Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Криоконсервация клеток морских беспозвоночных и увеличение их пролиферативной активности

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Криоконсервация клеток морских беспозвоночных и увеличение их пролиферативной активности"

На правах рукописи

КИСЕЛЕВ КОНСТАНТИН ВАДИМОВИЧ

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ КЛЕТОК МОРСКИХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ И УВЕЛИЧЕНИЕ ИХ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ

03.00.23 - биотехнология 03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 2004

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета МО РФ и в группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Костецкий Эдуард Яковлевич; доктор биологических наук, ст.н.с. Одинцова Нелли Адольфовна Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

ст.н.с. Попов Александр Михайлович; кандидат биологических наук Рыбин Вячеслав Григорьевич Ведущая организация: ФГУП Тихоокеанский научно-

исследовательский рыбохозяйственный центр

Защита состоится «15» июня 2004 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 005.003.01 при Биолого-почвенном институте ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-лет Владивостоку, 159. факс: (4232) 310-193

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ДВО РАН.

Автореферат разослан «7» мая 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук „„^¿его Музарок Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. За последние 10 лет было описано более 5000 химических соединений из морских организмов, причем многие из этих природных биоактивных метаболитов обладают высоким фармакологическим потенциалом. Особый интерес среди данных организмов привлекают губки, иглокожие, моллюски и другие морские беспозвоночные, которые представляют собой источник ценных биологически активных веществ, многие из которых не встречаются в наземных организмах (Ireland et al., 1988). В частности плоский морской еж Scaphechinus mirabilis содержит нафтохиноидные пигменты, главным из которых является эхинохром (Nishibori, 1957). Препарат Гистохром®, созданный на его основе, обладает уникальными терапевтическими свойствами (Еляков и др., 1999).

Некоторые виды морских беспозвоночных имеют обширную сырьевую базу, другие являются редкими. В любом варианте, в свете современных тенденций сохранения биоразнообразия, было бы заманчиво разработать технологии промышленного культивирования клеток этих животных с целью получения биологически активных веществ. Продукция биологически активных веществ in vitro может стать альтернативой химическому синтезу или аквакультуре, но при условии, что клетки в культуре будут обладать высоким потенциалом роста. До сих пор в мировой практике, несмотря на многочисленные исследования, получено лишь две культуры из тканей морских беспозвоночных и низших позвоночных: из тканей кораллов (Frank et al., 1994) и асцидий (Rinkevich, Rabinowitz, 1994). Низкая пролиферативная активность клеток морских беспозвоночных в условиях искусственного культивирования препятствует получению постоянных клеточных культур. Пробле-

му получения клеточной линии можно решить путем вывода клеток морских беспозвоночных из состояния дифференцировки, изменив экс-грессию генов ростовых факторов, но до сих пор в мировой практике эта проблема не нашла своего решения. Поэтому актуальность дальнейших широких и углубленных исследований особенностей культивирования клеток морских беспозвоночных не вызывает сомнений.

Наиболее перспективным источником получения делящихся клеток морских беспозвоночных является эмбриональный материал, но его получение носит сезонный характер. Это существенно снижает интенсивность исследований. Поэтому важным направлением нашей работы стала разработка методов криоконсервации для создания постоянного источника клеток этих животных.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась разработка научных основ криоконсервирования клеток и получения клеточных культур морских беспозвоночных. Предлагается стимулировать скорость деления клеток морских беспозвоночных через изменение уровня экспрессии факторов роста. Для этой цели мы использовали транскрипционный активатор транскрипции, ген §а14.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы криоконсервации клеточных культур морских беспозвоночных путем подбора оптимальных криопротекторов. Оценить жизнеспособность и провести анализ уровня синтеза РНК в клетках морских ежей и моллюсков после замораживания и оттаивания в присутствии разных криопротекторов.

2. Найти эффективный способ переносг чужеродных генов в клетки морских ежей.

3. Получить трансгенные культуры морских ежей и доказать экспрессию в них гена активатора транскрипции §а14.

4. Исследовать влияние гена §а14 на эмбриональное развитие морских ежей и пролиферативную активность клеток в первичных культурах.

Научная новизна. Впервые показано, что существует корреляция между криопротекторными свойствами липидов и температурами их фазовых переходов. Активатор транскрипции ген §а14 способен эффективно встраиваться в ДНК и экспрессироваться в эмбриональных клетках морских ежей. Экспрессия гена §а14 приводит к появлению де-дифференцированных клеток, которые обладают повышенным потенциалом роста по сравнению с контрольными клетками.

Практическая значимость. Практическая значимость работы связана с разработкой новых эффективных криопротекторов, использование которых при замораживании клеток морских беспозвоночных дает возможность значительно увеличить количество жизнеспособных клеток. Также в разработке приемов получения культур клеток морских беспозвоночных. Запатентован новый способ увеличения проли-феративной активности клеток морских ежей, основанный на получении трансгенных культур клеток, в которых идет экспрессия гена транскрипционного активатора §а14 (Патент РФ № 2205873).

Апробация работы. Результаты исследований представлены на первом международном симпозиуме "Генетический криобанк для ак-вакультуры, редких и исчезающих видов рыб и других гидробионтов" (Пущино, 2000), конференции молодых ученых Биолого-почвенного института ДВО РАН (2001), годичных научных конференциях Института биологии моря ДВО РАН (2001, 2002), всероссийской школе-

конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002), и первом всероссийском съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003). Данная работа выполнена при финансовой поддержке НОЦ ДВГУ за счет средств фонда US CRDF (проект VL-003) и Министерства Образования РФ (А0З-2.12-524) и президиума ДВО РАН (04-3-Г-06-023 и 04-3-А-06-047).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 91 странице машинописного текста, содержит 5 таблиц и 21 рисунок. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы содержит 148 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Экспериментальное исследование проводилось на морской биологической станции "Восток" Института Биологии моря ДВО РАН летом и осенью 2000-2002 г. Морские ежи (Scaphechinus mirabilis, Strongylo-centrotus nudus, St intermedius) и моллюски (Mizuchopecten yessoensis, Mytilus trossulus) были собраны в заливе Восток Японского моря. Нерест морских ежей стимулировали инъекцией 0,5 М КС1 в область аристотелева фонаря. Нерест моллюсков стимулировали термическим шоком. В экспериментах мы использовали выделенную при помощи метода щелочного лизиса (Маниатис и др., 1984) и очищенную плазмидную ДНК (рМА563 и рМА564), любезно предоставленную доктором М. Пташне (Гарвардский университет, США). Липиды морских беспозвоночных были экстрагированы с помощью хлороформ-метанольной процедуры (Folch, 1957). Липидные эмульсии были получены при помощи ультразвуковой обработки на основе культуральной среды L-15*

(Odintsova, Khomenko, 1991). Для криоконсервации клеток морских беспозвоночных мы использовали двухэтапный способ замораживания, как наиболее простой и достаточно эффективный (Odintsova, Tsal, 1995). В качестве криопротекторов использовали 10%-ный раствор ДМСО, содержащий 0,2 % трегалозу в комбинации с общими липид-ными экстрактами морских беспозвоночных. Сразу после оттаивания на водяной бане клетки отмывали от криопротекторов и добавляли L-15*. Температуры фазовых переходов тестированных общих липидных экстрактов были определены на дифференциальном сканирующем калориметре ДСК-2М (Odintsova et al., 2001). Трансгенные эмбрионы и эмбриональные клетки морских ежей получали методом ПЭГ-индуцируемого переноса (Bulgakov et al., 2002). Для получения первичных клеточных культур из морских ежей, их эмбрионы были диссоциированы в 0,25 % растворе коллагеназы на CMFSS (получена из печени краба Paralithodes camtschatica в ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток, Россия) в течение 20 минут при температуре 19 °С. Диссоциированные эмбрионы были промыты в стерильной морской воде. Далее клетки культивировали в среде L—15* в 24-луночных плато при 19 °С. Первичные клеточные культуры из тканей и эмбрионов моллюсков были получены путем диссоциации 0,25 % раствором коллагенозы, в течение 2,5 часов при 12 °С для взрослых животных и 20-30 мин для личинок. Диссоциированные клетки промывали несколько раз в морской воде. Затем осадок клеток ресуспендировали в ДНК выделяли из эмбрионо-нальных клеток морских ежей по методу, описанному ранее (Маниатис и др., 1984). Праймеры к гену цитоплазматического актина Cyllb морских ежей (Durica et al., 1988) и гену gal4 были подобраны на основе нуклеотидной последовательностей, взятых из генетического банка

(М35323 и NC_001148). Праймеры, прямой 5'-САА CGG АТС CGG TAT GGT GAA GGC-3' и обратный 5'-ТСС AGA CGG AGG ATG GCG TGG GGA-31, фланкировали фрагмент в 727 пар нуклеотидов гена актина Cyllb или 504 пар нуклеотидов, если в качестве матрицы использовали к ДНК, потому что выпадает одна интронная вставка. Праймеры, прямой - 5-ТСС AAC CAG GTG АСА G-3' и обратный - 5'-ССТ CGA GAA GAC СТТ G-3', фланкировали фрагмент в 712 пар нуклеотидов гена gal4. Тотальную РНК выделяли при помощи набора «Yellow-Solve» (Clonogen, Санкт-Петербург, Россия) по методике производителя. Для выделения фракции поли-(А)-РНК мы использовали набор на основе олиго (дТ) целлюлозы. Проводили обратно-транскрипционную реакцию на наборе фирмы Силекс М (Москва, Россия). Оценка уровня синтеза ДНК и РНК была сделана по ранее описанной методике (Odintsova et al., 1999). Экстракцию нафтохиноновых пигментов проводили из клеток по методике Кольцовой (Koltsova et al., 1981), с небольшими модификациями.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Криоконсервация клеток морских беспозвоночных Морские беспозвоночные требуют особых, отличных от других животных и растений, условий замораживания-оттаивания. Это заключение основано на анализе современной литературы и результатах нашей работы. Мы протестировали влияние различных криопротекторов как липидной, так и углеводной природы в сочетании с ДМСО на жизнеспособность и уровень синтеза РНК в клетках моллюсков и морских ежей в зависимости от различных клеточных типов и стадий эмбрионального развития. При использовании только определенных сочетаний криопротекторов в экспериментах на клетках моллюсков и морских

ежей возрастали жизнеспособность и уровень синтеза РНК. Лучшие показатели для клеток моллюсков были в пробах, где в качестве крио-протекторов использовалось сочетание ДМСО и трегалозы с мидийны-ми липидными экстрактами (рис. 1). Лучшие показатели для клеток морских ежей были в пробах, где в качестве криопротекторов использовалось сочетание ДМСО и трегалозы (рис. 2). Без криопротекторов основные показатели уровня синтеза РНК и жизнеспособность были

минимальными.

| 6000 -| 6000 1 I 4000 -|

| 3000 1 ■

? 2000 -

| 1000 1

Без ДМСО

гЬ

ДМСО

1 2 3 4 5 6 7 Рис. 1. Включение (С14)-уридина в клетках трохофоры мидии М. КояьиЫь после замораживания-оттаивания в первичной культуре. Незамороженные клетки (1); клетки, замороженные в присутствии: ДМСО (2), ДМСО + трегалозы (3), ДМСО + трегалозы + общего липидного экстракта из тканей моллюска С. дгауапиз (4), трегалозы (5), трегалозы + общего липидного экстракта из тканей моллюска С. #гауапиБ (6), трегалозы + общего липидного экстракта из тканей морского ежа Л. ШегтесИм (7). * Р < 0,05; ** Р <0,01

Рис. 2. Включение (С14)-уридина в клетках бластулы морских ежей St. иыйш после замораживания-оттаивания. Незамороженные клетки (1);

клетки, замороженные в присутствии ДМСО (2), ДМСО + трегалоза (Змг/мл) (3), ДМСО + трегалоза (Змг/мл) + общий липидный экстракт из тканей St. intermedius (4), трегалозы (Змг/мл) (5), трегалозы (Змг/мл) + общего липидного экстракта из тканей St. intermedius (6), трегалозы (16 мг/мл) (7). * Р < 0,05; ** Р< 0,01

Преимущество сочетания трегалозы и ДМСО объясняется тем, что трегалоза способна снизить токсический эффект ДМСО (Chen et al., 1993). ДМСО в высоких концентрациях токсичен для клеток. Однако это вещество необходимо для успешной криоконсервации, т.к. в высоких концентрациях понижает температуру замерзания культуральной среды, чем и объясняется его криопротекторное действие.

Криопротекторные свойства мидийных липидных экстрактов существенно отличаются от таковых липидов, выделенных из тканей иглокожих: добавление мидийных липидных экстрактов повышало жизнеспособность и уровень синтеза РНК у клеток моллюсков. Эти результаты коррелируют с данными термограмм, то есть с температурами фазовых переходов кристалл - жидкий кристалл. А именно, чем ниже температуры фазовых переходов кристалл - жидкий кристалл, тем большими криопротекторными свойствами обладают липидные экстракты (рис. 3).

Известно, что длительное хранение клеток при низких температурах не вызывает их повреждения, однако клетки разрушаются во время циклов замораживания-оттаивания. Наибольшая смертность наблюдается в области температур от-15 до -60 °С, которые клетки проходят дважды: один раз во время замораживания и другой - во время оттаивания (Gao, Critser, 2000). Скорее всего, жидкокристаллические липиды способны восстанавливать области разрушения или препятствовать повреждению мембраны во время замораживания-оттаивания.

Последнее выглядит наиболее правдоподобным, так как известно, что добавление фосфолипидов обеспечивает защиту против холодового шока сперматозоидов млекопитающих. При этом экзогенно добавленные фосфолипиды не встраиваются в мембрану, состав мембран в ходе замораживания-оттаивания не изменяется. Криопротекторные свойства мидийных липидных экстрактов выше криопротекторных свойств ли-пидных экстрактов иглокожих, так как значительная часть их термограммы лежит в области от -60 °С до -15 °С (рис. 3). Причем при этих температурах почти все общие липидные экстракты, выделенные, из иглокожих, уже находятся в твердокристаллическом состоянии. Поэтому можно говорить о корреляции между криопротекторными свойствами липидных экстрактов и их термограммами.

С. дтуапих ^

40 -75 -70 -С5 4« -55 -50 -45 -40 -15 -30 -21 -20 -15 -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 15 40 45

Температура, °С

Рис. 3. Термограммы общих липидных экстрактов из С^гауапиз (—), 5! ШегтесНиз (—) и А. атигепз'м (---)

Итак, ДМСО с трегалозой проявляют наилучшие криопротекторные свойства при замораживании-оттаивании клеток моллюсков и морских ежей. Добавление в культуральную среду мидийного липидного экстракта, по нашим данным, способно достоверно повысить жизнеспособность и уровень синтеза РНК в клетках моллюсков.

Влияние активатора транскрипции на рост и развитие эмбрионов и эмбриональных клеток морских ежей

Проблему получения клеточной культуры можно решить путем рывода клеток морских беспозвоночных из состояния дифференци-ровки, изменив экспрессию генов ростовых факторов. Для этой цели мы использовали ген §а14, входящий в состав галактозного оперона дрожжей Белок ва14 является активатором транскрипции эукариотических генов. Он способен функционировать в различных гетерологичных системах, таких как дрозофилла, млекопитающие и растения, связываясь с последовательностью ТвЛСЛ в промоторных участках генов и активируя их экспрессию (Ма й а1., 1988). Белки-активаторы транскрипции несут две функции в одной молекуле, т.е. содержат ДНК-связывающий .домен и участок, активирующий транскрипцию эукариотических генов (Р1азИпе, вапп, 1990). В работе использовали генно-инженерную конструкцию, плазмиду рМА563 (рис. 4 А), содержащую функциональный ген §а14 (Ма, Р1азИпе, 1987), и в качестве контроля плазмиду рМА564 (рис. 4 Б), содержащую ген лишенный участка, активирующего

транскрипцию.

Рис. 4. Плазмидные конструкции, используемые в эксперименте: плаз-мида с функциональным геном %а\4 рМА563 (А) и плазмида рМА564 с геном gal4R (Б). Ар - ген устойчивости к ампициллину, оп - точка на-

N05- промотр

N08* промотр

А

чала репликации, 1-147 - М-концевой домен, I и II - первый и второй участки гена gal4, связывающиеся с белком инициаторного комплекса

При обработке эмбрионов морских ежей плазмидой, содержащей ген gal4, эмбриональное развитие замедлялось. На некоторых эмбрионах наблюдали образование скоплений клеток в виде опухолеподобных структур (ОПС) (рис. 5).

Рис. 5. Внешний вид и полутонкие срезы контрольных (А и Б) и обработанных функциональным геном gal4 (В и Г) эмбрионов плоского морского ежа, линейка 25 мкм (Одинцова и др., 2003)

Трансформированные эмбрионы отстают по времени развития от контрольных. Через 60-80 часов после оплодотворения контрольные эмбрионы находились на стадии формирующегося плутеуса, в то время как форма трансформированных эмбрионов была округлая, внешне напоминающая таковую бластулы (рис. 5). Форма ОПС разнообразна. Часто эти образования представлены группой клеток, рыхло располо-

женных и содержащих большее количество межклеточного вещества (рис. 5). Края ОПС неровные, ограниченные поверхностью самих клеток. Диаметр образования меньше диаметра самого эмбриона в 2 и.бо-лге раз.

Несмотря на сходство с ранней гаструлой, эмбрионы с ОПС имеют ряд специфических особенностей: 1) происходит разрушение эпителиального слоя; 2) отмечено усиленное образование клеток мезенхимы; 3) бластоцель сжимается до небольшой полости в центре эмбриона. Количество эмбрионов с ОПС у плоского морского ежа было наибольшим при обработке плазмидной ДНК, содержащей ген gal4, через 15-20 минут после оплодотворения и достигало 24 %, что в 12 раз больше, чем при обработке геном gal4R (табл. 1).

Таблица 1. Влияние обработки плазмидой ДНК на эмбриональное

Вид обработки Время после оплодотворения "Эмбрионы с ОПС"

Без обработки ПЭГ рМА564 рМА563 15-20 мин 13 ±0,6 2,1 ±0,5 2 ±0,5 24±1,4**

Без обработки ПЭГ рМА564 рМА563 40-45 мин . 1,9 ±1 3,3 ±1 5,8 ±1 14+1*

Без обработки ПЭГ рМА564 рМА563 б часов 0 0 0 1±0,3**

* Р<0,05; **Р<0,01 Доказательство экспрессии гена gal4

Дальнейшим важным шагом было доказательство успешного переноса и экспрессии гена gal4 в эмбриональных клетках морских ежей.

Успешный перенос гена gal4 был доказан при помощи геноспе-цифической ПЦР, а экспрессия при помощи ОТ-ПЦР (рис. 6) Важно отметить, что при выполнении ОТ-ПЦР необходимо быть уверенным в отсутствии в пробе плазмидной ДНК и в качестве выделенной РНК. Поэтому первоначально определяли экспрессию гена актина (Су11Ь), который постоянно экспрессируется в клетках морского ежа (рис. 6).

М 1 2

Актин—> ИЗ ЕёИ

Рис. 6. Доказательство присутствия мРНК гена gal4 и гена актина Су11Ь в трансфецированных эмбрионах плоского морского ежа методом ОТ-ПЦР. Тотальная РНК выделена из эмбрионов плоского морского ежа через 55 часов после обработки плазмидой рМА563 (дорожка 1), из контрольных необработанных эмбрионов (дорожка 2), М - синтетический маркер

Наличие м-РНК в пробах эмбриональных клеток морских ежей, обработанных плазмидой с геном gal4, говорит об удачном переносе гена и его экспрессии Поэтому появление эмбрионов с ОПС можно отнести к активности гена gal4 в трансгенных эмбриональных клетках морских ежей.

Пролиферативная активность клеток морских ежей, трансформированных геном gal4

Дальнейшие эксперименты проводили на первичных клеточных культурах морских ежей для более детального изучения влияния гена

gal4 на деление клеток. Для этого ген gal4, либо его нефункциональный аналог gal4R, переносили в ДНК клеток первичных культур, полученных со стадии бластулы, и исследовали характеристики их роста.

Общее количество клеток в первичных культурах плоского морского ежа, после воздействия ДНК плазмиды рМА563, возросло в 4,4-4,6 раза, в течение 2-х месяцев культивирования. В клеточных культурах, обработанных плазмидой рМА564 - в 2,7-2,9 раза (рис. 7). Эта разница статистически достоверна (Р < 0,01). В контрольных культурах рост клеток был незначительным (рис. 7). Схожие результаты также получены на других видах морских ежей.

2,90

€■ I 1

1 7 14 21 28 35 42 49 Ев время культивирования (сутки)

Рис. 7. Динамика роста клеток в первичных культурах, полученных из эмбрионов плоского морского ежа со стадии бластулы. 1 - клетки, обработанные рМА563; 2 - клетки, обработанные рМА564; 3 - необработанные клетки

Уровень синтеза ДНК в первичных культурах плоского морского ежа, экспрессирующих ген gal4, возрастал в 2,2-2,3 раза по сравнению с таковым у нетрансгенных клеток (рис. 8). Аналогичные результаты получены также на других видах морских ежей.

Рис. 8. Увеличение синтеза ДНК в первичных культурах эмбриональных клеток плоского морского ежа после трансфекции гена gal4. Время культивирования трое суток. ** Р < 0,01

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Морские беспозвоночные представляют собой источник ценных биологически активных веществ. Разработка биотехнологий получения воспроизводимого источника этих веществ представляется важной задачей. Уменьшение пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных в условиях искусственного культивирования препятствует получению постоянных клеточных культур. В данной работе описан подход, который позволяет преодолеть это естественное затруднение. В последующих исследованиях могут использоваться те или иные регуля-торные гены, различные промоторы, либо гены, кодирующие факторы роста, специфичные для морских животных. Их эффективность будет повышаться, и несомненно, клеточные линии и штаммы будут получены. Особенность настоящей работы заключается в том, что в ней впервые показана принципиальная возможность использования чужеродных генов для увеличения пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных.

Методически, осуществить перенос трансгена оказалось не сложно. Критическим фактором в осуществленном нами ПЭГ-переносе является сэстояние "компетентности" эмбрионов, которое зависит от времени, которое прошло после их оплодотворения. Важными факторами является также концентрация эмбрионов и плазмидной ДНК.

По-видимому, появление опухолеподобных структур, описанных нами как результат трансфекции гена gal4, обусловлен экспрессией этого гена. Наши исследования показали, что перенос чужеродной плаз-мидной ДНК сам по себе вызывает сходную морфологическую аномалию. Однако, сравнение результатов экспериментов с полноразмерным геном gal4, и его аналогом, лишенным активаторных доменов, говорит о том, что функциональный ген, несомненно, функционирует и вызывает неорганизованное деление клеток.

В ходе работы возникло много вопросов, которые ждут своего исследования. В последующих экспериментах важно будет установить, какова стабильность чужеродного белка в клетках морского ежа, определить его мишень, какие сигнальные пути затронуты, стабильна ли модификация этих путей в делящихся клетках. Полученные в ходе настоящей работы данные говорят о том, что поиск мишени гена gal4 должен проводиться среди митогенных факторов, таких как эпидер-мальный фактор роста. Теоретически, представляется вероятной следующая схема действия гена gal4. Белок, продукт гена, активирует экспрессию какого-либо митогенного фактора (или факторов), нарушая его своевременное выключение. Это приводит к нарушению дифференциации клеток, увеличивает их пролиферативную активность. Другими словами, клетка продолжает делиться вместо того, чтобы специализироваться.

В этой связи особый интерес представляет изучение природы "опу-холеподобных структур", которые образуются в результате трансфек-ции. Важным шагом в настоящей работе было установление того факта, что эти структуры не являются описанными ранее обычными аномалиями развития эмбрионов, такими, которые наблюдаются при экзога-струляции. Однако пока не ясно, происходит ли злокачественная трансформация клеток. Клетки морских ежей в природных условиях не подвержены процессам злокачественной трансформации, и соответственно морфология новообразований не описана. Понятно, что морские ежи, как и другие организмы, содержат протоонкогены. По-видимому, отсутствие какого-либо эффекта протоонкогенов на клетки морских беспозвоночных можно объяснить отсутствием ферментов, необходимых для метаболической активации канцерогенов (Anderson, 1978) либо существованием антионкогенов, например, специфичных сульфолипидов у морских ежей (Sahara et al., 1997).

В практическом плане, мы считаем, что увеличение пролифератив-ной активности клеток, достигнутое в результате экспрессии гена gal4, позволяет получать постоянные культуры клеток. Однако, все культуры, которые нормально развивались в течение довольно продолжительного времени (до 3 мес.), были потеряны в результате микробного заражения. В этой связи, на первое место выходит необходимость разработки технологий, позволяющих избавиться от микроорганизмов. Первые эксперименты такого рода, выполненные в градиенте перколла, позволяют надеяться на успешность этого подхода.

Важным аспектом работы явилась разработка методов криоконсер-вирования клеток морских беспозвоночных. С успешным завершением этих экспериментов появилась возможность работать с эмбриональным

материалом в течение всего года, а не в течение двух месяцев, как это было ранее.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод криоконсервации клеток морских беспозвоночных, который позволяет получать около 30 % жизнеспособных клеток морских ежей и моллюсков.

2. ДМСО (10 %) в сочетании с трегалозой (3 мг/мл) обладают наилучшими криопротекторными свойствами при замораживании-оттаивании клеток моллюсков и морских ежей. Липидные экстракты с низкими температурами фазовых переходов обладали эффективными криопро-текторными свойствами.

3. Разработана методика ПЭГ-индуцированной трансфекции эмбрионов и эмбриональных клеток морских ежей геном gal4. Показано, что ген встраивается в ДНК клеток морских ежей и экспрессируется там.

4. Экспрессия гена gal4 приводит к нарушению эмбрионального развития морских ежей и формированию опухолеподобных структур на поверхности эмбрионов.

5. Экспрессия гена gal4 увеличивает число клеток и уровень синтеза ДНК в первичной культуре морских ежей. Это позволило разработать новый для морской биотехнологии метод увеличения пролифератнвной активности клеток, который заключается в использовании генов-активаторов транскрипции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ 1. Odintsova Nelly, Kiselev Konstantin, Sanina Nina and Kostetsky Edward Cryopreservation of primary cell cultures of marine invertebrates // Cryo-lett. 2001.22:299-310.

2. Bulgakov V.P., Odintsova N.A., Plotnikov S.V., Kiselev K.V., Zacharov E.V. and Zhuravlev Yu.N. Gal4-gene-dependent alterations of embryo development and cell growth in a primary culture of the sea urchins // Mar. Biotechnol. 2002. 4: 480-486.

3. Киселев К.В., Одинцова Н.А, Булгаков В.П., Кольцова Е.А., Яковлев К.В. Клетки морских ежей как возможные продуценты биологически активных веществ // Вестник ДВО РАН. 2002. Т. 5. С. 101-104.

4. Киселев К.В., Одинцова Н.А., Плотников СВ., Булгаков В.П. Экспрессия универсального активатора транскрипции эукариот gal4 в эмбрионах и первичных клеточных культурах морского ежа Scaphech-inus mirabilis. В сборнике тезисов 6-ой пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», 20-24 мая 2002 г., Пу-щино, Россия, Том 1: 254-255.

5. Одинцова Н.А., Киселев К.В., Булгаков В.П., Кольцова Е.А., Яковлев К.В. Влияние активатора транскрипции Gal4 на рост и развитие эмбрионов и эмбриональных клеток в первичных культурах плоского морского ежа // Онтогенез. 2003. Т. 34, N 4. С. 267-272.

6. Одинцова Н.А., Киселев К.В., Плотников СВ., Булгаков В.П. Патент РФ № 2205873. Способ увеличения пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных. МКИ7 С 12 N 5/10. Приоритет от 04.04.2002 г. Опубл. 10.06.2003 г., Бюлл. № 16.

7. Одинцова Н.А., Плотников СВ., Киселев К.В., Булгаков В.П. Использование генов - активаторов транскрипции - новый перспективный подход в области морской биотехнологии // Клеточные культуры: Информационный бюллетень. 2003. Вып. 18. С 3-8.

Подписано в печать 05.05.2004 г. Формат 60x90/16. Уч.-изд. л. 1. Тираж 100. Заказ 184. Отпечатано в типографии ЧП Ермаков, Владивосток, ул. Адм. Кузнецова, 76.

»114 22

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Киселев, Константин Вадимович

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Криоконсервирование - сохранение биологического материала при помощи сверхнизких температур.

1.1.1 Развитие методов криоконсервирования.

1.1.2. Классификация криопротекторов.

1.1.3. Естественные способы устойчивости к низким температурам и криопротекторы.

1.1.4. Криоконсервация морских животных.

1.1.5. Криопротекторы на основе липидов.

1.1.6. Жизнеспособность, целостность и функциональная активность в популяции клеток после замораживания-оттаивания.

1.2. Культуры клеток в морской биотехнологии.

1.2.1. Продукция биологически-активных веществ в культуре клеток

1.2.2 Культуры клеток морских беспозвоночных.

1.2.3. Увеличение пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных с помощью белковых активаторов. 1.2.3.1. Факторы роста морских ежей.

1.2.3.2. Новый подход для увеличения пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных.

1.2.3.3. Gal4 - представитель универсальных активаторов транскрипции эукариотических генов.

1.2.3.4. Возможность цис-регуляции гена ЭРФ морских ежей белком Gal4.

1.3. Перенос экзогенной ДНК в морской биотехнологии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2. МАТЕРИАЛЫ. 2.1. Животные.

2.2. Плазмиды.

3. МЕТОДЫ.

3.1. Приготовление препаратов липидов.

3.2. Замораживание клеточной суспензии.

3.3. Оттаивание клеточных культур.

3.4. Дифференциальная сканирующая калориметрия липидов.

3.5. Трансфекция эмбрионов морских ежей.

3.6. Получение первичных культур из клеток морских беспозвоночных

3.7. Фракционирование суспензии эмбриональных клеток морских ежей

3.8. Трансфекция первичных клеточных культур, полученных из эмбрионов морских ежей со стадии бластулы.

3.9. Выделение тотальной ДНК из эмбриональных клеток морских ежей

3.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием тотальной ДНК, выделенной из эмбриональных клеток морских ежей.

3.11. Выделение тотальной РНК из эмбрионов морских ежей и ее очистка . 34 • 3.12. Получение фракции матричной РНК.

3.13. ОТ-ПЦР анализ.

3.14. Рестрикционный анализ продуктов амплификации.

3.15. Включение Н3-тимидина.

3.16. Включение С14-уридина.

3.17. Фотосъемка.

3.18. Приготовление полутонких срезов.

3.19. Выделение и определение содержания нафтохиноновых пигментов из клеток первичных культур морского ежа.

Ф 3.20. Статистический анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Эмбриональное развитие морского ежа и мидии.

4.2. Криосохранение эмбриональных и соматических клеток морских беспозвоночных.

4.2.1. Жизнеспособность личиночных и соматических клеток моллюсков и эмбриональных клеток морских ежей после замораживания-оттаивания.

4.2.2. Уровень синтеза РНК в первичных культурах личиночных и соматических клеток моллюсков и эмбриональных клеток морских ежей после замораживания-оттаивания.

4.2.3. Температуры фазовых переходов общих липидных экстрактов морских беспозвоночных.

4.2.4. Особенности замораживания-оттаивания клеток морских беспозвоночных.

4.3. Влияние активатора транскрипции gal4 на рост и развитие эмбрионов и эмбриональных клеток морских ежей.

4.3.1. Трансфекция оплодотворенных яйцеклеток и эмбрионов морских ежей геном gal4.

4.3.2. Детекция генов, гомологичных генам цитоплазматических актинов Cyllb и СуШЬ морского ежа St. purpuratus в клетках морских ежей при помощи геноспецифической ПЦР.

4.3.3. Детекция гена gal4 в эмбриональных клетках морских ежей при помощи геноспецифической ПЦР.

4.3.4. Экспрессия гена, гомологичного гену цитоплазматического актина Cyllb St. purpuratus в клетках плоского морского ежа.

Щ, 4.3.5. Доказательство экспрессии гена gal4.

4.3.6. Рестрикционный анализ продуктов амплификации.

4.3.7. Количество эмбрионов с ОПС у разных видов морских ежей

4.3.8. Количество эмбрионов с окрашенными ОПС у разных видов морских ежей.

4.3.9. Образование ОПС в процессе культивирования эмбрионов морских ежей.

4.3.10. Влияние количества плазмидной ДНК на образование эмбрионов с ОПС у морских ежей.

4.4. Очистка эмбриональных клеток морских ежей фракционированием в ступенчатом градиенте плотности перколла.

4.5. Влияние ингибиторов киназ и фосфотаз на развитие эмбрионов морских ежей.

4.6. Пролиферативная активность клеток морских ежей, трансформированных геном gal4.

4.6.1. Трансфекция первичных клеточных культур морских ежей геном gal4.

4.6.2. Клеточные культуры, полученные из трансфецированных геном gal4 эмбрионов морских ежей.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Криоконсервация клеток морских беспозвоночных и увеличение их пролиферативной активности"

За последние 10 лет было описано более 5000 химических соединений из морских организмов, причем многие из этих природных биоактивных метаболитов обладают высоким фармакологическим потенциалом. Особый интерес среди данных организмов привлекают губки, иглокожие, моллюски и другие морские беспозвоночные, которые представляют собой источник ценных биологически активных веществ, многие из которых не встречаются в наземных организмах (Ireland et al., 1988). В частности плоский морской еж Scaphechinus mirabilis содержит нафтохиноидные пигменты, главным из которых является эхинохром (Nishibori, 1957). Препарат Гистохром®, созданный на его основе, обладает уникальными терапевтическими свойствами (Еляков и др., 1999 а,б; Мищенко и др., 2003).

Некоторые виды морских беспозвоночных имеют обширную сырьевую базу, другие являются редкими. В любом варианте, в свете современных тенденций сохранения биоразнообразия, было бы заманчиво разработать технологии промышленного культивирования клеток этих животных с целью получения биологически активных веществ. Продукция биологически активных веществ in vitro может стать альтернативой химическому синтезу или аквакультуре, но при условии, что клетки в культуре будут обладать высоким потенциалом роста. До сих пор в мировой практике, несмотря на многочисленные исследования, получено лишь две культуры из тканей морских беспозвоночных и низших позвоночных: из тканей кораллов (Frank et al., 1994) и асцидий (Rinkevich, Rabinowitz, 1994; Kawamura, Fujiwara, 1995).

Низкая пролиферативная активность клеток морских беспозвоночных в условиях искусственного культивирования препятствует получению постоянных клеточных культур. Проблему получения клеточной линии можно решить путем вывода клеток морских беспозвоночных из состояния дифференцировки, изменив экспрессию генов ростовых факторов, но до сих пор в мировой практике эта проблема не нашла своего решения. Поэтому актуальность дальнейших широких и углубленных исследований особенностей культивирования клеток морских беспозвоночных не вызывает сомнений.

Наиболее перспективным источником получения делящихся клеток морских беспозвоночных является эмбриональный материал, но его получение носит сезонный характер. Это существенно снижает интенсивность исследований. Поэтому важным направлением нашей работы стала разработка методов криоконсервации для создания постоянного источника клеток этих животных.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась разработка научных основ криоконсервирования клеток и получения клеточных культур морских беспозвоночных. Предлагается стимулировать скорость деления клеток морских беспозвоночных через изменение уровня экспрессии факторов роста. Для этой цели мы использовали транскрипционный активатор транскрипции, ген gal4.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы криоконсервации клеточных культур морских беспозвоночных путем подбора оптимальных криопротекторов. Оценить жизнеспособность и провести анализ уровня синтеза РНК в клетках морских ежей и моллюсков после замораживания и оттаивания в присутствии разных криопротекторов.

2. Найти эффективный способ переноса чужеродных генов в клетки морских ежей.

3. Получить трансгенные культуры морских ежей и доказать экспрессию в них гена активатора транскрипции gal4.

4. Исследовать влияние гена gal4 на эмбриональное развитие морских ежей и проли-феративную активность клеток в первичных культурах.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработан метод криоконсервации морских беспозвоночных, при использовании которого жизнеспособность клеток составляет 32 % для морских ежей и 30 % для мидии.

2. Осуществлен перенос гена gal4 в эмбрионы морских ежей и показано, что ген эффективно в них экспрессируется.

3. Экспрессия гена gal4 в эмбриональных клетках морских ежей приводит к дедиф-ференциации клеток и увеличивает их пролиферативную активность.

4. Предложен новый для морской биотехнологии способ увеличения пролифератив-ной активности клеток, заключающийся в использовании генов-активаторов транскрипции.

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии ДВГУ, а также в группе биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН.

Выделение липидных экстрактов и анализ температур их фазовых переходов были проведены совместно с сотрудниками кафедры биохимии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета: профессором д.б.н. Э.Я. Костецким и доцентом к.б.н. Н.М.Саниной. Определение содержания нафтохиноновых пигментов в клетках морских ежей проведено совместно с сотрудниками Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН - к.х.н. Е.А. Кольцовой и к.х.н. В.П.Глазуновым.

Автор приносит глубокую благодарность всем перечисленным сотрудникам и коллегам, своим научным руководителям, а также доктору М. Пташне (США) за предоставление образцов плазмидной ДНК.

Данная работа выполнена при частичной финансовой поддержке НОЦ ДВГУ за счет средств фонда US CRDF (проект VL-003) и Министерства Образования РФ (АОЗ-2.12-524) и президиума ДВО РАН (04-3-Г-06-023 и 04-3-А-06-047).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Киселев, Константин Вадимович

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод крноконсервации клеток морских беспозвоночных, который позволяет получать около 30 % жизнеспособных клеток морских ежей и моллюсков.

2. ДМСО (10 %) в сочетании с трегалозой (3 мг/мл) обладают наилучшими криопротек-торными свойствами при замораживании-оттаивании клеток моллюсков и морских ежей. Липидные экстракты с низкими температурами фазовых переходов обладали эффективными криопротекторными свойствами.

3. Разработана методика ПЭГ-индуцированной трансфекции эмбрионов и эмбриональных клеток морских ежей геном gal4. Показано, что ген встраивается в ДНК клеток морских ежей и экспрессируется там.

4. Экспрессия гена gal4 приводит к нарушению эмбрионального развития морских ежей и формированию опухолеподобных структур на поверхности эмбрионов.

5. Экспрессия гена gal4 увеличивает число клеток и уровень синтеза ДНК в первичной культуре морских ежей. Это позволило разработать новый для морской биотехнологии метод увеличения пролиферативной активности клеток, который заключается в использовании генов-активаторов транскрипции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Морские беспозвоночные представляют собой источник ценных биологически активных веществ. Разработка биотехнологий получения воспроизводимого источника этих веществ представляется важной задачей.

Уменьшение пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных в условиях искусственного культивирования препятствует получению постоянных клеточных культур. В данной работе описан подход, который позволяет преодолеть это естественное затруднение. В последующих исследованиях могут использоваться те или иные регуля-торные гены, либо гены, кодирующие факторы роста, специфичные для морских животных, а также различные промоторы. Их эффективность будет повышаться, и несомненно, клеточные линии и штаммы будут получены. Особенность настоящей работы заключается в том, что она впервые показала принципиальную возможность использования чужеродных генов для увеличения пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных.

Методически, осуществить перенос трансгена оказалось не сложно. Критическим фактором в осуществленном нами ПЭГ-переносе является состояние "компетентности" эмбрионов, которое зависит от времени, которое прошло после их оплодотворения. Важными факторами является также концентрация эмбрионов и плазмидной ДНК.

По-видимому, появление опухолеподобных структур, описанных нами как результат трансфекции гена gal4, обусловлен экспрессией этого гена. Наши исследования показали, что. перенос чужеродной плазмидной ДНК сам по себе вызывает сходную морфологическую аномалию. Однако, сравнение результатов экспериментов с полноразмерным геном gal4, и его аналогом, лишенным активаторных доменов, говорит о том, что ген, несомненно, функционирует и вызывает неорганизованное деление клеток.

В ходе работы возникло много вопросов, которые ждут своего исследования. В последующей работе важно будет установить, какова стабильность чужеродного белка в клетках морского ежа, определить его мишень, какие сигнальные пути затронуты, стабильна ли модификация этих путей в делящихся клетках. Полученные в ходе настоящей работы данные говорят о том, что поиск мишени гена gal4 должен проводиться среди ми-тогенных факторов, таких как эпидермальный фактор роста. Теоретически, представляется вероятной следующая схема действия гена gal4. Белок, продукт гена, активирует экспрессию какого-либо митогенного фактора (или факторов), нарушая его своевременное выключение. Это приводит к нарушению дифференциации клеток, увеличивает их про-лиферативную активность. Другими словами, клетка продолжает делиться вместо того, чтобы специализироваться.

В этой связи особый интерес представляет изучение того, что представляют собой "опухолеподобные структуры", которые образуются в результате трансфекции. Важным шагом в настоящей работе было установление того факта, что эти структуры не являются описанными ранее обычными аномалиями развития эмбрионов, такими как экзогаструля-ция. Однако пока не ясно, происходит ли злокачественная трансформация клеток. Клетки морских ежей в природных условиях не подвержены процессам злокачественной трансформации, и соответственно морфология новообразований не описана. Понятно, что морские ежи, как и другие организмы, содержат протоонкогены. По-видимому, отсутствие какого-либо эффекта протоонкогенов на клетки морских беспозвоночных можно объяснить отсутствием ферментов, необходимых для метаболической активации канцерогенов (Anderson, 1978) либо существованием антионкогенов, например, специфичных сульфо-липидов у морских ежей (Sahara et al., 1997).

В практическом плане, мы считаем, что увеличение пролиферативной активности клеток, достигнутое в результате экспрессии гена gal4, позволяет получить постоянную культуру клеток. Однако, все культуры, которые нормально развивались в течение довольно продолжительного времени (до 3 мес.), были потеряны в результате микробного заражения. В этой связи, на первое место выходит необходимость разработки технологий, позволяющих избавиться от микроорганизмов. Первые эксперименты, выполненные для очистки клеток в градиенте перколла, позволяют надеяться на успешность такого подхода.

Важным аспектом работы явилась разработка методов криоконсервирования клеток морских беспозвоночных. С успешным завершением этих экспериментов, появилась возможность работать с этим объектов в течение всего года, а не в течение двух месяцев, как это было ранее.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Киселев, Константин Вадимович, Владивосток

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М.: «Мир», 1983.128 с.

2. Анализ генома: Методы / Под ред. Дейвиса К. М: «Мир», 1990. 246 с.

3. Белоус A.M., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф. Замораживание и криоконсервация. М.: «Высшая школа», 1987. 80 с.

4. Виленчик М.М. Сколько лет можно хранить зародышевые клетки в криоконсервированном состоянии без существенного повреждения их генома? Пущино: 1983. 20 с.

5. Гахова Э.Н., Крате И.В., Найденко Т.Х. и др. Развитие зародыша морского ежа после низкотемпературной консервации// Онтогенез. 1988. Т. 19(2). С. 175-180.

6. Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М.: «Мир», 1997. 624с.

7. Грищенко В.И., Панков Е.Я., Обозная Э.Я. Качественное обновление свойств клеток после криоконсервирования // Успехи современной биологии. 1989. Т. 108. С. 299-309.

8. Еляков Г.Б., Федореев С.А., Максимов О.Б., Мищенко Н.П., Кольцова Е.А., Глебко Л.И., Красовская Н.П., Артюков А.А. Препарат гистохром для лечения воспалительных заболеваний сетчатки и роговицы глаз // Патент № 2134107. Бюл. № 22. 1999 (а).

9. Лебедев А.В., Иванова М.В., Красновид Н.И., Кольцова Е.А. Активность и взаимодействие с супероксид анион радикалом эхинохрома и его структурных аналогов // Вопросы медицинской химии 1999. Т. 45(2). С. 123-130.

10. Лейрих А.Н. 1985. Холодоустойчивость, температурные условия зимовки и пространственное распределение муравьев на Верхней Колыме: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Л. - 17 с.

11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: «Мир», 1982. 480 с.

12. Мищенко Н.П., Федореев С.А., Багирова В.Л. Новый оригинальный отечественный препарат гистохром® // Хим-фармацевтический журнал. 2003. Т. 37(1). С. 49-53.

13. Найденко Т.Х., Кольцова Е.А. Использование антиоксиданта эхинохрома при криоконсервации личинок морских ежей // Биология моря. 1998. Т 3. С. 198-201.

14. Одинцова Н.А. Основы культивирования клеток морских беспозвоночных. Владивосток: Дальнаука, 2001. 162 с.

15. Одинцова Н.А., Киселев К.В., Плотников С.В., Булгаков В.П. Патент РФ № 2205873. Способ увеличения пролиферативной активности клеток морских беспозвоночных. МКИ7 С 12 N 5/10. Приоритет от 04.04.2002 г. Опубл. 10.06.2003 г., Бюлл. № 16.

16. Пинаев Г.П. Методы культивирования клеток. Ленинград: «Наука», 1988. 322 с. Попов A.M. 2003. Биологическая активность и механизмы действия вторичных метаболитов из наземных растений и морских беспозвоночных: Автореф. дис. .доктора биол. наук. В. - 28 с.

17. Стехова С.И., Шенцова Е.Б., Кольцова Е.А., Кулеш Н.И. Антимикробная активность полигидроксинафтохинонов из морских ежей // Антибиотики и химиотерапия. 1988. Т. 33(11). С. 831-833.

18. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. В 2-х т. Т. 2. Пер. с англ. М.: "Мир", 1998. 391с.

19. Akasaka К, Nishimura A., Hijikata К., Iuchi Y., Morokuma J., Takahashi M., Morikawa H., Shimada H. Introduction of DNA into sea urchin eggs by particle gun // Molecular Marine Biology and Biotechnology. 1995. Vol. 4(3). P. 255-261.

20. Akasaka K, Nishimura A., Takata K., Mitsunaga K., Mibuka F., Ueda H., Hirose S., Tsutsui K. and Shimada H. Upstream element of sea urchin arylsulfatase gene serves as an insulator // Cellular and Molecular Biology. 1999. Vol. 45(5). P. 555-565.

21. Armstrong J.L., Childs G.V. Regulation of c-fos expression by EGF and GnRH in specific anterior pituitary cells from proestrous female rats // Journal of Histochemistry, and Cytochemistry. 1998. Vol. 46(8). P. 935-943.

22. Asahia E., Takahashi T. Cryopreservation of sea urchin embryos and sperm // Growth and Differentiation. 1979. V. 21(5). P. 423-430.

23. Anderson R.S. Developing an invertebrate model for chemical carcinogenesis: metabolic activation of carcinogens // Comparative Pathobiology. 1978. Vol. 4. P. 11-24.

24. Bale J.S., Worland M.R. and Block W. Effects of summer frost exposures on the cold tolerance strategy of a sub-Antarctic beetle // Journal of Insect Physiology. 2001. Vol. 47(10). P. 1161-1167.

25. Baynes S.M., Scott A. P. Cryopreservation of rainbow trout spermatozoa: the influence of sperm quality, egg quality and extender composition on post-thaw fertility // Aquaculture. 1987. Vol. 66. P. 53-67.

26. Block W. Cold tolerance of insects and other arthropodos // Functional Ecology, 1991. Vol. 5. P. 284-290.

27. Brewster E., Nicholson B.L. In vitro maintenance of amoebocytes from the American oyster Crassostrea virginica // Journal of Fish Res. Board. Can. 1979. Vol. 36(4). P. 461-467.

28. Bogo M.R., Vainstein M.H., Aragao F.J.L., Rech E., Schrank A. High frequency gene conversion among benomyl resistant transformants in the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliaell FEMS Microbiology Letters. 1996. Vol. 142. P. 123-127.

29. Bulgakov V.P., Odintsova N.A., Plotnikov S.V., Kiselev K.V., Zaharov E.V., Zhuravlev Yu.N. Ga/4-gene-dependent alterations of embryo development and cell growth in a primary culture of the sea urchins // Marine Biotechnology. 2002. Vol. 4. P. 480-486.

30. Camaioni A., Russo M.A., Odorisio Т., Gandolfi F., Fazio V.M., Siracusa G. Uptake of exogenous DNA by mammalian spermatozoa: specific localization of DNA on sperm heads // Journal of Reproduction Fertility. 1992. Vol. 96. P. 203-212.

31. Cecil J.T. Mitoses in cell cultures from cardiac tissue of the surf clam Spisula solidissima // Journal of Invertebrate Pathology. 1969. Vol. 14(3). P. 407-410.

32. Chao N., Chiang C., Hsu H., Tsai C., Lin T. Toxicity tolerance of oyster embryos to selected cryoprotectants // Aquatic Living Resources. 1994. Vol. 7. P. 99-104.

33. Chao N.H., Lin T.T., Chen Y.J., Hsu H.W., Liao I.C. Cryopreservation of late embryos and early larvae in the oyster and hard clam // Aquaculture. 1997. Vol. 155(1-4). P. 31-44.

34. Chao N.H., Liao I.C. Cryopreservation of finfish and shellfish gametes and embryos // Aquaculture. 2001. Vol. 197. P. 161-189.

35. Chen L., DeVries A.L., Cheng C.C. Evolution of antifreeze glycoprotein gene from a trypsinogen gene in Antarctic notothenioid fish // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1997. Vol. 94. P. 3811-3816.

36. Chen L., DeVries A.L., Cheng C.C. Convergent evolution of antifreeze glycoproteins in Antarctic notothenioid fish and Arctic cod // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1997. Vol. 94. P. 3817-3822.

37. Chen S.N., Wen C.M. Establishment of cell lines derived from oyster, Crassostrea gigas Thunberg and hard clam, Meretrix lusoria Roding // Methods in Cell Science 1999. Vol. 21. P. 183-192.

38. Chen Y., Foote R., Brockett C. Effect of sucrose, trehalose, hypotaurine, taurine and blood serum on survival of frozen bull sperm // Cryobiology. 1993. Vol. 30(4). P. 423-431.

39. Chen Z.Q., Kan N.C., Pribyl L., Lautenberger J.A., Moudrianakis E., Papas T.S. Molecular cloning of the ets proto-oncogene of the sea urchin and analysis of its developmental expression // Developmental Biology. 1988. Vol. 125(2). P. 432-440.

40. Cheng C.C., Chen L. Evolution of an antifreeze glycoprotein // Nature. 1999. Vol. 401. P. 443-444.

41. Cheng C.H., DeVries A.L. Structures of antifreeze peptides from the antarctic eel pout, Austrolycicthys brachycephalus // Biochimica et Biophysica Acta. 1989. Vol. 27(997). P. 55-64.

42. De Vries A.L. The role of antifreeze glycopeptides and peptides in the freezing avoidance of antarctic fishes // Comparative Biochemistry and Physiology. 1988. V. 90(B). P. 611-622.

43. De Vries A.L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes // Annual Review of Physiology. 1983. Vol. 45. P. 245-60.

44. DiCosmo F., Misawa M. Plant cell and tissue culture: alternatives for metabolite production // Biotechnology Advances.1995. Vol.l3(3). P. 425-453.

45. Domart-Coulon I., Doumeng D., Auzoux-Bordenave S., Fichant Y.L. Identification of media supplements that improve the viability of primarily cell cultures of Crassostrea gigas oysters // Cytotechnology. 1994. Vol. 16. P. 109-120.

46. Ellis L.L., Brodey M.M., Bishop S.H. Preparation of cell cultures from oyster heart and mantle // In Vitro Cell Developmental Biology. 1985. Vol. 21(3). P. 32a.

47. Ellis L.L. Electroporation of oyster cells // In Vitro Cell Developmental Biology. 1991. Vol. 27(2). P. 42a.

48. Frank U., Rabinowitz C., Rinkevich B. In vitro establishment of continuous cell cultures and cell lines from ten colonial cnidarians // Marine Biology. 1994. Vol. 120, P. 491-499.

49. Fujita Y., Tabata M. Cell cultures of Lithospermum erythrorhizon I I Plant Cell and Tissue Culture.1987. Vol. 43. P. 169-185.

50. Gao D., Critser J.K. Mechanisms of cryoinjury in living cells // ILAR J. 2000. Vol. 41(4). P. 187-196.

51. Griko Yu.V., Privalov P.L., Sturtevant J.M., Venyaminov K.P. Cold denaturation of staphylococcal nuclease // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1988. Vol. 85. P. 3343-3347.

52. Glonek Т., Greiner J. Method and composition for cryopreservation of tissue // Canadian patent №CA1335723. 1999.

53. Goncharova S.N., Sanina N.M., Kostetsky E.Y. Role of lipids in molecular thermoadaptation mechanisms in a seagrass Zostera marina // Biochemical Society Transaction. 2000. Vol. 28(6). P. 789-892.

54. Goodwin R.H. Replacement of vertebrate serum with lipid and other factors in the culture of invertebrate cells, tissue, parasites and pathogens // In Vitro Cell Developmental Biology. 1991. Vol. 27(A). P. 470-478.

55. Hursh D.A., Andrews M.E. and Raff R.A. A sea urchin gene encodes a polypeptide homologous to epidermal growth factor // Science. 1987. Vol. 237(4821). P. 1487-1490.

56. Hetrick F.M., Stephens E., Lomax N., Luttrell K. Attempts to develop a marine molluscan cell line. In report of Department of Microbiology University of Maryland 1981.

57. Honadel, Kallian Cryopreservation of murine embryos with trehalose and glycerol // Cryobiology. 1998. V. 25(4). P. 331-337.

58. Kalinina I.V., Gromov D.B. The nucleus of non-vible frozen-thawed amoeba has normal morphology and high function activity // Cryo-Letters. 1991. V. 12(3). P. 87-92.

59. Karanova M.V., Mezhevikina L.M., Petropavlov N.N. Study of cryoprotective properties of antifreeze glycoproteins from the white sea cod Gadus morhua on low temperature freezing of mouse embryos //Biofizika. 1995. Vol. 40(6). P. 1341-1347.

60. Kawamura K, Fujiwara S. Establishment of cell lines from multipotent epithelial sheet in the budding tunicate, Polyandrocarpa misakiensis // Cell Structure and Function. 1995.- Vol. 20(1). P. 97-106.

61. Khoo H.W., Ang L.H., Lim H.B., Wong K.Y. Sperm cells as vector for introducing foreign DNA into zebrafish // Aquaculture. 1992. Vol. 107. P. 1-9.

62. Koike H., Akasaka K., Mitsunaga-Nakatsubo K., Shimada H. Proximal cis-regulatory elements of sea urchin arylsulfatase gene // Development Growth and Differentiation. 1998. Vol. 40(5). P. 537-544.

63. Koltsova E.A., Boguslavskay L.V., Maximov O.B. On the functions of quinonoid pigment in sea urchin embryos // Journal of Invertebrate Reproduction. 1981. Vol. 4(1). P. 17-23.

64. Kominami Т., Takata H. Process of pigment cell specification in the sand dollar, Scaphechinus mirabilis // Development Growth and Differentiation. 2002. Vol. 44 (2). P. 113125.

65. Ma J., Przibilla E., Hu J., Bogorad L., Ptashne M. Yeast activators stimulate plant gene expression // Nature. 1988. Vol. 334. P. 631-633.

66. Ma J., Ptashne M. Deletion analysis of GAL4 defines two transcriptional activating segments // Cell. 1987. Vol. 48. P. 847-853.

67. MacKintosh C., Cohen P. Identification of high levels of type 1 and type 2A protein phosphatases in higher plants // Journal of Biochemistry. 1989. Vol. 262. P. 335-339.

68. Maramorosch K. Biotechnology in invertebrate pathology and cell culture. San Diego; London: Acad. Press, 1987. 511 p.

69. Mazur P. The role of intracellular freezing in the death of cells // Cryobiology. 1977. Vol.14. P. 251-272.

70. Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications // American Journal of Physiology. 1984. Vol. 247. P. 125-142.

71. McCoon P.E., Angerer R.C. and Angerer L.M. SpFGFR, a new member of the fibroblast growth factor receptor family, is developmentally regulated during early sea urchin development //Journal of Biological Chemistry. 1996. Vol. 271(33). P. 20119-20125.

72. Mitsuhashi J. Invertebrate cell system application. Boca Raton: GRC Press, 1989. Vol. 1, 2. 180 p.

73. Mifflin D., Robinson J.J. Proto-oncogene homologous sequences in the sea urchin genome //BioscienceReports. 1988. Vol. 8(5). P. 415-419.

74. McCoon P.E., Angerer R.C. and Angerer L.M. SpFGFR, a new member of the fibroblast growth factor receptor family, is developmentally regulated during early sea urchin development // Journal of Biological Chemistry. 1996. Vol. 271(33). P. 20119-20125.

75. Naidenko T. Cryopreservation of Crassostrea gigas oocytes, embryos and larvae using antioxidant echinochrome A and antifreeze protein AFP1// Cryo-Letters. 1997. Vol. 18. P. 375382.

76. Odintsova N.A.,. Khomenko A.V. Primary cell culture from embryos of the Japanese scallop Mizuhopecten yessoensis (Bivalvia) // Cytotechnology. 1991. Vol. 6. P. 49-54.

77. Odintsova N.A., Tsal L.G. Cryopreservation of primary cell cultures of bivalvia // Cryo-Letters. 1995. Vol.16. P. 13-20.

78. Odintsova N.A., Ermak A.V., Tsal L.G. Substrate selection for long-term cultivation of marine invertebrate cells // Comparative Biochemistry and Physiology. 1994. Vol. 107A. P. 613619.

79. Odintsova N.A., Bulgakov V.P., Plotnikov S.V. Engineering of sea urchin embryo development. In abstracts of 5th International Marine Biotechnology Conference Townsville, Australia 29 September 4 October 2000.

80. Odintsova N., Kiselev K., Sanina N., Kostetsky E. Cryopreservation of primary cell cultures of marine invertebrates // Cryo-Letters. 2001. Vol. 22(5). P. 299-310.

81. О'Neil L., Paynter S.J., Fuller В J., Shaw R.W., DeVries A.L. Vitrification of mature mouse oocytes in a 6 M Me2SO solution supplemented with antifreeze glycoproteins: the effect of temperature // Cryobiology. 1998. Vol. 37(1). P. 59-66.

82. Patil J.G., Khoo H.K. Nuclear internalization of foreign DNA by zebrafish spermatozoa and its enhancement by electroporation // Journal of Experimental Biology. 1996. Vol. 274. P. 121-129.

83. Pearl M., Arav A. Chilling sensitivity in zebrafish (Brachydanio rerio) oocytes is related to lipid phase transition I I Cryo-Letters. 2000. Vol. 21. P. 171-178.

84. Polovina M. Method and composition for cryopreservation of tissue // Canadian patent № CA2214280.1996.

85. Privalov P.L., Griko Y.V., Venyaminov S.Y., Kutyshenko V.P. Cold denaturation of myoglobin. // Journal of Molecular Biology. 1986. Vol. 190. P. 487-498.

86. Ptashne M., Gann A. Activators and targets // Nature. 1990. Vol. 346. P. 329-331.

87. Quantin В., Breathnach R. Epidermal growth factor stimulates transcription of the c-jun proto-oncogene in rat fibroblast // Nature. 1988. Vol. 334. P. 538-539.

88. Renard P. Cooling and freezing tolerances in embryos of the pacific oyster, Crassostrea gigas methanol and sucrose effects // Aquaculture. 199.1. Vol. 92(1). P. 43-57.

89. Ring R.A., Tesar D. Adaptations to cold in Canadian Arctic insects // Cryobiology. 1981. Vol. 18(2). P. 199-211.

90. Rinkevich В., Rabinowitz C. Acquiring embryo-derived cell cultures and aseptic metamorphosis of larvae from the colonial protochordate Botryllus schlosseri // Invertebrate Reproduction and Development. 1994. Vol. 25. P. 59-72.

91. Rinkevich B. Cell cultures from marine invertebrates: obstacles, new approaches and recent improvements // Journal of Biotechnology. 1999. Vol. 70(1-3). P. 133-153.

92. Rubinsky В., Arav A., Devries A.L. The cryoprotective effect of antifreeze glycopeptides from antarctic fishes // Cryobiology. 1992. Vol. 29(1), P. 69-79.

93. Ruggieri G.D. Drugs from the sea // Science. 1976. Vol. 194. P. 491-497.

94. Sanina N.M., Kostetsky E.Ya., Shnyrov V.L. Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology. 1991. Vol. 27. P. 265-274.

95. Schells G., Cobl C., Anderson S. Tissue cryopreservation method // Canadian patent № CA2078873.1992.

96. Shaw C.H., Carter G.H., Watson M.D., Shaw C.H. A functional map of the nopaline synthase promoter // Nucleic Acids Research. 1984. Vol. 12. P. 7831-7846.

97. Skouteris G.G., Kaser M.R. Expression of exogenous c-myc oncogene does not initiate DNA synthesis in primary rat hepatocyte culture // Journal of Cell Physiology. 1992. Vol. 150. P. 353-359.

98. Sin F.Y.T., Bartley A.L., Walker S., Sin I.L., Symonds J.E., Hawke L., Hopkins C.L. Gene transfer in Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) by electroporating sperm in the presence of pRSV-lacZ DNA//Aquaculture. 1993. Vol. 117. P. 57-69.

99. Sin F.Y.T. Transgenic fish // Reviews in Fish Biol, and Fisheries. 1997. Vol. 7. P. 417441.

100. Sparks K.A. Synopsis of invertebrate pathology. Exclusive of insects. Amsterdam: Elservier Science, 1985. 510 p.

101. Stephens E.B., Hetrick F.M. Preparation of primary cell cultures from The American oyster Crassostrea virginica I I In Vitro Rockville. 1979. Vol. 15(3). P. 198-199.

102. Storey K.B., Storey J.M. Natural freeze tolerance in ectothermic vertebrates // Annual Review of Physiology. 1992. Vol. 54. P. 619-637.

103. Symonds J.E., Walker S.P., Sin F.Y.T. Electroporation of salmon sperm with plasmid DNA: evidence of enhanced sperm/DNA association // Aquaculture. 1994. Vol. 119. P. 313-327.

104. Swales N., Utesch D. Metabolic activity of fresh and cryopreserved dog hepatocyte suspensions //Xenobiotica. 1998. Vol. 28(10). P. 937-948.

105. Tamaoki T. Use and specificity of staurosporine, UCN-01, and calphostin С as protein kinase inhibitors // Methods in Enzymology. 1991. Vol. 201. P. 340-347.

106. Tanaka S., Tajima M., Tsukada M., Tabata M.A comparative study on anti-inflammatory activities of the enantiomers, shikonin and alkannin // Journal of National Products. 1986. Vol. 49(3). P. 466-469.

107. Torres M., Siemens J., Meixner M., Sacristan M.D. // Plant Cell Tissue and Organ Culture. 1997. Vol. 47. P. 111-118.

108. Tsai H.J., Tseng F.S. Electroporation of a foreign gene into black Acanthopagrus schlegeli embryos I I Fish Science. 1994. Vol. 60. P. 787-788.

109. Usheva L.N., Odintsova N.A. Tumor-like lesions in the mantle of the mussel Modiolus dijficilis from the Sea of Japan // Diseases of Aquatic Organisms. 1999. Vol. 35(1). P. 63-68.

110. Jeyalectumie C., Subramoniam T. Cryopreservation of spermatophores and seminal plasma of the edible crab Scylla serrat Ц Biological Bulletin. 1989. Vol. 177. P. 247-253.

111. Voci A., Massajoli M., Bottazzi C., Demori I., Gallo G. Relationship between DNA synthesis and growth factor expression in primary cultures of adult rat hepatocytes // Boll. Soc. Ital. Biol. Sper. 1996. Vol. 72. P. 139-145.

112. Voituron Y., Storey J.M., Grenot C., Storey K.B. Freezing survival, body ice content and blood composition of the freeze-tolerant European common lizard, Lacerta vivipara // Journal of Comparative Physiology В. 2002. Vol. 172(1). P. 71-76.

113. Yamasu K., Suzuki G., Horii K., Suyemitsu T. Transcriptional regulation of the gene for epidermal growth factor-like peptides in sea urchin embryos // International Journal of Developmental Biology. 2000. Vol. 44. P. 777-784.

114. Yu J.K., Yan W., Zhang Y.L., Shen Y, Yan S.Y. Sperm-mediated gene transfer and method of detection of integratid gene by PCR // Acta Zoologica Sin. 1994. Vol. 40. P. 96-99.

115. Yuh CH, Bolouri H, Davidson EH. Genomic cis-regulatory logic: experimental and computational analysis of a sea urchin gene // Science. 1998. Vol. 279. P. 1896-902.

116. Watson PF in Effects of Low Temperatures on Biological Membranes, (eds) GJ Morris & A Clarke, Academic Press, London. 1981. pp 189-218 (a).

117. Watson PF The roles of lipid and protein in the protection of ram spermatozoa at 5 degrees С by egg-yolk lipoprotein // Journal of Reproduction and Fertilization. 1981. Vol. 62(2). P. 48392 (6).

118. Wiggins, Philippa M., Ferguson, Alexander B. Compositions and methods for preservation of living tissues //United States Patent № 5962.213,1999.

119. Worland M.R. and Block W. Desiccation stress at sub-zero temperatures in polar terrestrial arthropods // Journal of Insect Physiology. 2003. Vol. 49(3). P. 193-203.

120. Zhang X.S., Zhao L., Hua T.C., Zhu H.Y. A study on the cryopreservation of common carp Cyprinus carpio embryos // Cryo-Letters. 1991. Vol. 10. P. 271-278.