Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Постреанимационные изменения поведения белых крыс, перенесших 12-минутную клиническую смерть, и их коррекция с помощью некоторых регуляторов пептидов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Постреанимационные изменения поведения белых крыс, перенесших 12-минутную клиническую смерть, и их коррекция с помощью некоторых регуляторов пептидов"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

НАЗДРЕНКО Ирина Валерьевна

ПОСТРЕАНИМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПОВЕДЕНИЯ БЕЛЫХ КРЫС, ПЕРЕНЕСШИХ 12-МИНУТНУЮ КЛИНИЧЕСКУЮ СМЕРТЬ, И ИХ КОРРЕКЦИЯ С ПОМОЩЬЮ НЕКОТОРЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ

03.00.13. - физиология человека и животных 14.00.16. - патофизиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1997

Работа выполнена в НИИ общей реаниматологии РАМН (директор института -профессор В.В. Мороз) и на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (заведующий кафедрой -академик РАМН И.П. Ашмарин).

Научные руководители:

доктор медицинских наук A.B. Волков

доктор биологических наук, профессор A.A. Каменский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Р.У. Островская кандидат биологических наук И.М. Федорова

Ведущее учреждение - НИИ общей патологии и патологической физиологии РАМН

Защита диссертации состоится 24 ноября 1997 г. в 15.30. часов на заседании Специализированного Совета Д.053.05.35. биологического факультета Московского Государственного Университета им. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 24 октября 1997 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета

кандидат биологических наук

Б.А. Умарова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вопрос о полноценном is сю становлении функции ЦНС после клинической смерти до сих пор остается актуальной, до конца нерешенной проблемой современной реаниматологии. Результаты многочисленных исследований доказывают, что патологические процессы, возникающие в мозге в ходе умирания и последующей рециркуляции, продолжаются в постреанимационном периоде и могут приводить к развитию энцефалопатии различной тяжести. В частности, показано отсроченное формирование структурных и функциональных изменений в мозге даже в случае первоначального внешнего восстановления неврологического статуса (В.А. Неговский и соавт., 1987; Л.В. Молчанова, 1994; А.М. Гурвич и соавт., 1996; М.А. Аврущенко, 1996; Нага et al., 1993). Расстройства эмоционально-психических и когнитивных функций выступают как типичные и довольно частые, длительно сохраняющиеся осложнения у больных, перенесших терминальное состояние (Г.В. Алексеева, 1996; Grubb et al., 1996). В связи с этим экспериментальное выяснение характера и динамики постреанимационных изменений поведенческих реакций и поиск новых подходов к терапии и профилактике постреанимационных нарушений функций ЦНС является весьма актуальной в теоретическом и практическом отношении задачей современной реаниматологии. В настоящее время проводится разработка и исследование огромного количества препаратов, проявляющих нейропро-текторные свойства при ишемичеехом поражении мозга. В основном известные фармакологические средства служат для нормализации конкретных звеньев патогенетического процесса. Однако в последнее время все большее внимание исследователей привлекает возможность фармакологического воздействия на совокупность отдельных механизмов ишемической патологии мозга (Gisvold et al., 1996; Auer et al., 1995).

Одним из новых перспективных направлений в создают средств, влияющих на функции ЦНС и организма в целом в норме и патологии, является применение регуля-торных пептидов с их универсальными свойствами запуска каскадных механизмов регуляции компенсаторно-приспособительных процессов (И.П. Ашмарин, 1986; О.А. Гомаз-ков, 1995; Т.М. Ерошенко и соавт., 1991). Ранее в экспериментах по моделированию клинической смерти у белых крыс было продемонстрировано благоприятное влияние на течение постреанимационного процесса некоторых регуляториых пептидов, в частности, оксигоцина, соматостатина, AKTTVio и др. (А.В. Волков и соавт., 1992; 1995; 1996). В связи с этим требуется дальнейшая разработка методов сердечно-легочной и мозговой pea-

нимации и профилактики постреанимациошюй энцефалопатии с помощью регуляторных пептидов.

Цепь и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование поведения белых крыс в постреанимационном периоде после 12-мин остановки кровообращения в организме и оценка влияния некоторых регуляторкых пептидов на процессы мозговой реанимации и постреаюшационного восстановления функций ЦНС. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. изучить характер и динамику поведения крыс в течение 3-х месяцев постреанимационного периода, а именно оценить тревожно-фобический статус, двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность в различных условиях, способность к обучению, физическую выносливость и болевую чувствительность;

2. оценить влияние на восстановление поведенческих реакций крыс в постреанимационном периоде пептида дельта-сна, киоторфина, пептидных аналогов пирацетама ГВС-111 и ТГС-33, ГГС-8, а также пирацетама;

3. оценить влияние перечисленных выше пептидов на поведение ингактных крыс.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное длительное исследование поведения крыс после 12-мин клинической смерти. Показана возможность коррекции постреанимационной патологии мозга с помощью раннего однократного применения регу-ляторных пептидов (ГВС-1 И, ТГС-33, киоторфина и пептида дельта-сна). У интакгных животных оценено отсроченное влияние однократной инъекции данных пептидов на комплекс поведенческих реакций.

Теоретическая и практическая значимость работы. Выявлены особенности структуры постреанимационных нарушений поведенческих реакций крыс и их связь с сезоном. Показано, что в основе этих изменений лежит высокая уязвимость эмоционально-могивационной сферы поведения к ишемической патологии мозга. Установлена зависимость характера и динамики эффектов регуляторных пептидов от наличия или отсутствия постреанимационной патологии. Положительное влияние однократного введения после успешной сердечно-легочной реанимации киоторфина, ГВС-111 и ТГС-33 на уровень постреанимационной смертности, неврологическое восстановление на ранних этапах и на отсроченные нарушения поведения крыс после клинической смерти позволяет полагать, что эти препараты являются весьма перспективной основой для создания новых лекарственных средств для клинической практики.

Апробация работы. Результаты работы были изложены на научной конференции "Передовые рубежи анестезиологии и интенсивной терапии в медицине катастроф" (Новокузнецк, 1996), на 1-м Российском конгрессе по патофизиологии "Патофизиология органов и систем" (Москва, 1996), на Международном симпозиуме, посвященном 60-летию НИИ общей реаниматологии РАМН (Москва, 1996), на 1-м конгрессе Немецкого Общества Нейронаук (Берлин, 1996), на 2-м съезде Европейской Ассоциации Нейронаук (Страсбург, 1996), на 5-й Международной конференции Общества Поведенческих Нейронаук (Мехико, 1996), на Ежегодном съезде Европейского Общества Фармакологии Поведения (Кальяри, 1996), на 6-м Международном симпозиуме по Фармакологии Церебральной Ишемии (Марбург, 1996), на 6-м съезде Международной Ассоциации Нейротоксикологии (Сжегед, 1997), на 33-м Международном конгрессе Физиологических Наук (Санкт Петербург, 1997).

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 176 страницах, содержит 38 рисунков и 19 таблиц. Список литературы включает 272 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 514 самцах белых нелинейных крыс весом 180-220 г.

В экспериментах применяли следующие препараты:

- пептид дельта-сна (Trp-Ala-Gly-Gly-Asp-Ala-Ser-Gly-Glu) и киоторфин (Tyr-Arg), синтезированные в лаборатории химии пептидов НИИ Биоорганической Химии РАН;

- ГВС-111 (этиловый эфир К-фенилацетил-Ь-пролилглицина), ТГС-33 (смесь диастереомеров амида пироглутамиласпарагина, L-pGlu-L-Asn-NH2 и L-pGlu-D-Asn-NH2 в соотношении 2:3) и ТГС-8 (циклопролилглицин), синтезированные в отделе химии НИИ Фармакологии РАМН;

- пирацетам ("Polfa", Польша).

Препараты вводили в водном растворе из расчета 1 мл/кг или 0.1 мл/кг массы животных. Контрольным крысам вводили эквивалентные объемы физиологического раствора.

Модель клинической смерти: Внезапную остановку кровообращения в орга-

• . 4

низме на 10 или 12 минут вызывали у животных под эфирным наркозом путем внут-риторакального пережатия сосудистого нучка сердца металлическим Г-образныи крючком (В.Г. Корпачев и соавт., 1982). Комплекс реанимационных мероприятий включал в себя наружный массаж сердца в сочетании с искусственной вентиляцией легких воздухом. В течение двух недель после перенесенной клинической смерти ежедневно оценивалитгеврологический статус животных по методу С.П. Лысенкова и соавт. (1982). Затем проводили исследование комплекса поведенческих реакций крыс с помощью следующих методов:

Оценка тревожно-фобических состояний у крыс (В.Н. Родина и соавт., 1993), которая включает 9 тестов: определение латентных периодов спуска с высоты, прохождения через отверстие, выхода из "домика", выхода из центра открытого поля, оценка возникновения реакции пячения в ходе тестирования в открытом поле, оценка возникновения реакций пячения, затаивания, вокализации и прижимания ушей в ответ на действие руки экспериментатора. Поведенческие реакции животных оценивали в баллах, в целом для характеристики тревожно-фобического состояния животного использовали сумму баллов.

Для оценки двигательной и ориентировочно-исследовательской активности крыс применяли следующие методы:

метод "открытое поле" - регистрировали величину горизонтальной и вертикальной активности, количество отходов от стенки и выходов в центр арены, груминг, количество дефекаций. Тестировали животных в тишине в течение 5 мин. Через 3 мин после помещения животного в ноле вместо обычной лампы накаливания на 1 мин включали красную лампу, после чего восстанавливали исходный уровень освещенности.

метод "норковая камера" - регистрировали величину горизонтальной и вертикальной активности, число обследованных отверстий, груминг. Тестировали животных в тишине при свете красной лампы в течение 2 мин.

Выработку условных рефлексов проводили с помощью следующей модели обучения:

. выработка условной пшцедобывательной реакции на место в Т-образном лабиринте - обучение проводили в течение 4-х дней, животных помещали в лабиринт по 5 раз ежедневно. Регистрировали количество выполненных реакций, латентный период выхода из стартовой камеры, время реакции, количество ошибок.

Для оценки болевой чувствительности животных применяли следующие методы: метод "отдергивания хвоста" - регистрировали время реакции избавления от болевого раздражителя при погружении хвоста в горячую воду температурой 56° С.

метод "горячая пластина" - регистрировали время реакции: время от момента посадки до первого облизывания задней лапы при помещении животного на разогретую до 53° С металлическую поверхность.

В работе также исследовали статическую компоненту физической выносливости с помощью метода "вертикальная сетка" и уровень пищевой мотивации животных.

При обработке результатов использовали стандартные методы статистического анализа с помощью пакета статистических программ STATISTICA for Windows 4.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние 12-мин остановки кровообращения на поведение белых крыс в по-стреанимационпом периоде. На первом этапе работы было проведено исследование поведенческих реакций животных после 12-мин клинической смерти, перенесенной в зимнее ("зимние" крысы) или летнее ("летние" крысы) время года. В течение первых двух недель после реанимации "зимние" крысы по сравнению с "летними" характеризовались более высоким уровнем смертности (в 1.7 раз, р<р = 0.04), но более быстрым восстановлением неврологического статуса у выживших животных: исчезновение неврологического дефицита к 7-м суткам постреанимационного периода наблюдалось у 91 % "зимних" и у 57 % "летних" крыс (рф= 0.03).

Рис.1. Сезонные различия по уровню тревожности реанимированных крыс через 2 недели после клинической смерти. Значимые отличия от интактных крыс # р < 0.05.

При оценке тревожно-фобических состояний животных по методу Родиной и соавт. (1993) через две недели после остановки сердца выявлено увеличение уровня тревожности "зимних" реанимированных крыс по сравне-

индекс тревожности

6п »

зима лето НИИ интактные W///A реанимированные

2

нию с интактными (рис.1). При тестировании в открытом поле у "зимних" реанимиро-валных животных при резкой смене освещенности, горизонтальная активность была ниже (рис.2), а интенсивность груминга выше, чем у интактных, что позволяет говорить о повышении эмоционального напряжения животных. В этот же период у "летних" реанимированных крыс по сравнению с соответствующим контролем наблюдалось уменьшение тревожности (рис.1), а также усиление ориентировочно-исследовательской реакции и ослабление эмоционального напряжения в стрессогенных условиях открытого поля, о чем свидетельствует увеличение вертикальной активности (особенно в момент переключения света, рис.2), количества отходов от стенки и выходов в центр арены. Повторное тестирование через 3 месяца показало, что в "зимней" группе отличия реанимированных крыс от интактных в данных тестах исчезли, в то время как изменения поведения "летних" реанимированных крыс сохранились.

горизонтальная активность 30

20

10

т—I—I—I—I—I

0 1 2 3 4 5 6 минуты

—•— интаюиые

вертикальная активность

А

"I—I—I—I—I—I

0 1 2 3 4 5 6

минуты реанимированные

Рис.2. Двигательная активность крыс, реанимированных в зимний (А) и летний периоды (Б), через две недели после клинической смерти. Значимые отличия от интактных # р < 0.05.

3

Признаки повышения эмоционального напряжения у "зимних" реанимированных животных отмечались и при тестировании в бесстрессорных условиях норковой камеры: наблюдалось уменьшение числа обследованных отверстий (через две недели после остановки сердца) и усиление интенсивности груминга (через 3 месяца) по сравнению с интактиыми животными. У "летних." реанимированных крыс изменения поведения в норковой камере были обнаружены только при повторном тестировании через 3 месяца в виде увеличения двигательной активности и числа обследованных отверстий по сравнению с интактными животными, что может быть связано с ослаблением способности крыс к запоминанию экспериментальной ситуации.

Влияние клинической смерти на процессы обучения и памяти изучали с помощью выработки условной пигцедобывательной реакции на место в Т-образном лабиринте. Через две недели после реанимации выработка навыка у "зимних" реанимированных и интах-гных крыс происходила аналогично. Однако через 3 месяца у первых отмечалось увеличение времени реакции и количества ошибок. У "летних" оживленных крыс через две недели после реанимации наблюдалось ускорение обучения: обнаружено увеличение количества выполненных реакций и уменьшение латентного периода. Однако через 3 месяца выявлялось ухудшение воспроизведения ранее приобретенного навыка, а именно - снижение количества выполненных реакций, увеличение латентного периода и времени реакции. Отличий между реанимированными и интакшыми крысами по уровню пищевой мотивации не отмечено ни в "зимней", ни в "летней" группах. Анализируя полученные данные, можно предположить, что обнаруженное ускорение выработки навыка у "летних" реанимированных животных вызвано, скорее всего, подавлением пассивно-оборонительной реакции и смещением общего баланса мотиваций в сторону пищедобывагельного поведения. Вместе с тем, независимое от сезона ухудшение обучения, выявленное при повторном тестировании реанимированных животных, свидетельствует о нарушении процессов хранения и извлечения памятного следа после клинической смерти.

Рис.3. Болевая чувствительность крыс в тесте "горячая пластина" через две недели после реанимации. Значимые отличия от интактных крыс #р< 0.05.

Одновременно, независимо от сезона, у реанимированных животных отмечалось снижение физической выносливости в тесте "вертикальная сетка", а также уменьшение болевой чувствительности в тесте "горячая пластина" (рис.3), но не в тесге "отдергивания хвоста". Считается, что рефлекс лизания лап реализуется через высшие отделы головного мозга в отличие от рефлекса от-

время реакции

I I интактные

реанимированные

дергиваиия хвоста, замыкающегося на уровне спинного мозга (Borszer, 1990). Следовательно, можно полагать, что после реанимации у животных нарушается субъективная оценка значимости болевого стимула на высших уровнях ЦНС.

Таким образом, обобщая полученные данные, можно заключить, что наиболее уязвимой к воздействию клинической смерти является эмоционально-мотявационная сфера поведения крыс. В постреанимационном периоде у животных на фоне внешне восстановленного неврологического статуса, по крайней мере, в течение 3-х месяцев, выявляются серьезные изменения эмоциональной реактивности и ориентировочно-исследовательской реакции, нарушения процессов обучения и памяти, уменьшение физической выносливости и болевой чувствительности. Существенно, что характер и направленность постреанимационных изменений поведенческих реакций животных зависят от времени года, в которое проводятся эксперименты.

2. Коррекция постреанимационных изменений поведения крыс с помощью регулятор-

ных пептидов.

" "" 2.1. Влияние пептида дельта-сна на поведение крыс после 10-мин остановки серд ца.

Известно, что пептид дельта-сна (ПДС) обладает антигипоксическими и анти-стрессорными свойствами и оказывает модулирующее влияние на баланс некоторых аминокислот в мозге (A.M. Менджерицкий, 1990, 1992; И.И. Михалева, 1991). Исследование влияния ПДС на восстановление функций ЦНС после 10-мин остановки кровообращения проводили в зимнее время года в течение 8-ми месяцев. ПДС вводили "однократно внутрибрюшинно в дозе 120 мкг/кг через 1 час после успешной сердечно-легочной реанимации. Интактные животные получили аналогичную инъекцию ПДС. Введение ПДС не влияло на уровень смертности животных, темпы внешнего восстановления неврологического статуса и на уровень тревожности крыс. В то же время тестирование животных в стрессогенных условиях открытого поля обнаружило, что ПДС способствует компенсации изменений ориентировочно-исследовательской реакции и эмоциональной реактивности реанимированных крыс. Об этом свидетельствует нормализация интенсивности груминга (через две недели после остановки сердца), двигательной активности (через 3 месяца) и числа отходов от стенки и выходов в центр арены (через 5 месяцев), что можно расценить, как проявление антистрессорной активности ПДС (рис.4).

отходы от стенки арены # #

т-1-1-1-1

1 3 5 7 9 месяцы

интактные -■- ■ интактные + ПДС

выходы в центр арены 3 п

2 -1 -О --1

1-1-1-I-1

1 3 5 7 9 месяцы

реанимированные реанимированные + ГЩС

Рис.4. Влияние ПДС на поведение крыс в открытом поле. Значимые отличия от интакгных крыс # р < 0.05; от реанимированных с введением физраствора * р < 0.05.

4

2

0

В отсутствие стресса (в норковой камере) ПДС вызывал угнетение видоспеци-фической ориентировочно-исследовательской реакции реанимированных крыс. Снижение числа обследованных отверстий отмечалось через две недели после реанимации. В дальнейшем отличия от контроля исчезли (рис.5). По-видимому, этот эффект ПДС связан с его активирующими влияниями на тормозные системы мозга за счет повышения содержания ГАМК (МакМвоуа, 1992).

число обследованных отверстой 12-1

Рис.5. Влияние ПДС на поведете крыс в норковой камере. Значимые отличия от иигактных крыс # р < 0.05; от реанимированных с введением физраствора * р < 0.05.

При обучении в Т-образном лабиринте ПДС способствовал ухудшению выработки пищедобыва-тельного навыка реанимированных крыс. Изменения параметров обучения наблюдались в течение 5-ти месяцев. Через 8 месяцев после клинической смерти животные с введением ПДС хуже контрольных справлялись с решением усложненной задачи при помещении пищевого подкрепления в другой отсек лабиринта. Важно, что под действием ПДС наблюдалось стойкое снижение пищевой мотивации в течение всего периода исследований. По всей ви-

—•— ингакшье —|»-■ тгактье+ГЙС * реанимрованнье —♦- реамм(1роважье+ПДС

ю

димости, еще большие нарушения процессов обучения после реанимации, вызванные НДС, связаны с угнетением ориентировочно-исследовательской и пищевой мотиваций животных, что и препятствует формированию навыка.

Введение ПДС не влияло на уровень статической физической выносливости животных в тесте "вертикальная сетка".

время режцт

35-]

28- # #* --------

21 - Зг/*7

14-

7-

~т-1-1—

1 3 5 месяцы

—•— интактнье

»- интакгньв + ПРР -■*■••■ реанимированы:

реанилюрованнье + ГЩЗ

Рис.б. Влияние ПДС на болевую чувствительность крыс в тесте Горячая пластина". Значимые отличия от интактных крыс # р < 0.05; от реанимированных с введением физраствора * р < 0.05.

Исследование болевой чувствительности животных выявило значительную анальгетическую активность ПДС: обнаружено увеличение времени реакции реанимированных крыс в тестах и "отдергивания хвоста", и "горячая пластина" (рис.6). Данный эффект ПДС можно объяснить его активирующими влияниями наопиоидные механизмы мозга (Young, 1985).

Итак, ПДС при однократном введении через 1 час после 10-мин остановки кровообращения у крыс проявляет длительные нейропротекторные эффекты в стрессо-генных условиях, однако в отсутствие стресса способствует подавлению ориентировочно-исследовательской реакции и пищевой мотивации, что приводит к угнетению спонтанного поведения и процессов обучения крыс. Кроме того, выявляется анальге-тическая активность ПДС. Необходимо особо отметить, что введение ПДС интактным крысам достоверно не влияло на их поведение ни в одном из используемых тестов. Таким образом, ПДС проявляет свою явную длительную нейротропную активность только на фоне патологических процессов, развивающихся в организме в связи с перенесенной клинической смертью.

2.2. Влияние киоторфина на поведение крыс после 12-мин остановки сердца.

Известно, что киоторфин (КТ) - дипептид, выделенный из мозга зимоспящих животных, обладает способностью модулировать Са2+ токи, а также активность энке-фалинергической, моноаминергической и ацетилхолинергической систем m03ia (Ueda,

1987; Rackham, 1982). Исследование влияния КТ на восстановление функций ЦНС после 12-мин остановки кровообращения проводили в летний период в течение 3-х месяцев. КТ вводили однократно интраназалыю в дозе 0.05 мг/кг через 30 мин после успешной сердечно-легочной реанимации. Интактные животные получили аналогичную инъекцию КТ. Введение КТ способствовало снижению уровня постреанимационной смертности крыс, причем этот эффект КТ зависел от жизнеспособности популяции. Одновременно КТ ускорял исчезновение неврологического дефицита после реанимации (рис.7).

Рис.7. Влияние КТ на уровень постреанимационной смертности (А) и исчезновение неврологического дефицита у крыс (Б). Значимые отличия от контроля * р < 0.05.

В тесте Родиной и соавт. последствия введения КТ шггактным животным при тестировании их через две недели после инъекции были аналогичны эффектам, вызванным остановкой сердца, т.е. наблюдалось резкое снижение уровня тревожности по сравнению с шгтактными крысами с введением плацебо. Напротив, введение КТ реанимированным крысам привело к нормализации данного показателя (рис. 8, А). Сходная ситуация наблюдалась в этот же период и при тестировании в стрессогенных условиях открытого поля. У интактных крыс с введением КТ и у реанимированных крыс с введением плацебо было обнаружено увеличение вертикальной активности (рис.8, Б), числа отходов от стенки и выходов в центр арены, а также снижение количества дефекаций. Напротив, введение КТ реанимированным крысам способствовало нормализации отдельных показателей поведения животных, в частности, вертикальной активности при тестировании на ярком свету и при резкой смене освещенности.

количество животных, % 60

45 -30 -15 О

количество животных, % 80 -) *

60 -I

40 -

20

О

4-6 7-10 сутки i I реанимированные У////Л реанимированные + КТ

ичцекс тревожности 9-1

вертикальная активность 15 п #

#

Рис.8. Влияние КТ на поведение крыс в тесте Родиной и соавт. (А) и в открытом поле (Б). Значимые отличия от ин-тактных крыс # р < 0.05; от реанимированных с введением физраствора * р < 0.05.

2недом Змесар I I штактные

интжшые+КГ

2недепи 3месяца реанимированнье реаюадгюваннье + КГ

Через три месяца эффект инъекции КТ реанимированным крысам сохранился, в то время как в группе интактных крыс последствия введения КТ исчезли.

В бесстрессорных условиях норковой камеры КТ пе влиял на поведение как реанимированных, так и интактных животных по сравнению с соответствующим контролем в течение всего периода наблюдения.

Оценка уровня статической физической выносливости животных показала, что у интактных крыс КТ вызывает снижение времени удержания на вертикальной сетке (через две недели после инъекции), но не влияет на данный показатель у реанимированных животных.

В ходе выработки пшцедобывательной реакции на место в Т-образном лабиринте КТ не оказал влияния на параметры обучения интактных крыс. Инъекция КТ после реанимации привела к снижению количества выполненных реакций и повышению латентного периода и времени реакции на 4-й день эксперимента по сравнению с реанимированными крысами с введением физраствора практически до уровня интакт-ного контроля. Вместе с тем, КТ способствовал улучшению воспроизведения ранее приобретенного навыка у реанимированных крыс. Отличий по уровню пищевой мотивации между всеми экспериментальными группами не обнаружено. Можно предположить, что выявленные эффекты КТ связаны, скорее всего, с его нормализующим влиянием на эмоциональную реактивность животных, нежели непосредственно на механизмы памяти.

Наряду с отмеченным, и у интактных, и у реанимированных животных с введе-

нием КТ наблюдалось повышение болевой чувствительности. У интактных крыс КТ вызвал достоверное снижение времени реакции в тестах "отдергивания хвоста" и "горячая пластина" через две недели после инъекции, а у реанимированных - в тесте "отдергивания хвоста" через 3 месяца. Объяснить полученные данные довольно сложно, т.к. известно, что КТ обладает анальгетической активностью за счет усиления высвобождения Мет-энкефалина {TJeda, 1986). В данном случае можно предположить влияние КТ на нощщептивную систему мозга через неопиоидные механизмы.

Таким образом, однократное применение КТ через 30 мин после успешной сердечно-легочной реанимации уменьшает постреаиимационную летальность, ускоряет восстановление неврологического статуса животных, способствует нормализации эмоциональной реактивности и ориентировочно-исследовательской реакции крыс, что может иметь очень важное значение в процессе адаптации к постоянно изменяющимся условиям окружающей среды. Существенно, что направленность действия КТ зависит от наличия или отсутствия гипоксической патологии. Можно предположить, что нейропротекторное действие КТ после клинической смерти связано с его модулирующим влиянием на гомеостаз Са2+ и активность некоторых медиаторных систем мозга (Takagi, 1979; Ueda, 1987; Rackham, 1982).

2.3. Влияние пептидов с ноотропной активностью на поведение крыс после 12-мин остановки сердца.

Созданные несколько лет назад в НИИ фармакологии РАМН структурные аналоги пирацетама пептидной природы обладают положительным влиянием на кровоток и метаболизм мозга, проявляют антигипоксическяе, антиоксидантные свойства, оказывают влияние на процессы обучения, способны модулировать активность некоторых медиаторных систем мозга и т.д. (Т.А. Гудашева, 1985,1995; Ostrovskaya, 1994, 1995; Seredenin, 1995). Исследование влияния некоторых представителей этой группы препаратов, а именно: ТГС-33, основанного на пироглутаминовой кислоте, и ГВС-111, основанного на пролине, на восстановление функций ЦНС крыс после 12-мин остановки кровообращения проводили в летнее время года в течение 3-х месяцев. Для более полного анализа эффектов пептида ГВС-111 в работе также использовали пираце-там и пептид ТГС-8, который считается эндогенным метаболитом ГВС-111. Все вещества вводили однократно внутрибрюшинно через 30 мин после успешной сердечно-легочной реанимации, ТГС-33 и ГВС-111 - в дозах 0.1 и 0.3 мг/кг, соответственно;

пирацетам применяли в стандартной дозе 0.3 г/кг, ТГС-8 - в дозе 0.1 мг/кг. Интактные животные получили аналогичные инъекции ТГС-33 и ГВС-111.

количество животных, % 60 -1

0

количество животных, % 60

45 30 -15 -

О

I I реанимированные У////Л реанимированные + пептид

Рис.9. Влияние ТГС-33 (А) и ГВС-111 (Б) на уровень постреанимационной смертности крыс. Значимые отличия от контроля * р < 0.05.

*

Введите ТГС-33 и ГВС-111 привело к значительному снижению уровня постреанимационной смертности крыс и ускорению исчезновения неврологического дефицита. Причем влияние ГВС-111 на смертность животных определялось жизнеспособностью популяции (рис. 9). Пирацетам и ТГС-8 не повлияли на уровень летальности, при этом ТГС-8 несколько ускорял внешнее неврологическое восстановление у выживших крыс.

отходы от стенки арены 6

2 недели 3 месяца I 1 интактные

интактные + пептид

отходы от стенки арены 6

4 -

2 -

2 недели 3 месяца реанимированные реанимированные + пептид

Рис.10. Влияние ТГС-33 (А) и ГВС-111 (Б) на поведение крыс в открытом поле. Значимые отличия от шггактных крыс # р < 0.05; от реанимированных с введением физраствора * р < 0.05.

Ни одно из исследуемых веществ не оказало влияния на уровень тревожности животных после реанимации.

При тестировании в стрессогенных условиях открытого поля ТГС-33 и ГВС-111 способствовали нормализации эмоциональной реактивности и ориентировочно-

исследовательской реакции реанимированных крыс: наблюдалось уменьшение числа отходов от стенки (рис.10) и выходов в центр арены, а также увеличение количества дефекаций по сравнению с введением плацебо практически до уровня интактного контроля. Кроме того, ГВС-111 нормализовал реакцию животных на резкую смену освещенности экспериментальной камеры.

Рис.11. Влияние ГВС-111 на двигательную активность крыс через две недели после реанимации. Значимые отличия от интактных крыс # р < 0.05; от реанимированных с введением физраствора * р < 0.05.

Одновременно у реанимированных крыс с введением ГВС-111 или ТГС-33 по сравнению с введением плацебо было обнаружено снижение горизонтальной активности на 2-й мин опыта, тогда реашвмроеаннье+ГВС-111 как на 1-й мин по данному показателю отличий не отмечалось. Это свидетельствует об ускорении угашения двигательной активности реанимированных крыс под влиянием пептидов (рис.И). Аналогичная картина наблюдалась также и в соответствующих группах интактных животных, однако при введении ТГС-33 отличия от контроля не достигали уровня значимости (рми 0.09). Повторное тестирование животных через три месяца показало, что нормализующие эффекты частично сохранились в группе оживленных крыс с введением ТГС-33, в частности, отмечена нормализация вертикальной активности, в то время как при введении ГВС-111 отмечалось некоторое снижение эмоциональной реактивности животных. У интактных крыс в этот период последствий введения пептидов не выявлялось. Пирацетам через 2 недели после инъекции вызвал повышение горизонтальной активности реанимированных крыс (рис.12) и усиление их реакции на резкую смену освещенности: наблюдалось увеличение вертикальной активности и интенсивности груминга на 5-й мин опыта. Через 3 месяца эффекты пир-ацетама не сохранились.

горизонтальная акпвность 30-

20

10-

"I-1-г

1 2 3 4 5 6

~ интакгнье -»- игтактаье + ГЕС-111 * реанимированный

Рис.12. Влияние пирацетама на двигательную активность реанимированных крыс в открытом поле. Значимые отличия от интактных крыс # р < 0.05; от реанимированных с введением физраствора * р < 0.05.

Через 2 недели после введения ТГС-8 реаними-ЁШЗ реанимированные + лирацетам рованным крысам отмечалось лишь увеличение

вертикальной активности при резком переключении света на 4-й мин опыта. Вместе с тем, через 3 месяца проявились нормализующие эффекты ТГС-8: обнаружено снижение двигательной активности реанимированных крыс практически до уровня интактного контроля (рис.13).

горизонтальная активность 80 ■

60 40 20 0

2 недели 3 месяца I 1 интаетные

реанимированные

горизонтальная асговностъ 50-,

Рис.13. Влияние ТГС-8 на двигательную активность реанимированных крыс в открытом поле. Значимые отличия от интактных крыс # р < 0.05; от реанимированных с введением физраствора * р < 0.05.

2недегм Змееяде

1—11мастнье В бесстрессорных условиях норковой камеры по-

реаниуцюеаннье

реанюмрованнье+ТГСЗ следствия введения ТГС-33 и ГВС-111 у реанимированных крыс не выявлялись. ТГС-33 также не влиял на поведение в данном тесте и интактных животных. При этом ГВС-111 вызвал снижение двигательной активности интактных крыс через 2 недели после инъекции. Введение пирацетама реанимированным животным способствовало усилению горизонтальной активности через 2 недели после инъекции, однако через три месяца после инъекции этот эффект не сохранился. Последствия введения ТГС-8 оживленным животным проявились только через 3 месяца в виде тенденции к нормализации двигательной активности крыс.

При оценке уровня статической физической выносливости животных обнаруже-

но, что у реанимированных крыс ГВС-111 увеличивает время удержания на вертикальной сетке в период до 3-х месяцев, ТГС-33 не влиял на данный показатель. У интактных животных эффекты пептидов выявлены через 2 недели после инъекции: ГВС-1П вызывает снижение времени реакции, а ТГС-33 наоборот - увеличение. Пирацетам и ТГС-8 не влияли на физическую выносливость реанимированных животных.

В ходе выработки пищсдобывательной реакции на место в Т-образном лабиринте ТГС-33 способствовал некоторому ухудшению обучения реанимированных крыс: отмечено увеличение времени реакции на 4-й день опыта. У интактных крыс этот эффект ТГС-33 был более выражен: выявлено снижение количества выполненных реакций на 1-й, 2-й и 3-й дни, повышение латентного периода на 2-й и 4-й дни и времени реакции на 3-й день. Однако при тестировании через три месяца в группе реанимированных крыс с введением ТГС-33 улучшалось воспроизведение ранее приобретенного навыка: обнаружено снижение латентного периода и времени реакции по сравнению с введением плацебо, при этом последствий введения ТГС-33 ия-тактным крысам не наблюдалось. Введение ГВС-111 не повлияло на процессы обучения интактных животных. Вместе с тем у реанимированных крыс ГВС-111 улучшал как выработку навыка через 2 недели после инъекции (отмечено увеличение количества выполненных реакций на 1-й день и уменьшение времени реакции на 2-й, 3-й и 4-й дни), так и воспроизведение его при повторном тестировании через 3 месяца, о чем говорит повышение количества выполненных реакций и снижение времени реакции. Пирацетам способствовал некоторому улучшению выработки навыка у реанимированных животных (выявлено уменьшение времени реакции на 2-й день), но не влиял на воспроизведение его через 3 месяца. ТГС-8 не оказал значимого влияния на обучение реанимированных крыс. Отличий между животными с введением препаратов и плацебо по уровню пищевой мотивации не обнаружено. Отмечалось только снижение этого показателя у интактных крыс через 2 недели после инъекции ГВС-111.

Оценка болевой чувствительности крыс показала, что ГВС-111 и ТГС-33 приводят к частичной компенсации отклонений болевой чувствительности реанимированных крыс в тесте "горячая пластина" в период до 3-х месяцев. В тесте "отдергивания хвоста" последствия введения пептидов оживленным животным не

отмечаются. У интактных крыс оба пептида вызвали повышение болевой чувствительности в тесте "отдергивания хвоста", при этом в тесте "горячая пластина" ТГС-33 проявил анальгетический эффект. Пирацетам и ТГС-8 оказались неэффективными в данных тестах.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что однократное введение пептидных аналогов пирапегама, ГВС-111 и ТГС-33, после успешной сердечно-легочной реанимации способствует снижению постреанимациондой смертности, ускоряет исчезновение неврологического дефицита, нормализует уровень эмоциональной реактивности и ориентировочно-исследовательской реакции крыс, причем данные эффекты, по крайней мере, частично, сохраняются до 3-х месяцев после клинической смерти. Одновременно под действием этих пелтидов происходит ускорение угашенш двигательной активности живогных и, соответственно, привыкания к экспериментальной обстановке. Важно отметить, что ГВС-111 проявляет свои ан-тиамнестические свойства ка фоне постреанимационной патологии мозга. ТГС-33 оказал положительное влияние на обучение реанимированных животных на этапе извлечения памятно'0 следа, что характерно для Ц Ь-изомера, входящего в состав смеси, в то вре"4 как У интактных животных выявились амнестические эффекты Г, Б-изомера. наряду с отмеченным, обнаружено влияние данных пептидов на физическую вк-^сливость и бопевую чувствительность. Применение исходного прототипа - хп»ацетама на ранних этапах постреанимационного периода вызвало избыточную активацию поведения реанимированных животных, что соответствует клиническим данным. Следовательно, можно предположить, что механизмы действия пирацетама и его структурных аналогов существенно отличаются. В пользу этого говорит также тот факт, что при отсроченном (через 1 сутки после остановки сердца) введении ГВС-111 исчезают практически все его защитные эффекты. Пептид ТГС-8 считается эндогенным метаболитом ГВС-111 и его непосредственным действующим началом в мозге. Кроме того, есть данные, что ГВС-111 не способен проходить через ГЭБ. Однако обнаруженные отличия в эффектах ТГС-8 и ГВС-111 после реанимации можно объяснить тем, что вследствие нарушения проницаемости ГЭБ ГВС-111 проникает в мозг и запускает специфические механизмы действия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итоги проведенной работы, можно заключить, что в постреанимационном периоде после 12-мин клинической смерти, вызванной остановкой кровообращения в организме, у животных с начальным внешним восстановлением неврологического статуса происходят значительные изменения поведенческих реакций. Причем характер и направление этих изменений зависят от времени года, в которое проводятся эксперименты. Анализ полученных данных показал, что вследствие ишемического повреждения мозга в первую очередь страдает эмоционально-мотивационная сфера поведения. При этом наиболее серьезные нарушения касаются уровня пассивно-оборонительной мотивации. Одновременно отмечаются изменения мнестических функций, физической выносливости и болевой чувствительности. Иными словами, в постреанимационном периоде изменяются восприятие и оценка значимости стимулов окружающей обстановки, а, следовательно, и формирование целенаправленного поведения животных.

Существенно, что обнаруженные постреанимационные отклонения поведенческих реакций крыс можно было полностью или частично скомпенсировать с помощью однократной инъекции некоторых регуляторных пептидов. Пептид дельта-сна, использованный в качестве средства, модулирующего баланс возбуждающих и тормозных систем мозга, в посгреаяимациошюм периоде проявил характерные антистрессо-генные свойства. Однако его применение имело ряд негативных эффектов, в частности, угнетение спонтанного поведения и торможение процессов обучения животных. Исследование эффектов киоторфина и пептидных аналогов пирацетама при введении их после успешной сердечно-легочной реанимации показало, что эти разные по своим фармакологическим свойствам пептиды оказывают практически одинаковое положительное действие на восстановление функций ЦНС, лечебное на ранних этапах и профилактическое для отсроченных изменений. Важно, что у интактных крыс изменения поведения под влиянием данных пептидов были менее длительными и отличались по структуре по сравнению с реанимированными.

Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения возможностей использования рыуляторных пептидов для сердечно-легочной и мозговой реанимации и для профилактики постреанимационных энцефалопатии.

ВЫВОДЫ

1. Однократное применение ряда эндогенных и синтетических пептидов оказывает длительное влияние на характер и динамику лостреанимационных нарушений поведения, вызванных у самцов белых крыс 12-минутной клинической смертью.

2. В постреанимационном периоде на фоне внешне восстановленного неврологического статуса выявляются длительные нарушения поведения крыс: эмоциональной реактивности, ориентировочно-исследовательской реакции, способности к обучению, болевой чувствительности, физической выносливости.

3. Характер и динамика нарушений эмоциональной реактивности и ориентировочно-исследовательской реакции в значительной степени зависит от времени года, в которое проводили эксперименты, тогда как способность к обучению, болевая чувствительность и физическая выносливость снижаются у крыс независимо от сезона, в который они перенесли остановку кровообращения.

4. Введение пептида дельта-сна через 1 час после реанимации, не влияя на уровень смертности и начальное восстановление неврологического статуса, оказывает длительное (до 5-ти месяцев) положительное влияние на поведение крыс, нормализуя реакцию на стрессогенные стимулы. К негативным эффектам пептида дельта-сна относятся угнетение ориентировочно-исследовательской реакции в отсутствие стрессо-генных факторов, снижение пищевой мотивации и ухудшение обучения.

5. Введение киоторфина через 30 мин после реанимации уменьшает постреанимационную смертность, ускоряет восстановление неврологического статуса и нормализует поведение и мнестические функции крыс.

6. Введение пептидов ТГС-33 и ГВС-111 через 30 мин после реанимации оказывает наиболее благоприятное воздействие на восстановление функций ЦНС в постреанимационном периоде в противоположность пирацетаму, структурными аналогами которого они являются.

7. Выявленные различия во влиянии исследованных веществ на поведение реанимированных и интактных животных дают возможность утверждать, что направленность и длительность их эффектов в значительной мере определяется наличием или отсутствием постреанимационной патологии.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Харченко И.Б., Назаренко И.В., Зиганпшн Р.Х., Кошелев В.Б., Каменский А.А., Волков А.В. Влияние пептидов зимоспящих, неохиоторфина и киоторфина, на восстановительные процессы после 12-минутной остановки сердца. // Экспериментальные, клинические и организационные проблемы общей реаниматологии. Сборник трудов к 60-летию НИИ общей реаниматологии РАМН, под редакцией академика РАМН В. А. Неговского. - Москва. - 1996.-C.101-118.

2. Назаренко И.В., Каменский А.А., Волков А.В. Пострсанимационные изменения высшей нервной деятельности у крыс после 12-минутной останови! кровообращения. // Экспериментальные, клинические и организационные проблемы общей реаниматологии. Сборник трудов к 60-летию НИИ общей реаниматологии РАМН, под редакцией академика РАМН В.А. Неговского. - Москва. - 1996. - с.89-100.

3. Nazarenko I.V., Volkov A.V., Kamensky А.А. The neokyotorphin administration 12 min after cardiac anest influences on rat behaviour. // Abstract book of 1st Congress of the Neurowissenschaftliche Gesellschaft. - Berlin. - 1996. - p.192.

4. Назаренко И.В. Влияние пептидов с ноотропной активностью на течение постреанимационного процесса у крыс, перенесших 12-мин остановку сердца. // Тезисы конференции "Передовые рубежи анестезиологии и интенсивной терапии в медицине катастроф". - Новокузнецк. - 1996. - с.35.

5. Фигурина И.Б., Назаренко И.В., Зиганшил Р.Х., Волков А.В. Влияние пептидов зимоспящих неокиоторфина и киоторфина на восстановление крыс после 12-мин остановки сердца. // Тезисы конференции "Передовые рубежи анестезиологии и интенсивной терапии в медицине катастроф". - Новокузнецк. - 1996. - с.55.

6. Волков А.В., Назаренко И.В., Харченко И.Б., Мишарина Г.В., Муравьев О.Б., Аврущенко М.Ш., Пылова СЛ. Регуляторные пептиды для сердечно-легочной и мозговой реанимации после длительной остановки сердца. // Тезисы докладов 1-й Российского конгресса по патофизиологии "Патофизиология органов и систем". - Москва. - 1996. - с.293-294.

7. Nazarenko I.V., Volkov A.V., Kamensky А.А., Ziganshin R. The behavioural effects of kyotorphin in rats subjected to ischemia. // Fifth International Behavioral Neuroscience Society Conference. - Mexico. - 1996. - p.SO.

8. Nazarenko I.V., Volkov A.V., Kamensky A.A., Gudasheva T.A. The behavioral effects of peptide analogues of piracetam in rats subjected to ischemia. П Annual Meeting of the European Behavioural Pharmacology Society. - Cagliary. - 1996. - Behav. Pharmacol. -v.7. - Supp.l. 1. - p.74-75.

9. Nazarenko I.V., Kamensky A.A., Gudasheva T.A., Volkov A.V. The influence of piracetam peptide analogies on postischemic recovery in rats. // 6th International Symposium on Pharmacology of Cerebral Ischemia. - Marburg. - 1996. - p.102.

10. Misharina G.V., Nazarenko I.V., Volkov A.V. The treatment of postischemic disorders with oxitocin in rats. // 6th International Symposium on Pharmacology of Cerebral Ischemia. - Marburg. -1996. - p.100.

11. Nazarenko I.V., Kamensky A.A., Ziganshin R., Volkov A.V. The correction of postischemic behavioural disorders with kyotorphin in rats. // 2nd Meeting of European Neuroscience. - Strasbourg. - 1996, - p. 144.

12. Назаренко И.В., Волков A.B., Каменский А.А. Поведенческие эффекты пептида дельта-сна в постреанимационном периоде у крыс, перенесших 12-минутную ос-

тановку сердца. II Реаниматология на рубеже XXI века. Материалы Международного симпозиума, посвященного 60-летию НИИ общей реаниматологии РАМН. - Москва. - 1996.-c.50.

13. Харченко И.Б., Назаренко И.В., Кошелев В.Б., Волков А.В. Изменения регуляции сердечно-сосудистой системы в отделенном постреанимационном периоде. // Реаниматология на рубеже XXI века. Материалы Международного симпозиума, посвященного 60-летию НИИ общей реаниматологии РАМН. - Москва. - 1996. - с.70.

14. Назаренко И.В., Каменский А.А., Гудашева Т.А., Волков А.В. Постреанимационное восстановление функций ЦНС при системном введении новых пептидных аналогов пирацетама. // БЭМиБ. - 1997. - в печати.

15. Nazarenko I.V., Kamensky А.А., Volkov A.V. The delayed behavioral consequences of 12 mia cardiac airest-type cerebral ischemia in rats. // 6th Meeting of the International Neurotoxicology Association. - Szeged. - 1997. - p.105.

16. Назаренко И.В., Волков A.B., Каменский A.A., Гудашева Т.А. Влияние пептидов с ноотропной активностью на восстановление функций ЦНС после клинической смерти. // Вестник РАМН. - 1997. - в печати.

17. Nazarenko I.V., Kamensky А.А., Gudasheva Т.А., Volkov A.V. The effects of drugs with nootropic activity on neurological recovery after cardiac arrest. // Abstracts of International congress of physiological sciences. - St. Petersburg. - 1997. -P093.26.