Влияние экзогенных липидов и антиоксидантов на выживаемость и функциональную активность клеток личинок моллюсков и иглокожих после криоконсервации

Борода, Андрей Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние экзогенных липидов и антиоксидантов на выживаемость и функциональную активность клеток личинок моллюсков и иглокожих после криоконсервации
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Влияние экзогенных липидов и антиоксидантов на выживаемость и функциональную активность клеток личинок моллюсков и иглокожих после криоконсервации"

БОРОДА АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ ЛИПИДОВ И АНТИОКСИДАНТОВ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ЛИЧИНОК МОЛЛЮСКОВ И ИГЛОКОЖИХ ПОСЛЕ КРИОКОНСЕРВАЦИИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 9 .ПЕН ?010

004616245

На правах рукописи

БОРОДА АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Одинцова Нэлия Адольфовна

доктор биологических наук, Светашев Василий Иванович

доктор биологических наук, Жадан Петр Михайлович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится «23» декабря 2010 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 005.008.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН, по адресу: 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17. Телефон: 7 (4232) 31-09-05, факс: 7 (4232) 31-09-00.

E-mail: inmarbio@mail.primorye.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии моря им. A.B. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН (690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17).

Отзывы просим присылать на e-mail: mvaschenko@mail.ru

Автореферат разослан «■/<?» ноября 2010 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета, М.А. Ващенко

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Криоконсервация клеток личинок и целых эмбрионов - один из перспективных путей сохранения генофонда промысловых, а также редких и исчезающих видов животных и растений (Withers, 1987; Seymour, 1994). Учитывая, что водные экосистемы более уязвимы к антропогенной нагрузке, чем наземные, по инициативе профессора Б.Н. Вепринцева для исследования криоконсервации половых и эмбриональных клеток гидробионтов был разработан всероссийский проект "Низкотемпературный генетический банк промысловых и редких видов рыб и беспозвоночных". Актуальность развития методов криоконсервации клеток морских гидробионтов определяется не только необходимостью сохранения генофонда морских организмов в условиях усиливающегося антропогенного воздействия на Мировой океан, но и связана с потенциальной возможностью работы с эмбрионами и клетками этих объектов в течение всего года.

Различия в структуре и функции клеток являются причиной их неодинаковой реакции на низкую температуру, поэтому метод замораживания-оттаивания, разработанный для криоконсервации клеток одного вида, зачастую нельзя использовать для клеток других видов организмов. При замораживании клеток моллюсков и иглокожих в присутствии только традиционных криопротекторов, таких как диметилсульфоксид (ДМСО) и глицерин, используемых для криоконсервации клеток млекопитающих, происходит массовая гибель клеток, которая сопровождается значительным выходом свободных жирных кислот из липидов клеток. Ранее было установлено, что липидные экстракты из тканей морских гидробионтов с низкими температурами фазовых переходов обладают эффективными криозащитными свойствами и могут влиять на целостность клеточных мембран морских беспозвоночных (Odintsova et al., 2001; Odintsova et al., 2006). Особый состав жирных кислот клеточных мембран морских гидробионтов, в которых преобладают ненасыщенные жирные кислоты, влияет на криоустойчивость клеток этих объектов и требует принципиально новых подходов.

Цель и задачи работы

Цель работы - разработка новых типов криопротекторов для клеток моллюсков и иглокожих. Работа направлена на исследование механизмов криоустойчивости клеток этих объектов и ориентирована на сохранение биоразнообразия морских организмов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать оптимальные режимы для замораживания-оттаивания клеток моллюсков и иглокожих и изучить кинетику формирования, роста и перекристаллизации частиц льда при замораживании криозащитных смесей различного состава.

2. Исследовать выживаемость клеток личинок моллюсков и иглокожих после глубокого замораживания в присутствии традиционных криопротекторов.

3. Изучить влияние антиоксидантов и экзогенных липидов из тканей морских гидробионтов на выживаемость клеток личинок моллюсков и иглокожих после цикла замораживания-оттаивания.

4. Провести сравнительное морфофункциональное исследование клеток личинок моллюсков и иглокожих после цикла замораживания-оттаивания в присутствии традиционных криопротекторов и разработанных нами криозащитных смесей.

5. Изучить состав жирных кислот липидов клеток личинок моллюсков и иглокожих до и после замораживания в криозащитных смесях различного состава.

Научная новизна и теоретическое значение работы

Предложен новый подход для сохранения клеток морских беспозвоночных, включающий совместное использование мембранных стабилизаторов, экзогенных липидов и антиоксидантов. Комбинация этих компонентов обладает синергизмом действия, способствуя восстановлению физиологической активности клеток моллюсков и иглокожих после глубокого замораживания. Впервые установлено, что антиоксиданты, как отдельные компоненты криозащитной смеси, не обладают защитным действием. Обнаружены значительные различия в составе жирных кислот липидов клеток личинок до и после замораживания. Введение дополнительных криопротекторов (экзогенных липидов и антиоксидантов) в смеси, содержащие ДМСО и трегалозу, приводит к увеличению количества жизнеспособных клеток после оттаивания и, как следствие, снижению доли насыщенных жирных кислот, повышению доли моноеновых и полиеновых жирных кислот.

Научно-практическое значение работы

Развитие данного направления исследований позволит снять географические, сезонные и временные ограничения при проведении экспериментальных работ на половых клетках и эмбрионах морских животных. Понимание механизмов криоповреждений будет способствовать созданию новых эффективных криопротекторов, использование которых даст возможность значительно увеличить количество жизнеспособных клеток морских беспозвоночных после оттаивания, и тем самым способствовать развитию биотехнологий, основанных на использовании культур клеток морских организмов. Запатентован новый способ криосохранения клеток морских беспозвоночных (Патент Российской Федерации № 2314687).

Личный вклад автора

Личное участие автора заключается в планировании, подготовке и проведении экспериментов, статистической обработке и анализе полученных результатов. Автором в полном объеме выполнена экспериментальная часть исследования: получение первичных культур клеток морских гидробионтов,

приготовление криозащитных смесей, замораживание и оттаивание клеток, определение функциональной активности клеток с использованием биохимических методов, наблюдение за процессами формирования частиц льда в криозащитных смесях. Кроме того, сформирована электронная база публикаций по криобиологии.

Апробация работы и публикации

Результаты работы были представлены на международной конференции «Инновации в науке и образовании» (Калининград, 2005), 1-ом Дальневосточном международном симпозиуме по естественным наукам («1st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences», Владивосток, 2008), школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 2008), международной конференции «Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия» (Пущино, 2008), международной конференции Общества Криобиологии (CRYO 2009, «46th Annual Meeting of the Society for Cryobiology», Саппоро, Япония).

По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК и 1 патент Российской Федерации.

Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (07-0400367), ДВО РАН (09-I-P22-04; 09-II-CO-06-001; 09-III-A-06-206 и НТ-08-016-04) и Фонда Содействия Развития малых форм предприятий в научно-технической сфере (2009-2010 гг.).

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 109 страницах, иллюстрирована 14 рисунками и 7 таблицами. Список литературы содержит 168 наименований, из них 153 на английском языке.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал

Двустворчатые моллюски (Mytilus trossulus) и морские ежи (' Strongylocentrotus intermedius) были собраны в заливе Восток Японского моря. Личинки получали путем искусственного оплодотворения. Личинки моллюсков на стадии трохофоры (24—26 ч после оплодотворения) и морских ежей на стадии плавающей бластулы (14-15 ч после оплодотворения) собирали на нейлоновые фильтры (размер ячеи 30 мкм).

Личинки морских беспозвоночных на ранних стадиях развития отличаются повышенной чувствительностью к различным неблагоприятным факторам окружающей среды, поэтому первичные культуры их клеток были выбраны в качестве модельных систем.

Получение первичных клеточных культур

Первичные клеточные культуры получали диссоциацией личинок коллагеназой (препарат получен из печени краба Paralithodes camtschatica, ТИБОХ ДВО РАН). Концентрация суспензии клеток перед добавлением криопротекторов составляла 5—10х10б клеток/мл для моллюсков и 13-26х10б клеток/мл для морских ежей.

Экстракция липидов

Материалом для получения общих липидных экстрактов послужили ткани зеленых водорослей Viva fenestrata, гонады морских ежей S. intermedius и мягкие ткани двустворчатых моллюсков Crenomytilus grayanus. Все гидробионты были собраны в Амурском заливе (Японское море) в октябре-ноябре 2004—2009 гг.

Суспензию клеток (0.33 мл) личинок (М. trossulus и S. intermedius) осаждали центрифугированием 10 мин при 500 g. К осадку клеток до замораживания добавляли 1 мл стерильной морской воды, а для изучения вклада экзогенных липидов в состав жирных кислот липидов клеток до замораживания к осадку клеток добавляли 0.33 мл морской воды и 0.66 мл криозащитной смеси, содержащей ДМСО, трегалозу, общий липидный экстракт мидии С. grayanus, витамины С и Е. После замораживания-оттаивания к осадку клеток добавляли 1 мл стерильной морской воды. Эти суспензии клеток использовали для дальнейшей экстракции липидов.

Экстракцию общих липидов проводили по методу Фолча (Folch et al., 1957). В качестве антиоксиданта к препаратам липидов добавляли ионол (конечная концентрация в липидном экстракте 0.01%).

Разделение общего липидного экстракта С. grayanus проводили на колонке с силикагелем. Элюирование неполярных липидов проводили с помощью хлороформа и системы хлороформ-ацетон (1:1, по объему). Фракцию полярных липидов получали последовательным элюированием системами: хлороформ-метанол-вода (50:50:5, по объему); метанол; метанол-хлороформ-вода (70:30:10, по объему). Полученные фракции упаривали и растворяли в хлороформе.

Анализ состава жирных кислот липидов

Метиловые эфиры жирных кислот фосфолипидов получали метанолизом липидных экстрактов с безводной 5% HCl в метаноле при 95°С в течение 1 ч (Christie, 1993). Анализ метиловых эфиров ЖК проводили на газо-жидкостном хроматографе GC-9A (Shimadzu, Япония), оснащенным ионизационным детектором и колонкой 25 м х 0.25 мм с фазой Carbowax 20М. Идентификацию пиков МЭЖК на хроматограммах осуществляли на основании индексов эквивалентной длины цепи (Stransky et al., 1997) и при сравнении с известными стандартами.

Криопротекторы

Растворы всех криопротекторов были приготовлены на стерильной морской воде. В качестве основных криопротекторов использовали ДМСО, этиленгликоль, глицерин (в концентрации 10%) и трегалозу (20%). Аликвоты экзогенных липидов (общего липидного экстракта мидии С. grayanus (МЛЭ), фракции полярных (МЛЭп) и неполярных (МЛЭнп) липидов, общего липидного экстракта ульвы U. fenestrata (УЛЭ), холестерина или лецитина) вносили в криозащитные смеси (конечная концентрация 0.085-0.15%), нагретые до 68-70°С, и обрабатывали ультразвуком (30 КГц, 1-2 мин) с помощью ультразвукового диспергатора (Labsonic, Германия).

После внесения липидных экстрактов в криозащитные смеси добавляли в разных сочетаниях антиоксиданты (указана концентрация в криозащитной смеси): а-токоферол (витамин Е) (MP Biomedicals, Франция) - 0.01%, аскорбиновую кислоту (витамин С) (Sigma, США) - 0.005%, синтетический эхинохром (ТИБОХ ДВО РАН) - 0.01%, каталазу (Sigma) - 0.005-0.01%, супероксиддисмутазу (Sigma) - 0.005-0.01%, и восстановленный глутатион (Sigma) - 0.001%.

Замораживание суспензии клеток

Аликвоты суспензии клеток переносили в стерильные криопробирки (ТРР, Швейцария), последние помещали на ледяную баню и затем постепенно добавляли раствор криопротектора. Подготовленные образцы в ледяной бане переносили в холодильную камеру и инкубировали 10 мин при 4°С. Дальнейшее замораживание проводили, используя один из следующих режимов. Режим замораживания №1 - охлаждение с 4 до -80°С в парах жидкого азота в пенопластовой камере в течение 20 мин (скорость охлаждения -4°С/мин) с последующим замораживанием в жидком азоте. Режим замораживания №2 - охлаждение с 4 до -33°С в криостате (LAUDA, Германия) с постоянным перемешиванием в течение 15 мин (скорость охлаждения -2.5сС/мин), затем замораживание в морозильной камере до -80°С. Режим замораживания №3 - охлаждение с 4 до -33°С в криостате в течение 15 мин (скорость охлаждения -2.5°С/мин) с последующим помещением образцов в жидкий азот.

Оттаивание суспензии клеток

Через сутки хранения в жидком азоте, криопробирки помещали для оттаивания в водяную баню (18-20°С) при постоянном перемешивании. Сразу после оттаивания, к содержимому криопробирок постепенно добавляли 10 объемов стерильной морской воды (4°С). Образцы центрифугировали в течение 5 мин при 310 g, промывали морской водой и ресуспендировали в 0.33 мл модифицированной среды Лейбовича. Часть клеток после оттаивания культивировали при 17°С в течение 24—120 ч в 24-луночных планшетах (Corning, США), концентрация при посеве составляла 2-3*106 клеток/мл. Другую часть клеток использовали для приготовления липидного экстракта и дальнейшего изучения состава его жирных кислот.

Определение жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток оценивали до замораживания (интактные клетки), сразу после оттаивания (в пределах 40 мин) и через 24, 48, 72, 96 и 120 ч культивирования с помощью теста по исключению красителя трипанового синего, проводя прямой подсчет клеток в камере Горяева, и методом двойной окраски флуоресцентными красителями: флуоресцеин диацетат — пропидий йодид (Jones, Senft, 1985). Количество живых и мертвых клеток подсчитывали, по крайней мере, в пяти различных полях зрения по 500 клеток в трех параллелях. Количество разрушившихся клеток определяли по разнице между концентрацией клеток до замораживания и общей концентрацией живых и мертвых клеток после замораживания-оттаивания. Часть клеток культивировали в 24-луночных планшетах, наблюдая за морфологическими изменениями оттаянных клеток в течение нескольких суток. Наблюдения за клетками проводили с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 200 (Carl Zeiss, Германия).

Кроме оценки жизнеспособности клеток с помощью красителей, использовали МТТ-тест (восстановление 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида ферментами митохондрий), который проводили по стандартной методике (Mosmann, 1983). В течение часа после оттаивания к клеткам был добавлен МТТ, после чего клетки инкубировали в темноте при 18°С от 2 до 18 ч. Для растворения кристаллов формазана в каждую лунку добавляли 150 мкл 0.04N HCl в изопропаноле, оптическую плотность полученного раствора измеряли при длинах волн 595 нм/620 нм с помощью планшетного спектрофотометра DTX-880 (Beckman-Coulter, США). В качестве отрицательного контроля использовали стерильную среду L-15M без клеток. Оптическая плотность раствора, полученного после МТТ-теста клеток до замораживания, была принята за 100% и соответствовала максимальному уровню жизнеспособности клеток (положительный контроль).

Оценка пролиферативной активности клеток

Включение аналогов нуклеотидов в состав ядерной ДНК является показателем пролиферативной активности клеток (Zaldibar et al., 2004). Пролиферативную активность клеток в течение часа после оттаивания оценивали с помощью включения аналога тимидина - 5-бромо-2'-

дезоксиуридина (БДУ). Клетки инкубировали в присутствии 1 мМ БДУ в течение 24 ч при 18°С и фиксировали 4%-ым параформальдегидом. Детекцию БДУ-иммуноположительных клеток проводили с использованием метода непрямой иммунофлуоресценции. Препараты анализировали на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе TCS SP5 (Leica, Германия).

Криомикроскопия

Образцы криозащитных смесей, помещенных в камеру Фукса-Розенталя, охлаждали парами азота, затем жидким азотом, со скоростью от -20 до -25°С/мин. Наблюдения проводили в отраженном свете с использованием микроскопа Orthoplan (Leitz, Германия), оснащенным видеокамерой ВК-32 (Россия). Температуру образцов измеряли с помощью электронного термометра UT-320 (Uni-Trend, Гонконг) со специально изготовленной термопарой. Измерение геометрических параметров образующихся частиц льда проводили с помощью программы Reconstruct v. 1.1.0 (Copyright О 2007 John С. Fiala) по полученным фотографиям.

Статистический анализ

Процентное содержание ЖК (ЖК, содержание которых составляло менее 0.5%, не учитывали), количество насыщенных, моноеновых и полиеновых ЖК анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA по тесту Ньюмана-Кеулса. Количество живых и мертвых клеток, геометрические параметры частиц льда анализировали с помощью Т-теста. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Уровень значимости в 0.05 был выбран как минимальное значение статистической разницы во всех экспериментах. Результаты были обработаны при помощи программы Statistica v.6 (StatSoft Inc., 2001, www.statsoft.com).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Жизнеспособность клеток личинок моллюсков и иглокожих

Жизнеспособность интактных клеток моллюсков и иглокожих составляла не менее 95%. После цикла замораживания-оттаивания жизнеспособность клеток, замороженных без криопротекторов, не превышала 2-2.5%. Из тестированных режимов замораживания наиболее эффективными для клеток мидии оказалось охлаждение с 4 до -33°С со скоростью -2.5°С/мин с последующим помещением образцов в жидкий азот (режим №3), а для клеток морских ежей - охлаждение с 4 до -80°С со скоростью —4°С/мин с последующим замораживанием в жидком азоте (режим №1).

Важным моментом для криосохранения клеток мидии было присутствие проникающих через мембрану криопротекторов (ДМСО, метанола, глицерина или этиленгликоля). Без них введение других компонентов криозащитной смеси было неэффективно, хотя в присутствии проникающих криопротекторов выход живых клеток мидии после замораживания-оттаивания составлял около 5%. Жизнеспособность клеток морского ежа, напротив, снижалась при использовании проникающих криопротекторов, поэтому в качестве основного криопротектора в этом случае мы использовали непроникающий

криопротектор, дисахарид трегалозу, позволивший сохранить до 20% живых клеток (оценка с помощью витальных красителей).

Как известно, низкие температуры вызывают перестройку всего клеточного метаболизма (Raison, 1973). При отрицательных температурах может развиваться перекисное окисление липидов (Roca et al., 2005). В зависимости от температуры окружающей среды в мембранных липидах могут происходить изменения структуры цепей жирных кислот. Липиды в жидкокристаллическом состоянии способны восстанавливать области разрушения или препятствовать повреждению мембраны во время замораживания-оттаивания (Watson, 1981). Добавление к клеткам яичного желтка или холестерина значительно увеличивает стабильность мембран клеток, как позвоночных, так и беспозвоночных животных при различных неблагоприятных воздействиях, в том числе и при замораживании (Darin-Bennet, White, 1977; Watson, 1981; Goncharenko, Katkov, 1985; Katkov et al., 1996; Grout, McFadzen, 1999). Одной из возможных причин такого эффекта может быть снижение перекисного окисления липидов в присутствии экзогенных липидов (Darin-Bennet, White, 1977). Тестирование криопротекторов липидной природы показало, что добавление УЛЭ, холестерина или лецитина к смеси ДМСО и трегалозы (при замораживании клеток мидии) или к трегалозе (при замораживании клеток морского ежа) незначительно влияло на выход жизнеспособных клеток личинок этих животных, тогда как при использовании МЛЭ выход таких клеток увеличивался до 23-35%. Для определения компонента МЛЭ, обладающего криозащитным эффектом, мы разделили его на фракции полярных (МЛЭп) и неполярных (МЛЭнп) липидов. Тестирование этих фракций показало, что введение МЛЭп достоверно не влияло на выход живых клеток после оттаивания, а в присутствии МЛЭнп количество жизнеспособных клеток увеличивалось до 17-26%. Но отдельные фракции МЛЭ не превосходили по своей эффективности общий липидный экстракт.

В настоящее время установлено, что помимо механического разрушения мембран в основе деструктивного действия глубокого замораживания может лежать внутриклеточная генерация активных форм кислорода (АФК). Окислительные повреждения вызваны дисбалансом между генерацией и утилизацией АФК. В норме утилизация обеспечивается необходимым количеством антиоксидантов как внутри, так и снаружи клетки. При замораживании клетка окружена криозащитной смесью, в которой может отсутствовать необходимая концентрация антиоксидантов, и клеточная мембрана становится уязвимой для окислительной атаки (Roca et al., 2005). Введение антиоксидантов (витамина С, витамина Е, эхинохрома, каталазы, супероксиддисмутазы или восстановленного глутатиона) в любой комбинации в отсутствии каких-либо липидных экстрактов, практически не оказывало влияния на жизнеспособность клеток после оттаивания. Однако значительное повышение жизнеспособности клеток наблюдали при добавлении антиоксидантов в присутствии липидных экстрактов: добавление витаминов С и Е в присутствии МЛЭ позволило получить до 38% жизнеспособных клеток

мидии (в отличии от 25% в присутствии только МЛЭ), а добавление эхинохрома позволило получить до 52% живых клеток морского ежа (в отличии от 34% в присутствии только МЛЭ).

Введение каталазы, супероксиддисмутазы и восстановленного глутатиона, по отдельности и в комплексе друг с другом, в криозащитные смеси, содержащие МЛЭ, показало свою неэффективность в нашем исследовании. В целом, информация по использованию ферментов каталазы и супероксиддисмутазы при криоконсервации противоречива. В одних случаях, их добавление (совместно или по отдельности) оказывалось малоэффективным (Limaye, 1997). Введение супероксиддисмутазы приводило к значительной гибели клеток из-за дополнительной генерации перекиси водорода и сопровождалось фрагментацией молекул ДНК, характерной для апоптоза (Baumber, 2003). В других случаях было отмечено, что введение этих антиоксидантов значительно снижало уровень активных форм кислорода, а, следовательно, способствовало сохранению замораживаемых клеток (Diñara et al., 2001; Roca et al., 2005). Возможно, противоречивость этих результатов связана с особенностями объектов, выбранных для криоконсервации, либо с раздельным использованием ферментов, функционирующих в клетке совместно.

МТТ-тест клеток личинок моллюсков и иглокожих

Результаты МТТ-тестов показали, что жизнеспособность клеток мидии, замороженных в присутствии ДМСО и трегалозы, через 18ч после оттаивания составляла 5-6% от уровня положительного контроля (рис. 1). При введении в эту смесь МЛЭ, количество живых клеток возрастало до 25%. При дополнительном введении антиоксидантов, таких как витамины С и Е, процент жизнеспособных клеток мидии увеличивался до 30%. Проверка криозащитных свойств отдельных фракций МЛЭ показала, что добавление фракции полярных липидов в смесь ДМСО и трегалозы не влияет на выход жизнеспособных клеток после оттаивания, этот показатель остается таким же, как и при использовании смеси ДМСО и трегалозы. Введение фракции неполярных липидов МЛЭ повышало количество живых клеток до 15%.

При замораживании клеток морского ежа в присутствии только трегалозы выход жизнеспособных клеток достигал 50% от уровня положительного контроля (рис. 2). Использование трегалозы совместно с МЛЭ позволяло сохранять до 75% жизнеспособных клеток. Между фракциями МЛЭ не было выявлено достоверных отличий: жизнеспособность достигала 58-63%. Таким образом, количество жизнеспособных клеток при введении отдельных фракций не превышало количество таковых при использовании МЛЭ. Наиболее эффективной оказалась криозащитная смесь, состоящая из трегалозы, МЛЭ и эхинохрома: количество жизнеспособных клеток морских ежей после оттаивания достигало 90%.

и о

ь а> Ч

•л л

Й о я ю о и о с и

** ** П

■ 1—||д 31 п_О_11. 1 1

123456789

Рис. 1. Жизнеспособность клеток трохофоры мидии Муй1т 1го$зи1из до и после замораживания-оттаивания (результаты МТТ-теста):

1 - клетки до замораживания (положительный контроль); 2 - среда Ь-15М (отрицательный контроль); клетки, замороженные в присутствии: 3

- глицерина и трегапозы; 4 - ДМСО и трегалозы; 5 - ДМСО, трегалозы и МЛЭ; 6

- ДМСО, трегалозы и МЛЭп; 7 - ДМСО, трегалозы и МЛЭнп; 8 - ДМСО, трегалозы, витаминов С и Е; 9 - ДМСО, трегалозы, МЛЭ, витаминов С и Е. МТТ введен через час после оттаивания клеток. Инкубация с МТТ -18 ч при 18°С. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Уровень значимости относительно значения №4: *Р < 0.05, **Р < 0.01.

100

а 80 о

л 60 &

о ж

(О

О!

3 20

Рис. 2. Жизнеспособность клеток плавающей бластулы морского ежа 81гоп£у1осеп1гош$ ШегтесНия до и после замораживания-оттаивания (результаты МТТ-теста):

1 - клетки до замораживания (положительный контроль); 2 - среда Ь-15М (отрицательный контроль); клетки, замороженные в присутствии: 3 -

этиленгликоля и трегалозы; 4 - ДМСО и трегалозы; 5 - трегалозы; 6 - трегалозы и МЛЭ; 7 - трегалозы и МЛЭп; 8 -

трегалозы и МЛЭнп; 9 - трегалозы, МЛЭ и Эх. МТТ введен через час после оттаивания клеток. Инкубация с МТТ - 18 ч при 18°С. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Уровень значимости относительно значения №5: *Р < 0.05; **Р <0.01.

Оценка морфологии и функциональной активности клеток моллюсков и

иглокожих

Только жизнеспособные и функционально активные клетки трохофоры мидии М. ¡го$5и1т могут дифференцироваться в культуре (Р1о1шкоу е1 а1., 2003), при этом часть из них может распластываться на субстрате и образовывать агрегаты, способных к спонтанному сокращению (рис. 3 А). Анализ поведения клеток в культуре после оттаивания показал, что клетки, замороженные в присутствии ДМСО и трегалозы, не распластывались даже через несколько суток после оттаивания (рис. 3 Б). Клетки, замороженные в присутствии криопротектора, в состав которого входили ДМСО, трегалоза, МЛЭ и антиоксиданты, уже через сутки после оттаивания распластывались (рис. 3 В). Более того, эти клетки, как и клетки до замораживания, через сутки начинали спонтанно сокращаться.

'чЬ

*» * Ч-г— О * "-Г.

а Ч

„ . У&Щц.

Рис. 3. Клетки трохофоры мидии Mvtilus trossulus в культуре: А -

г 1

контрольные клетки до замораживания (80-90% клеток способны к распластыванию через 24 ч культивирования); Б, В - клетки через сутки после оттаивания, замороженные в присутствии: Б - ДМСО и трегалозы (полное отсутствие распластанных клеток); В - ДМСО, трегалозы, МЛЭ, витаминов С и Е (70-80% клеток находятся в распластанном состоянии). Линейка - 50 мкм. Фотографии получены с использованием инвертированного микроскопа Axiovert 200 (Carl Zeiss, Германия).

Интактные клетки трохофоры мидии М. ¡гозвиЫз способны не только распластываться и сокращаться в культуре, но и включать аналоги нуклеотидов в синтезируемую ДНК (ОсН^воуа е1 а1., 2010). Среди клеток, замороженных в присутствии ДМСО и трегалозы, после оттаивания не было обнаружено БДУ-иммуноположительных клеток, что свидетельствует об отсутствии клеток, в которых идет синтез ДНК (рис. 4 А). При использовании криозащитной смеси, состоящей из ДМСО, трегалозы, МЛЭ, витаминов С и Е, часть клеток после оттаивания уже через сутки культивирования была способна включать БДУ (рис. 4 Б).

А I Б

Рис. 4. Присутствие 5-бромо-2'-дезоксиуридин-иммунеположительных клеток (зеленая окраска) личинок мидии Mytilus trossulus после замораживания с различными криопротекторами: А - ДМСО и трегалозы; Б - ДМСО, трегалозы, МЛЭ, витаминов С и Е. Ядра клеток окрашены в синий цвет. Клетки культивировали после оттаивания в течение 3 сут. Линейка — 25 мкм. Фотографии получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа TCS SP5 (Leica, Германия).

В норме клетки бластулы морского ежа прикрепляются к субстрату в течение 24 ч культивирования (Ермак, Одинцова, 1996), часть из них начинает собираться в агрегаты, образуя эмбрионоподобные структуры - эмбриоиды (рис. 5 А). После цикла замораживания-оттаивания в присутствии трегалозы и эхинохрома часть клеток сохраняла способность распластываться на субстрате (рис. 5 Б). Через 96 ч культивирования после оттаивания в некоторых случаях наблюдали появление пигментных гранул внутри клеток (рис. 5 В). Клетки после оттаивания, как и интактные клетки, были способны образовывать эмбриоиды, которые активно двигались в течение 5-10 сут, в некоторых случаях наблюдали «экзогаструляцию» и образование спикул (рис. 5 Г и Д).

Состав жирных кислот липидов мидии С. grayanus и ульвы U. fenestrata

Для того, чтобы понять механизм защиты клеточных мембран моллюсков и иглокожих при криоконсервации, мы изучили состав жирных кислот добавляемых экзогенных липидов и провели оценку изменений в липидном составе клеток личинок мидии и морского ежа до и после

замораживания. Результаты анализа жирных кислот липидов мидии С. grayanus (общего липидного экстракта и его фракций), ульвы и. /епе$1гМа, клеток личинок мидии М. 1го8зи1т и морского ежа 5. ШегтесИт до замораживания представлены в таблице 1.

Рис. 5. Клетки плавающей бластулы морского ежа Strongylocentrotus intermedius в культуре. А - контрольные клетки до замораживания через 24 ч культивирования; Б-Д - клетки после замораживания-оттаивания: в

присутствии трегалозы и Эх через 24 ч (Б) и 120 ч (В, Г) культивирования; Д - в присутствии трегалозы и МЛЭ через 96 ч культивирования. Линейка - 100 мкм. Фотографии получены с использованием инвертированного микроскопа

Axiovert 200 (Carl Zeiss, Германия).

J о 3Ч . ÄO

О ,r>

Таблица 1. Состав жирных кислот липидов мидии СгепотуШт $гауапт (МЛЭ), фракции неполярных (МЛЭнп) и полярных липидов С. gгауапю (МЛЭп), липидов ульвы 1]Ьа /ёле$£га/а (УЛЭ), клеток МуШиз ¡гоьъиЫъ и Йгои^у/осеп/го/г« ШегтеЛшя

МЛЭ МЛЭнп МЛЭп УЛЭ Клетки М. йчти/и) Клетки Я. Шегте<И1

14:0 3.2 3.8 4.5 3.1 2.9

14:1 1.0

15:0 2.0

16:0 20.6 18.8 19.3 5.9 36.4 19.0

16:1п-9 2.2 13.0 1.2 4.0 3.2

16:4п-3 42.5

18:0 6.9 2.2 6.9 11.0 13.2

18:1п-9 2.3 4.5 0.8 6.9 3.3

18:1п-7 3.2 5.2 2.5 0.9 1.5 1.4

18:2п-6 1.8 1.8 0.7 1.5 2.5 3.4

18:3п-3 21.2

18:4п-3 26.4

20:0 и 1.1

20:1п-9 6.3

20:1п-7 6.5 6.3 6.7 2.6 3.0

20:4п-б 4.9 2.3 4.7 1.3 14.5

20:5п-3 24.2 18.7 24.2 12.3 19.1

22:0 0.9 0.6 1.1 2.5

22:2 КМШ 5.1 2.8 5.4 0.9

22:5п-6 1.9 2.5 2.6 1.9

22:5п-3 2.3 0.8 1.2 1.6

22:бп-3 9.3 11.4 12.8 5.0 0.9

X 4.6 5.4 5-3 1.7 5.1 5.7

НЖК 31.6 25.4 31.9 5.9 54.3 38.2

МЖК 14.2 29.0 11.2 0.9 16.0 17.2

ПЖК 49.5 40.2 51.5 91.5 24.6 38.9

ИН 246 225 259 343 135 185

Примечание: Содержание ЖК дано в процентах. НЖК, насыщенные жирные кислоты; МЖК, мононенасыщенные жирные кислоты; ПЖК, полиненасыщенные жирные кислоты; ИН, индекс ненасыщенности; «X», неопределенные жирные кислоты. Жирные кислоты с содержанием менее 0.5% не учитывали. Стандартное отклонение было менее 0.5% для трех повторов.

В состав МЛЭ входило 32% насыщенных ЖК (НЖК), 14% моноеновых ЖК (МЖК) и 50% полиеновых ЖК (ПЖК). Основные ЖК в МЛЭ: эйкозапентаеновая (20:5п-3), пальмитиновая (16:0) и докозагексаеновая (22:6п-3). Индекс ненасыщенности (ИН) составил 246.

Заметны явные различия ЖК состава двух фракций МЛЭ. В МЛЭнп содержание НЖК немного ниже, чем в МЛЭп (на 6.5%). Практически в 3 раза выше доля МЖК (29.0 против 11.2%), особенно: 16:1п-9 (13 против 1.2%) и 18:1п-9 (4.5 против 0.8%).

Однако, в МЛЭнп содержание ПЖК было значительно ниже, чем в МЛЭп (40.2 против 51.5%): 20:5п-3 (18.7 против 24.2%), 22:2 КМЮ (2.8 против 5.4%), 20:4п-6 (2.3 против 4.77%), 22:6п-3 (11.4 против 12.8%). Как следствие, ИН липидов в МЛЭп был выше, чем в МЛЭнп (259 против 225).

В УЛЭ содержалось всего 6 достоверно определяемых жирных кислот: 16:4п-3 (42.5%), 18:4п-3 (26.4%), 18:3п-3 (21.2%), 16:0 (5.9%), 18:2п-6 (1.5%) и 18:1п-7 до 1%. Вследствие высокой доли ПЖК, УЛЭ имел самый высокий ИН среди исследованных экстрактов (343).

Состав жирных кислот липидов клеток трохофоры мидии М. ¡гоъхиШх

Проанализированы изменения в липидном составе клеток мидии до и после замораживания в присутствии традиционных криопротекторов (ДМСО и трегалозы) и криозащитных смесей, содержащих помимо ДМСО и трегалозы, экзогенные липиды и антиоксиданты.

Важно отметить, что инкубирование клеток в присутствии ДМСО, трегалозы, МЛЭ (в количестве 0.15% от объема криозащитной смеси) и антиоксидантов до замораживания, практически не повлияло на ЖК состав клеток.

После замораживания-оттаивания в ЖК составе липидов клеток личинок М. ¡гоязиЫз происходили весьма существенные изменения, которые зависели от применяемых криопротекторов. В присутствии ДМСО и трегалозы происходило увеличение доли НЖК с 52.7 до 61.6% и снижение ПЖК (с 25.9 до 14.0%): доля 20:5п-3 снижалась с 12.1 до 4.7%, 22:6п-3 с 5.8 до 2.9%, 22:5п-6 с 2.1 до 1.2%, а 20:4п-6 с 1.5 до 1.1%. Сумма МЖК увеличивалась с 16.8 до 20.3%. ИН снижался со 143 до 86.

В присутствии криозащитной смеси, состоящей из ДМСО, трегалозы, МЛЭ, витаминов С и Е, картина менялась. Происходило уменьшение доли НЖК с 52.7 до 33.3%, особенно значительное у 16:0 (с 35.6 до 21.8%). Возрастала доля МЖК (с 16.8 до 31.8%): с 6.3 до 13.6% у 18:1п-9 и с 1.5 до 2.9% у 18:1п-7, и доля ПЖК (с 25.9 до 29.8%). ИН незначительно возрастал: со 143 до 152.

Замораживание клеток сопровождается образованием АФК (Яоса й а1., 2005). Чувствительность мембраны к окислительному стрессу, главным образом, определяется количеством ПЖК, подвергающихся перекисному окислению в присутствии АФК, что ведет к потере жирных кислот плазматической мембраной, и, как следствие, к нарушению ее целостности и функций (Мирзоян и др., 2004).

Наблюдается четкий синергизм действия витаминов Е и С, один из этих антиоксидантов связан с клеточной мембраной, а другой находится в водной фазе. После взаимодействия витамина Е с активными формами кислорода, витамин С способен восстанавливать токофероксильный радикал витамина Е, обеспечивая «работоспособность» витамина Е в следующих циклах (Buettner, 1993).

В наших экспериментах была обнаружена отрицательная корреляция между выживаемостью клеток и долей НЖК (г = -0.9991) в общих липидах клеток личинок мидии после замораживания-оттаивания в присутствии криозащитных сред различного состава. В тоже время наблюдали отчетливую положительную корреляцию между выживаемостью клеток и количеством МЖК (г = 0.9926) и ПЖК (г = 0.9765) в липидах этих клеток (рис. 6). Введение дополнительных криопротекторов (экзогенных липидов и антиоксидантов) в смеси, содержащие ДМСО и трегалозу, приводит к увеличению количества жизнеспособных клеток после оттаивания и, как следствие, снижению доли НЖК, повышению доли МЖК и ПЖК.

Состав жирных кислот липидов клеток бластулы морского ежа S. intermedius

До замораживания в экстракте клеток плавающей бластулы S. intermedius по сравнению с экстрактом клеток трохофоры M. trossulus присутствовало меньше НЖК (38%), но доля ПЖК была выше (39%). ИН в липидных экстрактах клеток бластулы морского ежа был значительно выше (185 против 135, соответственно).

После замораживания в присутствии ДМСО и трегалозы или трегалозы и УЛЭ происходило увеличение доли насыщенных ЖК (с 38 до 43%), при этом сумма моноеновых ЖК уменьшалась (с 17.2 до 14%). Следует отметить снижение доли ПЖК в оттаянных клетках (с 38.9 до 34-35%). Как результат, ИН снижался со 185 до 160.

При замораживании клеток в смеси ДМСО, трегалозы, МЛЭ и эхинохрома, происходило незначительное снижение НЖК с 38 до 36.6%, в основном за счет уменьшения доли 18:0 (с 13.2 до 9.9%). Доли индивидуальных МЖК и ПЖК, и, как следствие, ИН практически не изменялись.

Замораживание в криозащитной смеси, содержащей трегалозу, МЛЭ и эхинохром, приводило к небольшому увеличению насыщенных ЖК (с 38.2 до 39.3%), однако доля 18:0 снижалась (с 13.2 до 11.7%). Доля МЖК увеличивалась (с 17.2 до 18.2%). Общая сумма ПЖК снижалась с 38.9 до 37.7% за счет снижения доли 20:4п-6 (с 14.5 до 13.3%), 20:5п-3 (с 19.1 до 18.5%). ИН практически не изменялся.

Жизнеспособность, % Рис. 6. Графики корреляции жизнеспособности клеток личинок мидии Mytilus trossulus (оценка с помощью флуоресцентных красителей) и содержания насыщенных жирных кислот (НЖК), моноеновых жирных кислот (МЖК), полиеновых жирных кислот (ПЖК) в общих липидных экстрактах клеток личинок мидии после замораживания-оттаивания в присутствии: 1 - ДМСО и трегалозы; 2 - ДМСО, трегалозы и МЛЭ; 3 - ДМСО, трегалозы, МЛЭ и витамина Е; 4 -ДМСО, трегалозы, МЛЭ, витаминов С и Е. Пунктирные линии - доверительные "интервалы при уровне значимости 0.05. Графики получены при помощи программы Statistica v.6 (StatSoft Inc., 2001).

Анализ состояния криозащитных смесей при замораживании

Основные повреждения клеточных структур в период замораживания прямо или косвенно связаны с образованием кристаллов льда (Белоус и др., 1987). По форме и размеру частиц льда, образующихся в среде, можно косвенно судить о возможных повреждениях клеток при замораживании. Чем более округлые и менее упорядоченные частицы, тем меньше повреждений клеток они вызовут, однако, формирование кристаллов льда внутри клеток является губительным (Bank, Mazur, 1973). Для прояснения механизмов повреждения клеток при замораживании-оттаивании в присутствии криозащитных смесей различного состава, необходимо, прежде всего, знать какие процессы протекают в самих смесях, и какое влияние оказывает каждый отдельный компонент на процессы образования, роста и перекристаллизации частиц льда. Было проведено тщательное наблюдение за этими процессами, протекающими при замораживании морской воды с добавлением ДМСО,

Жизнеспособность, %

трегалозы и МЛЭ (6.7, 13.3 и 0.07%, соответственно), исследованы температуры замораживания и плавления этих смесей.

Кривые кристаллизации и плавления криозащитных смесей при замораживании-оттаивании представлены на рисунке 7 (А и Б, соответственно). Температура замораживания морской воды, на основе которой готовились криозащитные смеси, составляла -1.6°С. При замораживании происходило переохлаждение криозащитных сред на 5-8°С ниже температуры кристаллизации, за исключением среды с МЛЭ. В присутствии эмульсии липидов не происходило переохлаждения среды, вероятнее всего, липиды служили центрами начала кристаллизации. Более того, эта смесь не обладала определенной температурой кристаллизации. Введение ДМСО снижало температуру кристаллизации морской воды на 3°С, а введение трегалозы - на 0.6°С. При таянии большинства сред отчетливой точки плавления не наблюдали. Возможно, это связано с многокомпонентностью растворов. Плавление криозащитной среды, содержащей морскую воду и МЛЭ, происходило в широком диапазоне температур (от -11 до -2°С). Вероятно, такие широкие диапазоны температур кристаллизации и плавления способствуют плавному формированию и росту кристаллов льда в криозащитной среде, содержащей липиды.

Рост частиц льда при замораживании морской воды происходил в одном направлении, концы частиц имели заостренную форму. Такой вид твердая морская вода сохраняла до температуры перекристаллизации частиц льда. При температуре -108°С заметно образование расколов, что является началом формирования более крупных частиц льда (перекристаллизации). Температура начала формирования сколов, главным образом, зависит от жесткости субстрата (Rabin et al., 2006). Чем ниже жесткость субстрата, тем ниже температура начала формирования сколов. При температуре жидкого азота происходило окончательное формирование частиц льда. Подобную картину наблюдали при замораживании криозащитной среды, содержащей трегалозу.

Рост частиц льда при замораживании криозащитных сред, содержащих МЛЭ, происходил в нескольких направлениях, ветви имели несимметричную форму, а края частиц были округлые.

Наши результаты подтверждают литературные данные о влиянии некоторых экзогенных липидов на рост кристаллов льда при сверхнизких температурах: кристаллы имеют более сглаженные края и меньший размер, а при высоких концентрациях экзогенных липидов совсем не образуются (Андреев и др., 2008).

Время, мин

дистиллированная вода морская вода

морская вода + 6.7% ДМСО

морская вода + 13.3% трегапоза

морская вода + 0.07% ОЛЭ СгетотуШш grayamts

Время, мин

Рис. 7. Кинетика процесса замораживания-оттаивания криозащитных смесей различного состава. А - замораживание, Б - оттаивание. Температуру образцов измеряли с помощью электронного термометра UT-320 (Uni-Trend, Гонконг) со специально разработанной термопарой.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что оптимальным режимом замораживания клеток трохофоры мидии МуШш йшзм/ги является постепенное охлаждение с 4 до -33°С со скоростью -2.5°С/мин с последующим погружением в жидкий азот. Для замораживания клеток плавающей бластулы морского ежа $1гоп%у1асеп1го1т ЫегтесИт наиболее эффективным является охлаждение с 4 до -80°С со скоростью -4°С/мин и погружение в жидкий азот. Впервые обнаружено, что наиболее плавно процесс кристаллизации происходит в среде, содержащей экзогенные липидные экстракты, при этом формирующиеся частицы льда имеют более сглаженные края и меньший размер.

2. Установлено, что замораживание-оттаивание клеток личинок моллюсков и иглокожих в присутствии только традиционных криопротекторов (ДМСО и трегалозы) приводит к разрушению и гибели более 80% клеток. Антиоксиданты, как отдельные компоненты криозащитной смеси, не обладают защитным действием. Присутствие проникающих криопротекторов принципиально для криосохранения клеток моллюсков, тогда как для клеток иглокожих использование этого типа криопротекторов неэффективно.

3. Показано, что введение в криозащитную смесь эмульсии липидов из тканей мидии СгепотуйЫя ^гауапш в комплексе с антиоксидантами (витаминами С и Е - при замораживании клеток личинок мидии М. эхинохромом - при замораживании клеток личинок морского ежа 5. ШегтесНия) позволяет сохранять жизнеспособными до 40% клеток мидии и до 90% клеток морского ежа. Липиды из тканей зеленой водоросли ЦЫа fenestrata обладали меньшим защитным действием.

4. Установлено, что функциональная активность клеток личинок моллюсков и иглокожих может быть восстановлена после замораживания в жидком азоте: клетки трохофоры мидии сохраняют способность к адгезии, образованию агрегатов сокращающихся клеток и пролиферативной активности в культуре; клетки плавающей бластулы морских ежей способны к образованию эмбриоидов, к дифференцировке в пигментные клетки и клетки, продуцирующие спикулы.

5. Обнаружены значительные различия в составе жирных кислот липидов клеток личинок до и после замораживания. При использовании традиционных криопротекторов (при большом количестве погибших клеток) в липидных экстрактах клеток после размораживания присутствует большое количество насыщенных жирных кислот по сравнению с таковым в клетках до замораживания. В случае использования криозащитных сред, содержащих экзогенные липиды и антиоксиданты, одновременно с увеличением доли выживших клеток возрастает и доля ненасыщенных жирных кислот.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в рецензируемых журналах из списка рекомендованного ВАК:

1. Одинцова НА., Борода A.B., Санина Н.М., Костецкий Э.Я. Создание Криобанка клеток и личинок морских беспозвоночных // Ветеринарная патология. 2007. № 3 (22). С. 254-256.

2. Костецкий Э.Я., Борода A.B., Одинцова H.A. Изменения липидного состава эмбриональных клеток мидии Mytilus irossulus в процессе криоконсервации // Биофизика. 2008. Т. 53, № 4. С. 658-665.

3. Odintsova N.A., Boroda A.V., Velansky P.V., Kostetsky E.Ya. Fatty acid profile changes of embryonic cells of marine invertebrates during cryopreservation // Cryobyology. 2009. V. 59. P. 335-343.

Патент Российской Федерации:

1. Одинцова H.A., Борода A.B., Агеенко Н.В., Костецкий Э.Я. Способ криосохранения клеток морских беспозвоночных // Патент на изобретение № 2314687. М„ 2008. Бюлл. № 2.

Публикации в материалах конференции:

1. Одинцова H.A., Агеенко Н.В., Борода A.B., Костецкий Э.Я. Новые криопротекторы - важнейший этап на пути создания криобанка морских беспозвоночных // Международная научная конференция "Инновации в науке и образовании - 2005", 19-21 октября: Труды научной конференции. Ч. 1. Калининград: Изд-во КГТУ, 2005. С. 79-80.

2. Одинцова H.A., Борода A.B., Костецкий Э.Я. Создание единого низкотемпературного генетического банка (криобанка) на Дальнем Востоке для хранения половых продуктов, эмбрионов, личинок и клеток морских беспозвоночных // Перспективные направления развития нанотехнологий в ДВО РАН: Рабочее совещание: доклады, Владивосток, 16 июня 2007 г. Владивосток: ИАПУ ДВО РАН, 2007. С. 113-124.

3. Борода A.B., Одинцова H.A., Костецкий Э.Я. Изменение липидного состава эмбриональных клеток морских беспозвоночных в процессе криоконсервации // Биофизика живой клетки. 2008. Т. 9. С. 29. [Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия: Материалы конференции (Пущино, 28-30 октября 2008 г.)].

4. Борода A.B., Одинцова H.A. Криоконсервация эмбриональных клеток моллюсков и иглокожих // Цитология. 2008. Т. 50. С. 797. [Всероссийская школа по клеточной биологии. С.Петербург (6-11 октября 2008): Тезисы докладов]

5. Boroda A.V., Odintsova N.A., Kostetsky E.Y. Cryoresistance study of marine hydrobiontes and Cryobank foundation // 1st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences. Vladivostok, September, 2-7,2008: Abstracts. Vladivostok, 2008. P. 15.

6. Одинцова H.A., Яковлев К.В., Дячук В.А., Борода A.B. Стволовые клетки морских беспозвоночных: регуляция пролиферации и направленной дифференцировки in vitro. Криосохранение // Информационный бюллетень «Клеточные культуры» (С.Петербург). 2008. № 23. С. 23-30.

7. Boroda A.V., Andreev A.A., Kostetsky E.Ya., Odintsova N.A. The search of new cryoprotective compounds for marine invertebrate cells // CRYO 2009. 46th Annual Meeting of the Society for Cryobiology. July 19-23,2009, Sapporo, Japan. P. 212.

БОРОДА АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ

АВТОРЕФЕРАТ

Подписан в печать 15.11.2010 Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1,39 Уч.-изд. л. 1,29 Тираж 100 Заказ 529 Типография ДВГТУ. 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Борода, Андрей Викторович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Устойчивость живых организмов к низким температурам.Ю

1.2 Причины гибели клеток при замораживании.

1.2.1 Фазовый переход мембранных липидов.

1.2.2 Кристаллизация воды.

1.2.3 Осмотический шок.

1.2.4 Изменение рН.

1.2.5 Изменения компонентов мембран клеток.

1.2.6 Индукция апоптоза.

1.3 Криопротекторы, используемые для защиты клеток при криоконсервации

1.3.1 Проникающие криопротекторы.

1.3.1.1 Диметилсульфоксид.

1.3.1.2 Спирты.

1.3.2 Непроникающие криопротекторы.

Г.3.2.1' Углеводы.

1.3.2.2 Экзогенные липиды.

1.3.2.3 Антиоксид анты.

1.3.2.44Низкомолекулярныс антифризы.

1.4 Режимы замораживания-оттаивания.

1.4.1 Одноэтапное замораживание.28'

1.4.2 Ступенчатое замораживание.

1.4.3 Оттаивание.

1.5 Криоконсервация клеток и личинок беспозвоночных животных.

ГЛАВА Т. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Животные.

2.2 Методы.

2.2.1Шолучение первичных культур клеток.

2.2.2 Получение экстрактов липидов.

2.2.3 Анализ состава жирных кислот липидов.

2.2.4 Криопротекторы.

2.2.5 Замораживание клеток.

2.2.6 Оттаивание клеток.

2.2.7 Оценка состояния клеток.

2.2.7.1 Определение жизнеспособности клеток.

2.2.7.2 МТТ-тест.

2.2.7.3 Оценка пролиферативнон активности клеток.

2.2.7.4 Выявление ранних стадий апоптоза клеток.

2.2.8 Криомикроскопия.

2.2.9 Статистический анализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Оценка жизнеспособности клеток.

3.1.1 Жизнеспособность клеток личинок мидии М. 1го$т1№.

3.1.1.1 Оценка жизнеспособности клеток мидии с помощью двойной окраски' флуоресцеин диацетат-пропидий йодид.

3.1.1.2 Оценка жизнеспособности клеток мидии с помощью МТТ-теста.

3.1.2 Жизнеспособность клеток личинок морского ежа & ШегтесИш.

3.1.2.1 Оценка жизнеспособности клеток морского ежа с помощью двойной* окраски флуоресцеин диацетат-пропидий йодид.

3.2 Оценка морфологии и функциональной активности клеток.

3.2.1 Морфология и функциональная активность клеток личинок мидии М. /пжи/ш.

3.2.2 Морфология и функциональная активность клеток личинок морского ежа & ЫегтеШиз.

3.2.3 Выявление ранних стадий апоптоза клеток личинок морского ежа ШегтеМш.

3.3. Состав жирных кислот липидов.

3.3.1 Выявление свободных жирных кислот в липидных экстрактах клеток личинок мидии М

3.3.2 Состав жирных кислот липидов мидии С. дгауапю и ульвы II. /епея(га((

3.3.3 Состав жирных кислот липидных экстрактов клеток личинок мидии М. (Г055и1ш.

3.3.4 Состав жирных кислот липидных экстрактов клеток личинок морского ежа & ШегтеМш.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние экзогенных липидов и антиоксидантов на выживаемость и функциональную активность клеток личинок моллюсков и иглокожих после криоконсервации"

Актуальность проблемы. Криобиология — раздел биологии, связанный с изучением; влиянияшизких:температур' на живые структуры. Ее прикладной ветвью является криоконсерващш— использование:: сверхнизких температур для сохранешшклетокжтканей.

Прошло более 60 лет с первой удачной - попытки замораживания сперматозоидов петуха. (Polge et al., 1949)- С тех пор получена масса новых данных о; сохранении живых органелл, клеток,, тканей; органов, и целых организмов при* сверхнизких температурах в течение длительного периода времени; Ключевыми этапами; развития? криоконсервации? являются: первая; попытка;, замораживания эритроцитов (Smith, 1950); рождение живого организма^ с использованием; сперматозоидов« после' замораживания; (Stewart, 1951); эксперименты по замораживанию клеток растений (Latta, 1971) и их каллюсных тканей: (Bannier, Steponkus, 1972); получение: жизнеспособных эмбрионов? мыши; после криоконсервации (Whittmgham et al., 1972; Wilmut, 1972); начало, использования методов! криобиологии для хранения¡эмбрионов ; человека;(Cohen et all, 1985):

Криоконсервация стала оптимальным методом; сохранения; коллекций культур микроорганизмов (Heckley, 1978; Alexander, Hatt, 1980; Kirsop, Shell,. 1984; Kirsop, Doyle,. 1991). Впервые идея использования низкотемпературной консервации половых и соматических клеток редких и исчезающих видов животных и растений была выдвинута Б.Н. Вепринцевым на XIV Конгрессе Международного Союза Охраны Природы (IUCN) (Veprintsev, Rott, 1979). С тех пор криоконсервацию стали использовать для сохранения; вымирающих видов растений (Withers, 1987) и животных (Seymour, 1994). По инициативе профессора Б.Н; Вепринцева с 1986 исследования по криоконсервации половых и эмбриональных клеток гидробионтов в России выполнялись в рамках проекта "Низкотемпературный, генетический банк промысловых и редких видов рыб и беспозвоночных".

В самом начале любого исследования должны быть оптимизированы режим замораживания,. набор криопротекторов: и: их концентрация. Точное управление • скоростью снижения, температуры позволяет контролировать размер, форму и локализацию: кристаллов? льда, а для защиты клеток при замораживании; нужны; криопротекторы. Различия- в; структуре и функции клеток являются причиной« их неодинаковой реакции на низкую температуру, поэтому метод замораживания-оттаивания, разработанный; для криоконсервации одного вида, зачастую> нельзя; использовать для? клеток других видов организмов. Особый состав жирных кислот клеточных мембран морских животных, в которых преобладают ненасыщенные жирные кислоты, влияет на криоустойчивость клеток этих объектов и требует принципиально новых криопротекторов;

Криоконсервация клеток личинок и целых эмбрионов. - один из перспективных путей; сохранения? генофонда промысловых, а также редких и исчезающих видов; животных и растений (Withers, 1987; Seymour, 1994). Актуальность развития; методов; криоконсервации; клеток морских гидробионтов определяется; не только необходимостью» сохранения генофонда* морских организмовш; условиях усиливающегося; антропогенного воздействия на Мировой океан; но и связана с; потенциальной возможностью работьь с эмбрионами и клеткамшэтих объектов в течение всего года.

Цель и задачи исследования. Цель работы - разработка новых типов криопротекторов для. клеток моллюсков и иглокожих. Работа направлена на исследование механизмов криоустойчивости клеток этих; объектов, и ориентирована на сохранение биоразнообразия морских организмов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

3: Изучить влияние антиоксидантов и экзогенных липидов из тканей морских гидробионтов на выживаемость клеток личинок моллюсков и иглокожих после цикла замораживания-оттаивания:

5. Изучить состав жирных кислот липидов клеток личинок моллюсков и иглокожих до и после замораживания* в криозащитных смесях различного состава:

Научная новизна и? теоретическое значение работы. Предложен новый подход для сохранения, клеток морских беспозвоночных, включающий совместное использование мембранных стабилизаторов, экзогенных липидов« и антиоксидантов. Комбинация этих компонентов обладает синергизмом действия, способствуя восстановлению физиологической активности клеток моллюсков и иглокожих после глубокого замораживания: Впервые установлено, что антиоксиданты, как отдельные компоненты криозащитной смеси, не обладают защитным действием. Обнаружены значительные различия в составе жирных кислот липидов клеток личинок до и после замораживания. Введение дополнительных криопротекторов (экзогенных липидов и антиоксидантов) в смеси, содержащие ДМСО и трегалозу, приводит к увеличению количества жизнеспособных клеток после оттаивания и, как следствие, снижению доли насыщенных жирных кислот, повышению доли моноеновых и полиеновых жирных кислот.

Научно-практическое значение работы. Развитие данного направления" исследований позволит снять географические, сезонные и временные ограничения при проведении экспериментальных работ на половых клетках и эмбрионах морских животных. Понимание механизмов криоповреждений будет способствовать созданию новых эффективных криопротекторов, использование, которых даст возможность - значительно увеличить количество жизнеспособных, клеток морских: беспозвоночных после оттаивания- и тем: самым способствовать развитию биотехнологий, основанных на использовании , культур клеток морских организмов. Запатентован новый; способ криосохранения клеток морских беспозвоночных (Патент Российской Федерации № 2314687).

Личный- вклад> автора. Личное участие автора заключается в планировании, подготовке и проведении экспериментов, статистической* обработке и; анализе полученных результатов. Автором в полном: объеме выполнена экспериментальная часть исследования: получение первичных культур клеток морских гидробионтов; приготовление криозащигных смесещ' замораживание и: оттаивание клеток, определение функциональной активности клеток с использованием биохимических методов, наблюдение за процессами; формирования частиц льда: в; криозащитных смесях. Кроме того, сформирована1электронная|база публикаций по криобиологии.

Апробация результатов. Результаты работы были представлены, на международной конференции «Инновации в науке и образовании» (Калининград, 2005), 1-ом Дальневосточном международном; симпозиуме по естественным наукам («1st Far-Eastern International Symposium on bife Sciences», Владивосток, 2008), школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 2008), международной конференции «Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия» (Пущино, 2008), международной конференции Общества Криобиологии (CRYO 2009, «46th Annual Meeting of the Society for Cryobiology», Саппоро, Япония).

Публикации; По теме диссертации опубликовано 11 работ. Из них 3 статьи опубликованы в журналах из списка, рекомендованного ВАК РФ, и 1 патент Российской Федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения исследования, заключения, выводов и списка литературы, включающего 168 цитируемых работ, из них-153 на английском языке. Диссертация изложена на 109 страницах печатного текста, иллюстрирована 14 рисунками и содержит 7 таблиц. Данная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (07-04-00367), ДВО РАН (09-I-P22-04; 09-II-CO-06-001; 09-III-A-06-206 и НТ-08-016-04) и Фонда Содействия Развития малых форм предприятий в научно-технической сфере (2009-2010 г.).

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Борода, Андрей Викторович

ВЫВОДЫ

1. Показано, что оптимальным режимом замораживания клеток трохофоры мидии МуШш и^яиЫ является постепенное охлаждение с 4 до —33°С со скоростью —2.5°С/мин с последующим погружением в жидкий азот. Для замораживания клеток плавающей бластулы морского ежа Strongylocentrotus ШегтесИт наиболее эффективным является охлаждение с 4 до -80°С со скоростью -4°С/мин и погружение в жидкий азот. Впервые обнаружено, что наиболее плавно процесс кристаллизации происходит в среде, содержащей экзогенные липидные экстракты, при этом формирующиеся частицы льда имеют более сглаженные края и меньший размер.

3. Показано, что введение в криозащитную смесь эмульсии липидов из тканей мидии СгепотуШт grayanus в комплексе с антиоксидантами (витаминами С и Е - при замораживании клеток личинок мидии М Ь-оББгЛш, эхинохромом - при замораживании клеток личинок морского ежа & ШегтесИш) позволяет сохранять жизнеспособными до 40% клеток мидии и до 90% клеток морского ежа. Липиды из тканей зеленой водоросли иЬа/епезП'Ма обладали меньшим защитным действием.

5. Обнаружены значительные различия в составе жирных кислот липидов клеток личинок до и после замораживания. В случае использования традиционных криопротекторов (при большом количестве погибших клеток) в липидных экстрактах клеток после оттаивания присутствует большое количество насыщенных жирных кислот по сравнению с таковым в клетках до замораживания. При использовании криозащитных сред, содержащих экзогенные липиды и антиоксиданты, одновременно с увеличением доли выживших клеток возрастает и доля ненасыщенных жирных кислот.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данном исследовании проведено тестирование криозащитных свойств различных антиоксидантов и липидных экстрактов из тканей некоторых морских гидробионтов, а также изучен липидный состав мембран клеток моллюсков и иглокожих до и после замораживания.

Антиоксиданты, как отдельные компоненты криозащитной смеси, практически не проявляли криозащитных свойств. Хотя известно несколько примеров, когда для снижения уровня перекисного окисления липидов, которое происходит в результате генерации свободных радикалов1 при замораживании-оттаивании, в криозащитную смесь вводили антиоксиданты: витамин Е (Matthes et al., 1987), витамин С (Lane et al., 2002) и эхинохром -нафтохиноидный пигмент из морских ежей (Naidenko, 1997). Однако в вышеуказанных статьях отмечен лишь незначительный эффект используемых антиоксидантов на биологическую активность клеток и личинок после оттаивания. В наших экспериментах эффект от введения антиоксидантов был заметен только при добавлении их в комплексе с экзогенными липидами. Необходимо отметить, что антиоксиданты обладали специфичностью действия в зависимости от типа клеток: добавление витаминов С и Е было эффективно только при замораживании клеток трохофоры мидии М. trossulus, а эхинохрома - только при замораживании клеток плавающей бластулы морского ежа S. intermedins.

Для успешного замораживания клеток личинок мидии М. trossulus необходимы проникающие криопротекторы (в частности, ДМСО), тогда как для при замораживании клеток морского ежа S. intermedins они, напротив, снижали жизнеспособность клеток после оттаивания. В результате проведенных исследований разработан способ криосохранения биологического материала, позволяющий сохранять жизнеспособными 4050% клеток морских моллюсков и иглокожих в отличие от 10-15% при использовании только традиционных криопротекторов. Установлен синергизм действия различных компонентов криозащитных смесей, а именно, мембранных стабилизаторов углеводной природы, экзогенных липидов и антиоксидантов, при криоконсервации клеток морских беспозвоночных. Обнаружено, что клетки, замороженные в криозащитной смеси, содержащей все эти компоненты, функционально активны: клетки личинок моллюсков были способны к распластыванию на субстрате и последующей миогенной дифференцировке. После глубокого замораживания часть из них была способна включать аналоги нуклеотидов в состав ядерной ДНК, что может являться показателем пролиферативной активности клеток (Zaldibar et al., 2004). Клетки морского ежа S. intermedins после замораживания закреплялись на субстрате, некоторые синтезировали пигментные гранулы и спикулы, образовывали эмбриоиды, которые активно двигались в течение 5-10 сут. Замораживание индуцировало апоптоз у 2025% клеток бластулы морского ежа независимо от состава криозащитной среды.

Результаты определения жизнеспособности клеток показали, что жизнеспособность клеток личинок моллюсков и иглокожих после замораживания-оттаивания в присутствии ДМСО и трегалозы составляла 10-20% от уровня положительного контроля. При введении в эту смесь МЛЭ количество живых клеток возрастало до 25-75%. Проверка криозащитных свойств фракций полярных и неполярных липидов МЛЭ показала, что эти фракции обладают меньшим криозащитным действием, чем общий липидный экстракт.

Как известно, низкие температуры вызывают перестройку всего клеточного метаболизма (Raison, 1973). В составе ЖК липидов клеток моллюсков и иглокожих до и после замораживания-оттаивания наблюдали весьма существенные различия, которые зависели от того, в присутствии каких криопротекторов были заморожены клетки. Замораживание клеток личинок моллюсков в присутствии традиционных криопротекторов (ДМСО и трегалозы) приводит к гибели 80-90% клеток, что сопровождается появлением в липидных экстрактах клеток свободных ЖК. Данные Бишофа с коллегами (Bischof et al., 2002) подтверждают факт появления свободных жирных кислот при гибели клеток после замораживания. В липидах клеток после замораживания в присутствии экзогенных липидов и антиоксидантов происходит увеличение доли ненасыщенных ЖК. Мы предполагаем, что высокая эффективность данной криозащитной смеси обусловлена прежде всего присутствием в ее составе общего липидного экстракта из тканей мидии С. grayanus. Для высоко ненасыщенных липидов мидии характерна низкая температура фазового перехода, большая часть которого лежит в области ниже 0°С. Такие свойства экзогенных липидов могут смягчать низкотемпературный шок у клеток и препятствовать клеточному лизису при низких температурах (Bakht et al., 2006). Не исключено, что экзогенные липиды способны к эффективному обмену с мембранными липидами при резком понижении температуры или при окислении полиеновых ЖК в липидах клеточных мембран. Снижение ИН в экстрактах клеток, замороженных в присутствии ДМСО и трегалозы, вызвано, прежде всего, относительным снижением доли полиеновых ЖК. Вероятно, эти изменения связаны с перекисным окислением именно этих ЖК, наиболее чувствительных к нему (Roca et al., 2005). Точные механизмы взаимодействия компонентов криозащитной смеси с мембранными липидами во многом остаются еще неясными. Данная работа является первым шагом к расшифровке роли этих компонентов с целью их последующей направленной модификации.

Разрушение клеток при замораживании во многом вызвано формированием кристаллов льда (Белоус и др., 1987). Для прояснения механизмов повреждения клеток при замораживании-оттаивании в присутствии криозащитных смесей различного состава, необходимо, прежде всего, знать какие процессы протекают в самих смесях, и какое влияние оказывает каждый отдельный компонент на процессы формирования, роста и перекристаллизации частиц льда. Так же, как и в более ранних работах

Андреев и др., 2008), в данном исследовании показано, что липиды в составе криозащитных смесей воздействуют на рост кристаллов льда при сверхнизких температурах: частицы льда имеют более сглаженные края и меньший размер. Наиболее плавно процесс кристаллизации происходит в среде, содержащей экзогенные липидные экстракты. Наши данные подтверждают, что криозащитные среды, содержащие липиды, могут и должны быть использованы для криосохранения клеток морских беспозвоночных.

Экспериментальные данные диссертации могут служить основой для дальнейшего поиска эффективных криопротекторов для морских организмов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Борода, Андрей Викторович, Владивосток

1. Андреев A.A., Садикова Д.Г., Лаббе К., Ананьев В.И., Курников А.Л. Влияние липидов на образование льда при замерзании криозащитных растворов // Биофизика. 2008. Т. 53, № 4. С. 598-601.

2. Белоус A.M., Гордиенко Е.М., Розанов Л.Ф. Биохимия мембран: замораживание и криопротекция. Москва: Высшая школа, 1987. 80 с.

3. Берман Д.И., Алфимов A.B., Жигульская З.А., Лейрих А.Н. Зимовка и холодоустойчивость муравьев на северо-востоке Азии. Москва: Товарищество научных изданий КМК, 2007. 261 с.

4. Болдырев A.A. Введение в биохимию мембран. Москва: Высшая школа, 1986. 112 с.

5. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты // Вестник РАМН. 1998. Т. 7. С. 43-51.

6. Гахова Э.Н., Крастс И.В., Найденко Т.Х., Савельева H.A., Бессонов Б.И., Буцук C.B., Вепринцев Б.Н. Развитие зародышей морского ежа после низкотемпературной консервации // Онтогенез. 1988. Т. 19, № 2. С. 175— 180.

7. Ерохин A.C., Епишина И.М., Чернова И.Е. Новый антиоксидант -криопротектор спермы баранов//Зоотехния. 1994. Т. 10. С. 28-29.

8. Костецкий Э.Я., Борода A.B., Одинцова H.A. Изменения липидного состава эмбриональных клеток мидии Mytilus trossulus в процессе криоконсервации //Биофизика. 2008. Т. 53, № 4. С. 658-665.

9. Ли Н.Г., Осаковский В.Л., Иванова С.С. Химический состав и криопротекторная активность спиртового экстракта зимних гусеницбоярышницы Aporia crataegi L. // Известия АН. Серия биологическая. 2003. Т. 5. С. 547-552.

10. Ли Н.Г., Осаковский В.Л. О пластичности адаптационных процессов холодоустойчивости насекомых // Известия РАН. Серия биологическая. 2008. Т. 4. С. 1-5.

11. Лось Д.А. Структура, регуляция экспрессии и функционирование десатураз жирных кислот // Успехи биологической химии. 2001. Т. 41. С. 163-198.

12. Найденко Т.Х., Кольцова Е.А. Использование антиоксиданта эхинохрома А при криоконсервации эмбрионов и личинок морских ежей // Биология моря. 1998. Т. 24. С. 198-201.

13. Шайдуллин И.Н. Искусственное, осеменение овцы сперматозоидами-после глубокого замораживания// Животноводство. 1977. Т. 7. С. 58-61.

14. Acosta-Salmon Н., Jerry D.R., Southgate Р.С. Effects of cryoprotectant agents and freezing protocol on motility of black-lip pearl oyster {Pinctada margaritifera L.) spermatozoa // Cryobiology. 2007. V. 54, № 1. P. 13-18.

15. Adams S.L., Hessian P.A., Mladenov P.V. The potential for cryopreserving larvae of the sea urchin, Evechinus chloroticus // Cryobiology. 2006. V. 52. P. 139-145.

16. Aisen E., Quintana M., Medina V., Morello H., Venturino A. Ultramicroscopic and biochemical changes in ram spermatozoa cryopreserved with trehalose-based hypertonic extenders // Cryobiology. 2005. V. 50. P. 239-249.

17. Alexander M., Hatt H.D. Laboratoiy manual on preservation freezing and freeze-drying // American type culture collection methods / Ed. H. Hatt. Rockville, MD: ATCC, 1980. 51 p.

18. Allen R.T., Hunter III W.J., Agrawal D.K. Morphological and biochemical characterization and analysis of apoptosis // Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 1997. V. 37. P. 215-228.

19. Andreyev A.A., Petropavlov N.N. Crystallization of aqueous solutions of cryoprotectors from Gadus morhua and Gammarus lacustris 11 Biophysics. 1996. V.41.P. 1321-13251.

20. Arav A., Rubinsky B., Seren E., Roche J.F., Boland M.P. The role of thermal hysteresis proteins during cryopreservation of oocytes and embryos // Theriogenology. 1994. V. 41. P. 107-112.

21. Awapara I. Free amino acids in Invertebrates: a comparative study of their distribution and metabolism // Amino Acid Pools / New York: Elsevier, 1962. P. 158-175.

22. Bakas L.S., Disalvo E.A. Effect of Ca^on the cryoprotective action» of trehalose // Ciyobiology. 1991. V. 28, № 4. P. 347-353.

23. Bakht J., Bano A., Domini P. The role of abscisic acid and low temperature in chickpea {Cicer arietinum) cold tolerance. II. Effects on plasma membrane structure and function // Journal of Experimental Botany. 2006. V. 57, №14. P. 3707-3715.

24. Bank H., Mazur P. Visualization of freezing damage // The Journal of Cell Biology. 1973. V. 57. P. 729-742.

25. Bannier L.J., Steponkus P.L. Freeze preservation of callus cultures of Chrysanthemum morifolium Ramat 11 HortScience. 1972. V. 7. P. 194.

26. Baudot A., Alger L., Boutron P. Glass-forming tendency in the system water-dimethyl sulfoxide // Cryobiology. 2000. V. 40. P. 151-158.

27. Baudot A., Cacela C., Duarte M.L., Faustoc R. Thermal study of simple amino-alcohol solutions // Cryobiology. 2002. V. 44. P. 150-160.

28. Baudot A., Odagescu V. Thermal properties of ethylene glycol aqueous solutions // Cryobiology. 2004. V. 48. P. 283-294.

29. Baumber J., Ball B.A., Linfor J.J., Meyers S.A. Reactive oxygen species and cryopreservation promote DNA fragmentation in equine spermatozoa // Journal of Andrology. 2003. V. 24, № 4. P. 621-628.

30. Bennett V.A., Sformo T., Walters K., Toien O., Jeannet K., Hochstrasser R., Pan Q., Serianni A.S., Barnes B.M., Duman J.G. Comparative overwintering physiology of Alaska and Indiana populations of the beetle Cucujus clavipesi

31. Fabricius): roles of antifreeze proteins, polyols, dehydration and diapause // Journal of Experimental Biology. 2005. V. 208. P. 4467-4477.

32. Bernard B., Fuller B.J. Cryopreservation of human oocytes: a review of current 1 problems and perspectives // Human Reproduction Update. 1996. V. 2. P. 193—207.

33. Bischof J.C., Wolkers W.F., Tsvetkova N.M., Oliver A.E., Crowe J.H: Lipid, f and protein changes due to freezing in dunning AT-1 cells // Cryobiology.2002. V. 45. P. 22-32.

34. Block W. Cold tolerance of insects and other arthropods // Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 1990: V. 326. P. 613-633.

35. Block W. Cold tolerance of insects and other arthropodos // Functional Ecology. 1991. V. 5. P. 284-290.

36. Boroda A.V., Andreev A.A., Kostetsky E.Ya., Odintsova N.A. The search of new cryoprotective compounds for marine invertebrate cells // CRYO 2009, 46th Annual Meeting of the Society for Cryobiology, Sapporo, Japan. P. 212.

37. Bourgrier S., Rabenomanana L.D. Cryopreservation of the spermatozoa of the Japanese oyster, Crassostrea gigas II Aquaculture. 1986. V. 58. P. 277-280.

38. Buettner G.R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipidperoxidation, a-tocopherol, and ascorbate // Archives of Biochemistry and Biophysics. 1993. V. 300. P. 535-543.

39. Cabrita E., Robles V., Rebordinos L., Sarasquete C., Herraez M.P. Evaluation of DNA damage in rainbow trout {Oncorhynchus mykiss) and gilthead sea bream (Sparus aurata) cryopreserved sperm I I Cryobiology. 2005. V. 50. P. 144-153.

40. Chao N.H., Chiang C.P., Hsu H.W., Tsai C.T., Lin T.T. Toxicity tolerance of oyster embryos to selected cryoprotectants // Aquatic Living Resources. 1994. V. 7. P. 99-104.

41. Chao N.H., Liao I.C. Cryopreservation of finfish and shellfish gametes and embryos // Aquaculture. 2001. V. 197. P. 161-189.

42. Christie W.W. Preparation of ester derivatives of fatty acids for chromatographic analysis // Advances in Lipid Methodology Two / Ed. W.W. Christie. Dundee: Oily Press, 1993. P. 61-111.

43. Cohen J., Simons R., Fehilly C.B., Fishel S.B., Edwards R.G., Hewitt J., Rowland G.F., Steptoe P.C., Webster J.M. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved'at expanded blastocyst stage // Lancet. 1985. V. 8429. P. 647.

44. Collins A. M., Mazur P. Chill sensitivity of honey bee, Apis mellifera, embryos // Cryobiology. 2006. V. 53. P. 22-27.

45. Crowe J.H., Crowe L.M., Chapman D. Preservation of membranes in Anhydrobiotic Organisms: The Role of Trehalose // Science. 1984. V. 223. P. 701-703.

46. Darin-Bennet A., White I.G. Influence of the cholesterol content of mammalian spermatozoa on susceptibility to cold shock // Cryobiology. 1977. V. 14. P. 466-470.

47. Dattena M., Ptak G., Loi P., Cappai P. Survival and viability of vitrified in vitro and in vivo produced ovine blastocysts // Theriogenology. 2000. V. 53, № 8. P. 1511-1519.

48. DeVries A.L., Raymond J. A. Effect of fish antifreezes on the growth of single ice crystals // Cryobiology. 1988. V. 25, № 6. P. 512-522.

49. Diller K.R. Quantitative low temperature optical' microscopy of biological systems // Journal of Microscopy. 1982. V. 126. P. 9-28.

50. Diller K.R, Cravalho E.G. A cryomicroscope for the study of freezing and> thawing process in biological systems // Cryobiology. 1970. Y. 7. P. 191-199.

51. Dinara S., Sengoku K., Tamate K., Horikawa M., Ishikawa M. Effects of supplementation'with free radical scavengers on, the survival and fertilization« rates of mouse cryopreserved3 oocytes // Human Reproduction. 2001. V. 16, № 9. P. 1976-1981.

52. Duman J.G., DeVries A.L. Freezing behavior of aqueous solutions of glycoproteins from the blood of an Antarctic fish // Cryobiology. 1972. V. 9. P. 469-472.

53. Ellington J.E., Oliver S.A. Use of arabinogalactan in cell cryopreservation media. Patent of International'Class: A01N 1/02. 2006.

54. Folch Y., Lees S.M., Sloam-Stangley G.H. Isolation and purification of total lipids from animal tissues // Journal of Biological Chemistry. 1957. V. 226. P. 497-509.

55. Frey D., Lin A., Banik G. Directly injectable formulations which provide enhanced cryoprotection of cell products. Patent of International Class: A01N 1/02; A61K 048/00; C12N 005/08. 2004.

56. Gao D., Critser J.K. Mechanisms of cryoinjury in living cells // Journal of Experimental Zoology. 2000. V. 265. P. 187-196.

57. Gakhova E.N., Krasts I.V., Naidenko T.K., Saveleva N.A., Bessonov B.I. Embryonic development of the sea urchin after low-temperature preservation // Ontogenez. 1988. V. 19, № 2. P. 175-180.

58. Glander H.-J., Schaller J. Binding of annexin V to plasma membranes of human spermatozoa: a rapid assay for detection of membrane changes after cryostorage // Molecular Human Reproduction. 1999. V. 5, № 2. P. 109-115.

59. Goncharenko M.S., Katkov I.I. Influence of cholesterol on the resistance of membranes of human erythrocytes to electrical breakdown // Biophysics. 1985. V. 30, № 3. P. 482-487.

60. Graham J.K., Foote R.H. Effects of several lipids, fatty acyl chain length, and degree of unsaturation on the motility of bull spermatozoa after cold shock and freezing // Cryobiology. 1987. V. 24. P. 42-52.

61. Grout B.W.W., McFadzen I.R.B. The method of biological cryopreservation. Patent of International Class: A01N 1/02; G01N 33/50. 1999:

62. Hanquet-Dufour A.C., Kellner K., Heude C., Naimi A., Mathieu M., Poncet J.M. Cryopreservation of Crassostrea gigas vesicular cells: viability and metabolic activity // Cryobiology. 2006. V. 53, № 1. P. 28-36.

63. Hamaratoglua F., Erogluc A., Toner M., Sadler K.C. Cryopreservation of starfish oocytes // Ciyobiology. 2005. V. 50. P. 38-47.

64. Harbo J.R. Survival of honey bee (Hymenoptera: Apidae) spermatozoa after two years in liquid nitrogen (-196°C) // Annals of the Entomological Society of America. 1983. V. 76. P. 890.

65. Hardy K.H., Handyside A.H., Winston R.M.L. The human blastocyst: cell number, death and allocation during late preimplantation development in vitro //Development. 1989. V. 107. P. 597-604.

66. Hazel J.R. Thermal adaptation in biological membranes: is homeoviscous adaptation the explanation? // Annual Review of Physiology. 1995. V. 57. P. 19-42.

67. Heckley R.J. Preservation of microorganisms // Advances in Applied Microbiology. 1978. V. 24. P. 1-54.

68. Ishida G.M., Saito H., Ohta N., Takahashi T., Ito M.M., Saito T., Nakahara K., Hiroi M. The optimal equilibration time for mouse embryos frozen by vitrification with trehalose // Human Reproduction. 1997. V. 12, № 6. P. 12591262.

69. Ishiguro H., Kataori A., Nozawa M. Three-dimensional microscopic behavior of ice crystals and cells during directional solidification of muscle tissues treated with DMSO II Cryobiology. 2009. V. 59. P. 410.

70. Jabs T. Reactive oxygen intermediates as mediators of programmed cell death in plants and animals // Biochemical Pharmacology. 1999. V. 57. P. 231-245.

71. Jones K.H., Senft J.A. An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide // Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 1985. V. 33. P. 77-79.

72. Katkov I.I., Gordienko N.A., Ostashko F.I. Influence of lipid content of membranes on electro- and cryosurvival of bovine spermatozoa // Cryobiology. 1996. V. 33. P. 681-682.

73. Kawamoto T., Narita T., Isowa K., Aoki H., Hayashi M., Komaru A., Ohta H. Effects of cryopreservation methods on post-thaw motility of spermatozoa from the Japanese pearl oyster, Pinctada fucata martensii II Cryobiology. 2007. V. 54. P. 19-26.

74. Khaselev N., Murphy R.C. Structural characterization of oxidized phospholipids products derived from arachidonate-containing plasmenyl glycerophosphocholine // Journal of Lipid Research. 2000. V. 41. P. 564-572.

75. Kirsop B.E., Doyle A. Maintenance of microorganisms and cultured cells. London: Academic Press, 1991. 308 p.

76. Kirsop B.E., Snell J.S.S. Maintenance of microorganisms: a manual of laboratory methods. London: Academic Press, 1984. 207 p.

77. Koltsova E.A., Boguslavskaya L.V., Maximov O.B. On the functions of quinonoid pigments production in sea urchin embryos // International Journal of Invertebrate Reproduction and Development. 1981. V. 4. P. 17-28.

78. Kostal V., Havelka J. Low temperature storage of larvae and synchronization of adult emergence in the predatory midge Aphidoletes aphidimyza // Cryobiology. 2001. V. 42. P. 112-120.

79. Lane M., Maybach J.M., Gardner D.K. Addition of ascorbate during cryopreservation stimulates subsequent embryo development // Human Reproduction. 2002. V. 17, № 10. P. 2686-2693.

80. Latta R. Preservation of suspension cultures of plant cells by freezing // Canadian Journal of Botany. 1971. V. 49. P. 1253-1254.

81. Lee R.E. Insect cold-hardiness: to freeze or not to freeze // Bioscience. 1989. V. 39. P. 308-313.

82. Levitt J. A sulfhydryl disulphide hypothesis of frost injury and resistance in plants // Journal of Theoretical Biology. 1962. V. 3. P. 355.

83. Limaye L.S. Bone marrow cryopreservation: improved recovery due to bioantioxidants additives in the freezing solution // Stem Cells. 1997. V. 15, № 5. P. 353-358.

84. Loomis S.H. Freezing in intertidal invertebrates: an update // Cryo-Letters. 1987. V. 8. P. 186-195.

85. Lovelock J.E. The denaturation of lipid-protein complexes as a cause of damage by freezing // Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 1957. V. 147. P. 427-434.

86. Lundheim R. Physiological and ecological significance of biological ice nucleators //Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 2002. V. 357. P. 937-943.

87. Martinez-Paramo S., Barbosa V., Perez-Cerezales S., Robles V., Herraez M.P. Cryoprotective effects of antifreeze proteins delivered into zebrafish embryos // Cryobiology. 2009. V. 58, № 2. P. 128-133.

88. Matsuyama S., Reed J.C. Mitochondria-dependent apoptosis and cellular pH regulation // Cell Death and Differentiation. 2000. V. 7. P. 1155-1165.

89. Matthes G., Hackensellner H.A., Jentzsch K.D., Krause W., Oehme P. Protective effect of selenium compounds in the freeze preservation of erythrocytes//Folia Haematologica. 1979. V. 106. P. 394-398.

90. Matthes G., Hubner U., Granz M., Schutt M., Hackensellner H.A. Antioxidants increase the cryoresistance of GM-CFC // Folia Haematologica. 1987. V. 114, №4. P. 482-483.

91. Matthes G., Hubner U., Granz M., Schutt M. Antioxidants for bone marrow cryopreservation // Folia Haematologica. 1989. V. 416. P. 451-454.

92. Mazur P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intraocular freezing // Journal of General Physiology. 1963. V. 47. P. 347-369.

93. Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications // American Journal of Physiology. 1984. V. 247. P. 125-142.

94. Mazur P. Equilibrium quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos // Cell Biophysics. 1990. V. 17. P. 53-92.

95. Mazur P., Pinn I. L., Kleinhans F.W. Intracellular ice formation» in mouse oocytes subjected to interrupted rapid cooling // Cryobiology. 2007. V. 55. P. 158-166.

96. McFadzen I. R. B. Growth and survival of cryopreserved oyster and clam larvae along a pollution gradient in the German Bight // Marine Ecology Progress Series. 1993. V. 91. P. 215-220.

97. Men H., Monson R.L., Parrish J.J., Rutledge J.J. Degeneration of cryopreserved bovine oocytes via apoptosis during subsequent culture // Cryobiology. 2003. V. 47. P. 73-81.

98. Meryman H.T. Freezing injury and its prevention in living cells // Annual Review of Biophysics and Bioengineering / Eds. L.J. Mullins, W.A. Hagins, L. Stryer, C. Newton. Palo Alto: Annual Reviews, 1974. P. 341-363.

99. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // Journal of Immunological Methods. 1983. V. 65. P. 55-63.

100. Muldrew K., McGann L.E. The osmotic rupture hypothesis of intracellular freezing injury// Biophysical Journal. 1994. V. 66. P. 532-541.

101. Murga M.L.F., Cabrera G.M., Font de Valdez G., Disalvo A., Seldes A.M. Influence of growth temperature on cryotolerance and lipid composition of Lactobacillus acidophilus // Journal of Applied Microbiology. 2000. V. 88. P. 342-348.

102. Murphy D.J. A calcium-dependent mechanism responsible for increasing the freezing tolerance of the bivalve mollusc Modiolus demissus II Journal of Experimental Biology. 1977. V. 69. P. 13-21.

103. Nakaya U. Snow Crystals: Natural and Artificial. Cambridge: Harvard University Press, 1954. 510 p.

104. Naidenko T. Kh . Cryopreservation of Crassostrea gigas oocytes, embryos and larvae using antioxidant echinochrome A and antifreeze protein AFP1 I I Cryo-Letters. 1997. V.18. P. 375-382.

105. Nei T. Mechanism of freezing injury to erythrocytes: Effect of initial cell concentration on the post-thaw hemolysis // Cryobiology. 1981. V. 18, № 3. p. 229-237.

106. Neronov A.J., Mihailova-Boiadjieva A. Cryopreservation of rabbit cornea with polyethylene oxide-400. A scanning electron microscopy study // Cryo-Letters. 1989. V. 10. P. 279-288.

107. Newsholme P., Keane D., Welters H.J., Morgan N.G. Life and death decisions for the pancreatic p-cell: the role of fatty acids // Clinical Science. 2007. V. 112. P. 27-42.

108. Odintsova N.A., Ageenko N., Kiselev K., Sanina N., Kostetsky E. Analysis of marine hydrobiont lipid extracts as possible cryoprotective agents // International Journal of Refrigeration. 2006. V. 29. P. 387-395.

109. Odintsova N.A., Dyachuk V.A., Nezlin L.P. Myogenic and neurogenic differentiation in primary cell culture from Mytilus larvae // Cell Tissue Research. 2010. V. 339. P. 625-637.

110. Odintsova N.A., Ermak A.V., Tsal L.G. Substrate selection for long-term cultivation of marine invertebrate cells // Comparative Biochemistry and Physiology. 1994. V. 107. P. 613-619.

111. Odintsova N.A., Kiselev K., Sanina N., Kostetsky E. Cryopreservation of primary cell cultures of marine invertebrates // Cryo-Letters. 2001. V. 22. P. 299-310.

112. Odintsova N.A., Tsal L.G. Cryopreservation of primary cell cultures of Bivalvia//Cryo-Letters. 1995. V. 16. P. 13-20.

113. Olsen T.M., Duman J.G. Maintenance of the supercooled state in the gut of overwintering pyrochroid beetle larvae, Dendroides canadensis: role of ice nucleators and antifreeze proteins // Journal of Comparative Physiology B.1997. V. 167. P. 114-122.

114. Ostashko F.I. Biotechnology of cattle reproduction // Agrarna nauka. 1995. P. 181.

115. Peng X.-R., Liu T., Zhang Y. Addition of alpha-tocopherol to culture medium improves the quality and cryosurvival of nuclear-transferred ovine embryos // Journal of Reproduction and Development. 2008. V. 54, № 6. P. 403-407.

116. Pio C.J., Williams R.J., Baust J.G. Inhibition of ice crystal-growth by antifreeze proteins // Cryobiology. 1986. V. 23, № 6. P. 564.

117. Plotnikov S.V., Karpenko A.A., Odintsova N.A. Comparative characteristic of Mytilus muscle cells developed in vitro and in vivo // Journal of Experimental Zoology. 2003. V. 298A. P. 77-85.

118. Polge C., Smith A.U., Parkes A.S. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures //Nature. 1949. V. 164. P. 666.

119. Quinn P.J., Chow P.Y., White I.G. Evidence that phospholipid protects ram spermatozoa from cold shock at a plasma membrane site // Journal of Reproduction and Fertility. 1980. V. 60. P. 403-407.

120. Rabin Y., Steif P.S., Hess K.C., Jimenez-Rios J.L., Palastro M.C. Fracture formation in vitrified thin films of cryoprotectants // Cryobiology. 2006. V. 53. P. 75-95.

121. Raison J.K. Temperature-induced phase changes in membrane lipids and their influence on metabolic regulation // Symposia of the Society for Experimental Biology. 1973. V. 27. P. 485-512.

122. Reaumur R.A.F. Memoires pour Servir a l'histoire des Insectes // Paris: dTmprimerie Royal. 1734. V. 170. P. 141-147.

123. Rubinsky B., Arav A., DeVries A.L. The ciyoprotective effect of antifreeze glycopeptides from Antarctic fishes // Cryobiology. 1992a. V. 29. P. 69-79.

124. Rubinsky B., Coger R., Ewart K.V., Fletcher G.L. Ice-crystal growth and lectins // Nature. 1992b. V. 360. P. 113-114.

125. Sanina N.M., Kostetsky E.Y. Thermotropic behavior of major phospholipids from marine invertebrates: changes with warm acclimation and seasonal acclimatization // Comparative Biochemistry and Physiology. 2002. V. 133. P. 143-153.

126. Seymour J. Freezing time at the zoo // New Scientist. 1994. V. 1910. P. 2123.

127. Simpson A.M., Swan M.A., White I.G. Action of phosphatidylcholine in protecting ram sperm from cold shock // Gamete Research. 1986. V. 15. P. 4356.

128. Smith A.U. Prevention of haemolysis during freezing and thawing of red blood cells // Lancet. 1950. V. 6644. P. 910-911.

129. Srivastava S., Desai P., Coutinho E., Govil G. Protective effect of L-arginine against lipid peroxidation in goat epididymal spermatozoa // Physiological Chemistry. 2000. V. 32. P. 127-135.

130. Stebbing A.R.D. Bioassay // The effects of stress and pollution on marine animals / Eds. B.L. Bayne, D.A. Brown, K. Burns, D. Dixon, A. Ivanovici, R. Livingstone, D.M. Lowe, M.N. Moore, A.R.D. Stebbing, J. Widdows. New York: Praeger, 1985. P. 133-137.

131. Stewart D.L. Storage of bull spermatozoa at low temperatures // Veterinary Record. 1951. V. 63. P. 65-66.

132. Storey K.B., Storey J.M. Biochemistry of cryoprotectants // Insects at low temperature / R.E. Lee Jr.; D.L. Denlinger. N.Y.: Chapman and Hall, 1991. P. 64-93.

133. Stott S.L., Karlsson J.O.M. Visualization of intracellular ice formation using high-speed video cryomicroscopy// Cryobiology. 2009. V. 58. P. 84-95.

134. Stransky K., Jursik T., Vitek A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene-interrupted) fatty acids // Journal of High Resolution Chromatography. 1997. V. 20. P. 143-158.

135. Svetashev V.I., Vaskovsky V.E. A simplified technique for thin-layer microchro-matography on lipids // Journal of Chromatography. 1972. V. 67, № 2. P. 376-378.

136. Sztein J.M., Noble K., Farley J.S., Mobraaten L.E. Comparison of permeating and nonpermeating cryoprotectants for mouse sperm cryopreservation // Cryobiology. 2001. V. 42, № 1. P. 28-39.

137. Thain J.E. Biological effects of contaminants: oyster (Crassostrea gigas) embryo bioassay // Techniques in Marine Environmental Sciences. 1991, № 11. P. 1-12

138. Theede H. Resistance adaptations of marine invertebrates and fish to cold // Effects of temperature on ectothermic organisms / Ed. W.Wieser. Berlin-Heidelberg-New York: Springer, 1973. P. 249-269.

139. Theede H., Schneppenheim, Beress L. Antifreeze glycoproteins in Mytilus edulis // Marine Biology. 1976. V. 36. P. 183-189.

140. Toner M., Cravalho E.G., Stachecki J., Fitzgerald T., Tompkins R.G., Yarmuch M.L., Armant D.R. Nonequilibrium freezing of one-cell mouse embryos //Biophysical Journal. 1993. V. 64. P. 1980-1921.

141. Vajta G. Vitrification of the oocytes and embryos of domestic animals // Animal Reproduction Science. 2001. V. 60. P. 357-364.

142. Veprintsev B.N., Rott N.N. Conserving genetic resources of animal species // Nature. 1979. V. 280. P. 633-634.

143. Voronina E.W., Wessel G.M. Apoptosis in sea urchin oocytes, eggs, and early embryos // Molecular Reproduction and Development. 2001. V. 60i P. 553561.

144. Wang W.B., Leopold R.A., Nelson D.R., Freeman T.P. Cryopreservation of Musca domestica (Diptera: Muscidae) embryos // Cryobiology. 2000. V. 41. P. 153-166.

145. Watson P.F. The effects of cold shock on sperm cell membranes // Effects of low temperatures on biological membranes / Eds. G.J. Morris, A. Clarke. London: Academic Press, 1981a. P. 189-218.

146. Watson P.F. The roles of lipid and protein in the protection of ram spermatozoa at 5 degrees C by egg-yolk lipoprotein // Journal of Reproduction and Fertility. 1981b. V. 62, № 2. P. 483-492.

147. Wei T., Chen C., Hou J., Xin W., Mori A. Nitric oxide induces oxidative stress and apoptosis in neuronal cells // Biochimica et Biophysica Acta. 2000. V. 1498. P. 72-79.

148. Welters H.J., Tadayyon M., Scarpello J.H.B., Smith S.A., Morgan N.G. Mono-unsaturated fatty acids protect against beta-cell apoptosis induced by saturated fatty acids, serum withdrawal or cytokine exposure // FEBS-Letters. 2004. V. 560.« P. 103-108.

149. WhittmghamD.G., Leibo S.P., Mazur P: Survival'of mouse embryos frozen' to -196»and"-2960C // Science. 1972. V. 178. Pi 411-414.

150. Wilmut' I. The effects of cooling rate, cryoprotectant agent' and stage of development on> survival of mouse embryos during freezing and thawing // Life Sciences. 1972. V. 11. P. 1071-1079.

151. Woelke G.E. Development of a receiving water quality bioassay criterion based on the 48 hour Pacific oyster (Grassostrea gigas) embryo I I Washington Department of Fisheries. 1972. V. 9. P: 1-93.

152. Wyllie A.H. Cell death: a new classification separating apoptosis from necrosis // Cell Death in Biology and Pathology / Eds. I.D. Bowen, R.A. Lockshin. New York: Chapman and Hall, 1981. P. 9-34.

153. Yankson K., Moyse J. Cryopreservation of the spermatozoa of Grassostrea tulipa and three other oysters // Aquaculture. 1991. V. 97. P. 259-267.

154. Younis A.I., Rooks B., Khan S., Gould K.G. The effects of antifreeze peptide III (AFP) and insulin transferrin selenium (ITS) on cryopreservation of chimpanzee (.Pan troglodytes) spermatozoa // Journal of Andrology. 1998. V. 19, №2. P. 207-214.

155. Zachariassen K.E. Physiology of cold tolerance in insects // Physiological Reviews. 1985. V. 65. P. 799-832.

156. Zachariassen K.E., Husby J.A. Antifreeze effect of thermal hysteresis agents protects highly supercooled insects //Nature. 1982. V. 298. P. 865-867.

157. Zaldibar B., Cancio I., Marigomez I. Circatidal variation in epithelial cell proliferation in the mussel digestive gland and stomach // Cell and Tissue Research. 2004. V. 318. P. 395-402.

158. Zell S.R., Bamford M.H., Hidu H. Cryopreservation of spermatozoa of the American oyster Crassostrea virginica II Cryobiology. 1979. V. 16. P. 448460.

159. Zeron Y., Sklan D., Arav A. Effect of polyunsaturated fatty acid supplementation on biophysical parameters and chilling sensitivity of ewe oocytes // Molecular Reproduction and Development. 2002. V. 61. P. 271-278.

Информация о работе

Борода, Андрей Викторович
кандидата биологических наук
Владивосток, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

Влияние экзогенных липидов и антиоксидантов на выживаемость и функциональную активность клеток личинок моллюсков и иглокожих после криоконсервации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы