, крови и зрелых эритроцитов. В основе эритропоэза лежат процессы пролиферации, дифференциации и созревания эритроидных предшественников в красном костном мозге с последующим выходом эритроцитов в сосудистое русло (Захаров Ю.М., 2000). Эритроциты - это безъядерные клетки, функционирующие за счет энергии гликолиза, не содержащие митохондрий, рибосом, бе-локсинтезирующей системы и не дышащие. Высокий уровень специализации эритроидных клеток обусловлен наличием в эритроцитах гемоглобина - специфического белка с уникальными свойствами, который обеспечивает быстрое поглощение кислорода из альвеолярного воздуха легких и его транспорт в клетки и ткани организма (.Гагауеп А., е1 а1., 1999). Осуществляя транспорт газов, эритроциты обеспечивают тем самым нормальное течение всех физиологических процессов в организме. Снижение числа эритроцитов обязательно влечет за собой снижение содержания гемоглобина крови. В периферической

13

крови организма человека содержится примерно 2,3x10 эритроцитов. Время жизни одного эритроцита составляет, в среднем, 100 - 120 дней и ежедневно разрушается около 1% этих безъядерных клеток. Таким образом, для поддержания постоянного уровня циркулирующих по сосудистому руслу эритроцитов в организме непрерывно происходит обновление пула этих клеток, со скоростью примерно 2,3 миллиона эритроцитов в 1 секунду. Эритроциты образуются из общего предшественника клеток крови - стволовой гемопоэтической

клетки. В процессе созревания этой клетки она контактирует с различными цитокинами, дающими сигнал для ее дальнейшего развития. Одни цитокины побуждают стволовую клетку дифференцироваться в направлении эритроид-ного звена гемопоэза, а другие, воздействуя на уже относительно дифференцированные эритроидные предшественники, побуждают их пролиферировать, увеличивая продукцию эритроцитов костным мозгом. В норме секреция эри-тропоэтина и эритропоэз находятся в сбалансированном состоянии, поддерживающем равенство между продукцией и гибелью эритроцитов (рис. 1).

Рис. 1. Синтез и действие эритропоэтина.

В физиологических условиях в красном костном мозге около 95% клеток предшественников проходят все этапы дифференцировки, становятся полноценными эритроцитами и выходят в кровяное русло. Это явление получило название «эффективный эритропоэз». Снижение данного процесса происходит вследствие значительного уменьшения продукции эритропоэтина. От 3 до 7% �