Структурно-функциональные изменения нейронов моллюска после криоконсервации

Дмитриева, Евгения Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональные изменения нейронов моллюска после криоконсервации
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные изменения нейронов моллюска после криоконсервации"

На правах

Дмитриева Евгения Владимировна

Структурно-функциональные изменения нейронов моллюска после криоконсервации

Специальность 03.00.02 биофизика АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г. Пущино, 2004

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН, г Пущино.

Научный руководитель Официальные оппоненты

Ведущее учреждение

кандидат биологических наук, Гахова Эдит Николаевна

доктор биологических наук, профессор Буданцев Аркадий Юстианович

доктор биологических наук Гордон Рита Яковлевна

Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, г. Москва

Защита состоится «_»_2004 года в ___ на заседании

Диссертационного совета Д 002.38.01 при Институте биофизики клетки РАН По адресу: 142 290, Пущино, Московской области, ул. Институтская 3, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН

По адресу: 142 290, Пущино, Московской области, ул. Институтская 3, ИБК РАН.

Автореферат разослан «_»_

2004 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук

Смолихина Т.И.

4*9 <

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Сохранение жизнеспособных клеток, тканей, органов при глубоком замораживании (криоконсервация) в течение длительного времени (десятки лет) представляет собой современную проблему при создании многих биологических и медицинских технологий. Одной из актуальных задач является изучение возможности длительного сохранения в замороженном (-196°С) состоянии нервных клеток и ткани без потери жизнеспособности. Интерес к этой проблеме имеет как научно-фундаментальный характер, так и прикладной в связи с необходимостью создания криобанка трансплантатов нервной ткани (Sorensen et al., 1986; Jensen et al, 1987; Robbins et al, 1990; Frodl et al„ 1994; Brunet, 2003). Известны работы по криоконсервации эмбриональной и дифференцированной ткани мозга человека, обезьян, лабораторных животных, культуры нервной ткани (Das et al., 1983; Scott and Lew, 1986; Collier et al., 1987; Silani et al., 1988; Roos et al., 1997; Brunet, 2003). Однако, введение в практику нейромедицины методов криоконсервации пока не получило развития в основном из-за непредсказуемости результатов, обусловленных недостатком фундаментальных знаний о механизмах криоповреждений и путей криозащиты.

Нейроны и нервы позвоночных и беспозвоночных животных благодаря свойствам электровозбудимых мембран и хорошо отлаженным способам регистрации электрической активности используются для исследований механизмов действия криопротекторов и низких температур (Pribor, Nara, 1973; Lenz et al., 1974; Menz, 1975; Scott and Lew, 1986; Гахова и др., 1989; Robbins et al., 1990; Sucher A. et al., 1991; Frodl et al., 1994; Чекурова, 1994; Kislov et al., 2000). В ряде работ, выполненных на нейронах и аксонах позвоночных и беспозвоночных животных, показано, что после криоконсервации в присутствии защитных агентов восстанавливаются электрические параметры нейрональных мембран (Asher, 1972; Pasic, De sa Faria, 1979; Гахова и др., 1989; Sucher et al., 1991; Decherchi et al., 1997; Gakhova et al., 1997). Однако сохранение электрических свойств нейрональных мембран после криоконсервирования нейронов не может быть единственным показателем жизнеспособности клеток. Раскрытие основных механизмов перехода клеток в недеятельное состояние при глубоком замораживании и выхода из него сопряжено с изучением структурно-функциональных перестроек, осуществляющихся при этих переходах. Для нервной ткани, состоящей из высокоспециализированных клеток с внутриклеточной формой регенерации, изучение компенсаторно-приспособительных процессов, как результата воздействия криозащитных агентов и низких температур, имеет особое значение.

В то же время работ по исследованию последствий криоконсервации на внутриклеточные структурные и метаболические свойства нейронов незначительное число, закономерности репарации клеточных структур после низкотемпературного воздействия до настоящего времени окончательно не выяснены и требуют ^а-п-ч^й"»! ■ ппппятттщтй р -црй связи комплексное

изучение морфо-функциональных свойств нейронов на модельных объектах (например, нейронах беспозвоночных) представляется весьма актуальной задачей, поскольку это позволит не только определить области криоповреждений и в значительной степени прогнозировать степень восстановления, но и оценить возможности повышения криорезистентности нейронов с помощью модификации криопротектирующих сред.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучить восстановление структуры и функции нервных клеток после криоконсервации на примере идентифицированных нейронов изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L Были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить характер повреждений и нормализации структуры и функции нейронов после замораживания-оттаивания методами электронной и люминесцентной микроскопии.

2. Оценить степень влияния криопротектора на структуру и функцию нейрона (методами электронной и люминесцентной микроскопии)

3 Изучить способность криоконсервированных нейронов формировать отростки в культуре in vitro

Научная новизна. Впервые с помощью методов электронной и люминесцентной микроскопии прослежена динамика восстановления структуры и функции нейронов моллюска после замораживания до температуры жидкого азота в присутствии диметилсульфоксида в качестве криопротектора. Показано, что ответ нейрона на замораживание до -196°С является суммированным ответом клетки на воздействие криопротектора и физических процессов, сопровождающих замораживание-оттаивание. Впервые показано, что после замораживания мозга моллюска в жидком азоте нейроны способны формировать отростки в клеточной культуре in vitro.

Практическая ценность работы. Результаты работы имеют теоретическое значение, расширяя представления в познании механизмов криозащиты и криоповреждения на клеточном уровне. Результаты, полученные в данной работе на нейронах моллюска, могут быть экстраполированы на нервные клетки позвоночных. Работы в данном направлении могут быть использованы при создании криобанка трансплантатов нервной ткани в медицинских целях.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на XYI Совещании «Консервация генетических ресурсов», 23-24 ноября 2000г, Пущино; на XYII Совещании «Консервация генетических ресурсов», 19-21 ноября 2002г, Пущино; на YII Европейской конференции международного общества нейробиологии беспозвоночных, 12-16 сентября 2003г, Калининград/ Светлогорск/ Отрадное; на YIII Пущинской конференции молодых ученых «Биология. Наука XXI века», Пущино, май 2004.

Публикации. По теме диссертации было опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 в реферируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 110 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Содержит 30 рисунков и 10 таблиц. Список цитируемой литературы включает 160 наименований.

Содержание работы

Объект и методы исследований. Работа была выполнена на изолированном мозге взрослого моллюска Ьутпаеа БгацпаНз Ь. Мозг этого моллюска состоит из нескольких пар ганглиев, соединенных между собой комиссурами и коннективами. Каждый из ганглиев содержит глиальные клетки и нейроны, размером от 10 до 250мкм (Дьяконова и др, 1970; Жерелова, 1971). Все ганглии и отходящие от них нервы заключены в соединительнотканную оболочку. Замораживанию (криоконсервированию) подвергался интактный орган, состоящий из разнородной популяции клеток со сложными межклеточными связями и синаптическими структурами.

Изолированный мозг моллюска замораживали в парах жидкого азота до -196°С, со скоростью 380-450°С/мин. В качестве криопротектора использовали диметилсульфоксид (ДМСО) в концентрации 1,8 - 2,1М. Материал сохраняли в жидком азоте от 1 месяца до 2 лет. Оттаивание осуществляли на водяной бане при 22-24°С со скоростью 380-450°С/мин. Скорость замораживания-оттаивания измеряли при помощи медно-константановых термопар с компьютерной регистрацией данных. Для осмотического уравновешивания внутриклеточной среды с наружным раствором добавление и отмывание криопротектора осуществляли постепенно (Кислов и др., 2000). После оттаивания и отмывания криопротектора для изучения восстановления структуры и функции мозг помещали в физиологический раствор следующего состава (в мМ): ЫаС1-80; КС1-1.6, МвС12 -1; СаС12-2, буфер Нереэ, рН~7,5; и затем инкубировали при 4-6°С (Е) согласно схеме эксперимента:

А В(20мин)С 0(50 мин) Е (2ч20мин) Р(5ч50мин)С(8ч50мин)Н

Рис. 1 Схема эксперимента Пояснения к схеме' А-В - препаровка; 20-22°С

В-С - добавление криопротектора, в течение 20 мин, 20-22°С

С - замораживание в парах жидкого азота, У~400°С/мин,

С-Ц - хранение в жидком азоте от 1 месяца до 2 лет; -196°С

И - размораживание на водяной бане (22°С, У~400°С/мин);

Б-Е - огмывание криопротектора (22°С), в течение 30 мин,

Е- Б - снижение температуры инкубирования от 22 до 4-6°С, в течение 90мин,

в, Н - инкубирование препарата мозга при 4-6°С, в течение 5 и 8 часов после

размораживания ткани

В скобках дано время с момента выделения мозга (без учета сроков хранения в жидким азоте).

Для изучения влияния замораживания-оттаивания и ДМСО изолированный мозг моллюска фиксировали для электронной и люминесцентной микроскопии в каждой из экспериментальных точек согласно схеме эксперимента. В качестве контроля использовали изолированный мозг, инкубированный в физиологическом растворе при тех же временных и температурных режимах, что и в эксперименте, но не подвергавшийся замораживанию в жидком азоте и воздействию ДМСО.

Для оценки правильности выбранного режима замораживания-оттаивания методами микроэлектродного отведения потенциалов были измерены мембранный потенциал (МП) и потенциалы действия (ПД) криоконсервированных нейронов через 30 минут, 1 час, 1,5, 2, 3 и 24 часа после оттаивания и инкубирования в физиологическом растворе при 4-6°С. Результаты эксперимента показали, что криоконсервированные нейроны сразу после оттаивания и отмывания криопротектора не генерировали ПД и имели очень низкий МП (-20мВ). Через 1,5-3 часа после инкубирования оттаянного мозга моллюска при 4-6°С в физиологическом растворе значения МП и ПД нейронов не отличались от контрольных: -60 -г- -40мВ и 110-170мВ, соответственно (рис. 2).

Рис.2.Криоконсервирован-ные нейроны через 1,5-2ч после оттаивания

генерировали ПД в otbci на импульсы тока силой 1мА продолжительностью

А - ответ нейрона до замораживания-оттаивания Б-нейрон после замораживания-опаивания и 1,5-2 часового инкубирования при 4-6°С Пунктирная линия -базовая (ПП)

Резутьтаты электрофизиологических исследований согласуются с ранее полученными данными (Гахова и др, 1989; Чекурова, 1994, Gakhova et all, 1997) и свидетельствуют о сохранении целостности мембраны криоконсервированных нейронов.

Для изучения функционального сосюянин клеток был использован метод, основанный на окраске препаратов флуоресцентным красителем акридиновым оранжевым (АО). Димеры АО, связанные с односпиральными участками РНК, флуоресцируют в красной области спектра l^o- Мономеры АО, интеркалированные в двухспиральные участки РНК, флуоресцируют в зеленой области спектра 153о (рис. 3) Соотношение полос излучения 164(/1;:й, обозначенное как параметр а (а=Гб4г/15зо), отражает соотношение одно- и

двухспиральных участков РНК в цитоплазме и в связи с этим используется нами в качестве показателя функциональной активности клетки (Карнаухов, 1978, Карнаухов, 2001, Гордон, 1989; Сергиевич, 2002; Карнаухова и др., 2002).

Для люминесцентного анализа мозг моллюска фиксировали смесью Карнуа (этанол : хлороформ : ледяная уксусная кислота - 6:3:1) (Бродский, 1960) в течение 30 минут, затем обезвоживали в спиртах и заливали в парафиновые блоки. Серийные срезы (толщиной 7 мкм) депарафинировали смесями ксилол-спирт, выдерживали в цитрат-фосфатном буфере 4 минуты (рН 4,2) и окрашивали флуоресцентным красителем акридиновым оранжевым (10"5М, SIGMA, США) на том же буфере в течение 10 минут.

)я

750 /,, ИМ

750 X, нч

— комплексы мономеров АО с двухспиральными нуклеиновыми кислотами

....... комплексы димеров АО с односпиральными

нуклеиновыми кислотами

Рис. 3. Спектры люминесценции окрашенных АО клеток чозга моллюска А - Цитоплазма Б - Ядро Длина волны возбуждения 465 нм

После отмывания срезов в буфере (по 5 минут), окрашенные срезы исследовали методом микроспектрального флуоресцентного анализа с использованием двухволнового микрофлуориметра "Радикал ДМФ-2" (МП "Радикал", Россия) (Карнаухов, 2001). Специальная программа "Микрофлуор" позволяет получать гистограммы распределения интенсивное гей флуоресценции в красной и зеленой областях спектра, а также параметра а=164О/15з0 исследуемых клеток в течение 15-20 минут с выводом точек на фазовую плоскость и статистической обработкой данных с использованием t-критерия Стьюдента. Измерения флуоресценции препарата проводили отдельно для ядер и цитоплазмы, с помощью зонда диаметром 7мкм. Измерение флуоресценции ядер не показало достоверной разницы, поэтому в данной работе все основные измерения были выполнены по результатам регистрации люминесценции цитоплазмы.

Контрольная обработка депарафинированных срезов в растворе кристаллической рибонуклеазы A (SIGMA, США) в забуференном физиологическом растворе (рН 7,5) в концентрации 1,0 мг/мл при 37°С в течение 30 минут показала, что после окрашивания люминесценция в красной

области спектра цитоплазмы клеток уменьшалась на 91-95%, что свидетельствует о специфическом связывании АО с РНК (5-9% неспецифическое связывание, в т.ч. с белками). Известно, что при фиксации, заливке и приготовлении гистологических препаратов в цитоплазме клетки транспортная РНК не сохраняется, а доля мРНК составляет всего несколько процентов (Бродский , 1966), следовательно сохраняющаяся в цитоплазме РНК - это рРНК. Следовательно, свечение цитоплазмы обусловлено связыванием рРНК с красителем.

При рН 4.2 (стандартная методика окрашивания АО), АО может связываться в цитоплазме клетки с мукополисахаридами, образуя соединения, люминесцирующие также в красной области спектра. Контрольное окрашивание препарата АО при рН 2.2, когда связывание АО происходит только с мукополисахаридами, показало уменьшение красной флуоресценции на 90%, что подтверждает 90% связывание АО с РНК (10% - неспецифическое окрашивание).

Для электронно-микроскопических исследований изолированный мозг моллюска фиксировали в каждой из экспериментальных точек (В, С, D, Е, F, G, Н) согласно схеме эксперимента в течение 16 часов в смеси альдегидов следующего состава (в мл)' глутаральдегид 25% (1,02), 4% параформ на 0,1М какодилатном буфере (2,3), 1М какодилатный буфер (0,22), диметилсульфоксид 100% ( 0,126), Н20 (0,78), рН смеси 7,2; 18-20°С(Мошков, 1985; Piccard, 1976). Дополнительно мозг фиксировали 1% раствором осмия на 0,2М какодилатном буфере. Обезвоживание проводили по спиртам возрастающей концентрации и в 3-х сменах абсолютного ацетона. Заливали препарат в ЭПОН-812 Срезы толщиной Юмкм готовили на пирамитоме LKB. При помощи светового микроскопа на толстых срезах идентифицировали нейрон МП-3, эти срезы переклеивали на другие блоки и резали ультратонко на ультратоме LKB Ultrotome-3 Контрастировали насыщенным спиртовым (на 70% этаноле) раствором уранилацетата (SERVA) и цитратом свинца (Гайер, 1974) и изучали в электронном микроскопе TESLA BS-500 (Чехословакия). Для качественной оценки структуры участки цитоплазмы фотографировали при увеличении 10 000, 14 ОООх.

Показано, что изменение в соотношении моносом, рибосом, связанных с эндоплазматическим ретикулумом, и рибосом, ассоциированных в полисомы, характеризует синтетическую активность белоксинтезирующего аппарата клетки (Gordon et all, 1997). Для оценки состояния белоксинтезирующего аппарата клетки был проведен подсчет рибосом по всему полю электронно-микроскопических фотографий на однородных участках цитоплазмы. Подсчитывали количество моносом; рибосом, связанных с эндоплазматическим ретикулумом, и рибосом, ассоциированных в полисомы, в контрольных и опытных нейронах на 5 пластинах для каждой экспериментальной точки (рис.1). Расчет осуществляли по формуле: (x=[M/(M+P+EPR)]xl00%), где х -искомая величина, М - число моносом, Р- число рибосом, ассоциированных в полисомы, EPR- число рибосом, связанных с ретикулумом. Доли рибосом, 8

ассоциированных в полисомы, и рибосом, связанных с ретикулумом, определяли по этой же формуле с соответствующими значениями числителя: Р и EPR. Статистическая обработка по критерию Стьюдента.

Жизнеспособность нейронов после криоконсервации изучали и по поведению клеток в культуре ткани in vitro. Для выделения одиночных нервных клеток из мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. и последующего культивирования использовали ранее описанную методику (Костенко и др, 1985). Замороженно-оттаянный мозг моллюска после инкубирования при 4-6°С в течение 15-18 часов помещали в промежуточный раствор (NaCl - 80 мМ, рН 6,8) (Костенко, 1981; Костенко и др., 1985), на 1 час при 4-6°С; изолировали нейроны из ганглиев путем ферментативной обработки ткани 0,35% раствором проназы (Serva, США) с последующим механическим выделением клеток. Изолированные нейроны культивировали на поверхности стекла без покрытия в чашках Петри в питательной среде, в специальных камерах (Костенко, Третьяк, 1978) Питательная среда представляла собой солевой раствор (NaCl -90mM, КС1 -5, СаС12 -2, MgCl2 - 1,5, tris HC1 -0,25) без добавления сыворотки, но содержащий 10%RPMI и 0,008% гентомицина (рН 7,9). Способность нейронов к морфологической дифференцировке оценивали по доле изменивших морфологию (на ранних этапах культивирования) и образовавших отростки клеток от общего числа жизнеспособных (т.е прикрепившихся к стеклу) нейронов. Культуру клеток исследовали под микроскопом МБИ-13 при обычном освещении.

Результаты и обсуждение

Чтобы показать, что криоконсервированные нейроны сохраняют жизнеспособность, были использованы методы микроэлектродного отведения потенциала, культуры ткани in vitro. Чтобы выявить морфофункциональные изменения нейронов после криосохранения были использованы методы люминесцентной и электронной микроскопии. В работе оценено влияние криопротектора диметилсульфоксида, замораживания-оттаивания и физиологического раствора на нейроны изолированного мозга большого прудовика.

1. Изменение функциональной активности нейронов моллюска (люминесцентная микроскопия)

1.1. Изменение функционального состояния синтетического аппарата нейронов моллюска при повышении температуры среды обитания от 4 до 22°С

Показано, что изменение метаболизма РНК в нейронах зависит от физиологического состояния животных и меняется при различных видах экспериментально вызванной активности (Бродский, 1966; Карнаухов, Вартонь,

1971; Мельникова и др, 1980). Чтобы изучить физиологический диапазон изменений функциональной активности мы провели эксперименты по нагреванию животных от 4 до 22°С с исследованием изменений параметра а методом люминесцентной микроскопии. Для этого моллюсков помещали в среду, которую нагревали до 22°С в течение суток. Через 0,5, 1.5, 3, 6, 12, 18 и 24 часа (6,5, 13, 16.8, 20.5, 21.5, 21.9, и 22°С соотве1Ственно) после начала нагревания из тела животного выделяли мозг и фиксировали по описанной методике для люминесцентных исследований. Контролем служил мозг животных, содержавшихся при 4° С. Функциональную (синтетическую) активность измеряли на нейронах большого и малого париетальных и висцерального ганглиев по параметру а.

Было обнаружено (рис. 4), что в первые часы нагревания среды значение функциональной активности по параметру а увеличивалось и достигало максимального значения через 1,5 часа (13°С), что на 35% выше контрольного значения. Значение параметра а при дальнейшем нагревании постепенно снижалось и после 6-часового нагревания при 20,5°С достигало плато, на 20% превышая контрольные значения. Все средние значения параметра а при исследованных температурах достоверно отличались от контрольных значений при 4°С (р<0.05).

/Г

О 5 10 15 20 25

Температура, °С

► — изменение средних значений параметра а цитоплазмы нейронов в зависимости от температуры среды - контроль, 4°С

Рис. 4. Изменение средних значений параметра а цитоплазмы нейронов большого прудовика в зависимости от температуры среды обитания животного чере! 0 5ч (6.5°С), 1 5ч (13.0°С), Зч (16,8°С), 6ч (20 5°С), 12ч (21 5°С), 18ч (21 9°С), 24ч (22 0°С) после начала нагревания

Следовательно, превышение функциональной активности по параметру а на 35% относительно контроля находится в физиоло! ическом диапазоне изменений функциональной активности для данного животного Эти опыты по выявлению диапазона функционально обусловленных изменений параметра а при нагревании животного были проверены при нагревании и охлаждении изолированного мозга моллюска В этом случае изменения параметра а относительно 4°С контроля составили 30%.

1.2. Изучение изменения функциональной активности нейронов моллюска после криоконсерваиии

Изучение проводили на идентифицированных нейронах МП1 и МПЗ малого париетального ганглия прудовика (Дьяконова и др., 1970). Анализ данных люминесцентной микроскопии, представленных в виде безразмерного относительного параметра а показывает увеличение функциональной активности сразу после отмывания криопротектора (на 35-40%) (криоконсервированные нейроны и нейроны изолированного мозга после воздействия ДМСО, рис.5). Значение параметра а сохранялось на высоком уровне в течение первых 1,5 часов инкубирования в физиологическом растворе при 4-6°С, при дальнейшем инкубировании в течение 5 и 8 часов при этой же температуре снижалось до контрольного значения. Это говорит о том, что функциональная активность криоконсервированного нейрона, (измеренная по параметру а через 8 часов 50 минут после выделения из тела животного) восстанавливается до исходного значения.

Известны работы, показывающие изменение связывания АО с рРНК в цитоплазме нервных клеток в зависимости от физиологического состояния животного (Гордон и др, 1989; Gordon et all, 1997). Авторами выявлена зависимость между значением параметра а и соотношением моносом и рибосом, ассоциированных в полисомы, в цитоплазме нейронов: значение параметра а уменьшалось при снижении доли рибосом, ассоциированных в полисомы, и возрастании числа моносом.

Рис. 5 Изменение среднего значения параметра а цитоплазмы нейрона МП1 малого париетального ганглия моллюска Lymnaea stagnalis L после замораживания-

Значение параметра а криокон-сервированных нейронов после отмывания криопротектора (22°С, 2ч20мин) на 40% выше контроля После воздействия ДМСО и его отмывания (без замораживания, 22°С, 2ч20мин) среднее значение параметра а на 30% выше контроля В контрольных нейронах к 5 часам инкубирования наблюдалось незначительное увеличение параметра а (13-15%) После продолжительного инкубирования в физиологическом растворе (4-6°С) к 5-8 часам от момента оттаивания значения параметра а опытных и контрольных нейронов не отличались

——'— замораживание-оттаивание

Количественный подсчет моносом, рибосом, ассоциированных в полисомы и рибосом, связанных с ЭПР, от общего числа рибосом на единицу площади

оттаивания (Схема эксперимента на рис 1)

а ,------

0 2 4 6 8

Время, ч

— контроль (раствор Риш ера),

клетки показал тенденцию к увеличению доли моносом в цитоплазме нейронов после инкубации с ДМСО и после замораживания-оттаивания. При длительной инкубации в физиологическом растворе при 4-6°С и в контроле и в опыте продолжалось увеличение числа моносом относительно общего количества рибосом. Доля рибосом, связанных с эндоплазматическим ретикулумом, показала тенденцию к уменьшению как в опытных, так и в контрольных нейронах при увеличении времени инкубирования в физиологическом растворе Это позволяет предположить, что наиболее сильно влиянию ДМСО, воздействию замораживания-оттаивания и длительного инкубирования в физиологическом растворе подвержен эндоплазматический ретикулум

2. Изучение изменения ультраструктуры нейрона МПЗ мозга моллюска после криоконсервации

В норме для нейрона МПЗ малого париетального ганглия моллюска Lymnaea stagnalis L характерно присутствие хорошо развитого эндоплазматического ретикулума. комплекса Гольджи, присутствие лизосом, ламеллярных структур, электронноплотных гранул, вакуолей различного типа. Для описания ответа клетки на воздействие были выбраны органеллы, занимающие заметную часть цитоплазмы нейрона и играющие значительную роль в жизни клетки' эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи, митохондрии, а также другие структуры, в которых выявляются заметные изменения: складчатость и число пор ядерной оболочки, вакуоли, гранулы, ламеллярные структуры и лизосомы.

Изучение изменений ультраструктуры нейрона после воздействия замораживания-оттаивания, криопротектора ДМСО, охлаждения и длительного инкубирования в физиологическом растворе выявило сходный характер изменений органелл.

Изменения эндоплазматического ретикулума (ЭПР) из-за его преимущественно центрального положения в клетке наиболее хорошо заметны и являются наиболее выраженными. При любом из описанных воздействий наблюдается набухание цистерн ретикулума (рис 6). Более сильные воздействия (замораживание в присутствии криопротектора) вызывают более выраженный ответ, заключающийся в наиболее значительном увеличении объема цистерн ЭПР. Также необходимо отметить зональность изменений ЭПР: более выраженную в приядерной области цитоплазмы и практически не заметную на периферии клетки. Зональность изменений наиболее сильно выражена у криоконсервированных нейронов, слабее - у подвергшихся воздействию только ДМСО и незаметна у контрольных нейронов после охлаждения.

При продолжительном инкубировании в физиологическом растворе наблюдается заметная дегрануляция части эндоплазматического ретикулума, сопровождаемая образованием большого числа ламеллярных структур. Формирование большого числа ЛС может свидетельствовать о нарушении липидного синтеза (Hook et al., 1986; Kanai, 1989; Carvalho, 1998). Ламеллярные

структуры свойственны нейронам моллюска и в норме (Боровягин, 1968, Bocharova et all, 1975, Вартонь, 1978)

Рнс.б.Ультраструктурные изменения гранулярного энлотазматического ретикулума

А-контрольный нейрон после 20-50 минутного инкубирования в физиологическом расгворе при 22JC Б-после охлаждения контрольных нейронов ог22 до 4-6 °Г Анало!ичная картина изменений ЭПР наблюдалась после инкубации с ДМСО, а 1акже на периферийных участках криоконсервированных ней-ронор сразу после оттаивания 22 С В - в при-ядерной области клетки посте замораживания-оттаивания 22rC I -ламел-тярные структуры (-1С) Шката SOOhm

Проведенные подсчеты долевых соотношений моносом и рибосом связанных с ретикулумом, показали увеличение доли моносом на 7-11,3% и уменьшение доли связанных с ретикулумом рибосом (на 8-9,9%) возможно, за счет дегрануляции ретикулума Вероятно основной вклад в увеличение количества моносом вносит частичная фрагментация ретикулума и сокращение его протяженности в результате длитегтьного инкубирования и воздействий замораживания-оттаивания и ДМСО

Аппарат Гольджи на изменение внешних условий отвечает изменением организации диктиосом (рис 7)

Добавление ДМСО вызывало усиление аутофагоцитоза. о чем свидетельствует появление большого количества разнообразных по форме и размеру аутофагосом, образование большого числа мультивезикулярных телец Изменения диктиосом комплекса Гольджи в ответ на охлаждение (в контроле, после воздействия ДМСО) и сразу после замораживания-оттаивания носят одинаковый характер, что выражается в образовании комплекта сложных пузырьков Восьмичасовое инкубирование в физиологическом растворе при 4-6°С стирае! различия в структурной организации диктиосом комплекса Гольджи контрольной и опытной клеток Через 8 часов инкубации мозга аппарат Гольджи образует обширную сеть в цитоплазме всех клеток, что свидетельствует о нормализации его структуры

Рис. 7 Изменения ультраструктурной организации диктиосом аппарата Гольджи

К контроль (тот же, что рис 6) Б - после инкубации с ДМСО, диктиосомы комплекса Гольджи окружены везикулами, что говорит о гипераюивации Стрелкой показано мультивезикулярное тельце (МвТ),

В - комплекс сложных пузырьков(СлП) В центре СлП можно заметить несколько цис1ерн аппарата Гольджи (показано двойной стрелкой), элек1роннопрозрачных и не образующих такой системы цистерн, как в контрольных нейронах Шкала 500 нм

И течение митохондрий (М) приядерной области также носи1 сходный характер при охлаждении контрольных нейронов, после инкубации с ДМСО, после отмывания ДМСО и последующего охлаждения, замораживания-опаивания и выражается в сильном набухании Необходимо отметить, что хотя изменения митохондрий при всех описанных воздействиях носят сходный характер, они различаются по степени ответа После воздействия ДМСО и последующего охлаждения наблюдается более сильное увеличение объема митохондрий, чем сразу после инкубации с ДМСО (рис 8)

В цитоплазме контрольных нейронов после охлаждения наблюдалось прилегание к митохондриям разнообразных структур, что может говорить о повышенной активности М Напротив, в криоконсервированных нейронах сразу после оттаивания такого прилегания цитоплазматических структур к М не наблюдалось, что возможно связано со снижением активности М в этот период После замораживания-оттаивания изменения митохондрий приядерной области сходны с изменениями этих органелл после воздействия ДМСО и последующего охлаждения, что может быть следствием инкубации с криопротектором + замораживание ^оттаивание Аналогичные изменения митохондрий приядерной области наблюдались при охлаждении контрольных нейронов от 22 до 4-6°С При дальнейшем инкубировании в физиологическом растворе при 4-6°С ультраструктурные отличия митохондрий после описанных воздействий сглаживались и через 8 часов митохондрии контрольной и опытной клеток практически не различались Это говорит о нормализации ультраструктурной организации, а следовательно и функции митохондрий криоконсервированных нейронов

Рис. 8. Ультрасгруктурные изменения митохондрий после охлаждения, воздействия ДМСО, замораживания-оттаивания

А - контроль (тот же, что рис 6) Б, В - митохондрии контрольных нейронов в приядерной области цитоплазмы (Б) и на периферии (В) после охлаждения от 22 до 4-6сС Г, Д - митохондрии в приядерной области (Г) и на периферии (Д) клетки после замораживания-опаивания

Сходная картина изменений ультраструктурной организации

митохондрий в приядерной области нейрона наблюдалась после воздействия ДМСО и последующего охлаждения Для сравнения

Е,Ж-ультраструктура митохондрий после инкубации с криопротектором (22°С), Е-приядерная область, Ж-периферия клетки Шкала 500нм

Сходные изменения ультраструктурной организации митохондрий (набухание) описаны после воздействий облучения, электрораздражения на нейроны позвоночных (Манина, 1971) Ультраструктурная организация митохондрий после 8 часового инкубирования при 4-6°С в физиологическом растворе сходна с описанной в литературе после длительного сохранения клеток в условиях гипотермии (гепатоциты, Griffiths et all, 2000), или в ответ на анаэробный стресс (растительные клетки, Vartapetian et all, 2003)

Ядерная оболочка После воздействия ДМСО, охлаждения и замораживания-оттаивания наблюдалось увеличение складчатости ядерной оболочки нейронов в области аксонного холмика, что говорит о усилении обмена между ядром и цитоплазмой Наиболее выражен этот процесс у криоконсервированных

нейронов после оттаивания и отмывания криопротектора Сильная складчатость ядерной оболочки в области аксонного холмика криоконсервированных нейронов сохранялась после длительной инкубации в физиологическом растворе при 4-6°С Под воздействием длительного инкубирования и охлаждения увеличивалась складчатость ядерной оболочки контрольных нейронов также в области аксонного холмика Такая же картина наблюдалась после инкубирования с ДМСО с последующим охлаждением Заметно увеличивалось количество пор ядерной оболочки после 1) воздействия ДМСО и последующего охлаждения. 2) у криоконсервированных нейронов после оттаивания и отмывания ДМСО, 3) у контрольных нейронов после охлаждения (рис 9)

Рис.9. Изменение числа пор ядерной оболочки.

А - контроль (тот же, что рис 6) Увечиченис числа пор ядерной мембраны Б - после воздействия ДМСО и последующего охлаждения, В - после оттаивания и отмывания криопротектора криоконсервированных нейронов, Г - после охлаждения контрольных нейронов от 22 до 4-6°С в течение 1,5 часов Обозначения 3-закрытая пора, О- открытая пора Шкала 500нм

Происходило не только увеличение числа пор ядерной оболочки но и их открывание Если в норме открытые поры наблюдались в редких случаях, то здесь было заметно большое число открытых пор, что свидетельствует об усилении выброса из ядра РНП материала Об усилении синтеза и выброса из ядра РНП свидетельствует и ультраструктурная организация ядрышка (большое содержание гранулярного материала и наличие пустот в ядрышках) в этот период, и скопление рибосом в приядерной области клетки, не наблюдаемое ранее Со стороны ядра наблюдалось прилегание гранулярного материала к внутренней оболочке ядра в области пор, на снимках в области открытых пор (рис 9, Г,В) заметно прохождение гранулярного материала из ядра в цитоплазму

Исследование изменений ультраструктурной организации идентифицированного нейрона МПЗ под влиянием криопротектора ДМСО, замораживания-оттаивания, длительного инкубирования в физиологическом растворе и охлаждения показало, что на каждое воздействие клетка отвечает сходными изменениями органелл. Исследование влияния ДМСО показало набухание цистерн (приядерная область) и разрыхление эндоплазматического ретикулума с частичной фрагменгацией ("розетты", Манина, 1971), образование большого количества лизосом, увеличение объема отдельных митохондрий приядерной области наряду с нормальными митохондриями на периферии клетки. После инкубации с ДМСО наблюдалось увеличение складчатости ядерной мембраны. Под воздействием ДМСО происходило накопление большого числа электронно-плотных гранул, лизосом, липосом, ламеллярных структур, появляются крупные вакуоли. При последующем инкубировании этих нейронов в физиологическом растворе при 4-6°С изменения ультраструктуры нейрона МПЗ носили сходный характер с изменениями ультраструкгуры, наблюдаемыми при длительном инкубировании в физиологическом растворе контрольных нейронов. Замораживание-оттаивание оказывало более сильное воздействие на ультраструктурную организацию нейрона, чем криопротектор. В ультраструктурной организации нейрона сразу после оттаивания (без отмывания ДМСО, 22°С) прежде всего необходимо отметить зональность ультраструктурных изменений органелл, выраженную сильнее, чем при воздействии только криопротектора. Наиболее значительны были изменения органелл приядерной области клетки: сильное увеличение цистерн ретикулума в объеме, набухание митохондрий с деструктивными изменениями крист, увеличение складчатости ядерной мембраны. Периферическая часть цитоплазмы практически не показала изменений: митохондрии имели нормальные размеры и форму, цистерны эндоплазматического ретикулума были лишь незначительно увеличены в объеме. Изменения диктиосом аппарата Гольджи не были подчинены зональности цитоплазмы, носили одинаковый характер и выражались в формировании комплексов сложных пузырьков. Развивалась общая вакуолизация цитоплазмы. После отмывания криопротектора отмечено усиление общей вакуолизации цитоплазмы криоконсервированных нейронов, выраженное в дальнейшем увеличении цистерн ретикулума, присутствии большого количества гладкоконтурных пузырьков. Ультраструктурная организация ядрышка свидетельс!вует об усилении синтетических процессов в ядре (увеличение гранулярного компонента в ядрышке), при этом наблюдалось увеличение числа пор ядерной оболочки (рис. 9В). Редко встречающиеся структуры комплекса Гольджи представляли собой 2-5 электроннопрозрачных цистерн. Происходило накопление разнообразных по форме и размеру ламеллярных структур, в большей степени, чем липосом и лизосом. Митохондрии с деструктуивными изменениями уже не встречались, но возрастало число лизосом. Можно отметить усиление аутофагоцитоза, что также может свидетельствовать о начале процессов нормализации ультрасгруктурной организации нейрона. При последующем инкубировании криоконсервированных нейронов в физиологическом растворе при 4-6°С

наблюдалось начало сборки цистерн аппарата Гольджи в единый комплекс, уменьшение объема цистерн ретикулума, их организация в единую сеть. Ультраструктурная организация ядрышка в этот период говорит об инволюции ядра, ведущей к снижению активности. На охлаждение от 22 до 4-6°С контрольные нейроны отвечали сходными изменениями органелл цитоплазмы: набуханием цистерн ретикулума, формированием комплексов сложных пузырьков из аппарата Гольджи (вакуолизация цитоплазмы), увеличением складчатости ядерной мембраны, увеличением числа пор ядерной оболочки (ультраструктурная организация ядрышка в этот период свидетельствует об активации синтетических процессов в ядре), набуханием митохондрий с деструктивными изменениями крист. В общем, ультраструктурная организация контрольных нейронов после охлаждения свидетельствует об увеличении синтетической активности клетки. После длительного инкубирования в физиологическом растворе в ультраструктурной организации всех нейронов (как опытных, так и контрольных) наблюдались сходные изменения эндоплазматического ретикулума, митохондрий (удлинение и уплощение). В некоторых клетках были видны скопления гранул на периферии клетки. Уплощенные цистерны комплекса Гольджи образовывали сеть, встречалось много лизосом, ламеллярных структур, на периферии клетки присутствовали скопления структур, называемые очагами дегенерации (Манина, 1971). Встречались гипертрофированные структуры аппарата Гольджи, измененные цистерны ретикулума (розетты, свидетельствующие о фрагментации ретикулума), большие вакуоли в цитоплазме.

3. Исследование поведения в культуре in vitro нейронов

криоконсервированного мозга моллюска

Для подтверждения жизнеспособности криоконсервированных нейронов были проведены эксперименты по поведению оттаянных нейронов в культуре in vitro.

Перед введением нейронов в культуру in vitro изолированный мозг инкубировали при 4-6°С в течение 15-18 часов. Клетки мозга, не прошедшие предварительного длительного инкубирования, не формировали отростки. Нейроны контрольных клеток вели себя обычным образом - были способны к морфологической дифференцировке без предварительного инкубирования. Факт получения огростков криоконсервированных нейронов после длительной инкубации при пониженной температуре подтверждает необходимость восстановительного периода для опытных нейронов и свидетельствует о сохранении структуры и функции криоконсервированными нейронами в течение как минимум 18 часов после оттаивания. Клетки летних и зимних животных обрабатывали разным способом. Нейроны, полученные из мозга моллюсков, отловленных в зимний период, как в опыте, так и в контроле, образовывали отростки только после обработки нервных колец промежуточным раствором, снижающим общий уровень Са2^. Нейроны мозга летних моллюсков формировали отростки и без стимулирования регенерационной активности клеток промежуточным раствором. Это может

объясняться тем, что в зимний период в клетках и гемолимфе пойкилотермных животных происходит накопление неорганических ионов, в том числе и кальция (Сорокина, 1978, Мартемьянов, 2001)

Для морфологической дифференцировки необходимо, чтобы после эксплантации в культуру нейроны прикрепились к стеклу и втянули аксоны, оставшиеся после изоляции клеток из мозга (Костенко, 1985, Griffiths et all, 2000) Затем нейроны округляются и приобретают способность к движению У некоторых нейронов образуются наплывы цитоплазмы ламеллы, указывающие на начало процесса роста отростков Часть нейронов объединяется в группы, состоящие из двух и более клеток В наших

экспериментах нейроны, изолированные из мозга после замораживания-оттаивания при введении в культуру вели себя сходным образом

В первые сутки культивирования в питательной среде клетки втягивали аксоны и округлялись, из них до 70% от общего числа клеток прикрепилось к стеклу Из этих, потенциально способных к морфологической дифференцировке нейронов, около 28 % сформировали огростки У некоторых нейронов были видны только ламеллы, в то время как другие успевали сформировать крупные, ветвистые отростки На второй день количество клеток, формирующих отростки, значительно увеличивалось (до 56% от общего числа прикрепившихся к стеклу нейронов) Длина отростков превышала диаметр сомы, на концах наблюдались округлые наплывы цитоплазмы (зоны роста), свидетельствующие о дальнейшем их развитии В течение трех суток культивирования наблюдали утолщение, ветвление отростков и агрегацию нейронов В процессе дальнейшего культивирования (не менее 7-8 суток) более мелкие нейроны (30-50 мкм) постепенно погибапи, в то время как у более крупных происходило разрастание отростков и образование контактов между отростками соседних клеток (рис 10)

Рис. 11. Рост отростков криоконсервированных нейронов в культуре in vitro 7 суток культивирования в питательной среде m vitro, 22°С А - контроль, Б - криоконсервированный нейрон Шкала 30 мкм

Срок жизни культуры криоконсервированных клеток не отличался от продолжительности жизни контрольных и составлял 10-11 суток, что согласуется с ранее полученными данными (Костенко, 1985).

Заключение

В результате проведенных исследований получены данные, свидетельствующие о том, что нейроны прудовика Lymnaea stagnalis L. способны возвращаться к жизнедеятельности после замораживания и длительного, до 2-х лет, хранения изолированного мозга при температуре жидкого азота, -196°С. Электрические параметры (МП и ПД) мембран восстанавливались до характерных для данных нейронов значений, что согласуется с ранее полученными данными (Гахова и др., 1989; Gakhova et al., 1997). Впервые показано, что нейроны, изолированные из криоконсервированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. и помещенные в культуру in vitro, способны к регенерации, образуя отростки неотличимые от таковых у контрольных нейронов. Однако для проявления этих функций нейронам после оттаивания необходимо было пройти восстановительный период: выдерживание деконсервированного и отмытого от криопротектора (ДМСО) мозга моллюска в физиологической среде при низкой температуре(4-6°С). Для восстановления электрических параметров в этих условиях потребовалось не менее 1,5-2 часов. Для формирования нейрональных отростков перед высевом в культуру также было необходимо предварительное выдерживание оттаянного мозга при низких температурах (в наших экспериментах от 15 до 18 часов).

Люминесцентное и электронномикроскопическое исследования нейронов показали сложный характер морфофункциональных изменений в этот период. Максимальные изменения функциональной активности криоконсервированных нейронов по параметру а (увеличение значения а на 35-40% после оттаивания нейронов и отмывания криопротектора) находились, как показано нами, в соответствии с физиологически обусловленным диапазоном для этого объекта (Карнаухова, Сергиевич, Дмитриева и др., 2002).

Описанные изменения ультраструктуры в результате а)влияния ДМСО, б)воздействия замораживания-оттаивания, в)охлаждения от 22 до 4-6°С и г)длительного (8ч) инкубирования в физиологическом растворе при 4-6°С демонстрируют сходный (независимо от воздействия) характер перестроек эндоплазматического ретикулума, комплекса Гольджи, митохондрий, образование и накопление лизосом, ламеллярных структур, очагов дегенерации, увеличение количества крупных вакуолей, присутствующих в меньших количествах в норме.

Сходные изменения органелл наблюдались под влиянием разных воздействий: электрораздражения (Bocharova et al., 1972; облучения, экспериментального невроза (Манина, 1971), аноксии (Vartapetian et all, 2003), длительного инкубирования в условиях гипотермии и гипоксии (Griffiths et all, 2000; Jintti et all., 1992). Скопление лизосом и электронно-плотных гранул на

периферии клетки может свидетельствовать также и о повреждениях внутриклеточных структур (Манина, 1971), которые не были летальными для клетки, что подтверждается росюм отростков в клеточной культуре. Через 8 часов после оттаивания и отмывания криопротектора уровень функциональной активности по параметру а и ультраструю ура нейронов были подобны контрольным.

Известно, что широко применяемый криопротектор ДМСО может оказывать не только защитное, но и повреждающее действие на клетку (Т^коувкп е1 а!., 1971; Шраго, 1983; Коро'ка е! а1, 2003). Методами люминесцентной и электронной микроскопии показано, что значительный вклад в ответ клеток на замораживание-оттаивание составляет ответ нейрона на воздействие криопротектора. в частности ДМСО.

Таким образом, комплексное изучение нейрона после криоконсервации изолированного мозга моллюска позволило не только показать сохранение жизнеспособности нейронов после временной остановки его жизнедеятельности, но и охарактеризовать структурно-функциональные перестройки клетки при воздействии разных факторов, сопровождающих процесс криоконсервации.

Выводы:

1. После замораживания в жидком азоте изолированного мозга Ьутпаеа з1а§паНз Ь со скоростью ~400°С/мин в прису1ствии 2М ДМСО нейроны сохраняли жизнеспособность и восстанавливали структуру и функцию после оттаивания при условии длительного инкубирования при низкой температуре.

2 Изменения функциональной активности нейронов после оттаивания, измеренные по параметру а (а" 1б4о /Ьзо), носят сложный характер: значение параметра а сразу после оттаивания не отличается от контроля, значительно возрастает после отмывания криопротектора ДМСО (3540%), удерживается на высоком уровне в течение 1,5 часов при охлаждении изолированного мозга, и возвращается к контрольному уровню после длительного инкубирования (8 часов). Эти изменения находятся в пределах физиологически обусловленного диапазона

3. Результаты исследования ультраструктуры криоконсервированного мозга после оттаивания свидетельствуют о восстановлении структуры и функции нейрона в течение 8 часов инкубирования при 4-6°С.

4. Диметилсульфоксид оказывает влияние на структуру и функцию клетки Уровень функциональной активности под воздействием 2М ДМСО возрастает в среднем на 35% относительно контроля и вносит основной вклад в изменения параметра а криоконсервированных нейронов.

5. Криоконсервированные нейроны после длительного (18 часов) инкубирования в физиологическом растворе при 4-6°С способны формировать отростки.

6. Общая картина ультраструктурных и функциональных изменений нейронов после оттаивания является следствием суммарного воздействия ДМСО, длительного инкубирования в физиологическом растворе и физических процессов, сопровождающих замораживание-оттаивание клеток.

Список публикаций:

1. Карнаухова Н.А., Сергеевич JI.A., Дмитриева Е.В , Гахова ЭН., Карнаухов В.Н. Исследование функциональной активности ганглиев большого прудовика при изменении температуры // Биофизика, 2002, т.47, вып. 6, с.1080-1085.

2. Гахова ЭН., Дмитриева Е.В. Криоконсервация нервной ткани //Биофизика живой клетки, 2003, т. 7, с.65-68.

3. Ивличева Н.А., Дмитриева Е.В., Костенко М.А., Гахова Э.Н. Криоконсервированные нейроны Lymnaea stagnalis способны к морфологической дифференцировке в культуре //Биофизика, 2004, т. 49, вып 4, с. 710-714.

4. Дмитриева Е.В. Гахова Э.Н., Карнаухов В Н , Карнаухова Н А , Кислов А.Н , Сергеевич JI.A. (2004) Изменение синтетической активности нейронов изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L после замораживания в жидком азоте// Материалы XYII совещания «Консервация генетических ресурсов», 19-21 ноября 2001г., Пушино.

5. Каранова М В., Дмитриева Е В., Березин Д.Е., Гахова Э.Н. (2004) Измерение точки замерзания тканевых жидкостей прудовика Lymnaea stagnalis L и ротана Perccottus glenhi как тест на присутствие криопротекторов// Материалы XYII совещания «Консервация генетических ресурсов», 19-21 ноября 2001г., Пущино.

6 Dmitrieva Е , Moshkov D.A., Gakhova E.N. Ultrastructural changes of the mollusc neurons after cryopreservation // Abs. VTT east European conference of the international society for invertebrate neurobiology / Simpler nervous systems. Kaliningrad - Svetlogorsk - Otradnoe, 2003. P. 39.

Принято к исполнению 27/09/2004 Исполнено 27/09/2004

Заказ № 341 Тираж 75 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat ru

РНБ Русский фонд

2006-4 4891

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дмитриева, Евгения Владимировна

Введение

1. Обзор литературы

Оглавление

2. Материалы и методы

2.1. Объект исследования

2.2. Подготовка животного к опыту

2.3. Замораживание-оттаивание изолированного мозга 33 моллюска

2.4. Люминесцентная микроскопия

2.5. Исследование ультраструктуры

2.6. Культура in vitro

3. Результаты и обсуждение

3.1. Замораживание изолированного мозга прудовика до -196°С и электрофизиологический контроль жизнеспособности нейронов после оттаивания

3.2. Изменение функциональной активности нейронов моллюска (люминесцентная микроскопия)

3.2.1. Изменение функционального состояния синтетического аппарата нейронов моллюска Lymnaea stagnalis L. при повышении температуры среды обитания от 4-6°С до 20- 44 22°С

3.2.2. Изучение изменения функциональной активности нейронов моллюска после криоконсервации

3.2.3. Люминесцентная микроскопия изолированного мозга при длительном инкубировании при +4.+6°С(контроль)

3.2.4. Изменение функционального состояния синтетического аппарата (по параметру а) нейронов изолированного мозга моллюска при изменении температуры инкубирования 52 изолированного мозга

3.3. Изучение изменений ультраструктуры нейрона МПЗ мозга моллюска после криоконсервации

3.3.1. Ультраструктура контрольных нейронов

3.3.2. Изучение изменений ультраструктурной организации эндоплазматического ретикулума после воздействий замораживания-оттаивания, ДМСО и последующих охлаждения (от +20-22°С до +4-6°С) и длительного инкубирования в физиологическом растворе при +4-+6°С (в сравнении)

3.3.3. Изучение изменений ультраструктурной организации диктиосом комплекса Голъджи после воздействий замораживания-оттаивания, ДМСО и последующих охлаждения (от 20-22°С до 4-6°С) и длительного инкубирования в физиологическом растворе при +4-+6°С (в сравнении)

3.3.4. Изучение изменений ультраструктурной организации митохондрий после воздействий замораживания-оттаивания, ДМСО и последующих охлаждения (от 20-22°С до 4-6°С) и длительного инкубирования в физиологическом растворе при +4-+6°С (в сравнении)

3.3.5. Изучение изменений ультраструктурной организации ядерной оболочки нейронов после воздействий замораживания-оттаивания, ДМСО и последующих охлаждения (от 20-22°С до 4-6°С) и длительного инкубирования в физиологическом растворе при +4-+6°С (в у^ сравнении)

4. Исследование поведения в культуре in vitro нейронов 83 криоконсервированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные изменения нейронов моллюска после криоконсервации"

Сохранение жизнеспособных клеток, тканей, органов при глубоком замораживании (криоконсервация) в течение длительного времени (десятки лет) представляет собой современную проблему при создании многих биологических и медицинских технологий. Раскрытие основных механизмов перехода клеток в состояние обратимой остановки жизни и выхода из него связано с исследованием структурно-функциональных перестроек, осуществляющихся при этих переходах. В связи с этим изучение замораживания нервных клеток до ультранизких температур представляется весьма перспективным из-за возможности регистрации целостности клеточных мембран и рецепторов электрофизиологическими методами, возможности наблюдения за поведением криоконсервированных нейронов в культуре in vitro, а также благодаря возможности изучения поведения криоконсервированных трансплантатов нервной ткани в мозге животных. Несомненно, что в сочетании с гистохимическими, ультрамикроскопическими, иммунологическими и другими методами изучение криоконсервации нервных клеток (нервной ткани) внесет существенный вклад в понимание механизмов криоповреждений и криозащиты в процессе глубокого замораживания.

Интерес к проблеме криоконсервации нервной ткани имеет как научно-фундаментальный характер, так и прикладной в связи с необходимостью создания криобанка трансплантатов нервной ткани для медицинских целей (Frodl et all, 1994; Robbins et all, 1990; Sauer et all, 1992; Brunet et all, 2003). Первые результаты по выживанию ткани мозга цыпленка после замораживания до температуры -196°С были опубликованы в 1953 г. (Luyet, Gonzales, 1953). Позднее, в 1980 г., было показано, что нервная ткань эмбриона млекопитающих переживают замораживание до -90°С при хранении в течении 18 недель. Далее можно привести ряд работ, в которых эмпирически подобранные режимы замораживания и использование традиционных криопротекторов (диметилсульфоксид, глицерин) позволили с разной степенью сохранности заморозить ткань мозга крыс и приматов, в том числе человека (Sckott et all, 1986; Silani et all, 1988), культуру нервной ткани (Kawamoto, Barret, 1986; Petite, Calvet 1997; Sckott et all, 1986). В изучение прошедших замораживание нейронов входило тестирование жизнеспособности и описание морфологической сохранности, роста отростков в культуре in vitro, состояния рецепторов, синтеза медиаторов, восстановления электрической активности, приживляемости трансплантатов в мозге животных (Jensen et all, 1985; Sckott et all, 1986; Sucher et all, 1992). Успех криоконсервации в значительной степени зависел от возраста донора, скоростей замораживания-оттаивания, химической природы и концентрации криопротектора. Несмотря на актуальность проблемы, введение в практику нейромедицины методов криоконсервации, пока не получило развития в основном из-за непредсказуемости результатов, обусловленных недостаточностью сведений о механизмах криоповреждений и путей криозащиты.

В ряде работ, выполненных на нейронах и аксонах позвоночных и беспозвоночных животных, показано, что после криоконсервации в присутствии защитных агентов восстанавливаются электрические параметры нейрональных мембран (Asher, 1972; Pasic, De sa Faria, 1979; Гахова и др., 1989; Sucher et al., 1991; Decherchi et al., 1997; Gakhova et al., 1997). Однако сохранение электрических свойств нейрональных мембран после криокон-сервирования нейронов не может быть единственным показателем жизнеспособности клеток. Раскрытие основных механизмов перехода клеток в недеятельное состояние при глубоком замораживании и выхода из него сопря6 жено с изучением структурно-функциональных перестроек, осуществляющихся при этих переходах. Для нервной ткани, состоящей из высокоспециализированных клеток с внутриклеточной формой регенерации, изучение компенсаторно-приспособительных процессов, как результата воздействия криозащитных агентов и низких температур, имеет особое значение. В то же время работ по исследованию последствий криоконсервации на внутриклеточные структурные и метаболические свойства нейронов незначительное число, закономерности репарации клеточных структур после низкотемпературного воздействия до настоящего времени окончательно не выяснены и требуют дальнейших исследований. В этой связи комплексное изучение морфо-функциональных свойств нейронов на модельных объектах (например, нейронах беспозвоночных) представляется весьма актуальной задачей, поскольку это позволит не только определить области крио-повреждений и в значительной степени прогнозировать степень восстановления, но и оценить возможности повышения криорезистентности нейронов с помощью модификации криопротектирующих сред.

Целью данной работы было изучить восстановление структуры и функции нервных клеток после криоконсервации на примере идентифицированных нейронов МП1 и МПЗ изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

3. Изучить способность криоконсервированных нейронов формировать отростки в культуре in vitro

1. Обзор литературы

Криоконсервация - обратимая остановка жизнедеятельности клеток На сегодняшний день криоконсервирование (замораживание и сохранение при сверхнизких температурах, -196°С) - единственный известный метод, способный обеспечить сохранение клеток и тканей животных и растений в течение многих месяцев и даже лет без значительной потери жизнеспособности.

Поскольку при столь низких температурах биохимические реакции, необходимые для жизни, не протекают, то клетки (ткани, органы, организмы) находятся в состоянии временной обратимой остановки жизни (жизнедеятельности), или анабиоза (Лозина-Лозинский, 1972, Голдовский, 1981, Ушатинская, 1990). При хранении биологического материала при -196°С единственным известным на сегодня повреждающим фактором является радиоактивный фон Земли и космические излучения. Расчеты, полученные на основании экстраполяции экспериментальных данных по действию радиации на клетки при низких температурах, показывают, что они могут храниться при -196°С по крайней мере в течение нескольких сотен лет без накопления летальных повреждений ДНК (Виленчик, 1983).

Согласно современным представлениям основной причиной повреждений клетки при замораживании является образование вне- и внутриклеточного льда. При вымораживании воды в лед живые системы подвергаются воздействию комплекса физико-химических факторов. Среди них существенное значение имеют внутриклеточная кристаллизация, гиперконцентрация солей и ионной силы раствора, изменение величины рН и зарядовых характеристик мембран, значительное обезвоживание и фазовые превращения биополимеров и надмолекулярных структур (Пушкарь и др., 1977; Белоус, Грищенко, 1994).

Процесс кристаллообразования по-разному воздействует на клетки и ткани. Это зависит прежде всего от скорости охлаждения биоматериалов, 8 присутствия в среде криопротекторов и других защитных добавок, от скорости отогрева, от свойств самого биологического материала.

Процесс криоконсервирования в целом можно представить в виде схемы, состоящей из последовательных стадий:

1. Подготовка объекта к замораживанию: получение биологического материала, погружение в искусственную физиологическую среду и выдерживание в ней для адаптации. Длительность инкубирования и температурные условия зависят от конкретного объекта и поставленных задач.

2. Замещение физиологической среды на криозащитный раствор, который может содержать один криопротектор, или сочетание нескольких криопротекторов, метаболические вещества, антиоксиданты и др. Обычно этот раствор гипертоничен по отношению к клетке, поэтому криопротектор добавляют постепенно до конечных концентраций. Время выдерживания в этом растворе для осмотического уравновешивания внутриклеточной среды с криозащитным раствором может колебаться от нескольких минут до нескольких часов при постоянной температуре.

3. Глубокое охлаждение до температуры жидкого азота, -196°С. Это может быть замораживание путем непосредственного погружения биологического материала в жидкий азот, или замораживание в парах жидкого азота, или по определенной программе с применением специальных замораживающих устройств.

4. Длительное сохранение биологического материала в жидком азоте (-196°С), или в парах жидкого азота (-150 н-170°С) в специальных хранилищах.

5. Отогрев объекта по определенному режиму до положительных температур.

6. Отмывка криозащитного раствора и замещение его физиологической средой. При таянии кристаллов льда и отмывке клеток от криопротектора клетки обычно оказываются 9 гипертоничными по отношению к наружному раствору. Для избежания постгипертонического лизиса вымывание криопротектора обычно осуществляют медленно до исчезающих его концентраций.

На каждом этапе криоконсервации, клетки (ткани, органы) подвергаются воздействию разного рода химических и физических факторов. Развитие методов криоконсервации клеток, тканей, органов основано на изучении механизмов их криоповреждений и криозащиты в процессе замораживания и отогрева.

Способность восстановления жизнедеятельности после оттаивания заисит от сохранения целостности клеточных структур, межклеточных контактов, рецепторов и др. Степень сохранности непосредственно связана со свойствами клеток (тканей) — механизмами устойчивости к экстремальным воздействиям, к которым клетки (ткани, организмы) не могли быть приспособлены в течение своей эволюции. Раскрытие основных механизмов перехода в недеятельное состояние (анабиоз) и выхода из него сопряжено с изучением структурно-функциональных перестроек, происходящих при этих переходах. В связи с этим изучение замораживания нервных клеток (нервной ткани, мозга) до ультранизких температур представляется перспективным из-за возможности регистрации целостности клеточных мембран электрофизиологическими методами, возможностью наблюдения за поведением криоконсервированных нейронов в культуре ткани, и, благодаря развитой за последние годы техникой трансплантации нервной ткани в мозг животных, возможностью изучения криоконсервированных трансплантатов. Криоконсервация нервной ткани

Первые наблюдения за выживаемостью нейрональной ткани после замораживания относятся к 1953 году, когда Лайет и Гонзалес (Luyet&Gonzales, 1953) показали, что ткань мозга цыпленка может переживать замораживание до -196°С. Позднее, в 1980 году, были опубликованы данные о переживании эмбриональной ткани мозга

10 млекопитающих в течение нескольких недель при -90°С, замороженных с медленной скоростью с использованием 10% ДМСО. (Houl&Das, 1980). Дальнейшие работы показали возможность криоконсервации нервной ткани человека и животных при использовании криозащитных сред. Интерес к криоконсервации нервной ткани был проявлен в связи с развитием методов трансплантации клеток и тканей в медицинских целях, поэтому особое внимание было уделено изучению криоконсервации не изолированных нейронов, а нейрональной ткани (коры головного мозга, гипокампа и др.), которую можно трансплантировать в мозг реципиентам сразу после оттаивания, или через промежуточный этап проведения изолированных клеток через культуру in vitro.

К этому времени были уже достигнуты значительные успехи в криоконсервации и сохранении при температуре жидкого азота различных изолированных клеток в однородных суспензиях (клетки эмбриональной нервной ткани, клетки крови, взвесь сперматозоидов, клетки печени, селезенки, почки и др.) (Silani et al., 1988; Фуллер и др., 2003; Гольцев и др, 2003).

Замораживание ткани (и органов) в отличие от изолированных клеток до ультранизких температур сопряжено с определенными трудностями. Для успешного решения задач криоконсервации различных тканей (и органов) необходимо учитывать особенности их биологической организации. В противоположность клеточным суспензиям ткани (и органы) имеют фиксированную геометрию, высокую плотность клеток, разнообразие клеточных типов. Структурная организация, клеточная дифференциация, и, соответственно, степень функционирования отдельных клеточных популяций в этой системе различны. Поэтому проникновение и распределение криозащитных веществ, а также фронта кристаллизации в ткани происходят неравномерно, что обуславливает появление температурного градиента и градиента осмотического давления. Даже маленькие кусочки ткани, или органа (каковым является мозг моллюска), содержат клетки с различными морфофункциональными особенностями.

Оптимальные условия их выживания в процессе криоконсервации могут существенно отличаться, так как они по-разному реагируют на сдвиг температуры, природу и концентрацию криопротекторов, на сложные криоконсервирующие смеси и т.д. Наглядно это показано на примере замораживания в одних и тех же условиях седалищных нервов лягушки до -10-П5°С: нервы, лишенные оболочки, восстанавливали электрические пераметры после оттаивании, в отличие от интактных (Pribor&Nara, 1969). Нейроны и глиальные клетки человека и лабораторных животных в различной степени сохраняли жизнеспособность при одних и тех же условиях замораживания-оттаивания (Redmond et al., 1988; Koopmans et al., 2001; Гольцев и др. 2003). Показано также, что контакты, необходимые для функционирования тканевой системы, оказываются наиболее уязвимыми местами для осмотического стресса и фазовых переходов, сопровождающих процесс криоконсервации (Armitage et al., 1995; Yang et al., 1996).

К настоящему времени имеется ряд работ по криоконсервации эмбриональной и зрелой нервной ткани животных. Эмбриональные ткани, в том числе и нервная, отличаются пониженной иммунологической компетентностью и относительно хорошо переносят цикл замораживания^ отогрева при удачном подборе криопротекторов и криозащитных сред (Fang &Zhang; 1992; Collier et al., 1993; Swett et al., 1994; Petite et al., 1995; 1997; Koopmans et al., 2001). Тем не менее, авторы отмечают, что клетки, культивированные после длительной криоконсервации эмбриональной нервной ткани, были очень чувствительны к механическим и осмотическим воздействиям, а процент приживления трансплантатов после криоконсервирования был довольно низким (Albert, Das, 1984)

Существенную роль в восстановлении морфофункциональных свойств нервной ткани после воздействия таких экстремальных факторов, как охлаждение и замораживание, играет ее способность к регенерации. Клетки эмбриональной нервной ткани способны к митотическому делению и росту клеток, поэтому поврежденные клетки могут замещаться новыми, а критериями успешной криоконсервации может служить изучение биосинтеза

12 белка и ДНК (клеточные механизмы, обеспечивающие эти функции ткани) (Бабийчук и др., 2000).

Клетки зрелой дифференцированной нервной ткани имеют внутриклеточную форму регенерации, и ее замораживание и восстановление криоповреждений могло встретить ряд трудностей, отличных от замораживания эмбриональной ткани. Тем не менее, показана возможность криоконсервации и восстановление жизнеспособности постнатальной нервной ткани практически при тех же условиях замораживания-оттаивания, что и эмбриональной ткани (Kawamoto Barret., 1986; Negishi et al., 2002; Petite et al., 1997). В недавней работе Брюне с соавт. (Brunet et al., 2003) опубликованы успешные результаты такого исследования. Авторы замораживали небольшие кусочки (1 мм3) коры головного мозга человека в среде DMEM (250 мкл) с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 8% ДМСО. Замораживание осуществляли медленно со скоростью 1°С/мин до -196°С и хранили в жидком азоте в течение 2-х лет. После быстрого оттаивания и механической диссоциации размороженных кусочков выделенные из них клетки были введены в культуру in vitro. Иммуноцитофлуоресцентный анализ показал, что и глиальные клетки, и нейроны криоконсервированной ткани в культуре не отличались от контрольных.

Несомненный интерес в качестве объекта для исследований в области криоконсервации нервной ткани представляют простые нервные системы беспозвоночных. Несмотря на то, что беспозвоночные относятся к пойкилотермным животным и, вероятно, более устойчивы к низким температурам по сравнению с млекопитающими, их клетки, тем не менее, не приспособлены к анабиозу. Замораживание до температуры жидкого азота (криоконсервация, т.е. введение в криоанабиоз) требует использования криозащитных средств и специально подобранных режимов замораживания-оттаивания. Эксперименты, выполненные на личинках морских ежей (стадии плутеуса), имеющих развитую нервную сеть, показали, что криоконсервация в присутствии криопротекторов не повреждала эти жизненно-важные структуры: личинки после оттаивания плавали в толще воды и нормально развивались (Гахова и др., 1989). Личинки усоногих раков после замораживания до -196°С с использованием криопротекторов сохраняли фоточувствительные рецепторы (положительный фототаксис) (Гахова и др., 1990). Была осуществлена криоконсервация изолированного мозга пресноводных и морских голожаберных моллюсков (Pasic&De sa Faria, 1979; Гахова и др., 1989; Gakhova, 1997).

Основное преимущество этой модели над изолированными клетками и кусочками ткани мозга в том, что здесь идет речь о введении в анабиоз интактного органа, и соответственно сохранении клеточной гетерогенности, межклеточных связей, синаптических структур. Мозг морских и пресноводных моллюсков состоит из нескольких пар ганглиев, соединенных между собой комиссурами и коннективами. Каждый из ганглиев содержит глию и до 2000 нейронов разного размера (от 10 до 250 мкм — у пресноводных моллюсков; от 10 до 1000 мкм - у морских голожаберников). Все ганглии и отходящие от них нервы заключены в соединительнотканную оболочку.

Тела нейронов, в том числе «гигантских», в ганглиях моллюсков расположены по наружной поверхности ганглия, и посылают свои аксоны в центральную область — в нейропиль, где находятся синаптические контакты между отростками нейронов (Боровягин, Сахаров, 1968; Kandel, 1976). Как показали эксперименты, замораживание изолированного мозга моллюсков с сохранением жизнеспособности возможно только в присутствии криозащитных агентов (Pasic&De sa Faria, 1979; Гахова и др., 1989). Авторы использовали изолированный мозг моллюска Lymnaea stagnalis L. для изучения механизмов действия криопротекторов и ультранизкого замораживания с применением методов фиксации мембранного потенциала и регистрации трансмембранных ионных токов на диализированных нейронах (Кислов, Пластинкин, 1994; Чекурова, 1994). Основные результаты показали, что независимо от используемого вида криопротектора (диметилсульфоксид, этиленгликоль, формамид, маннитол) происходило увеличение порога активации ионных каналов, уменьшение пика входящих и выходящих токов (К+. Na+, Са++, СГ), уменьшение проводимости мембраны для К+, Na+, Са++. Эффекты криопротекторов на ионные каналы имели обратимый характер. После оттаивания ганглиев, замороженных в жидком азоте, нейроны восстанавливали характерные для них электрические параметры через 1,5-2 часа. Несмотря на различия в деталях, нейроны беспозвоночных и позвоночных имеют ряд общих структурных особенностей (Kandel, 1976), поэтому результаты по изучению влияния криопротекторов и ультранизких температур могут быть в значительной степени экстраполированы на нейроны позвоночных.

Криопротекторы

В настоящее время известно большое количество естественных и синтезированных веществ, способных предотвращать разрушение клеток при их замораживании и последующем отогреве. По характеру взаимодействия с клеткой криопротекторы можно разделить на проникающие в клетку и не проникающие. Первые отличаются высокой растворимостью и легкостью проникновения через мембраны, что приводит к понижению осмотического давления, создаваемого во время кристаллизации воды (Белоус и др., 1987). Наиболее широко используемые криопротекторы этого типа, как глицерин, диметилсульфоксид, этиленгликоль, формамид и др., по механизму действия можно отнести к полифункциональным: обезвоживание клеток за счет увеличения осмотичности внешнего раствора, сопровождающееся понижением точки максимального переохлаждения внутриклеточной жидкости; замедление образования кристаллов льда и изменение их формы; связывание свободной внутриклеточной воды, доступной для кристаллизации (Пушкарь и др., 1977; Белоус и др., 1987); поддержание трехмерности структуры белковых молекул внутри клетки (Meryman et al., 1977); стабилизация или ингибирование активности ферментов (Hochachka, Somero, 1973; Ring, 1980), стабилизация фосфолипидных мембран (Anchordogue et al., 1991).

Применение криопротекторов позволяет сохранить клетки, ткани при глубоком замораживании. Но в то же время используемые вещества могут оказывать токсическое действие на биологический объект, обусловленное как осмотическими, так и биохимическими эффектами (Fahy et al., 1990; Катков, 1999; Kopeika et al., 2003). Известно, что криопротекторы могут влиять на биоструктуры различного уровня организации и способны вызывать существенные изменения биохимических процессов в клетках (Fahy et al., 1990; Фулер и др., 2003). Криопротекторы также могут изменять свойства нуклеиновых кислот и вызывать денатурацию при высокой концентрации (Strauss et al., 1968; Корнилова и др., 1993). Поэтому выбор криозащитных веществ имеет большое значение при замораживании и долгосрочном хранении биологических объектов.

Виды животных, относящиеся к разным систематическим группам животных, часто обнаруживают различную чувствительность к одному и тому же криопротектору (Чуйко, 1989; Гахова, 1994; Чекурова, 1994). Показано, например, что ДМСО вызывал необратимое подавление спонтанной спайковой активности нервных клеток абдоминального ганглия морского моллюска Aplysia depilans, в то время как глицерин не оказывал токсического действия. Оба агента вызывали снижение значений МП, но ДМСО в большей степени, чем глицерин (Pasic, de sa Faria, 1970). Противоположные результаты получены на нейронах прудовика Lymnaea stagnalis L. (Кислов, Пластинкин, 1994; Чекурова, 1994).

Глицерин (от 0,5 до 3 М) оказывал токсический эффект на мембраны нейронов прудовика. Изучение интегральных токов на диализированных нейронах прудовика под воздействием криопротекторов различной химической природы (ДМСО, этиленгликоль, формамид) показало частичную и обратимую инактивацию Са"1"1" и Na+ ионных каналов входящего тока К+ (Кислов, Пластинкин, 1994). Изучая механизмы действия криопротекторов на нейрональную мембрану авторы делают вывод, что наиболее важными для мембраны являются осмотические эффекты, создаваемые высокими концентрациями протекторов. Изучение

16 криозащитных свойств ДМСО, этиленгликоля и формамида при замораживании до -196°С изолированного окологлоточного кольца ганглиев прудовика со скоростью 500°С/мин показало, что наиболее эффективным был ДМСО (1,5 М). После оттаивания нейроны восстанавливали электрические характеристики мембран (Гахова и др., 1989; Gakhova et al., 1997).

Другие работы, выполненные на вентральном нервном стволе рака (Asher, 1972), седалищном нерве лягушки (Pribor, Nara, 1969) и седалищном нерве кролика (Lenz et al., 1975) и отходящих от поясничных корешков нервов крысы (Menz, 1975;) не выявили явного токсического действия ДМСО, глицерина или этиленгликоля. Уменьшение амплитуды ПД, вызванное этими агентами, восстанавливалось. При замораживании седалищного нерва лягушки до -10 н- 15°С глицерин, как показано, не обладал криозащитным эффектом, тогда как ДМСО оказывал защитное действие на нервы, лишенные оболочек (в отличие от нервов с оболочками) (Pribor, Nara, 1969). ДМСО обладал более значимым криозащитным эффектом и при замораживании до -196°С седалищного нерва кролика (Lenz et al. 1975).

ДМСО в качестве криопротектора используется при исследованиях возможности ультранизкого замораживании эмбриональной ткани мозга млекопитающих: человека (Kawamoto&Barrett, 1986; Petite&Calvet. 1997;

Koopmans, 2001; Negishi, 2002), обезьяны (Redmond et al, 1988; Negishi,

2002), крыс (Fang&Zhang, 1992; Swett et al., 1994). При изучении криоконсервации ткани мозга взрослых человека и животных также применяют диметилсульфоксид в качестве основного криозащитного компонента замораживающих сред (Collier et al., 1993; Petite&Calvet, 1997;

Koopmans et al., 2001; Jacoby et al., 2002; Brunet et al., 2003). Повидимому выбор разными авторами ДМСО в качестве криопротектора для нейрональной ткани человека и животных разных систематических групп не случаен. Многими работами показано, что скорость проникновения ДМСО в ткани животных намного выше, чем других веществ, как например, глицерина. Так, в работе Мейзура и соавт. (Mazur, 1976) показано, что полное

17 насыщение поджелудочной железы эмбриона крысы ДМСО происходит при 0°С за 10-15 мин, в то время как глицерин проникает в нее за 180 мин. Большинство эффектов ДМСО являются обратимыми и исчезают после удаления криопротектора (Чуйко, 1989). Суммарный криозащитный эффект ДМСО объясняется не только его коллигативными свойствами (снижение температуры начала кристаллизации жидкой фазы), с чем обычно связывают защитное действие криопротекторов, но определяется многообразными биологическими эффектами этого вещества: способность захватывать свободные радикалы, образующихся при замораживании биологического материала, тем самым предотвращая перекисное окисление в мембранных структурах клетки (Пушкарь и др, 1978; Фуллер и др, 2003; Fieck et all, 2000); оказывать защитное влияние на мембранные гликопротеины (Anchordogue, 1991); стабилизировать структуру белков и клеточных мембран; стимулировать репаративные процессы после криоконсервации (Wewetzer, Delmaghani, 2001; Hunt et all, 2003), и др.

Однако, не исключается и токсическое действие ДМСО (Теодорович, Козлов, 1966; Strauss et al., 1968; Корнилова и др., 1993). Природа токсического эффекта ДМСО на молекулярном уровне изучается, а также ведется поиск блокирования этого эффекта (Fahy et al., 1990).

Известно, что токсическое воздействие криопротекторов, обусловленное химическими и осмотическими эффектами, в значительной степени зависит от природы и концентрации используемого вещества, и условий эквилибрации (осмотического уравновешивания клеток с раствором криопротектора): температуры и длительности контакта клеток с раствором криопротектора. Условия эквилибрации, как правило, подбирают опытным путем. Для сохранения целостности клеточных мембран добавление криопротектора до конечных концентраций в среду перед замораживанием осуществляют медленно во избежание резкого сокращения клеточного объема. Отмывание криопротектора после оттаивания биологического образца является еще более критичным, и его проводят также медленно (ступенчато), чтобы избежать резкого увеличения клеточного объема

18 вследствие быстрого тока воды в клетку при выравнивании трансмембранных осмотических градиентов (Белоус, Грищенко,1994). Скорости замораживания-оттаивания

Экспериментальные данные, накопленные к настоящему времени, свидетельствуют о том, что для каждого типа замораживаемых клеток требуются свои оптимальные скорости охлаждения (замораживания).

Исторически сложилось два комплекса методов замораживания: медленное охлаждение со скоростями от 0,1до 2-3°С/мин, и быстром охлаждении, 10н-00°С/мин).

При медленном охлаждении клеток или тканей, когда скорости достаточно низкие (например, от 0.1 до 2-3°С/мин), идут зарождение, формирование и рост внеклеточных кристаллов льда. Внеклеточная вода вымораживается, в результате чего наружная среда (между кристаллами льда) становится гиперосмотичной по отношению к клетке. Для выравнивания осмотических градиентов свободная вода покидает клетку (дегидратация клетки). В результате, при низких скоростях охлаждения лед либо не образуется внутри клетки, либо его доля столь незначительна, что не повреждает клеточные структуры. Однако, при слишком медленном охлаждении клетка оказывается окруженной долгое время концентрированным раствором солей, входящих в состав среды. Кроме этого, при дегидратации повышается концентрация солей внутриклеточного раствора. Этот эффект может быть одной из основных причин гибели клетки. При высоких скоростях охлаждения клетки не успевают потерять доступную для кристаллизации свободную воду, внутренняя среда становится переохлажденной. И опасность заключается в образовании внутриклеточных кристаллов льда.

В последнее время часто используют сверхбыстрое охлаждение -несколько сот градусов в секунду. Эта методика позволяет достигать аморфизации остаточной воды в клетке. Все большее распространение приобретают методы криосохранения органов и больших кусочков тканей с использованием методик, обеспечивающих полную витрификацию ткани, т.е. исключающих образование льда (Fahy et all, 2004; Wusteman et all, 2004).

Для эмбриональных нервных клеток и ткани позвоночных используют в основном два режима замораживания: 1) двухэтапное замораживание с постоянной медленной скоростью (1°С/мин) до -60°С, затем погружение в жидкий азот; 2) трехэтапное - охлаждение до -25°С со скоростью 15-30°С/мин, выдерживание при этой температуре в течение 20 мин и последующее погружение в жидкий азот (Silani et al., 1988; Redmond et al., 1988). Оба режима не были связаны со свойствами конкретных криозащитных растворов и их концентрациями. Замораживание кусочков ткани мозга в парах жидкого азота также показало положительные результаты, хотя скорости охлаждения при этом скорее всего высокие (авторы не измеряли скорость охлаждения) Гольцев с соавт. (2003) показали значительную вариабельность сохранности клеток, определяемую режимом криоконсервирования. Глиальные клетки обладают большей криостабильностью по сравнению с нейрональными при одних и тех же режимах замораживания (Redmond et al., 1988; Гольцев и др., 2003).

Замораживание изолированных ганглиев морского моллюска Aplysia осуществляли в присутствии 10-20% глицерина с медленной скоростью (в 1 мл криозащитной среды на смеси соль-лед, -20°С, в течение 20 мин, затем — жидкий азот). Приблизительно через 1 час после оттаивания нейроны проявляли спонтанную активность.

Изолированный мозг другого моллюска, прудовика Lymnaea stagnlis, замораживали с высокой скоростью, 500°С/мин, до -196°С с использованием 1,5 М ДМСО. Оттаивание образцов для избежания рекристаллизации осуществляют с высокой скоростью ( в случае мозга прудовика - 500°С/мин), обычно на водяной бане, 37°С (Гахова и др., 1989).

Таким образом, показана принципиальная возможность сохранения в жизнеспособном состоянии нервных клеток эмбриональной и зрелой нервной ткани человека, позвоночных и беспозвоночных животных. Морфологическая и функциональная сохранность криоконсервированных

20 клеток зависит от структурно-функциональных свойств замороженного образца (эмбриональная или постнатальная нервная ткань; интактный мозг, например, моллюсков; суспензия выделенных из ткани нейронов), химической природы и концентрации криопротектора в защитной среде, режимов низкотемпературного консервирования. Общий ответ клетки на воздействие внешних факторов Большинство представлений о механизмах криоповреждений и криозащиты клеток связано с биологическими мембранами, поскольку именно они воспринимают первые сигналы окружающей среды, и они первыми реагируют на стрессовые ситуации (Белоус и др., 1987). О результатах криоконсервирования нервных клеток часто судят по восстановлению электрических характеристик клеточной мембраны (Asher, 1972; Pasic, De sa Faria, 1979; Гахова и др., 1989; Decherchi et al., Gakhova et al., 1997). Вероятно это правомочно, поскольку рядом исследователей показано существование взаимосвязи между электрическими параметрами мембраны нейронов и морфофункциональным состоянием их ядра и цитоплазмы (Бочарова, 1975; Дьяконова, 1970; Гахова, 1979; Сотников и др., 1980).

О результатах криоконсервации также может свидетельствовать поведение нейронов в культуре in vitro и в ткани реципиентов после трансплантации клеток из замороженно-оттаянной донорской нервной ткани.

Имеются данные, что для проявления функциональной активности после оттаивания криоконсервированного биологического объекта необходим восстановительный период: для нейронов изолированных ганглиев аплизии - в течение 1-го часа (Pasic& De sa Faria, 1979); личинок морского ежа — от 1 до 3-х часов (Гахова и др. 1988), для нейронов изолированного мозга прудовика - 1,5-2 часа (Гахова и др., 1989). Вероятно, этот период необходим для восстановления трансмембранных ионных градиентов и внутриклеточных репарационных процессов.

Адаптационные возможности нейронов с внутриклеточной формой регенерации значительно выше, чем у других клеток. При воздействии внешних факторов нервные клетки способны быстро реагировать путем

21 изменений функционирования белоксинтезирующей системы в целом (Бродский, 1966; Дьяконова, 1970, Гахова, 1979; Гордон, 2000). Изменения компонентов белоксинтезирующей системы являются общим компонентом реакции клеток как на физиологические, так и повреждающие воздействия.

В этой связи изучение изменений белоксинтезирующей системы в восстановительный период, как ответ на стресс, вызванный охлаждением и глубоким замораживанием, имеет важное значение для понимания не только внутриклеточных механизмов криоповреждений, криоустойчивости, но и характера репарационных процессов.

На воздействие внешних факторов клетка отвечает изменением количества и состава работающих рибосом, морфологическими и функциональными изменениями комплекса Гольджи, митохондрий, эндоплазматического ретикулума. Как следствие внутриклеточных повреждений происходит накопление лизосом и остаточных телец на периферии клетки.

Изменения метаболизма рРНК как ответ на внешнее воздействие Способность к быстрой деградации и накоплению рибосом является характерной особенностью метаболической реакции нейронов на смену функционального состояния. Так, через ЗОминут после электрораздражения в приядерной области цитоплазмы нейронов моллюска появляется огромное количество рибосом, хотя меченая вновь синтезированная РНК в цитоплазме еще не обнаруживается (Бочарова, 1973). В цитоплазме заметные количества вновь синтезированной РНК обнаруживаются лишь спустя 1-2 часа с момента появления метки в ядре, но количество ее в 2 и более раз меньше, чем в ядре (Дьяконова, Вепринцев, 1970). Синаптическая активация нейронов в течение 10 минут вызывала изменения в объеме клеток и структурные перестройки, свидетельствующие о перестройке метаболизма, но не приводила к изменению скорости внутриклеточного синтеза РНК (Меркулова, Даринский, 1982). После окончания активации в течение 24 часов наблюдали усиление синтеза РНК, степень которого была прямо пропорциональна интенсивности предшествующего воздействия.

Накопление РНК в телах нейронов при воздействии может быть следствием двух процессов: усиления ее синтеза и транспорта или ослабления ее распада (Кленикова, Малинаускайте, 1980).

Существуют два основных метода цитохимического анализа нуклеиновых кислот (НК) — визуальная флуоресцентная микроскопия и проточная цитометрия. Проточная цитометрия позволяет исследовать большие массивы клеток за короткий промежуток времени, но не позволяет проводить исследования на идентифицированных нейронах, а следовательно, и морфологическое исследование клеток. Визуальная флуоресцентная микроскопия позволяет выявить и оценить характер распределения НК в клетке и отдельных клеточных структурах, но не дает понятия о количестве НК. Кроме того, этот метод позволяет исследовать идентифицированные нейроны, а значит, оценить и морфологические изменения клеток. Для решения этих вопросов был разработан метод флуоресцентной диагностики и двухволновые микрофлуориметры, представляющие собой комбинацию флуоресцентного микроскопа со спектроанализирующим устройством, снабженную электронными блоками регистрации и управления (Карнаухов и др., 1983; Карнаухов, 1987). Нуклеиновые кислоты не обладают флуоресценцией при комнатной температуре, поэтому флуоресцентные методы их анализа основаны на использовании флуоресцентных красителей, например, акридинового оранжевого (АО). Зеленая флуоресценция АО в комплексе с двухспиральными НК связана с интеркалированием мономеров красителя, а красная на молекулах РНК и денатурированных однонитевых участках ДНК — с образованием ассоциатов димеров красителя на фосфатных группах. Димеры и мономеры красителя различаются по своим оптическим свойствам (Карнаухов, 1978).

Известно, что при фиксации, заливке и приготовлении гистологических препаратов в цитоплазме клетки транспортная РНК не сохраняется, а доля мРНК составляет всего несколько процентов (Бродский, 1966),

23 следовательно сохраняющаяся в цитоплазме РНК - это рРНК. Следовательно, свечение цитоплазмы обусловлено связыванием рРНК с красителем. Показано, что 37-45 % РНК в клетке может находиться в двухспиральной конформации (Darzynkiewicz et all., 1975).

Димеры АО, связанные с односпиральными участками рРНК, флуоресцируют в красной области спектра I^o- Мономеры АО, интеркалированные в двухспиральные участки рРНК, флуоресцируют в зеленой области спектра I530- Следовательно, соотношение величин интенсивностей люминесценции комплексов АО с односпиральными и двуспиральными участками РНК Омо/Ьзо), обозначенное как параметр а (а^мо/^зо) (Карнаухов, 1978), отражает соотношение одно- и двухспиральных участков рРНК в цитоплазме. Окрашивание цитоплазмы акридиновым оранжевым (АО) выявляет состояние рРНК в рибосомах (Gordon et all, 1997) и в связи с этим используется как показатель функциональной (синтезирующей) активности клетки (Карнаухов, 1978; Гордон, 1989; Карнаухов, 2001; Сергиевич, 2002; Карнаухова и др., 2002). Так, при увеличении температуры среды обитания моллюсков от 4 до 18°С возрастает количество рибосом в цитоплазме (Вартонь, Боровягин, 1977), сопровождаемое повышением значения параметра а (Мельникова, Карнаухов, 1980)

Изменения ультраструктуры нейронов на внешние воздействия.

На изменение внешних условий клетки отвечают общими изменениями ультраструктуры внутриклеточных органе лл. Так при стимуляции мотонейронов спинного мозга лягушки в течение 10 мин электрическими стимулами частотой 1Гц наблюдалось набухание элементов эндоплазматического ретикулума с его частичной дегрануляцией. При этом уменьшалось количество рибосом и полисом (Меркулова, Даринский, 1982). Увеличение длительности раздражения до 25 минут при неизменной частоте приводило к более выраженным изменениям органелл: сильнее набухали митохондрии в соме нейрона и наблюдались более интенсивная пролиферация и набухание элементов пластинчатого комплекса. При

24 увеличении частоты стимуляции до 50Гц и раздражении в течение 10 минут наблюдалось нарушение упорядоченности расположения эндоплазматического ретикулума и его вакуолизация, дегрануляция мембран ретикулума с трансформацией в гладкие. В цитоплазме встречались характерные образования эндоплазматической сети в виде спиралей и концентрических окружностей. Наблюдалась пролиферация мембран комплекса Гольджи, появление лизосом и мультивезикулярных тел вблизи этого органоида. Значительное набухание митохондрий сопровождалось деструктивными изменениями их крист. Однако наблюдаемые патологические сдвиги в организации нейрона были обратимы (Меркулова, Даринский, 1982). Набухание эндоплазматического ретикулума с вакуолизацией цитоплазмы, увеличением аутофагоцитоза и набуханием структурных элементов аппарата Гольджи наблюдали в местах разрыва клеточной мембраны при перфузии нейронов моллюска (Погорелая и др, 1980). После перфузии изолированных нейронов обнаруживалось много митохондрий со сжатым матриксом и сохранившимися кристами. При этом в участках, удаленных от места разрыва плазматической мембраны органеллы, в том числе митохондрии, оставались интактными. Диссоциация и сборка эндоплазматического ретикулума и мембран аппарата Гольджи происходят при оплодотворении и раннем развитии яиц морского ежа (Jaffe, Terasaki, 1993; Terasaki, 2000). Обратимые и необратимые изменения митохонд-риальной структуры описаны на растительных клетках (Vartapetian et all, 2003). Обнаруженная лентовидная структура митохондрий относится за счет видоизменения митохондриальной организации, имеющее адаптивный характер в результате длительной аноксии. В этой же работе отмечена роль экзогенных Сахаров в увеличении сроков переживания клеток растений в условиях аноксии. Интересные данные по связи морфологии митохондрий с их потенциальной функциональной нагрузкой приведены в работе Липиной с соавт. (2002). Сравнивая образ жизни и строение кардиомиоцитов трех видов моллюсков (морского ангела, прудовика и виноградной улитки) авторы пришли к выводу, что больший относительный объем митохондрий с более

25 плотной их укладкой и очень большое число межмитохондриальных контактов в кардиомиоцитах морского ангела говорят о большей функциональной нагрузке на эти органеллы. Увеличенные митохондрии с вакуолизированными изменениями крист здесь однозначно свидетельствуют о повышенной активности этих органелл.

Физиологический стресс характеризуется быстрым и преимущественным синтезом так называемых стрессорных белков. Эти белки синтезируются и в нормальных клетках, но или в малых количествах или имеют другую локализацию. Так, иммунофлуоресцентными исследованиями установлено, что за фрагментацию и /или везикуляризацию эндоплазматического ретикулума и комплекса Гольджи ответственны изменения во внутриклеточном распределении двух стрессорных белков, 80 и ЮОкД, которые в клетках, растущих в обычных условиях ассоциируются с мембранами ретикулума и аппарата Гольджи соответственно (Welch, Suhan, 1985). В клетках после воздействия теплового шока оба этих белка обнаруживаются в ядре. Однако вакуолизация Гольджи не оказывает заметного эффекта на его функцию.

Сходные изменения органелл клеток наблюдались под влиянием разных воздействий: электрораздражения (Bocharova et al., 1972) облучения, экспериментального невроза (Манина, 1971), аноксии (Vartapetian et all, 2003), длительного инкубирования в условиях гипотермии и гипоксии (Griffiths et all, 2000; Jantti et all., 1993), действия тяжелых металлов (Fowler et all, 1983; Woods, Fowler, 1986), героина и морфина (Borgia et all, 1982; Borgia, Crowell et all, 1982). Известно, что дегрануляция эндоплазматического ретикулума и его пролиферация в гепатоцитах взрослых крыс под действием тяжелых металлов (Т1С13*4Н20) (инъекции, Woods, Fowler, 1986), или при воздействии ethylbenzene (вдыхание, Elovaara et all, 1985) зависят от дозы. При этом во всех случаях в цитоплазме клеток было отмечено изменение морфологии митохондрий. При любом воздействии, как правило, наблюдается образование и накопление лизосом. Сходные по морфологии частицы были описаны ранее в разных тканях многих животных.

Среди различных по морфологии лизосомных частиц выделяют по крайней мере четыре типа: первичные лизосомы, вторичные лизосомы, аутофагосомы и остаточные тельца (Ченцов, 1984). Среди вторичных лизосом выделяют особую группу лизосом — аутофагосомы, в составе которых встречаются фрагменты или целые цитоплазматические структуры: митохондрии, элементы ретикулума, рибосомы, гранулы гликогена и т,д. Число аутофагосом значительно возрастает при метаболических стрессах, при различных повреждениях клеток (Покровский, Тутельян, 1976) Остаточные тельца содержат меньше гидролитических ферментов, в них происходит уплотнение содержимого, его перестройка. Часто в остаточных тельцах наблюдается вторичная структуризация непереваренных липидов, которые образуют сложные слоистые структуры (ламеллярные структуры, миелиноподобные структуры). Здесь же происходит отложение пигментных веществ, возможно, участвующих в дыхании (каротиноиды, Карнаухов, 1988). Известно о накоплении так называемых цитосом (лизосом, ламеллярных структур) в цитоплазме нейронов зимних моллюсков (взятых из температуры содержания 4°С) (Warton, Borovjagin, 1977) Миелиноподобные структуры встречаются и в нормальных клетках. Они были обнаружены при ультраструктурном исследовании культуры клеток олигоденроцитов (Nussbaum et all, 1998), цитоплазмы сине-зеленых водорослей (Авакян и др., 1978) или нейронов моллюсков (Боровягин, Сахаров, 1968), в развивающихся ооцитах (Айзенштадт, 1984; Семакова, Киселева, 2003).Известно накопление гранул липофусцина и ламеллярных структур (миелиноподобных тел) в результате старения организмов (Frolkis et all, 1995). Дальнейшая судьба остаточных тел может быть двоякой — одни из них выбрасываются из клетки путем экзоцитоза, другие остаются вплоть до гибели (гранулы липофусцина).

Особое место занимает увеличение числа лизосом, связанное с усилением аутофагоцитоза, например, в ответ на разнообразные воздействия. Так, при отравлении крыс Т2 токсином (микотоксин, метаболит плесневых грибов, поражающих корма и пищевые продукты) (Кравченко и др., 1983), в результате электрораздражения (Меркулова, Даринский, 1982), под

27 действием облучения, экспериментального невроза (Манина, 1971) возникают обширные скопления лизосом, называемые еще очагами дегенерации. Очаги дегенерации в нейронах состоят из продуктов распада ультраструктур и окружающей мембраны, образуя фагосому. Известно, что развитие дегенеративных процессов в цитоплазме нейронов у различных животных при функциональном перенапряжении и других воздействиях не сопровождается гибелью клеток. Жизнедеятельность клеток сохраняется вследствие одновременно протекающих процессов образования лизосом, а также реперативной регенерации ультраструктур (Манина, 1971). В результате воздействия изменяется и внутренняя структура лизосом: появляются лизосомы, содержащие прерывистые и накладывающиеся друг на друга ламеллярные структуры (Nott, Moore, 1987). Увеличение числа лизосом в клетках при патологических процессах — обычное явление. Однако в большинстве случаев смерти клетки не предшествовало освобождение гидролаз из лизосом (Ченцов, 1984). Ферменты лизосом, без сомнения, участвуют в автолизе погибших клеток, но это вторичное явление, а не причина гибели самих клеток. Таким образом, изменение функционального состояния и действие повреждающих факторов вызывают в клетках однотипные изменения в состоянии рибосом, эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, митохондрий и накоплении лизосом. В большинстве случаев изменения, вызванные повреждающими факторами, обратимы при восстановлении нормальных условий. Для выяснения механизмов действия низких температур и успешного научно обоснованного поиска условий низкотемпературного консервирования различных клеток, органов и тканей особое значение приобретает исследование состояния ультраструктурной организации клеток, так как этот уровень является единственным связующим звеном между данными молекулярной биологии, биофизики, биохимии и макромикроскопческой морфологии. Кроме того, изучение ультраструктуры клетки на уровне которой осуществляется непосредственная связь структурных и функциональных показателей, позволяет локализовать повреждения и в определенной мере прогнозировать степень восстановления.

В настоящее время по вопросу изменения ультраструктуры клетки при действии низких температур и факторов низкотемпературного консервирования имеются разрозненные работы, которые требуют обобщения с целью установления общих и частных закономерностей. В обзоре Пушкаря с соавт. (1978) по ультраструктуре клетки при воздействии низких температур и замораживания описаны изменения ультраструктуры митохондрий, выражающиеся в набухании, исчезновении крист отдельных митохондрий, снижении плотности матрикса. При этом как медленно, так и быстро оттаянные и/или замороженные клетки демонстрировали сходные изменения ультраструктуры митохондрий. Изменения гранулярного эндоплазматического ретикулума зависели от температуры инкубирования в растворе криопротектора: глицерин, добавленный при 0°С вызывал значительно меньшее набухание ретикулума, чем при 22°С. В последнем случае была отмечена незначительная дегрануляция ретикулума. О структурах комплекса Гольджи в цитоплазме клеток сразу после оттаивания ничего не говорится. Возможно, что наблюдаемое усиление вакуолизации цитоплазмы при низких температурах происходит за счет редукции диктиосом Гольджи.

В литературе, посвященной проблеме криоконсервации, изучение морфологии клеток на уровне световой и электронной микроскопии, метаболизма РНК и ДНК, белка и липидов (в том числе мембранных фосфолипидов), активности ферментов (в т.ч. мембранных) сводится к изучению повреждений и устойчивости под влиянием низкотемпературных факторов, и к оценке жизнеспособности криоконсервированного материала (на основании морфологических показателей, подвижности, пролиферирующей и регенерирующей способности) (Пушкарь и др. 1978; Белоус, Грищенко, 1994; Фуллер и др, 2003). Работ, посвященных характеру и динамике восстановления ультраструктуры и функции клеток после воздействия замораживания-оттаивания, в доступной литературе не обнаружено.

2. Материалы и методы

Крупные и ярко окрашенные нейроны мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. (класс Gastropoda, подкласс Pulmonata, отряд Basommatophora) хорошо идентифицируются. На нейронах мозга этого моллюска были отработаны концентрации криопротективных веществ (Гахова, 1989) при замораживании, описаны электрофизиологические характеристики (Дьяконова с соавт. 1970; Бочарова, 1975), ультраструктурные особенности (Дьяконова с соавт. 1970; Warton et all, 1977; Pogorelaya et all, 1977). Большую роль при выборе объекта сыграла его доступность в природе. Большие размеры клеток позволяют изучать структурные и метаболические изменения на одиночных идентифицированных нейронах. На основании электрических характеристик можно говорить о сохранности клеточных мембран после замораживания-оттаивания.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Дмитриева, Евгения Владимировна

4. Диметилсульфоксид оказывает влияние на структуру и функцию клетки. Уровень функциональной активности под воздействием 2М ДМСО возрастает в среднем на 35% относительно контроля и вносит основной вклад в изменения параметра а криоконсервированных нейронов.

Заключение

Люминесцентное и электронномикроскопическое исследования нейронов показали сложный характер морфофункциональных изменений в этот период (Дмитриева и др, 2001; Dmitrieva et all, 2003). Максимальные изменения функциональной активности криоконсервированных нейронов по параметру а (увеличение значения а на 35-40% после оттаивания нейронов и отмывания криопротектора) находились, как показано нами, в соответствии с физиологически обусловленным диапазоном для этого объекта (Карнаухова, Сергиевич, Дмитриева и др., 2002).

Исследование изменений ультраструктурной организации идентифицированного нейрона МПЗ под влиянием криопротектора ДМСО, замораживания-оттаивания, длительного инкубирования в физиологическом растворе и охлаждения показало, что на каждое воздействие клетка отвечает сходными изменениями органелл. Исследование влияния ДМСО показало набухание цистерн (приядерная область) и разрыхление эндоплазматического ретикулума с частичной фрагментацией ("розетты", Манина, 1971), образование большого количества лизосом, увеличение объема отдельных митохондрий приядерной области наряду с нормальными митохондриями на периферии клетки. После инкубации с ДМСО наблюдалось увеличение складчатости ядерной мембраны. Под воздействием ДМСО происходило накопление большого числа электронно-плотных гранул, лизосом, липосом, ламеллярных структур, наблюдалось появление крупных вакуолей. При последующем инкубировании этих нейронов в физиологическом растворе при 4-6°С изменения ультраструктуры нейрона МПЗ носили сходный характер с изменениями ультраструктуры, наблюдаемыми при длительном инкубировании в физиологическом растворе контрольных нейронов. Замораживание-оттаивание оказывало более сильное воздействие на ультраструктурную организацию нейрона, чем криопротектор. В ультраструктурной организации нейрона сразу после оттаивания (без отмывания ДМСО, 22°С) прежде всего необходимо отметить зональность морфологических изменений органелл, выраженную сильнее, чем при воздействии только криопротектора. Наиболее значительны были изменения органелл приядерной области клетки: сильное увеличение цистерн ретикулума в объеме, набухание митохондрий с деструктивными изменениями крист, увеличение складчатости ядерной мембраны. Периферическая часть цитоплазмы практически не показала изменений: митохондрии имели нормальные размеры и форму, цистерны эндоплазматического ретикулума были лишь незначительно увеличены в объеме. Изменения диктиосом аппарата Гольджи не были подчинены зональности цитоплазмы, носили одинаковый характер и выражались ь формировании комплексов сложных пузырьков. Развивалась общая вакуолизация цитоплазмы. После отмывания криопротектора отмечено усиление общей вакуолизации цитоплазмы криоконсервированных нейронов, выраженное в дальнейшем увеличении цистерн ретикулума, присутствии большого количества гладкоконтурных пузырьков. Ультраструктурная организация ядрышка свидетельствует об усилении синтетических процессов в ядре (увеличение гранулярного компонента в ядрышке), при этом наблюдалось увеличение числа пор ядерной оболочки (рис. 27). Редко встречающиеся структуры комплекса Гольджи представляли собой 2-5 электроннопрозрачных цистерн. Происходило накопление разнообразных по форме и размеру ламеллярных структур, в большей степени, чем липосом и лизосом. Митохондрии с деструктуивными изменениями уже не встречались, но возрастало число лизосом. Можно отметить усиление аутофагоцитоза, что также может свидетельствовать о начале процессов нормализации ультраструктурной организации нейрона. При последующем инкубировании криоконсервированных нейронов в физиологическом растворе при 4-6°С наблюдалось начало сборки цистерн аппарата Гольджи в единый комплекс, уменьшение объема цистерн ретикулума, их организация в единую сеть. Ультраструктурная организация ядрышка в этот период говорит об инволюции ядра, ведущей к снижению активности. На охлаждение от 22 до 4-6°С контрольные нейроны отвечали сходными изменениями органелл цитоплазмы: набуханием цистерн ретикулума, формированием комплексов сложных пузырьков из аппарата Гольджи (вакуолизация цитоплазмы), увеличением складчатости ядерной мембраны, увеличением числа пор ядерной оболочки (ультраструктурная организация ядрышка в этот период свидетельствует об активации синтетических процессов в ядре), набуханием митохондрий с деструктивными изменениями крист. В общем, ультраструктурная организация контрольных нейронов после охлаждения свидетельствует об увеличении синтетической активности клетки. После длительного инкубирования в физиологическом растворе в ультраструктурной организации всех нейронов (как опытных, так и

90 контрольных) наблюдались сходные изменения эндоплазматического ретикулума, митохондрий (удлинение и уплощение). В некоторых клетках были видны скопления гранул на периферии клетки. Уплощенные цистерны комплекса Гольджи образовывали сеть, встречалось много лизосом, ламеллярных структур, на периферии клетки присутствовали скопления структур, называемые очагами дегенерации (Манина, 1971). Встречались гипертрофированные структуры аппарата Гольджи, измененные цистерны ретикулума (розетты, свидетельствующие о фрагментации ретикулума), большие вакуоли в цитоплазме.

Аналогичные изменения органелл клеток наблюдались под влиянием разных воздействий: электрораздражения, облучения, экспериментального невроза (Манина, 1971), аноксии (Vartapetian et all, 2003), длительного инкубирования в условиях гипотермии и гипоксии (Griffiths et all, 2000; Jantti et all., 1992), действия тяжелых металлов (Fowler et all, 1983; Woods, Fowler, 1986), героина и морфина (Borgia et all, 1982; Borgia, Crowell et all, 1982). Известно, что дегрануляция эндоплазматического ретикулума и его пролиферация в гепатоцитах взрослых крыс под действием тяжелых металлов (Т1С13*4Н20) (инъекции, Woods, Fowler, 1986) зависят от дозы, При этом во всех случаях в цитоплазме клеток было отмечено изменение морфологии митохондрий. Повышение объемной плотности митохондрий (набухание) также не может однозначно свидетельствовать в пользу повышения функциональной активности этих органелл или

91 свидетельствовать наоборот, о снижении их функции. Так, изучая влияние радиационного облучения на размеры митохондрий кардиомиоцитов крыс в ранние сроки после облучения обнаруженное увеличение количества крупных митохондрий авторы связывали со снижением их дыхательной функции (Сироткин и др., 1988). В работах Маниной (1971) набухание митохондрий связывается скорее с увеличением их функции, чем со снижением активности. Подобные изменения цистерн гранулярного ретикулума (набухание) наблюдались при охлаждении другими авторами (Arber et all., 1986). Под влиянием циклогексимида, известного ингибитора белкового синтеза, происходило образование в цитоплазме скоплений трубчатых структур различного размера, лизосом и ламеллярных структур (Horvath et all, 1973). В цитоплазме криоконсервированных нейронов после длительного выдерживания в физиологическом растворе также обнаруживались подобные образования, но особенно много их было в цитоплазме контрольных нейронов. Характерные образования эндоплазматической сети в виде спиралей и концентрических окружностей в цитоплазме опытных нейронов после 8 часового инкубирования в физиологическом растворе при 4-6°С не отличались от наблюдаемых после воздействия электрораздражения мембранных образований (Меркулова, Даринский, 1982). Возможно, что длительное влияние физиологического раствора оказывало на нейроны даже больший эффект, чем замораживание-оттаивание.

Известно, что широко применяемый криопротектор ДМСО может оказывать не только защитное, но и повреждающее действие на клетку (Kopeika et al., 2003).

Скопление лизосом и электронно-плотных гранул на периферии клетки может свидетельствовать также и о повреждениях внутриклеточных структур (Манина, 1971), которые не были летальными для клетки, 4Td подтверждается ростом отростков в клеточной культуре. Под воздействием ДМСО наблюдалось образование и накопление лизосом, содержащих прерывистые и накладывающиеся друг на друга ламеллярные структуры, пожалуй, даже в большей степени, чем в результате замораживания-оттаивания или длительного инкубирования. Сходное усиление аутофагических процессов в клетках Mytilus edulis наблюдали под действием антрацена и фенантрена (Nott, Moore, 1987), тяжелых металлов (Fowler et all, 1983).

В работе методами люминесцентной и электронной микроскопии показано, что значительный вклад в ответ клеток на замораживание-оттаивание составляет ответ нейрона на воздействие криопротектора, в частности ДМСО.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дмитриева, Евгения Владимировна, Пущино

1. Авакян А.А., Кац Л.Н., Минеева J1.A., Ратнер Е.Н. Гусев М.Б. 1978. Электронномикроскопические данные о мезосомоподобных и миелиноподобных структурах у синезеленых водорослей. Микробиология. 47(4). 739-44.

2. Айзенштадт Т.Б. 1984. Цитология оогенеза. М: Наука, 204с.

3. Архипов В.В., Костенко М.А. 1981. Подвижность и взаимодействие в культуре изолированных нейронов взрослых моллюсков // Эвол. биохим. и физиол. Т. 17, №2. С. 187-191.

4. Белоус A.M., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф. 1987. Замораживание и криопротекция // Биохимия мембран: Уч. пособие для биол. и мед. спец. вузов / под ред. Болдырева А.А. М.: высш. шк. 80с

5. Белоус A.M., Грищенко В.И. (1994) Криобиология. Киев, «Наукова Думка», 432 с

6. Болдырева Н.В. 1929. Перезимовка водных организмов // Гидробиологический журнал, 9(1-3). С. 45-82.

7. Боровягин В.Л., Сахаров Д.А. 1968. Ультраструктура гигантских нейронов тритонии. Атлас. М.: Наука. 75с.

8. Бочарова Л.С. 1973. Изменение синтеза РНК при привыкании нейрона моллюска к электрическому раздражению // В кн. Клеточные механизмы памяти. Пущино-на-Оке. 146-156.

9. Бочарова Л.С. 1975. Идентификация гигантских нейронов в центральной нервной системе брюхоногих моллюсков.// в сб. Приборы и методы для микроэлектродного исследования клеток. Пущино. С. 18-27.

10. Бродский В.Я. 1960. О способах фиксации и подготовки материала для количественного цитохимического анализа. Т.2, № 5, 613с.

11. Бродский В.Я. 1966. Трофика клетки. М: Наука. 356с.

12. Вартонь С.С. 1974. Структурно-функциональная характеристика гигантских нейронов прудовика.// Дис.канд.биол.наук.: Пущино, 111с.

13. Виленчик М.М. (1983) Сколько лет можно хранить зародышевые клетки в криоконсервированном состоянии без существенного повреждения их генома. Консервация генетических ресурсов. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН. 21 с.

14. Гайер Г. 1974. Электронная гистохимия. М. Мир, 485с., с.45.

15. Гахова Э.Н. 1979. Трансмембранные ионные потоки возможные регуляторы синтеза РНК в нейронах: Дис.к-т биол.наук / Пущино, Инт биофизики клетки, 206с.

16. Гахова Э.Н. 1994. Генетический криобанк как способ сохранения биоразнообразия водных беспозвоночных// Биофизика живой клетки3 т.6, с.21-27.

17. Гахова Э.Н., Дмитриева Е.В. 2003. Криоконсервация нервной ткани //Биофизика живой клетки, т. 7, с.65-68.

18. Гахова Э.Н., Чекурова Н.Р., Кислов А.Н., Вепринцев Б.Н. 1989.

19. Гигантские нейроны сохраняют жизнеспособность после глубокого замораживания мозга пресноводного моллюска Lymnaea stagnalis Ь//Криобилогия. №1, 19-21

20. Гахова Э.Н., Корн О.М., Буцук С.В. 1990. Замораживание личинок усоногого рака Balanus impovisus до температуры -196°С //Биология моря., №4, с.62-65.

21. Гахова Э.Н., Крастс И.В., Найденко Т.Х., Савельева Н.А., Бессонов Б.И., Буцук С.В., Вепринцев Б.Н. 1988. Развитие зародышей морского ежа после низкотемпературной криоконсервации //Онтогенез, т.19. с. 175-180

22. Голдовский A.M. (1981) Анабиоз. Л.: Наука, 136 с.

23. Гольцев А.Н., Турина Т.М., Бабенко Н.Н., Останков М.В. 2003. Влияние различных режимов криоконсервировании на некоторые характеристики эмбриональных нервных клеток // Проблемы криобиологии, №1. 46-50

24. Гордон Р.Я. 2000. Исследование генерализованного метаболического ответа нервных клеток на смену функционального состояния и на действие повреждающих факторов: Дис. д-р биол. наук /Институт биофизики клетки РАН (ИБК РАН). Защищена 2000.12.06.

25. УДК 576.3.331. 147 с.: 5 таб.} , 42 ил.} Библиогр.: 416 назв.

26. Гордон Р.Я., Бочарова Л.С., Попов В.И., Карнаухов В.Н. 1989. Различия в состоянии рибосом нервных клеток, выявляемые при флуорохромировании акридиновым оранжевым.//Цитология, 31(1). 7379.

27. Дьяконова Т.Л. 1969. Исследование метаболизма РНК и изменений в ультраструктуре и цитоморфологии нейрона при генерации им потенциалов действия: Дис.к-т биол.наук /Институт биофизики клетки РАН (ИБК РАН). 162с.

28. Дьяконова Т.Л., Вепринцев Б.Н. 1970. Особенности структурной и функциональной организации и метаболической активности нейронов прудовика. М. Деп. В ВИНИТИ 01.06.70., №819-69, 26с

29. Жадин В.И. 1952. Моллюски пресных вод СССР. М. Изд-во Акад. Наук СССР, 376с.

30. Жерелова О.М. 1971. Электрофизиологические характеристики гигантских нейронов моллюска большого прудовика // В сб. Биофизика живой клетки. Под ред. Акад. Франка Г.М. Пущино,

31. Зернов С.А. 1928. О зимовке водяных организмов во льду и мерзлой земле// Русский гидробиологический журнал, 7(1-2). С. 1-7.

32. Ивличева Н.А., Дмитриева Е.В., Костенко М.А., Гахова Э.Н. 2004.

33. Криоконсервированные нейроны Lymnaea stagnalis способны к морфологической дифференцировке в культуре //Биофизика, т. 49, вып. 4, с. 710-714.

34. Каранова М.В., Дмитриева Е.В., Березин Д.Е., Гахова Э.Н. (2004)

35. Измерение точки замерзания тканевых жидкостей прудовика Lymnaea stagnalis L и ротана Perccottus glenhi как тест на присутствие криопротекторов// Материалы XYII совещания «Консервация генетических ресурсов», 19-21 ноября 2001г., Пущино.

36. Карнаухов В.Н. 1978. Люминесцентный спектральный анализ клетки. М. Наука, 207с.

37. Карнаухов В.Н. 1988. Биологические функции каротиноидов. М.: Наука, 240.

38. Карнаухов В.Н. 2001. Спектральный анализ в клеточном мониторинге состояния окружающей среды. М.: Наука, с. 186.

39. Карнаухов В.Н., Вартонь С.С. 1971. Ультраструктурная организация каротиноидсодержащих гранул в нейронах моллюсков // Цитология. Т. 13, №9. С. 1088-1093.

40. Карнаухов В.Н., Карнаухова Н.А., Яшин В.А. 1983. Методы и техника флуоресцентной диагностики. ОНТИ НЦБИ, Пущино. 32с.

41. Карнаухов В.Н., Яшин В.А., Казанцев А.П., Карнаухова Н.А., Кулаков В.И. 1987. Двухволновый микрофлуориметр-фотометр на базе стандартных блоков и узлов. Цитология. Т.29, №1, с.50-53.

42. Карнаухова Н.А., Сергиевич Л.А., Дмитриева Е.В., Гахова Э.Н., Карнаухов В.Н. 2002. Исследование функциональной активности нейронов ганглиев большого прудовика при изменении температуры. // Биофизика. Т. 47, вып. 6, 1080-1985сс.

43. Катков И.И. (1999) Некоторые аспекты осмотических реакций клеток. 1. Основные физические явления и условия существования точки максимальн ого отклонения объема. Проблемы криобиологии, вып.2, с. 3-11.

44. Кислов А.Н., Пластинкин Д.В. 1994. Действие некоторых криопротекторов на мембрану нейронов моллюска //Биофизика живой клетки,, т.6, с.118-120.

45. Кленикова В.А., Малинаускайте Л.Д. 1980. Накопление РНК в теле нейронов как показатель их функциональной деафферентации// Физиол. ж.СССР. 66(3). 339-343

46. Корнилова С.В., Леонтьев B.C., Шкорбатов А.Г., Благой Ю.П., Козлов А.В., Григорьев Д.Н. (1993) Изучение действия криопротекторов на макромолекулярные параметры ДНК. Проблемы криобиологии, вып. 4, С. 20-24.

47. Костенко М.А. 1972. Выделение одиночных нервных клеток из мозга моллюска Lymnaea stagnalis для дальнейшего культивирования их in vitro // Цитология. Т. 14. №10. С. 1274-1278

48. Костенко М.А. 1973. Цитофизиологические характеристики изолированних нейронов моллюска Lymnaea stagnalis in vitro: автореф. дис. . канд. биол. наук. Пущино, С. 26.

49. Костенко М.А. 1985. Внутриклеточная регуляция дифференцировки и регенерации нейронов в культуре: Дис. . д-ра биол. наук. Пущино,. 360с.

50. Костенко М.А., Мусиенко B.C., Смолихина Т.И. 1981 Влияние рН среды и внутриклеточного содержания Са на рост отростков нейронов прудовика в культуре // Цитология. Т.23. №7. С. 779-787

51. Костенко М.А., Смолихина Т.И. 1982. Метод получения изолированных нейронов моллюсков с высокой регенерационной активностью: А.с. СССР, 913254 Б.И. № 10.

52. Кравченко JI.B., Хвыля С.И., Авреньева Л.И., Морозов И.А., Тутельян В.А. 1983. Влияние Т2 токсина на ультраструктуру а активность органеллспецифических ферментов некоторых органов крыс. // Цитология, Т.25, №11. 1264-69

53. Лозина-Лозинский Л.К. (1972) Очерки по криобиологии: Адаптации и. устойчивость организмов и клеток к низким и сверхнизким температурам. Л.: Наука, 288 с.

54. Манина А.А. 1971. Ультраструктурные изменения и репаративные процессы в центральной нервной системе при различных воздействиях. Л.: Медицина, 190с.

55. Мартемьянов В. И. 2001.//Эвол. биохим. и физиол. Т.37. №2. С. 107-111

56. Мельникова Е.В., Карнаухов В.Н. 1980. Температурная зависимость соотношения односпиральных и двухспиральных нуклеиновых кислот в идентифицированных гигантских нейронах моллюска. // Цитология, 22(4). 434-440.

57. Меркулова О.С., Даринский Ю.А. 1982. Реакция нейрона на длительную стимуляцию. Л: Наука, 172с.

58. Михеева И.Б., Тирас Н.Р., мошков Д.А., Пашков В,И., Гришин Е.В. 2000. Десмосомоподобные контакты маутнеровских нейронов как мишени действия яда скорпиона // Цитология., т. 42. №7. с. 635-646

59. Мошков Д.А. 1985. Адаптация и ультраструктура нейрона. М. Наука, 200с.

60. Погорелая Н.Х., Скибо Г.Г., Троицкая Н.К. 1980. Структурные особенности изолированных и перфузированных нейронов моллюсков Helix pomatia // Нейрофизиология. Т.12(3): 297-302.

61. Покровский А.А., Тутельян В.А. Лизосомы. М: Наука, 1976. 370с.

62. Приборы и методы для микроэлектродного исследования. 1975. // Пущино, 203с.

63. Пушкарь Н.С., Белоус A.M., Иткин Ю.А., Вишневский В.И., Розанов Л.Ф. 1977. Низкотемпературная кристаллизация в биологических системах. Киев, «Нукова думка», 244 е.

64. Пушкарь Н.С., Капрельянц А.С., Панков Е.Я. 1978.

65. Ультраструктура клетки при низких температурах. "Наук, думка", 140с.

66. Семакова К.Н., Киселева Е.В. 2003. Миелиноподобные структуры как возможный источник гладкого эндоплазматического ретикулума в ранних ооцитах амфибий// Цитология, 45(8). 746-757

67. Сергиевич Л.А., Карнаухова Н.А. 2002. Изменение функциональной активности синтетического аппарата тимоцитов крыс под действием острого и хронического у-излучения // Радиационная иммунология. Т. 42, № 1, 48-53сс.

68. Сироткин В.В., Автандилов Г.П., Володин Н.Д. 1988. Влияние радиационного облучения на размеры митохондрий кардиомиоцитов крыс. // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, №12. 751-54.

69. Сорокина 3. А. 1978. Состояние калия, натрия и воды в цитоплазме клеток. Киев: Наук, думка, С. 214

70. Сотников О.С., Курчиков А.Л., Казаченко В.Н., Бочарова Л.С. (1980) Сравнительный анализ морфологических и физиологических характеристик живого изолированного нейрона //Физиол. Журн. СССР им. И.М.Сеченова. Т. 66, № 4, С. 497-507.

71. Теодорович В.Н., Козлов Г.А. 1966. Влияние защитных веществ на процесс замораживания и оттаивания клеточных элементов крови. //В кн. Реакция клеток и их белковых компонентов на экстремальные воздействия. М-л., 51-57.

72. Ушатинская Р.С. (1990) Скрытая жизнь и анабиоз. М.: Наука. 182 с.

73. Фуллер Б., Грин К., Грищенко В.И. 2003. Криоконсервирование для создания банка клеток: современные концепции на рубеже XXI столетия //Проблемы криобиологии, №2. 62-83.

74. Чекурова Н.Р. 1994. Использование электрофизиологического метода для изучения механизмов криоповреждений и способов криозащиты // Биофизика живой клетки, Т.6. с. 121-126

75. Ченцов Ю.С. 1984. Общая цитология. МГУ, 350с.

76. Чуй ко В. А. (1989) Механизм криозащитной эффективности и фармакологические свойства ДМСО //Криобиология. 1, С. 3-10

77. Albert E.N., Das G.D. (1984) Neocortical transplantans in the rat brain: an ultrastructural study //Experientia. V. 40, P. 294-298.

78. Anchordogue T.J., Cecchini C.A., Crowe J., Crowe L.M. (1991) Insights into thecryoprotective mechanism of dimethyl sulfoxide for phosholipid bilayers. Ciy obiology, V. 28, P. 467-473.

79. Arber S.L., Neilly J.P., Lin J.C., Kriho V. 1986. The effect of 2450 MHz microwave radiation on the ultrastructure of snail neurons // Physilogical Chemistry and Physics and Medical NMR, 18. 243-249.

80. Armitage W.J., Juss B.K., Easty D.L. 1995. Differing effects of various cryoprotectants on intercellular junctions of epithelial cells //Cryobiology. V.32, P 52-59

81. Asher L.M. (1972) Effects of DMSO on the electrical response of Homarus nerves frozen to -20°C, -30°C and at room temperature //Cryobiology. V. 9, P. 153-162

82. Bocharova L.S., Kostenko M.A., Veprintsev B.N and Allachverdov B.L. 1996. Copletely isolated molluscan neurons. An Ultrastructural study. // Brain Res., 101: 185-198.

83. Borgia G, Cocchiararo M, Crowell J, Lambiase A, Nappa S, Schreil W, Piazza M. 1982. Ultrastructural changes in hepatocytes of mice treatment with heroin // Boll Soc Ital Biol Sper, Mar. 30; 58(6). 344-8.

84. Borgia G, Crowell J, Cocchiararo M, Lambiase A, Nappa S, Schreil W, Piazza M. 1982. Ultrastructural changes in hepatocytes of mice treatment with morphine // Boll Soc Ital Biol Sper, Aug. 30; 58(16). 1075-8.

85. Brunet J-F, Pellerin L., Magostretti P., Villemure J-G. 2003. Cryopreservation of human brain tissue allowing timely production of viable human brain cells for autologous transplantation. Cryobiology, V. 47, № 2, P. 179-183.

86. Carvalho F., Sousa M., Oliveira E., Carvalheiro j., Baldaia L. 1998.

87. Ultrustructure of oogenesis in Penaeus kerathurus (Crustacea, Dacapoda). I. Previtellogenic oocytes. J.Submicros. Cytol.Pathol. 30; 409-416.

88. Collier TJ, Gallagher MJ, Sladek CD. 1993. Cryopreservation and storage of embryonic rat mesencephalic dopamine neurons for one year: comparison to fresh tissue in culture and neural grafts.

89. Brain Res. ;623(2):249-56.

90. Darzynkiewicz Z., Traganos F., Sharpless Т., Melamed M.R. 1975. Conformation of RNA in situ as studied by acridine orange staining and automated cytofluorometry. Exp. Cell Res. V.95, p.143-153.

91. Elovaara E, Engstron K, Nickels J, Aito A, Vainio H. 1985. Biochemical and morphological effect of long-term inhalation exposure of rats to ethylbenzene // Xenobiotica, Apr; 15(4). 299-308.

92. Fang J, Zhang ZX. 1992. Cryopreservation of embryonic cerebral tissue of rat.Cryobiology. Apr;29(2):267-73.

93. Fowler BA, Kardish RM, Woods JS 1983. Alteration of hepatic microsomal structure and function by indium chloride. Ultrastructural, morphometric, and biochemical studies // Lab Invest, Apr; 48(4). 471-8.

94. Frolkis V.V., Kvitnitskaya-Ryzhova T. Yu., Martynenko O. A. 1995. Aging of neurons in the mollusk Lymnaea stagnalis small parietal ganglion: a morpho-functional comparison in the same neuron.// Exp.Gerontology, 30(5). 533-544.

95. Gakhova E.N., Kislov A.N., Chekurova N.R. 1997. // Study of membrane properties of mollusk neuron after freeze-storage at liquid nitrogen temperature for 8 years // Infusionstherapie Transfusionsmedizin. V. 24. № 5. P. 378-379

96. Gordon R.Ya., Bocharova L.S., Kruman L.I., Popov V.I., Kazantsev A.P., Khutzian S.S., Karnaukhov V.N. 1997. Acridin orange as an indicator of the cytoplasmic ribosome state // Cytometry, v. 29. P. 215-221.

97. Griffiths B.J. Nathan, Evans J.Peter. 2000. Ultrastructural changes in hypothermically preserved hepatocytes. // Cryobiology, V.40. 176-181

98. Hochachka P.W., Somero G.N. (1973) Strategies of biochemical adaptation. Saunder. 483 p.

99. Hook G.E., Gilmore L.B., Talley F.A. 1986. Dissolution and reassembly of tubular myelin-like multilamellar structures from the lungs of patients with pulmonary alveolar proteinosis. Lab.Invest. 55: 194-208.

100. Horvath E., Kovacs K., Szabo S., Garg B.D., Tuchweber B. 1973. Effect of cycloheximide on the fine structure of corpus lutein in intact and hypophysectomized rats // Zellforsch Z., 146. 223-35.

101. HouIe, J.D., Das G.D. (1980) Freezing of embryonic neural tissue and its transplantation in the rat brain //Brain Res., V. 192, P 570-574

102. Hunt Ch. J., Armitage S.E., Pegg D.E. 2003. Cryopreservation of umbilical cord blood; 2. Tolerance of CD34+ cells to multimolar dimethyl sulphoxide and the effect of cooling rate on recovery after freezing and thawing // Cryobiology, V.46(l). 76-87

103. Jacobv DB, Lindberg C, Ratliff J, Wetzel K, Stewart GR, Dinsmore J. 2002. Comparison of fresh and cryopreserved porcine ventral mesencephalon cells transplanted in A rat model of Parkinson's disease. J Neurosci Res. Aug 1;69(3):3 82-96.

104. Jaffe A. Laurinda, Terasaki Mark 1993. Structural changes of the endoplasmic reticulum of sea urchin eggs during fertilization// Developmental biology, (156). 566-573

105. Jantti J., Kuismanen E. 1993. Effect of caffeine and reduced temperature (20 degrees C) on the organization of pre-Golgi and Golgi stack membranes. //J.Cell Biol. Mar; 120 (6): 1321-35.

106. Jensen S., Sorensen Т., Zimmer J. 1985. Deep-freeze storage of immature rat hippo campae tissue prior to intracerebral transplantation //Neuro-Science > Letters, v.22, p. 528.

107. Lenz H., Koertz W., Preussler H. (1975) The freezing threshold of the peripheral motor nerve: an electrophysiological and light-microscopical study on the sciatic nerve of the rabbit. Cryobiology, V. 12, P. 486-496.

108. Luyet В., Gonzales F. (1953) Growth of nerve tissue after freezing in liquid nitrogen //Biodynamica. V. 7, P. 171-173.

109. Mazur P. (1966) Physical and chemical basis of injury in single celled microorganisms subjecte d to freezing and thawing. Cryobiology. NY-L, Acad.Press. P. 213-315.

110. Menz L.J. (1975) Effect of cryoprotective agents on rat cutaneous nerves. Cryobiology, V. 12, P. 405-416.

111. Meryman H.T. Williams R.J., Douglas M.St (Jr.) (1977) Freezing injury from "solution effects" and its prevention by natural and artificial cryprotection //Cryobiology. V. 14,3,287-312

112. Moshkov D.A., Tiras N.R., Saxon M.E. 1980. Phalloidin changes the synaptic contacts ultrastructure//Naturwissenschafien,. V. 67. 194-195.

113. Negishi T, Ishii Y. Kawamura S, Kuroda Y, Yoshikawa Y. 2002. Cryopreservation of brain tissue for primary culture. Exp Anim. Jul;51(4):383-90.

114. Nott JA, Moore MN 1987. Effects of polycyclic aromatic hydrocarbons on molluscan lysosomes and endoplasmic reticulum // Histochem J., Jun-Jul; 19(6-7). 357-68.

115. Pandey A.K. 1989. // Biol. Struct. Morphog. V. 2. № 3. р. 1 Ю-116.

116. PasicM., De sa Faria L.J. (1979) Effects and freezing on abdominal gangliaof Aplysia//Cryobiology. V. 16, P. 390-400

117. Petite D, Calvet MC. 1995 Cryopreserved neuronal cells in long-term cultures of dissociated rat cerebral cortex: survival and morphometric characteristics as revealed by immunocytochemistry.

118. Brain Res. Jan 16;669(2):263-74.

119. Petite D, Calvet MC. 1997. Morphometric characteristics of cryopreserved mesen cephalic dopamine neurons in culture.

120. Brain Res. Sep 19;769(1):1-12.

121. Petite D., Calvet M-Ch. 1997. Cryopreserved GABAergic neurons in cultures of rat cerebral cortex and mesencephalon: a comparative morphometric study with anti-GABA antibodies //Brain Research. 747. p. 279-289

122. Piccard J. J. Ultrastructure of the cementgland of a Xenopus laevis. J.Morphol. 148: 192-207.

123. Pogorelaya N.K., Elekes K., Kiss 1.1977. Electron microscopic investigation of a giant neuron identified in the right parietal ganglion of Lymnaea stagnalis L. //Acta biol. Acad. Sci. hung., 28 (4), 451-460

124. Pribor D.B., Nara A., 1969 Toxicity and cryoprotection by dimethyl sulfoxide and by glycerol in isolated frog sciatic nerves. Cryobiology, V.5, № 6, P. 355-365.

125. Redmond DE Jr, Naftolin F, Collier TJ, Leranth C, Robbins RJ, Sladek CD, Roth RH, Sladek JR Jr. 1988. Cryopreservation, culture, and transplantation of human fetal mesencephalic tissue into monkeys. Science. V. 242,4879, P.768-71

126. Ring R.A., Tesar D. (1980) Cold-hardiness of the arctic beetle, Pytho americanus Kirby //J. Insect Physiol. V. 26, P. 763-764

127. Robbins R.J., Torres-AIeman I., Leranth C., Bradberry C.W., Deutch A.Y., Welsh S., Roth R.H., Spenser D., Redmond E., Naftolin F. 1990. Cryopreservation of human brain tissue // Exp. Neurology 107. p. 208-213

128. Sauer H. et al. 1992. Cryopreservation, survival function of intrastriatal fetal mesencephalic grafts in a rat model of Parkinson's disease //Exp Brain Res., v.90, p.54-62.

129. Scott B, Lew J. 1986. Neurons in cell culture survive freezing. Effect on electric membrane properties. Exp Cell Res. ;162(2):566-73.

130. Silani V., Pizzuti A., Strada O. et al. 1988. Human neuronal cell viability demonstrated in culture after cryopreservation //Brain Res. V. 473, № 1, P. 169-174

131. Steponkus P.L., Langis R., Fujikawa S. 1992. Cryopreservation of plant tissues by vitrification // In 'Advances in low temperature biology'. Ed. P.L.Steponkus. JAI Press, London, p. 1-61.

132. Strauss G.H., Kelly R.B., Sinsheimer R.L. (1968) Denaturation of RNA with dimethyl sulfoxide. Biopolymers. № 6, P. 793-807.

133. Swett JW, Paramore CG, Turner DA. 1994. Quantitative estimation of cryopreservation viability in rat fetal hippocampal cells. Exp Neurol. Oct; 129(2):330-4.

134. Swindale N.V., Benjamin P.R. 1976. The anatomy of neurosecretory neurons in the pond snail Lymnaea stagnalis L. // Philosophical transactions of the royal society of London. Biological sciences, 274 (931). 169-202.

135. Terasaki Mark. 2000. Dynamics of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus during early sea uchin development// Molecular Biology of the Cell, (11).

136. Thomas GP, Welch WJ, Mathews MB, Feramisco JR. 1982. Molecular and cellular effects of heat shock and related treatments of mammalian tissue culture cells. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. (46). 985-996

137. Tiras NR, Pavlik LL, Moshkov DA 1992. Alteration in the cytoskeleton of the goldfish mauther cells under various pharmacological treatments // Acta histochem, V. 41. 249-256.

138. Warton S.S., Borovjagin V.L. 1977. Ultrastructural organization of giant neurons of the mollusk Lymnaea stagnalis L under different environmental temperatures//Acta boil. Acad. Sci. hung., 28(4), 429-44lpp.

139. Wewetzer K., Dilmaghani K. 2001. Exposure to dimethyl sulfoxide at 37°C prior to freezing significantly improves the recovery of cryopreserved Hybridoma cells // Crybiology, V.43(3). 288-92

140. Woods JS, Fower BA. 1986. Alteration of hepatocellular structure and function by thallium chloride: ultrastructural, morphometric, and biochemical studies //Toxicol Appl Pharmacol, Apr; 83(2). 218-29.

141. Wusteman M, Robinson M, Pegg D. 2004. Vitrification of large tissues with dielectric warming: biological problems and some approaches to their solution// Crybiology, V.48(2). 179-89.

142. Yang H., Jia X.M., Ehertz S., McGann L.E. (1996) Mechanisms of cryoinjury and cryoprotection in split-thickness skin //Cryobiology. V. 33, P. 376-389

Информация о работе

Дмитриева, Евгения Владимировна
кандидата биологических наук
Пущино, 2004
ВАК 03.00.02

Диссертация

Структурно-функциональные изменения нейронов моллюска после криоконсервации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы