Функциональная и регенеративная активность нейронов после криоконсервации изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L.

Ивличева, Наталья Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функциональная и регенеративная активность нейронов после криоконсервации изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L.
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Функциональная и регенеративная активность нейронов после криоконсервации изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L."

На правах рукописи

Ивличева Наталья Александровна

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ И РЕГЕНЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙРОНОВ ПОСЛЕ КРИОКОНСЕРВАЦИИ ИЗОЛИРОВАННОГО МОЗГА МОЛЛЮСКА ЬУМЫАЕА ЯТАОЫАиБ I.

03.01.02-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 ЯНВ 2013

ПУЩИНО - 2013

005048672

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук и в Путинском государственном естественно-научном институте

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Гахова Эдит Николаевна

Официальные оппоненты:

Буданцев Аркадий Юстиапович - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, заведующий лабораторией функциональной гистохимии

Мсжевикина Людмила Михайловна - доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки РАН, ведущий научный сотрудник лаборатории механизмов рецепции

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Защита диссертации состоится <<Щу> февраля 2013 г. в 14 ч. 00 мин. на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.038.01 при Федеральном государственном бюджетном Учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущиио, ул. Институтская, д. 3

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.

Автореферат разослан « 21» января 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета у

кандидат биологических наук г(пСл >^молихина Татьяна Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Длительное сохранение жизнеспособной нервной ткани в замороженном состоянии (криоконсервация в жидком азоте, при -196°С) является современной и актуальной проблемой в связи с развитием в последние годы методов трансплантологии в нейромедицине и, соответственно, необходимостью создания запаса нейронального материала в криобанках.

В настоящее время криоконсервация стала обычной процедурой для длительного сохранения многих типов клеток животных, таких как клетки крови, клетки костного мозга, сперматозоиды, клеточные культуры, и др. Успешные протоколы криоконсервирования в основном разработаны для однородных клеточных суспензий (Фуллер и др., 2003; Meryman, 2007; Choi, Bischof, 2010; Seth, 2012). Изолированные ткани плохо переносят низкотемпературную криоконсервацию, а для целых органов эти методы пока не разработаны. Клетки в составе ткани, создавая определенную архитектуру функциональной единицы, более плотно упакованы, чем в клеточных суспензиях, с которыми исследователи чаще всего имеют дело. Гетерогенный клеточный состав нейроналыюй ткани (разного типа нейроны и глиальные клетки) и экстраклеточная структура, - все вместе могут создавать проблемы при попытке экстраполировать протоколы криоконсервирования с клеточных суспензий на кусочки органов, ткани, нейросферы (Fagy et al., 2004; Pegg, 2007; Paynter, 2008). Одна из таких проблем заключается в том, что экстраклеточные структуры и межклеточные связи могут быть не менее важными объектами криоконсервирования, чем сами клетки, особенно, если они плотно упакованы в структуре ткани (Acker et al., 2000; Müller-Schweinitzer, 2009; Pegg, 2010). Поэтому в настоящее время являются особенно актуальными исследования механизмов криоповреждений и криозащиты нервной ткани как неделимой интегрированной структуры.

В этой связи в качестве модельных объектов интерес представляют нервные системы беспозвоночных, как например, мозг моллюска Lymnaea stagnalis L., который представляет собой гетерогенную ткань, включающую полифункциональные нейроны разного размера и обширные вненейрональные области, по многим свойствам сходные с аналогичными структурами позвоночных. Хорошо отлаженные способы регистрации электрической активности нейронов, разработанные методы клеточной и органной культуры (Гелетюк и др., 1970; Костенко и др. 1972; Wong et al., 1981; Ивличева, Гахова, 2007), а также доступность объекта для исследователей в любое время года, делают мозг моллюска привлекательной моделью для исследования в области криобиологии (Гахова и др., 1989; Дмитриева, 2004; Ивличева, Гахова, 2007). Изучение особенностей криоповреждений и криозащиты мозга моллюска как целой интегральной структуры позволит определить области криоповреждений, прогнозировать степень восстановления и оценить возможности режимов криоконсервации и создания оптимальных криозащитных сред.

Цель и основные задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении влияния криоконсервации на функциональную и регенеративную способность зрелых нейронов на примере криоконсервирования изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L.

В соответствии с целью были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить электрическую активность нейронов переживающего мозга моллюска в органной культуре без криоконсервации и после криоконсервации: мембранные потенциалы (МП), генерацию потенциалов действия (ПД) и постсинаптических потенциалов (ПСП), рецепторные ответы на медиаторы.

2. Провести поиск синаптических связей между нейронами переживающего мозга моллюска в органной культуре после криоконсервации.

3. Исследовать в клеточной культуре выживаемость и регенеративные способности нейронов, выделенных из замороженно-отгаянного мозга моллюска.

4. Выявить характер протективного действия (крио- или нейро- протекторное) пептида Thr-Ser-Lys-Tyr (TSKY) выделенного из мозга зимоспящих сусликов Spermophillus undulates. Определить его влияние на выживаемость и регенеративные способности нейронов в культуре на разных этапах криоконсервирования.

5. Проанализировать влияние пептида TSKY на кристаллизацию и формирование микрочастиц льда в криозащитных растворах в процессе замораживания до температуры жидкого азота.

Научная новизна. Важными достижениями работы являются результаты по изучению электрической активности нейронов переживающего мозга моллюска в органной культуре до и после криоконсервации, поскольку замораживанию подвергался интактный орган, состоящий из разнородной популяции дифференцированных клеток со сложными межклеточными связями и синаптическими структурами. Впервые показано, что на фоне сохранения целостности основной массы нейронов криоповреждения были связаны с межнейрональными областями, а именно с аксонами и синаптическими структурами. Нейроны, выделенные из криоконсервированных ганглиев, как показано в культуре in vitro, обладали способностью к регенерации нервных отростков и образованию контактов. Впервые показано, что пептид TSKY, выделенный из мозга зимоспящих животных, может участвовать в восстановительных процессах в период оттаивания и оказывать нейропротекторное, положительное воздействие, на жизнеспособность нейронов после криоконсервации, а не криопротекторное на этапе замораживания. Криомикроскопические исследования подтверждают отсутствие у пептида TSKY криопротекторных свойств, так он не влиял на характер кристаллизации и формирование микрочастиц льда при замораживании растворов.

Научно-практическое значение работы. Результаты работы вносят вклад в изучение механизмов криопровреждений и криозащиты тканей (и целых органов) животных при криоконсервации. Полученные знания о роли нейропротекторных факторов при гипотермии и при глубоком замораживании изолированных нейрональных тканей позволит продолжить поиск новых эффективных и безопасных способов криоконсервации нервных клеток и ткани. Результаты проведенных исследований могут быть использованы для модификации и разработки криозащитных сред, повышающих жизнеспособность, нейрональной ткани, нейросфер, кусочков мозга.

Конкурсная поддержка. РФФИ грант №10-04-01319-а; грант конкурса УМНИК, гос. контракт № 6639р/9106 от 02.03.09 и № 8229р/12633 от 06.07.10; АФГИР (США, CRDF) проект RUB 2-010001-PU-05; р2004Наукоград-а № 04-04-9730.

Апробация диссертации. Основные материалы исследований были представлены на 8-й, 9-й, 11-й, и 13-й пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино 2004, 2005, 2007, 2009гг.), на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005), VIII (Kazan, 2006) и IX (St. Petersburg, 2009) East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology «Simpler Nervous Systems», XIX Международной конференции-совещании «Консервация генетических ресурсов» (Пущино, 2008), III Всероссийском Конгрессе с международным участием студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010», Школе-конференции «Инновационные подходы в изучении биосистем» (Нижний Новгород,

2010), Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011), VII и VIII Международном междисциплинарном Конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2011, 2012), 14th International Hibernation Symposium «Living in a seasonal world: Thermoregulatory and metabolic adaptations» (Semmering, Austria, 2012 ), IV Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012).

Публикации.

Основные результаты диссертации представлены в 20 печатных работах, из них 5 в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК; 1 - глава в книге; 2 - в сборнике; 12 тезисов.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста с использованием 26 рисунков и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, полученные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержит 159 ссылок.

Список принятых сокращений. МП - мембранный потенциал; ПД - потенциал действия; ВПСП - возбуждающий постсинаптический потенциал; ТПСП - тормозной постсинаптический потенциал; НС - нервная система (мозг) моллюска; MK4JI -микрочастица льда; L-15 - среда для культивирования (Leibowitz); КСНП - культуральная среда для нейронов прудовика; TSKY - пептид Thr-Ser-Lys-Tyr; ДМСО -диметилсульфоксид.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ

Объект. Эксперименты проводили на ганглиях окологлоточного кольца (мозге) пресноводного моллюска Lymnaea stagnalis. Моллюсков собирали с весны до осени в естественных водоемах обитания. Собранных в природе прудовиков содержали в аквариумах при 4°С (перед экспериментом, их выдерживали сутки при комнатной температуре, 18-20°С). Кроме этого, моллюсков выращивали из оплодотворённой икры и содержали в аквариумах при 18-20°С.

Криоконсервация: метод замораживания-оттаивания изолированного мозга моллюска. Выделение мозга проводили при комнатной температуре. В качестве криопротектора использовали 2М диметилсульфоксид (ДМСО). Замораживали ганглии в парах жидкого азота со скоростью 400°С/мин. Материал сохраняли в жидком азоте от 24 ч. до 2 лет. Оттаивание осуществляли на водяной бане при 22-24°С со скоростью 500°С/мин. После оттаивания и постепенного отмывания криопротектора для изучения восстановления структуры и функции нейронов мозг помещали в физиологический раствор (мМ): 80 NaCl, 1.6 КС1; 1 MgCl2, 2 СаСЬ, 7.5 рН и инкубировали при 4-6°С до 15-18 час, но не менее 1.52 час (Гахова и др, 1989).

Метод органотипического культивирования мозга моллюсков. Изолированный мозг моллюска (ганглии), предварительно освободив от толстой соединителыю-тканной оболочки, помещали в 2-4 мл питательной среды, применяемой при культивировании изолированных нейронов. Ганглии находились в среде, не прикрепляясь к поверхности стекла. Флаконы хранили в темноте при 4-6°С. Смену среды проводили по мере того, как происходило ее закисление (от 2-3 до 6-9 сут). Обеззараживание осуществляли каждый раз при смене среды в растворе, содержащим 50 мкг/мл гентамицина. Культивирование ганглиев моллюска после криконсервации проводили таким же образом. Регистрацию электрических характеристик нейронов ганглиев проводили через каждые 2-3 сут. на протяжении 16 сут. культивирования. Срок культивирования в экспериментах составлял от 3-х до 16 сут.

Культивирование изолированных нервных клеток моллюсков осуществляли по методу, разработанному д.б.н. М.А. Костенко для нервных клеток моллюсков (Костенко, 1972, 1982). Сразу после изолирования мозг выдерживали при 4-6°С от 2 до 18 час в растворе, используемом для длительного переживания нервной ткани моллюсков (мМ): 90 NaCl, 5 KCl, 2 CaCh, 1.5 MgCl2, 7.8 pH (Костенко, 1985). Изолированное кольцо ганглиев подвергали ферментативной обработке (0.35% проназы на физиологическом растворе), отмывали от фермента и механическим образом (многократным пипетированием) выделяли клетки (Костенко и др., 1982). Культивирование осуществляли при комнатной температуре на питательной среде с антибиотиком (гентамицин 20 мкг/мл): 90 NaCl, 5 KCl, 2 СаСЬ, 1.5 MgCh, 0.25 trisHCl, без добавления сыворотки, но содержащей 20% L-15 (Sigma, США), 7.6-7.9 pH.

Жизнеспособность нейронов в клеточной культуре оценивали с помощью светового микроскопа МБИ-13, микроскопа Carl Zeiss Axiovert 40 CFL с настройками по Хоффману, и Olympus IX-70 по следующим морфологическим критериям: в норме нейроны имеют чёткие контуры и равномерную структуру; повреждённые нейроны имеют ярко окрашенное и/или диффузно окрашенное ядро и цитоплазму. Дегенерировавшие нейроны легко определялись по явным признакам лизиса, вакуолизации цитоплазмы или темно-бурой окраске пигмента. Регенерационную активность оценивали по доле клеток, сформировавших отростки в первые 24 ч. культивирования, от общего числа прикрепившихся к стеклу нейронов. Целостность клеточных мембран нейронов оценивали по проницаемости для витального красителя (метиленовый синий). Культивировали при 20°С. Контролем служили клетки животных, мозг которых не подвергался криоконсервации.

Жизнеспособность нейронов в интактном мозге моллюска оценивали методом прижизненного окрашивания Live/Dead. Для прижизненного окрашивания использовали Live/Dead Cell Double Staining Kit: (Sigma, США L-3224, Molecular Probes®) (Vasudevan et al., 2008). Компонент A - кальцеин AM (X ex/em ~ 495/~ 515 nm); компонент В - этидийгомодимер-1 (I ex/em ~ 528/~ 617 nm). Образцы инкубировали 30 мин при 20-22°С в физиологическом растворе, содержащим 4мМ компонента А, тестирующего внутриклеточную эстеразную активность и ЗмМ компонента В, тестирующего целостность клеточной мембраны. Флуоресценцию нейронов регистрировали на микроскопе Leica CTR DM 6000В при увеличении 2.5х, 20х и 40х.

Метод внутриклеточного отведения мембранных потенциалов. Вырезанное кольцо окологлоточных ганглиев вместе с буккальными ганглиями обрабатывали смесью ферментов (от 5 до 25 мин): проназа Е (Sigma, США) - 2мг/мл, коллагеназа (Sigma, США) -2 мг/мл, трипсин - 2 мг/мл, с последующей отмывкой физиологическим раствором для моллюсков. Состав раствора (мМ): 50 NaCI, 1.6 KCl; 4 СаС12, 1.5 MgCh, 10 trisHCl, 7.4 pH. Затем ганглии помещали в рабочую камеру объемом 1.5 мл без протока. Мембранный потенциал нейрона отводили внутриклеточным стеклянным микроэлектродом R=20-60 МОм, заполненным KCl (0.08-3 M) на усилитель производства фирмы Микромед и через аналого-цифровой преобразователь записывали на компьютер IBM PC 486DX4-S. Отведение осуществляли от нескольких нейронов, используя до 5-ти каналов одновременно. В электрофизиологических экспериментах было использовано более 60 изолированных нервных колец, и проанализировано свыше 300 записей нейронной активности мозга как после замораживания-оттаивания, так и не прошедших криоконсервацию. Внутриклеточное отведение мембранных потенциалов осуществляли от наиболее крупных идентифицированных нейронов: ПБ4, ПБ4-кл, ЛБ4, ЛБ4-кл, ППеД1, ЛПеД1, нейронов ППеА-кластера, ЛПеА-кл, ВД1, ВД4, ВА-кл. Серотонин (5-гидрокси-Ь-триптамин, 5-НТ) (Sigma, США) вносили в камеру микропипеткой или с протоком.

Обработка мозга пептидом TSKY. Пептид TSKY был выделен из мозга зимоспящих сусликов Spermophillus undulatits, затем синтезирован в лаборатории химии пептидов ФГБУН ИБХ РАН (Ziganshin et al, 1994). Изолированное окологлоточное нервное кольцо прудовика предварительно инкубировали 60 мин в растворе питательной среды (20% L-15) (Sigma, США) с добавлением пептида TSKY в концентрациях (1-10"7М, 1-10~бМ и I ■ 10"5 М) при 22-24°С и при 4-6°С. Нейроны выделяли из ганглиев, как описано выше, затем культивировали при 22-24°С в КСНП. В контроле предварительную инкубацию мозга проводили в растворе без пептида. При криоконсервации мозга прудовика, пептид TSKY добавляли в раствор криопротектора и в отмывающий раствор в концентрации 1-10 ~5М.

Криомикроскопия. Криопротектирующие растворы различной концентрации охлаждали в камере Фукса-Розенталя (объем образца 3.2 мкл, толщина слоя 200 мкм), помещённой в специально разработанную пенопластовую камеру, сначала в течение 15 мин в парах жидкого азота, затем после достижения -130°С в жидкий азот, со скоростью охлаждения от -5 до -25°С/мин. Температуру образцов измеряли непосредственно в замораживаемом растворе с помощью электронного термометра АТТ-2006 (Aktakom, Taiwan) с микротермопарой медь-константан (Copper/Constantan microthermocouple) и диаметром 0.1 мм. Наблюдения проводили в отражённом свете при помощи криомикроскопа Orthoplan (Zeiss, Germany) с использованием объектива Planachromat 4х/0.10 (Андреев и др., 2008). Фоторегистрацию изображений криомикрочастиц растворов осуществляли при температуре жидкого азота (-196°С) (Андреев и др., 2009). Видеорегистрацию проводили при помощи видеокамеры НВ-35 (Россия).

Методы оценки ошибок измерений и программное обеспечение. Для записи сигналов нервных клеток была использована программа Spike-СЗ (автор Воронцов Д.Д.). Все данные представлены как средние значения и их стандартные ошибки. При проверке статистической достоверности различий между группами сравнения использовали непарный /-критерий Стьюдента для малых выборок.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выживаемость нейронов в клеточной культуре после криоконсервации мозга с использованием ДМСО н криомикроскопия протектирующих растворов

Изучение криоконсервации изолированного мозга моллюска с использованием разных концентраций ДМСО (1М, 2М и ЗМ) показало, что лучшая сохранность нейронов обеспечивается ДМСО в концентрации 2М (рис. 1). В этом варианте эксперимента в клеточной культуре выживало 78% нейронов, изолированных из заморожено-оттаянного мозга, в то время как с использованием других концентраций ДМСО (1М и ЗМ) живыми были 38% и 3% нейронов, соответственно (р < 0.001).

Известно, что сохранность клеток при замораживании и хранении в жидком азоте в первую очередь зависит от механических повреждений, связанных с характером кристаллизации, а также с размерами и формой микрочастиц льда (MK4JI). Крупные кристаллы и MK4J1, имеющие формы с острыми углами, как правило, являются причиной механических повреждений клеток. Одно из основных свойств криопротекторов - это изменение характера кристаллизации растворов. Криомикроскопический анализ растворов с разной концентрацией ДМСО показал, что при замораживании раствора с 2М ДМСО размеры МКЧЛ (при -196°С) не превышали 50 мкм (от 10 до 50 мкм) и имели преимущественно овальную форму, без острых углов, со сглаженными границами, или форму «розочек».

Рис. 1. Зависимость количества живых нейронов в культуре, выделенных из мозга после криоконсервации,от

концентрации ДМСО, %

контроль 1М 2М ЗМ

* - достоверная разница между числом живых нейронов в контроле и после криоконсервации мозга моллюска с разными

концентрациями ДМСО. р < 0.001.

В то же время, при замораживании растворов с 1М ДМСО MK4J1, образовавшиеся при температурах ниже -140°С, имели размеры от 25 до 100 мкм, а с ЗМ ДМСО - преобладали МКЧЛ размером более 50 мкм. Крупные МКЧЛ имели неправильную форму с четкими ровными границами, перемежающимися с острыми углами.

Таким образом, можно предположить, что лучшая сохранность нейронов при замораживании мозга с 2М ДМСО связана с формированием при этой концентрации используемого криопротектора менее травматичных для клеток МКЧЛ. Поэтому в наших опытах в качестве криопротектора мы использовали 2М ДМСО.

2. Морфофункциональное состояние нейронов в ганглиях моллюска после

криоконсервации в жидком азоте (тестирование жизнеспособности с применением витального красителя kit Live/Dead)

Для изучения последствий криоконсервации на изолированный мозг моллюска, как комплексной многоклеточной системы, прежде всего, было проведено тестирование на определение живых и мертвых нейронов в оттаянных интактных ганглиях. Для этой цели использовали 2-х компонентный флуоресцентный витальный краситель kit Live/Dead (Molecular Probes®). Флуоресценция клеток в зеленом диапазоне спектра (X ex/em ~495/~515 пт) по всей поверхности ганглиев свидетельствовала о том, что окрашенные нейроны были живыми. Кроме этого, зеленая флуоресценция была тестом на наличие эстеразной активности в телах нейронов (Vasudevan et al., 2008). Нервные отростки, наблюдаемые на поверхности ганглиев (под ганглионарной оболочкой) также флуоресцировали зеленым, что говорит о сохранении эстеразной активности не только в телах нейронов, но и в нейрональных отростках.

Следующим шагом было изучение физиологической сохранности (или восстановления) не отдельных нейронов, а всей системы мозга после криоконсервации. Мы изучили электрические характеристики нейронов в системе интактного мозга до и после замораживания-оттаивания так как электрическая активность является основным показателем физиологической активности нервной системы.

3. Электрические характеристики нейронов переживающего мозга моллюска в органной культуре

Ранее было показано, что после криоконсервирования изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis нейроны восстанавливают электрические характеристики (Гахова и др., 1989; Чекурова и др., 1987; Чекурова, 1992). Следует подчеркнуть, эти данные были получены на нейронах, изолированных из заморожено-оттаянного мозга моллюска. Процедура выделения нейронов из стромы ганглиев включает ферментативную и механическую обработки, которые тоже могут вызывать повреждения. Отделить эти повреждения от тех, которые являются результатом физико-химических процессов,

сопровождающих процесс криоконсервации, оказалось невозможным. Кроме этого, неизвестно распространяются ли эти повреждающие эффекты в процессе замораживания-оттаивания мозга на связи между нейронами в ганглиях (контакты, рецепторные структуры). Ответы на эти вопросы можно было получить при изучении электрофизиологических свойств нейронов в составе ганглиев мозга в переживающей органной культуре, а не на изолированных нейронах. Для этого мы исследовали переживание изолированного мозга моллюска в культуре in vitro в течение 16 сут культивирования до и после замораживания.

3.1. Электрические характеристики нейронов ганглиев моллюска в органной культуре без криоконсервации

Микроэлектродным методом отведения биопотенциалов было проанализировано 66 клеток в 22 нервных системах (НС). Для анализа электрических характеристик МП и ПД выбирали нейроны в области расположения идентифицированных нейронов (рис. 2): в буккальных ганглиях - клетки в области локализации нейронов Б1, Б2, БЗ, Б4; в висцеральном ганглии - в области нейронов ВД1 - ВД4 и А-кластера; в педальных ганглиях - нейроны в области А- кластера и клетки Д1; в правом и левом париетальных ганглиях — группы клеток с вентральной стороны ганглиев; в церебральных ганглиях - в области нейрона Ц1.

Рис. 2. Схема расположения идентифицированных нейронов, электрические показатели которых использовали для оценки жизнеспособности мозга Lymnaea stagnalis (вид с дорзальной стороны).

Отмечены нейроны ЛБ1, ЛБ2, ЛЕЗ, ПБ4 в левом и правом буккальных ганглиях; ВА-кл - группа нейронов в области А-кластера и нейроны ВД1 и ВД4 в висцеральном ганглии; ПеА-кл - группа нейронов в области А-кластера и нейроны ЛПеД1 и ППеД1 в левом и правом педальных ганглиях; ЛЦеЦ1 ПЦеЦ! нейроны в левом и правом церебральных ганглиях (обозначения и классификация нейронов приведены согласно работам Benjamin & Winlow, 1981; Syed et al, 1991). Овалами обозначены

идентифицированные нейроны.

Из 66-ти исследованных нейронов электрические характеристики зарегистрировали у 57 нейронов (86.3%). В первые сутки органотипического культивирования МП нейронов варьировали в зависимости от конкретной клетки от -40.8 до -61.5 мВ (п = 56), амплитуды ПД - от 56.6 до 93.7 мВ; частота генерации ПД (одиночных и в пачках! варьировала от 23.4 до 164.6 импульсов в минуту, что соответствует частоте генерации от 0.39 до 2.7 Гц.

При длительном органном культивировании мозга моллюска у 17 из 57 активных нейронов (29.8%) были зарегистрированы постсинаптические потенциалы от 4 до 10 мВ. Важно отметить, что в органной культуре мозга моллюска были выявлены синаптические связи как в первые, так и в последующие 16 сут культивирования. Например, на 12 сут культивирования в ответ на деполяризацию (+1нА, 0,5 мсек) нейрона ППеД1 нейрон ВА-кл отвечал тормозными постсинаптическими потенциалами.

Кроме того, мы получили ответы клеток на аппликацию серогонина (3-10"5М, 4-10"6М), что свидетельствует о сохранности рецепторной активности нейронов мозга. Серотонин

(3-Ю"5 М) вызывал угнетение спонтанной генерации ПД нейрона ППеД1 правого педального ганглия и активацию электрической активности у нейрона А-кластера левого педального ганглия (рис. 6А).

Таким образом, на полученной модели переживающей органной культуры in vitro в течение 16сут культивирования мы наблюдали функционирование изолированного мозга моллюска. Данная модель использовалась нами далее в качестве контроля для изучения последствий криоконсервации на уровне интегрированной НС.

3.2. Изучение электрических характеристик нейронов в органной культуре после криоконсервации изолированного мозга моллюска

Ранее было показано, что электрические характеристики нейронов восстанавливаются приблизительно через 2-2.5 ч после оттаивания мозга моллюска и инкубирования его в физиологическом растворе при 4-8°С (Гахова и др., 1989). В нашей работе регистрацию электрических параметров нейронов проводили в первые сутки, не ранее, чем через 8 ч после оттаивания криоконсервированного мозга, отмывания его от криопротектора и инкубирования в питательной среде.

Рис. 3. Генерация потенциалов действия нейронов после криоконсервации в первые сутки культивирования.

Нейрон ВД4 генерирует ПД.

а) и б) - паттерны пачечной активности 2-х нейронов правого париетального (ППа) ганглия;

б) - генерация ПД и ВПСП нейронов ППа.

ВД4

lllliilillillliilllllll

150 мВ

ППа а)

ППа б)

ЩИ

150 мВ

110 мВ

-U

-^—05 с

15 мВ

В переживающем заморожено-оттаянном мозге прудовика было изучено 57 нейронов из 20 НС. Из них у 47 нейронов (84%) были зарегистрированы электрические характеристики.

ЛБ4

12 сут

лпнишшшш

| 50 мВ

0~5 с

ЛБ4-КЛ 16 сут

10с

Рис. 4. Периодическая пачечная активность ЛБ4 и ЛБЗ буккального ганглия и ПСП нейрона ЛБ4-кл заморожено-оттаянного мозга прудовика в органной культуре, 12-16 сут.

На рис. 3 даны примеры записи электрической активности нейронов Д4 висцерального ганглия и двух нейронов из группы клеток с вентральной стороны правого париетального ганглия мозга прудовика в первые сутки культивирования после оттаивания. В первые сутки органотипического культивирования МП разных нейронов в ганглиях варьировал от -41 до - 55.7 мВ (п = 44), амплитуды ПД - от -76.9 до -92.3 мВ; частота генерации ПД (одиночных и в пачках) варьировала от 4.5 до 72.5 импульсов в минуту, что соответствует от 0.74 до 1.2 Гц. При культивировании мозга моллюска у 19 из 47 нейронов (40.4%) были зарегистрированы постсинаптические потенциалы от 4 до 10 мВ (рис. 3, рис. 4). Таким образом, количество живых функционально активных клеток не отличается в ганглиях до и после криоконсервации. Однако в разных опытах при сравнении идентичных пар нейронов в разных препаратах (п= 12, по 2 - 3 пары нейронов в каждом препарате) выявляются отличия между контрольными и криоконсервированными клетками. На рис. 5 даны в качестве примера иллюстрации электрической активности двух пар нейронов: Г111еД1 - на 5 и 10 сут культивирования, и нейрона ВД4 - на 16-е сут органного культивирования.

ППеД1 контр 5 сут

ППеД1 крио- -5 сут

ППеЯ1 ; || 1.....||

контр 10 сут

ППеД1 крио-10 сут

ШШш*

ШП1111П-,:

| 50 мВ

4-иЛ4-Ш4-|60л

Рис. 5. Электрическая активность нейронов в органной культуре на 5, 10 и 16 сут:

ППеД1 и ВД4 без криоконсервации (контр) и аналогичных нейронов после криоконсервации (крио-).

ВД4

ягОШХШШШ

| 50 мВ

Нейрон Д1, который, как известно, является дофаминэргическим интернейроном, обеспечивающим запуск респираторного ритма (Буес! е! а1., 1990), после криоконсервации не проявляет типичной для него спонтанной электрической активности, но в то же время у него наблюдается ПСП-активность такая же, как в контрольных образцах. С другой стороны, интернейрон Д4 висцерального ганглия, который также входит в состав генератора респираторного ритма, обеспечивая работу пневмостома моллюска (Буес), \yinlow, 1991Ь), после замораживания-оттаивания на 16 сут культивирования не только сохраняет спайковую активность, но и увеличивает частоту генерации ПД, а также проявляет пачечную импульсную активность в отличие от идентичного нейрона в контроле.

При культивировании заморожено-оттаянного мозга моллюска удалось зарегистрировать ответы нейронов на серотонин. На рис. 6Б приведены примеры, где серотонин в концентрации (3 • 10"5 М, 4-10"6М) вызывал снижение частоты генерации ПД нейрона ППеД1 и одного из нейронов А-кластера левого педального ганглия, а в некоторых случаях ингибировал генерацию ПД. В отличие от контроля ответная реакция криоконсервированных нейронов на серотонин, как правило, имела более длительный временной интервал.

ППеД1

+5-НТу

лиш

■

+5-НТ

- 25 мин 60 с

5-НТ60 с

Б + 5-нт у

ППеД1 '

■ |50 мВ

ППеА-кл-1- I............■ п. .1111 50 мВ

^ 300 с

+ 5-НТ ~ 5"нт

Рис. 6. Реакция нейронов мозга моллюска (10 сутки культивирования) на добавление серотонина. А) - мозг без криоконсервации, Б) - мозг после оттаивания. Маркированы начало подачи серотонина (+5-НТ) в проток и начало подачи отмывающего физраствора (-5-НТ). Серотонин (3'10"5М) вызывал угнетение спонтанной генерации ПД дофаминового нейрона ППеД1 и нейрона ППеА-кл.

Далее мы анализировали возможность сохранения синаптических связей между нейронами, локализованными в разных ганглиях. С этой целью мы изучили связь между нейроном ППеД1 (педальный ганглий) и нейронами из висцерального ганглия (ВД1, ВД4. А-кластера). Известно, что эти нейроны являются основой функционирования нейрональной сети, отвечающей за респираторное и пищевое поведение моллюска (Буес! е1 а1., 1991).

После криоконсервации синаптические связи между нейронами выявить не удалось (рис. 1Б), в отличие от контроля (рис. 1А). Анализировали возможность связи в каждом из 20 замороженно-оттаянных НС. Как можно видеть (рис. 1Б), электрически вызванная деполяризация нейрона ППеД1 (+02 нА, 40 мсек) не вызывала синаптических ответов нейронов висцерального ганглия. Также, не выявлен ответ нейрона ППеД1 и нейрона ВД4 на электрически вызванную деполяризацию (+0,4 нА, 40 мсек) нейрона из ВА-кл. В тоже время, отсутствовали импульсные ответы нейрона из ВА-кл на вызванную деполяризацию (+0,1 нА, 40 мсек) нейрона ППеД1.

Таким образом, после криоконсервации ганглиев на фоне электрически активных нейронов (наличие МП, ПД и реакции на аппликацию серотонина) обнаружено отсутствие функциональных синаптических связей между ними. Это могло быть следствием повреждений, вызванных либо физическими воздействиями, сопровождающими процесс криоконсервации, либо токсическим влиянием ДМСО. Известно, что криопротекторы, в том числе ДМСО, обладают не только криозащитными свойствами, но могут оказывать токсическое действие на клетки и клеточные системы (РаЬу, 2010).

ППеД1

диШДШШ

ППеД1

50 мВ

150 мВ

ВА-кл,

| 50 мВ

ВД4

.П.

¡50 мВ

Рис. 7. Пример тестирования еинаптической связи в мозге моллюска в первые сутки органотипического культивирования до- и после- криоконсервации.

Чтобы исключить повреждающий эффект ДМСО на нервные отростки и синаптические структуры было изучено влияние ДМСО на наличие еинаптической связи между нейронами ППеД] и ВД4 в образцах, не подвергавшихся криоконсервации. На рис. 8 видно, что 2М ДМСО не влиял на функционирование синаптической связи: электрическая стимуляция (+1нА, 0,5 мсек) нейрона ППеД 1 вызывала ВПСП ответ нейрона ВД4.

ППеД1.

150 мВ

ВД4

| 50 мВ

10с

Рис. 8. Пример функционирования синаптической связи в мозге моллюска после обработки 2М ДМСО (без криоконсервации).

Таким образом, отсутствие синаптических связей в заморожено-оттаянных ганглиях было зафиксировано в первые сутки органотипического культивирования. Связи не восстанавливались в течение 16 сут культивирования. Такой характер повреждения возможен на уровне нейропиля в ганглиях или в комиссурах, соединяющих ганглии. Отсутствие связей при увеличении сроков культивирования может говорить о том, что для регенерации отростков и восстановления синаптических структур после криоконсервации требуется более 16 сут, либо свидетельствовать о необратимости повреждений.

4. Анализ регенеративной активности изолированных нейронов в клеточной культуре in vitro по и после криоконсервировации мозга моллюска

Чтобы выяснить обладают ли криоконсервированные нейроны способностью формировать de novo и регенерировать нейрональные отростки, а также образовывать контакты между клетками, мы использовали впервые разработанный д.б.н. М.А. Костенко (1973) метод культивирования нейронов, изолированных из мозга моллюска нейронов.

На рис. 9 представлены иллюстрации регенерации нейрональных отростков нейронов, изолированных из контрольных, не подвергавшихся замораживанию ганглиев, и нейронов из криоконсервированных ганглиев. В момент изоляции нейронов из стромы заморожено-оттаянного ганглия обращает на себя внимание то, что клетки, как показали наши наблюдения, проявляют адгезивность свойственную контрольным нейронам.

Рис. 9. Регенерация изолированных нейронов и формирование нейрональных отростков в культуре in vitro до- и после- криоконсервации мозга моллюска, 1-2 сут. Температура культивирования 18-22°С. Шкала 30 мкм. тн - тело нейрона, а - аксон, д — дендриты, л - ламеллы, в - варикозные расширения

без криоко л v if- С-ТИ Д юервации (30 ч in vitro) V А

порле криок .в* «Ж' ТН Ьнсервации (30 ч in vitro) д /й тн шт ; , 1 V

В первые сутки в культуре in vitro 73% от общего числа криоконсервированных нейронов прикреплялись к культуральной подложке, и втягивали культи аксонов, которые, как правило, остаются после изоляции клеток из мозга (рис. 9). Во время ретракции в большинстве случаев отростки полностью втягивались в тело клетки и само тело нейрона округлялось. Это является одним из признаков способности нейрона к дальнейшей дифференцировке и регенерации нервных отростков (Костенко, 1985; Сотников, 2008).

В начальный период культивировании (до трех суток) как в контроле, так и в опыте можно было наблюдать формирование пластинчатых конусов роста, либо образование ламелл. У более чем половины прикрепившихся к стеклу нейронов (до 62 %) формировались нервные отростки (рис. 9). Формирование отростков сопровождалось как их удлинением/разветвлением, так и сокращением, что приводило к изменению направления роста отростков. Сокращение отростков, направленное к телу нейрона, или, наоборот, к концу отростка, приводило к перемещению нейронов. Таким образом, нейроны приобретали способность к активному движению.

При дальнейшем культивировании нейронов (до 7-8 сут) дайна отростков превышала диаметр сомы, на концах нейритов наблюдались округлые наплывы цитоплазмы (зоны роста), свидетельствующие о развитии нейритов. Как в опыте, так и в контроле наблюдались утолщение, ветвление отростков и агрегация нейронов (рис. 10). Эти характеристики

поведения нейронов в культуре, выделенных из заморожено-оттаянных ганглиев, не отличаются от контрольных и соответствуют описаниям культуры нейронов моллюсков, данных Костенко (1985) и Сотниковым (2008).

Без криоконсервации

После криоконсервации

Рис. 10. Регенерация нервных отростков и формирование контактов в клеточной культуре (от 3 сут) до и после криоконсервации мозга моллюска.

а) - образование ламелл и филлоподий; б) - формирование отростков из «невтянувшегося» аксона;

в) - образование ламеллоподий, формирование межнейронных контактов и агрегация нейронов в

группы; г) - агрегация нейронов в группу, рост отростков и аутозамыкание нейрональных отростков;

д) - образование нейрональных контактов, агрегация нейронов в группы.

Стрелками отмечены участки образования нейрональных контактов.

тн - тело нейрона, д - дендриты, а - аксоны, ф - филлоподии, л - ламеллы, к - контакты,

аг - агрегация нейронов, о - отростки нейрона.

При культивировании более 7-8 суток на фоне интенсивного разрастания отростков и их ветвления наблюдали образование контактов между отростками соседних клеток. Важно отметить, что стремление нейронов устанавливать контакты было свойственно всем культивируемым нейронам, которые регенерировали отростки и находились на расстоянии 150 мкм друг от друга как в опыте, там и в контроле. Если у нейрона не были сформированы нейриты, в большинстве случаев он не контактировал с другими нейронами, а отростки, которые подходили от соседних клеток «обходили» данный нейрон.

Дифференцированные униполярные нейроны моллюска в культуре в результате регенерации превращались в мультиполярные. В живой культуре нейронов, выделенных как из интактного мозга не прошедшего криоконсервацию, так и из прошедшего криоконсервацию мозга, наблюдались постоянные перемещения нейронов вследствие сокращения или удлинения нейритов и их объединения с другими нейронами в группы.

Таким образом, мы показали, что нейроны, выделенные из криоконсервированных ганглиев моллюска, сохраняют регенерационную способность. В культуре in vitro они

постоянно формируют отростки, которые растут, ветвятся и образуют контакты друг с другом (рис. 10). На основании этих данных можно предположить, что отсутствие синаптических связей в заморожено-оттаянных ганглиях является следствием криоповреждений нервных отростков и структуры синапсов, находящихся в нейропиле и комиссурах.

Следующий этап нашей работы был направлен на поиск нейро- и кркозащитных средств с целью максимального снижения криоповреждений вызванных криоконсервировацией органа и/или для повышения регенеративных свойств ткани.

5. Влияние пептида TSKY на жизнеспособность изолированных нейронов

Для оптимизации процесса криоконсервации изолированного мозга был выбран путь поиска нейропротекторных добавок, которые могли бы снижать уровень метаболизма нейронов, т.к. в гипометаболическом состоянии клетки более устойчивы к различным стрессовым факторам. Мы предположили, что одним из таких веществ может быть нейропептид TSKY, выделенный из мозга зимоспящих сусликов Spermophillus undulates (Ziganshin et al., 1994; Kramarova et al, 1996, Игнатьев и др., 1995).

5.1. Эффекты пептида TSKY в зависимости от температуры при предварительной инкубации ганглиев моллюска (22-24°С и 4-6°С)

Дозо-зависимые эффекты пептида TSKY при инкубации мозга моллюска при 22-24°С

После инкубации мозга моллюска при температуре 22-24°С в растворе с различными концентрациями пептида TSKY доля живых нейронов при культивировании увеличивалась по сравнению с контролем в среднем на 72.2% при концентрации пептида 1Т0"5 М, на 54.4% -при МО"6 Ми на 57.2%-при М0"7М(рис. ПА).

При этих же условиях доля нейронов с отростками через 24 ч культивирования снижалась по сравнению с контролем и в среднем составляла 30.8% при концентрации пептида 1 ТО"5 М, 29.17% - при МО"6 М и 13.3%-при М0"7М(рис. 12А).

Дозо-зависимые эффекты пептида TSKY при инкубации мозга моллюска при 4~6°С

После инкубации мозга моллюска при пониженной температуре (4—6°С) в растворе с различными концентрациями пептида TSKY доля живых нейронов при культивировании значительно увеличилась по сравнению с контролем в 3,5 раза при 1Т0"5М, в 3,2 раза при МО"6 М и в 2 раза при 1 • 10"7 М (рис. 11Б).

400 х 350 и 300

* ш 250 О о

£ i 200 " о. £ >§■ 150

= 2! § 100

* 50

С)

400 330

3 300 i С? 250 § ^ 200 и о

О X 150 *" 2

100

о и

* т 50

Рис. 11. Количество живых нейронов после культивирования в течение 24 ч в КСНП.

Предварительная инкубация изолированного мозга моллюска при 22-24°С (А) и 4-6°С (Б) в течение 60 мин. (*), *(*), *** - разница между количеством живых нейронов в опыте с инкубацией в растворе без пептида (контроль) и после инкубации с пептидом в различных концентрациях ТвКУ; р < 0.1, р < 0.025; р < 0.0001, соответственно; непарный /-критерий Стьюдента.

Инкубация мозга моллюска при пониженной температуре (4-6°С) в растворе с различными концентрациями пептида ТЭК-У не приводила к значимому изменению количества клеток с формирующимися отростками в первые сутки культивирования, и доля клеток с отростками составила 48% при НО 5 М, 24% - при МО"6 М и 29% - при 1-Ю"7 М (рис. 12Б). Однако необходимо отметить, что в данных условиях сохранялась тенденция к снижению формирования отростков. В то же время, количество нейронов, формирующих отростки в первые сутки культивирования после предварительной обработки пептидом ТБКУ в различных концентрациях, было достоверно ниже, чем в контроле при 22-24°С (рис. 12А). Нами не было обнаружено достоверных отличий между контрольными и опытными экспериментами после обработки пептидом при низкой температуре, 4-6°С.

Рис. 12. Количество живых нейронов с отростками после культивирования in vitro в течение 24 ч.

Предварительная инкубация мозга моллюска в растворе с различными концентрациями пептида TSKY при 22-24°С (А) и при 4-6°С (Б) *. ** - разница между числом живых нейронов с отростками в опыте с инкубацией в растворе без пептида (контроль) и после инкубации с пептидом, р < 0.05, р < 0.001, соответственно; непарный i-критерий Стьюдента.

Таким образом, под влиянием пептида TSKY при 4-6°С происходит увеличение (в 3.5 раза) общего числа живых клеток (рис. 11Б). Наиболее выраженный эффект наблюдался при концентрации пептида 10"5М. Кроме того, под действием пептида наблюдалось снижение (рис. 12А), либо тенденция к снижению (рис. 12Б), числа нейронов с отростками вне зависимости от температуры инкубации мозга с пептидом.Имеются данные, что концентрация пептида TSKY в мозге зимоспящих животных, находящихся в состоянии спячки, приблизительно в 2 раза выше, чем в мозге активных животных, и этот пептид способен значительно снижать скорость сердечных сокращений у 36-часовых куриных эмбрионов (Kramarova et al., 1996). Показано также, что охлаждение мышей, которым предварительно ввели пептид TSKY. индуцировало у животных длительную гипотермию (Игнатьев и др., 2005).

Таким образом, полученные нами результаты, позволяют предположить, что нервные клетки моллюска при обработке пептидом TSKY могут переходить в новое физиологическое состояние (возможно, в состояние гипометаболизма/гипобиоза), в котором могут находиться в течение продолжительного промежутка времени без потери жизнеспособности, но со снижением функциональных свойств.

5.2. Влияние нейропептида TSKY на сохранность нейронов в процессе криоконсервации

Для изучения влияния пептида TSKY на выживаемость и регенеративную способность нейронов после криоконсервации мозга провели 3 варианта экспериментов: 1) без добавления TSKY: инкубирование ганглиев в криозащитном растворе с 2М ДМСО в течение 20 мин при 4-6°С и последующее замораживание; 2) с добавлением 10"5 М TSKY в криозащитный раствор и последующим замораживанием в этом же растворе; 3) 10"5М TSKY добавляли только в раствор для оттаивания и отмывания от криозащитной среды.

Первый вариант эксперимента служил контролем. Во втором варианте эксперимента мы не обнаружили в клеточной культуре разницы в количестве живых нейронов, выделенных из оттаянного мозга, предварительно обработанного и замороженного в криозащитной среде с 10~5 М TSKY, по сравнению с контролем (39.5 ± 24.4%, п=12) (рис. 13).

12 3

■ живые нейроны □ нейроны с отростками

Рис. 13. Влияние пептида Т8КУ (10"5М) на жизнеспособность нейронов в культуре (24 ч) после криоконсервации мозга. Количество живых нейронов и нейронов с отростками (%): 1 (контроль) - в отсутствие пептида в инкубационной среде и в криозащитном растворе; 2 - после предварительной инкубации мозга с пептидом и с добавлением пептида в криозащитный раствор; 3- добавление пептида при оттаивании и отмывании мозга от криозащитной среды. ***, * - указывают на достоверную разницу между значениями количества живых нейронов и нейронов с отростками относительно контроля, р < 0.0004 и р < 0.033, соответственно; непарный /-критерий Стьюдента.

Однако количество нейронов, формирующих отростки, в процентном отношении к числу живых нейронов было одинаковым в контроле (рис. 13,1) и опыте (рис. 13,2). Для выяснения возможных проявлений криоповреждений в период оттаивания мы провели третий вариант экспериментов. Пептид добавили в раствор, где происходило оттаивание ганглиев и отмывка от криопротектора. Результаты показали, что количество живых нейронов в опыте было в 2 раза выше относительно контроля (п=10), однако количество нейронов с отростками относительно общего числа живых было на 10% ниже по сравнению с тем же контролем (рис. 13, 3). Предположительно, физические процессы в период оттаивания (например, перекристаллизация) вызывают такие же повреждения, как и в период замораживания, и присутствие в этот период пептида ТБКУ защищает нейроны от возможных негативных воздействий микрочастиц льда (МКЧЛ). Вероятно, в данных условиях пептид ТЭКУ, может участвовать и в репарационных процессах нейронов.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что пептид ТБКУ не оказывает криопротекторного действия в процессе замораживания, но, возможно, обладает гипометаболическими свойствами, что снижает функциональную активность нейронов, уменьшая чувствительность нейронов к повреждениям, тем самым проявляя нейропротекторный эффект.

Для выяснения причин отсутствия положительного влияния TSKY при использовании его непосредственно при криоконсервации мы мы проанализировали его влияние на характер кристаллизации и формирование MK4J1 при замораживании растворов до -196°С.

5.3. Изучение возможных крнозащитных свойств TSKY

Была проведена видеосъемка процесса замораживания от 20°С до -196°С физиологического раствора с добавлением следующих компонентов: 20% L-15 (Leibowitz); 20% L-15 + TSKY (10 5 M); 20% L-15 + 2M ДМСО; 20% L-15 + TSKY (10"5M) + 2M ДМСО.

Анализ видеоизображений начального этапа кристаллообразования в растворах без пептида (рис. 14а,б) и с добавлением пептида TSKY (105 М) (рис. 14в,г) показал, что TSKY не влиял на характер кристаллизации. Кроме того, присутствие TSKY не смещало значения температурной точки кристаллизации растворов.

При температурах ниже -100°С происходило растрескивание льда (Rabin et al., 2006; Андреев и др., 2009) и формирование МКЧЛ разной формы и размеров в зависимости от состава раствора.

а - 0.1°С б - о.Гс f -196'С е -196' О m 'v«, î 1

в - 12°С г - 1 2°С К!

Рис. 14. Микрочастицы льда в криопротектирующих средах при -196°С:

а) 20% Ь-15 ^ейхда^); б) 20% Ь-15 + ТБКУ (10"5М);

в) 20% Ь-15 + 2М ДМСО; г) 20% Ь-15 + ТБКУ (Ю"5М) + 2М ДМСО. Шкала 100 мкм.

На рис. 14д показано, что при замораживании в физиологическом растворе с 20% 1_-15 формируются МКЧЛ с гранями в виде правильных геометрических фигур с острыми углами (ромбы, треугольники, трапеции), размером от 50 до 100 мкм. Подобную форму и размеры имеют МКЧ льда после замораживания дистиллированной воды и физиологического раствора (Андреев и др., 2009). При замораживании раствора с 20% L-15 и 2М ДМСО наблюдалось формирование округлых и шестиугольных МКЧЛ со сглаженными краями (рис. 14ж). Добавление пептида Т5КУ (10'5М) в эти два раствора не изменяло характера льдообразования (рис. 14е,з).

Отсутствие эффекта пептида Т5КУ на температурную точку кристаллизации растворов, характер начального этапа кристаллизации и формообразование МКЧЛ подтверждает наше предположение, что Т8КУ не является классическим криопротектором. Мы предполагаем, что пептид Т5КУ проявляет нейропротекторные свойства, защищая клетки от механического и осмотического стресса, вызванных рекристаллизацией льда и выравниванием осмотических градиентов во время или после оттаивания. Кроме этого не исключено, что, благодаря этому свойству, Т5КУ может влиять на репарационные процессы в поврежденной ткани.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований мы получили данные, которые свидетельствуют, что после криоконсервации изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. нейроны сохраняются живыми (флуоресцентный анализ Live/Dead) и восстанавливают функциональную активность. Мозг моллюска (1.5 - 2.7 мм) - это кольцо ганглиев, которые содержат ~20000 полифункциональных нейронов и включают богатые вненейрональные области, состоящие из нескольких видов глиальных клеток, длинных аксонов, синаптическпх структур. Криоконсервации таким образом подвергалась интегрированная структура, включающая разнородные элементы.

Эксперименты показали, что в органной культуре после криоконсервации мозга нейроны восстанавливати электрические характеристики (МП, генерация ПД и ПСП) до характерных для этих нейронов значений. Однако, синаптических связей между нейронами зарегистрировано не было. Такого рода повреждения нервной ткани могли происходить в центральных областях ганглиев, в нейропиле, и/или в комиссурах и коннекгивах, соединяющих ганглии. В клеточной культуре удалось показать, что нейроны, выделенные из криоконсервированного мозга, сохраняли способность к регенерации нервных отростков и формированию контактов. На этом основании можно предположить, что при определенных условиях в органной культуре поврежденные области нервной ткани могут быть восстановлены.

Первостепенное значение имеют исследования, направленные на предотвращение криоповреждений путем модификации криозащитных сред. Привлекательно использовать для этих целей природные агенты, участвующие в биохимических механизмах холодо- и морозоустойчивости. Интерес представляют, с нашей точки зрения, те, которые могут снижать уровень метаболизма ткани (или органа), т.к. в гипометаболическом состоянии клетки более устойчивы к стрессовым ситуациям. Предположительно такими свойствами может обладать пептид TSKY (Thr-Ser-Lys-Tyr), выделенный из мозга зимоспящих сусликов Spermophillus undulates (Ziganshin et al., 1994; Kramarova et al., 1996). Нам удалось впервые показать, что пептид TSKY, добавленный в криозащитный раствор на на стадии оттаивания, может проявлять нейропротекторные свойства и оказывать метаболический эффект, увеличивая жизнеспособность ткани мозга моллюска на этапе размораживания. Эти результаты расширяют возможности в усовершенствовании криозащитных сред, которые могут быть использованы для криоконсервации нервной ткани.

выводы

1. Показано, что после криоконсервации изолированного мозга моллюска Ьутпаеа stagnalis Ь. нейроны сохраняют жизнеспособность и электрическую активность (МП, ПД, ПСП) при органотипическом культивировании. Зарегистрированы ответы нейронов криоконсервированного мозга моллюска на аппликацию серотонина.

2. Синаптические связи между идентифицированными нейронами не были зарегистрированы в криоконсервированном мозге, в отличие от контроля. Связи не восстанавливались на протяжении 16 суток органотипического культивирования. Предположено, что причинами отсутствия связей могут быть криоповреждения межклеточных структур в нейропиле и комиссурах.

3. В клеточной культуре показано, что нейроны после криоконсервации сохраняют функциональную активность: формируют нервные отростки и устанавливают контакты друг с другом.

4. Впервые показано нейропротекторное действие пептида ТБКУ, выделенного из мозга зимоспящих животных, на стадии оттаивания криоконсервированного мозга моллюска. При замораживании изолированного мозга моллюска пептид ТБКУ не проявлял криопротекторных свойств.

5. Анализ видеоизображений процесса замораживания до температуры жидкого азота показал, что пептид ТЭКУ не влияет на характер кристаллизации и формообразование МКЧ льда, что подтверждает отсутствие у ТБКУ криопротективных свойств в период замораживания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. H.A. Ивличева, Е.В. Дмитриева, М.А. Костенко, Э.Н. Гахова. Криоконсервированные нейроны моллюска способны к морфологической дифференцировке в культуре in vitroll Биофизика, 49(4), 2004, 710-714.

2. H.A. Ивличева, С.Н. Мякишева, Э.Н. Гахова. Нервная клетка - модель для изучения механизма действия криопротекторов и эффективности криоконсервации // Ветеринарная патология, 1(20), 2007, 42-43.

3. H.A. Ивличева, Л.И. Крамарова, Р.Х. Зиганшнн, В.Г. Цыганова, В В. Рогачевский, Э.Н. Гахова. Влияние пептида Thr-Ser-Lys-Tyr на жизнеспособность изолированных нейронов Lymnaea stagnalis L. //Биологические мембраны, 29(3), 2012,195-199.

4. H.A. Ивличева, Э.Н. Гахова. Культура дифференцированных нейронов взрослого моллюска - альтернативная модель изучения процессов регенерации нервной системы// Биомедищша, 6, 2007, 89-96.

5. С.Н. Мякишева, Н.Ю. Сахарова, Н.А Ивличева. Криоконсервация культивируемых клеток нейробластомы мыши N1E-115 для биомедицинских исследований // Биомедицина, 6, 2007, 153-157.

Статьи в книгах:

6. L.I. Kramarova, N.A. Ivlicheva, R.H. Ziganshin, A.A. Andreev, E.N. Gakhova. The hibernation-related peptide TSKY acts as a neuroprotector in cultured pond snail neurons // Living in a Seasonal World: Thermoregulatory and Metabolic Adaptations, R. Bieber, A. Millesi (Eds.) Springer-Verlag GmbH, Heidelberg, Deutschland, chapter 18,2012, 201-210.

Статьи в сборниках:

7. H.A. Ивличева, И.А. Чистопольский, Э.Н.Гахова. Криоконсервация окологлоточного кольца ганглиев пресноводного моллюска Lymnaea stagnalis L. II Биофизика живой клетки, 9, 2008, 58-60.

8. H.A. Ивличева, В.Г. Цыганова, В.В. Рогачевский, Л.И. Крамарова, Р.Х. Зиганшин, Э.Н. Гахова. Влияние регулятора естественного гипобиоза, пептида TSKY на жизнеспособность изолированных нейронов Lymnaea stagnalis в культуре in vitro IIВ сб. статей международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», г.Пущино, Т.2, 2011, 505-510.

Тезисы:

9. H.A. Ивличева, М.А. Костенко. Способность нейронов моллюска Lymnaea stagnalis L после криоконсервании формировать в культуре in vitro ветвистые отростки // В сб. тезисов VIII международной школы конференции молодых ученых, г. Пущино, 2004, с.83.

10. H.A. Ивличева, Е.В. Дмитриева, М.АКосгенко, Э.Н. Гахова. Изучение жизнеспособности изолированных нейронов моллюска Lymnaea stagnalis L. после криоконсервации изолированного мозга методом культуры клеток in vitro II В сб. тезисов Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина», г. Санкт-Петербург, 2005, с.46.

11. H.A. Ивличева, С.Н Мякишева, М.А. Костенко. Изучение влияния pH среды на сезонную способность формировать отростки нейронами моллюска Lymnaea Stagnalis L. в культуре in vitroll В сб. тезисов IX международной школы конференции молодых ученых, г. Пущино, 2005, с. 116.

12. N.A. Ivlicheva, S.N. Myakisheva, E.N. Gakhova. The neunte regeneration and outgrowth in vitro culture before and after cryopreservation of isolated brain of snail Lymnaea stagnalis L. depending on the medium pH // Simpler Nervous Systems: VIII East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology, September 13-17, thesis of lectures, Kazan, 2006, p. 34.

13. H. А. Ивличева, И. А. Чистопольский. Восстановление функциональных свойств нейронов в культуре in vitro после криоконсервации изолированной нервной системы моллюска Lymnaea stagnalis (-196°С) // В сб. тезисов XI международной школы конференции молодых ученых, г. Пущино, 2007, с.248-249.

14. N.A. Ivlicheva, I.A. Chistopolskiy, E.N. Gakhova. Isolated neurons from cryopreserved (-196 C) snail brain retain viability. // Simpler Nervous Systems: IX East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology, September 9-13/ thesis of lectures, St. Petersburg, 2009, p. 46.

15. H.A. Ивличева, И.А. Чистопольский, Э.Н. Гахова. Восстановление активности нейронов после криоконсерващш изолированной нервной системы моллюска Lymnaea stagnalis (-196 С) // В сб. тезисов XIII международной школы конференции молодых ученых, г. Пущино, 2009, с. 103.

16. H.A. Ивличева, Чистопольский, Э.Н. Гахова. Простая нервная система: анализ жизнеспособности нейронов изолированного мозга Lymnaea stagnalis после криоконсервации (-196 С) //В сб. тезисов III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспиратнов-биологов «Симбиоз-Россия 2010», г.Нижний Новгород, 2010, с. 169-170.

17. H.A. Ивличева, Э.Н. Гахова, В.Г. Цыганова, В.В. Рогачевский, Р.Х. Зиганшин, Л И. Крамарова. Нейропротекторньш эффект пептида TS К.Y при низких и сверхнизких температурах // В сб. тезисов 7го международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, Украина, 2011, с.193-194.

18. Л И. Крамарова, Э.Н. Гахова, Р.Х. Зиганшин, H.A. Ивличева. Эндогенные гипометаболические факторы и их возможное применение при трансплантации и криоконсервации нервной ткани // В сб. тезисов 7го международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, Украина, 2011, с.234-235.

19. H.A. Ивличева, ЛИ. Крамарова, Р.Х. Зиганшин, A.A. Андреев, В.Г. Цыганова, Э.Н. Гахова. Влияние пептида TSKY на жизнеспособность нейронов в культуре после криоконсерващш изолированного мозга пресноводного моллюска Lymnaea stagnalis L. // В сб. тезисов 8го международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, Украина, 2012, с. 179-180.

20. Ивличева H.A., Крамарова Л.И., Андреев A.A., Зиганшин Р.Х., Гахова Э.Н. Нейропротекторньш эффект гипометаболического фактора TSKY на нейроны моллюска при подготовке к криоконсерващш (-196°С) // В сб. тезисов IV Съезда биофизиков России, г.Нижний Новгород, Т.2, 2012, с. 60.

Подписано в печать:

14.01.2013

Заказ № 8067 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ивличева, Наталья Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Криоконсервация. Биофизические аспекты.

1.1.1. Основные этапы криоконсервации.

1.1.2. Причины повреждений клеток при замораживании.

1.1.3. Кристаллизация воды.

1.1.3.1. Кристаллы и микрочастицы льда в процессе замораживания

1.1.3.2. Рекристаллизация.

1.1.4. Режимы замораживания-оттаивания (скорости).

1.1.4.1. Низкие скорости замораживания.

1.1.4.2. Высокие скорости замораживания. Витрификация.

1.1.4.3. Режимы замораживания нервных клеток и ткани.

1.1.5. Протекторы.

1.1.5.1. Основные свойства криопротекторов.

1.1.5.2. Криопротекторы, используемые для защиты нервных клеток и ткани при криоконсервации.

1.1.5.3. Протекторные добавки в криозащитные среды.

1.2. Современное состояние и перспективы криоконсервации нервной ткани.

1.2.1. Криоконсервация эмбриональных нервные клеток и ткани.

1.2.2. Криоконсервация дифференцированной нервной ткани.

1.2.3. Криоконсервация нервных стволовых клеток.

1.2.4. Использование альтернативных объектов для изучения последствий криоконсервации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональная и регенеративная активность нейронов после криоконсервации изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L."

Длительное сохранение жизнеспособной нервной ткани в замороженном состоянии (криоконсервация в жидком азоте, при -196°С) является современной и актуальной проблемой в связи с развитием в последние годы методов трансплантологии в нейромедицине и, соответственно, необходимостью создания запаса нейронального материала в криобанках.

В настоящее время криоконсервация стала обычной процедурой для длительного сохранения многих типов клеток животных, таких как клетки крови, клетки костного мозга, сперматозоиды, клеточные культуры, и др. Успешные протоколы криоконсервирования в основном разработаны для однородных клеточных суспензий (Фуллер и др., 2003; Meryman, 2007; Choi, Bischof, 2010; Seth, 2012). Изолированные ткани плохо переносят низкотемпературную криоконсервацию, а для целых органов эти методы пока не разработаны. Клетки в составе ткани, создавая определенную архитектуру функциональной единицы, более плотно упакованы, чем в клеточных суспензиях, с которыми исследователи чаще всего имеют дело. Гетерогенный клеточный состав нейрональной ткани (разного типа нейроны и глиальные клетки) и экстраклеточная структура, - все вместе могут создавать проблемы при попытке экстраполировать протоколы криоконсервирования с клеточных суспензий на кусочки органов, ткани, нейросферы (Fagy et al., 2004; Pegg, 2007; Paynter, 2008). Одна из таких проблем заключается в том, что экстраклеточные структуры и межклеточные связи могут быть не менее важными объектами криоконсервирования, чем сами клетки, особенно, если они плотно упакованы в структуре ткани (Acker et al., 2000; Müller-Schweinitzer, 2009; Pegg, 2010). Поэтому в настоящее время являются особенно актуальными исследования механизмов криоповреждений и криозащиты нервной ткани как неделимой интегрированной структуры.

Цель и основные задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении последствий криоконсервации на функциональную и регенеративную способность зрелых нейронов на примере криоконсервирования изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L.

В соответствии с целью были поставлены и решены следующие задачи:

3. Исследовать в клеточной культуре выживаемость и регенеративные способности нейронов, выделенных из замороженно-оттаянного мозга моллюска.

4. Выявить характер протективного действия (крио- или нейро-протекторное) пептида Thr-Ser-Lys-Tyr (TSKY) выделенного из мозга зимоспящих сусликов Spermophillus undulates. Определить его влияние на выживаемость и регенеративные способности нейронов в культуре на разных этапах криоконсервирования.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Ивличева, Наталья Александровна

выводы

1. Показано, что после криоконсервацин изолированного мозга моллюска Ьутпаеа stagnalis Ь. нейроны сохраняют жизнеспособность и электрическую активность (МП, ПД, ПСП) при органотипическом культивировании. Зарегистрированы ответы нейронов криоконсервированного мозга моллюска на аппликацию серотонина.

3. В клеточной культуре показано, что нейроны после криоконсервациц сохраняют функциональную активность: формируют нервные отростки и устанавливают контакты друг с другом.

4. Впервые показано нейропротекторное действие пептида Т8КУ, выделенного из мозга зимоспящих животных, на стадии оттаивания криоконсервированного мозга моллюска. При замораживании изолированного мозга моллюска пептид Т8КУ не проявлял криопротекторных свойств.

5. Анализ видеоизображений процесса замораживания до температуры жидкого азота показал, что пептид ТБКУ не влияет на характер кристаллизации и формообразование МКЧ льда, что подтверждает отсутствие у ТБКУ криопротективных свойств в период замораживания.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований мы получили данные, которые свидетельствуют, что после криоконсервации изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. нейроны сохраняются живыми (флуоресцентный анализ Live/Dead) и восстанавливают функциональную активность. Размеры мозга моллюска, состоящего из ганглиев, соединенных комиссурами, не превышают 1.5 - 2.7 мм. Тем не менее, это орган, состоящий из -20000 полифункциональных нейронов и включающий богатые вненейропальные области, состоящие из нескольких видов глиальных клеток, длинных аксонов, синаптических структур* Криоконсервации таким образом подвергалась интегрированная структура, включающая разнородные элементы.

Мы изучили электрические характеристики нейронов в органной культуре до и после криоконсервации изолированного мозга моллюска. На протяжении 16 суток культивирования у 86,3 % нейронов из некриоконсервированных ганглиев (контроль) и 84% нейронов криоконсервированных (опыт) сохранялась электрическая активность (МП, ПД, частота генерации ПД, ПСП), характерная для нейронов данного вида моллюска. В обеих группах ганглиев зарегистрированы ответы нейронов на аппликацию серотонина (3-10° М).

Однако, после криоконсервации в более чем 20 попытках, обнаружить синаптические связи между идентифицированными нейронами локализованных в разных ганглиях не удалось. В контроле они всегда регистрировались. Чтобы исключить возможное токсическое действие ДМСО мы инкубировали ганглии в среде с 2 М ДМСО без замораживания, и результаты показали отсутствие эффекта ДМСО на функционирование синаптических связей. Мы предположили, что отсутствие синаптических связей в заморожено-оттаянных ганглиях, является следствием криоповреждений межклеточных структур в нейропиле и комиссурах, и связано с физическими процессами, сопровождающими криоконсервацию.

К настоящему времени установлено, что в процессе замораживания и оттаивания в основе многочисленных повреждающих факторов лежит внутриклеточное формирование льда (Mazur, 1965, 1977). Вероятность внутриклеточного замораживания контролируется скоростью охлаждения и проницаемостью клеток к воде. Но это в полной мере относится к однородной суспензии клеток, концентрация которых в растворе такова, что клетки находятся на достаточно большом расстоянии друг от друга (Mazur, 1985, Pegg, Diaper, 1983). Попытки использовать протоколы криоконсервации, разработанные для клеточных суспензий, безуспешны для замораживания тканей и органов (Pegg, 2010). Прежде всего, здесь имеет значение так называемый «эффект упаковки», который наглядно продемонстирован на примере замораживания взвеси эритроцитов (Рамазанов, Бондаренко, 2009) и ядерных клеток (De Loecker et al, 1998). Авторы показали, что в зависимости от плотности упаковки клеток и от скорости замораживания и отогревания образование кристаллов льда может происходить внутри клеток во время замораживания, снаружи во время оттаивания вследствие рекристаллизации льда. В обоих случаях кристаллизация (как внутри-, так и межклеточная) оказывает повреждающее действие. Эти наблюдения могут иметь отношение к криоконсервации тканей и органов. Кроме этого, криоконсервация ткани, и особенно органов, осложняется еще и тем обстоятельством, что они состоят из гетерогенной (а не однородной) популяции клеток, и разного рода межклеточных структур и межклеточных связей (Pegg et al, 2006; Taylor, 2006). Именно экстраклеточный матрикс может оказывать большое влияние на процесс замораживания ткани/органа, в связи с особенностями формирования льда в клетках и межклетниках (Taylor, Pegg, 1983; Müller-Schweinitzer Е, 2009; Pegg, 2010).

Мы показали, что в клеточной культуре нейроны, выделенные из криоконсервированного мозга, сохраняли способность к регенерации

70 нервных отростков и формированию контактов. На этом основании можно предположить, что при определенных условиях в органной культуре поврежденные области нервной ткани могут быть также восстановлены.

Таким образом, успех криоконсервации ткани/органов требует развития методов, которые полностью предотвращают формирование льда, или как альтернатива, предотвращают повреждения, либо способствуют репарации клеточных структур, поврежденных при замораживании-оттаивании.

Исследования, направленные на предотвращение криоповреждений путем модификации криозащитных сред, имеют большое значение. Так например, результаты криоконсервации нейросфер, которые можно рассматривать как модели ткани, могут быть улучшены предварительной обработкой или после оттаивания факторами роста, антиоксидантами или ингибиторами апоптоза (Mattson, Rychlik, 1990; Milosevic et al., 2005).

Привлекательно использовать для этих целей природные агенты, участвующие в биохимических механизмах холодо- и морозоустойчивости (Kramarova et al., 2004; Крамарова и др., 2009). Интерес представляют, с пашей точки зрения, те, которые могут снижать уровень метаболизма ткани (или органа), т.к. в гипометаболическом состоянии клетки более устойчивы к стрессовым ситуациям. Предположительно такими свойствами может обладать пептид TSKY (Thr-Ser-Lys-Tyr), выделенный из мозга зимоспящих сусликов Spermophillus undulates (Ziganshin et al., 1994; Kramarova et al., 1996). Изучение влияния пептида TSKY на точку кристаллизации растворов, характер начала кристаллизации и формирование микрочастиц льда при температуре жидкого азота с помощью криомикроскопии не выявило у этого вещества криопротекторных свойств.

Однако, нам удалось впервые показать, что пептид TSKY, добавленный в криозащитный раствор на стадии оттаивания, может проявлять нейропротекторные свойства и оказывать гипометаболический эффект,

71 увеличивая жизнеспособность ткани мозга моллюска на этапе размораживания. Эти результаты расширяют возможности в усовершенствовании криозащитных сред, которые будут использованы для криоконсервации нервной ткани.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ивличева, Наталья Александровна, Пущино

1. Андреев A.A., Садикова Д.Г, Лаббе К, Ананьев В.И, Курников A.JT. Влияние липидов на образование льда при замерзании криозащитных растворов. //Биофизика. 2008. Т. 53(4). С. 598-601

2. Андреев A.A., Садикова Д.Г, Гахова Э.Н, Пашовкин Т.Н., Тихомирова A.M. Замерзание криозащитных растворов и выживание спермиев рыб при криоконсервации. // Биофизика. 2009. Т. 54(5). С. 869875

3. Бабийчук Г.А, Ломако В.В, Шуляк Л.И, Шило A.B., Ломакин И.И. Функциональное состояние фрагментов эмбриональной нервной ткани после гипотермического хранения и трансплантации реципиенту. // Проблемы криобиологии. 2000. №2. С. 40-48

4. Белоус A.M., Грищенко В.И. Криобиология. 1994. Киев: Наукова Думка. 432с.

5. Белоус А. М, Гордиенко Е.А, Розанов Л.Ф. Замораживание и криопротекция. // Биохимия мембран. 1987. М.: Высш.шк. 80с.

6. Виленчик М.М. Сколько лет можно хранить зародышевые клетки в криоконсервированном состоянии без существенного повреждения их генома. // Консервация генетических ресурсов. 1983. Пущино. ОНТИ ПНЦ РАН. 21с.

7. Гахова Э.Н, Чекурова Н.Р, Кислов А.Н, Вепринцев Б.Н. Гигантские нейроны сохраняют жизнеспособность после глубокого замораживания мозга пресноводного моллюска Lymnaea stagnalis L. // Криобиология. 1989. №1. С. 19-23

8. Гахова Э.Н. Корн О.М, Буцук C.B. Замораживание личинок усоногого рака Baianus impovisus до температуры -196°С. // Биология моря. Т.4. С. 62-65

9. Гелетюк В.И., Орлова A.A., Вепринцев Б.Н. Электрическая активность нейронов изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. при переживании в течение двух месяцев в различных питательных средах. // ВИНИТИ. 1970. № 2899-71

10. Дмитриева Е.В., Структурно-функциональные изменения нейронов моллюска Lymnaea stagnalis L. после криоконсервации. // Автореф. дис . канд. биол. наук. 2004. Пущино. 22с.

11. Дмитриева Е.В., Мошков Д.А., Гахова Э.Н. Ультраструктурные изменения нейрона МПЗ моллюска Lymnaea stagnalis L. после криоконсервации изолированного мозга. // Цитология. 2006. Т. 48(6). С. 480-485

12. Дьяконова Т.Л., Вепринцев Б.Н., Особенности структурной и функциональной организации и метаболической активности нейронов прудовика. //ВИНИТИ. 1969. №816-69

13. Жадин В.И. Моллюски пресных вод СССР. 1952. М.: Изд-во акад. наук СССР. 376с.

14. Игнатьев Д.А., Загнойко В.И., Сухова Г.С., Баканева В.Ф., Сухов В.П. Биологически активные субстанции в тканях гибернирующих животных. //Ж. общ. биол. 1995. Т. 56(4). С. 450-469

15. Игнатьев Д. А., Воробьёв В.В., Зиганшин Р.Х. Влияние синтетического аналога пептида TSKY, выделенного из мозга зимнеспящего суслика, на крыс и мышей. // Высш. нерв. деят. 2005(а). Т. 55(1). С. 84-90

16. H.A. Ивличева, Э.Н. Гахова. Культура дифференцированных нейронов взрослого моллюска альтернативная модель изучения процессов регенерации нервной системы. // Биомедицина. 2007. Т. 6. С. 89-96

17. Каранова М.В., Цветкова Л.И., Межевикина Л.М., Григорьев П.А. Антифризные гликопротеины как дополнительные компоненты криозащитных сред. // Цитология. 1999. Т.41(3/4). С. 275-276

18. Кислов А.Н., Пластинкин Д.В. Действие некоторых криопротекторов на мембрану нейронов моллюска. // Биофизика живой клетки. 1994. Т.6. С. 118-120

19. Костенко М.А. Внутриклеточная регуляция дифференцировки и регенерации нейронов в культуре: Дис. . д-ра биол. наук. Пущино. 1985. 360с.

20. Костенко М.А. Выделение одиночных нервных клеток из мозга моллюска Lymnaea stagnalis для дальнейшего культивирования их in vitro. //Цитология. 1972. Т. 14(10). С. 1274-1278

21. Костенко М.А. Цитофизиологические характеристики изолированних нейронов моллюска Lymnaea stagnalis in vitro: Автореф. дис . канд. биол. наук. Пущино. 1973. 26с.

22. Костенко М.А., Вепринцев Б.Н., Культивирование нервной ткани взрослого моллюска Lymnaea stagnalis L. в органных культурах in vitro. 11 Цитология. 1972. Т. 14(11). С. 1392-1397

23. Костенко М.А., Смолихина Т.П. Метод получения изолированных нейронов моллюсков с высокой регенерационной активностью: A.c. СССР, 913254 Б.И. 1982. № 10.

24. Крамарова Л.И., Зиганшин Р.Х., Гахова Э.Н. Эндогенныегипометаболические-гипотермические факторы и их возможное применение для жизни в холоде. // Биоорганическая химия. 2009. Т. 35(5). С. 597-609

25. Межевикина JIM., Каранова М.В. Использование антифризных гликопротеинов при замораживании в жидком азоте ранних эмбрионов мышей. // Известия РАН. Серия биологич.1995. Т. 2. С. 172-177

26. Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Проявление и устранение эффекта «упаковки» в средах с непроникающими и проникающими криопротекторами. // Проблемы криобиологии. 2009. Vol. 19 (3). Р. 312323

27. Сотников О.С. Статика и структурная кинетика живых асинаптических дендритов. 2008. СПб.: Наука. 397с.

28. Фуллер Б., Грин К., Грищенко В.И. Криоконсервирование для создания банка клеток: современные концепции на рубеже XXI столетия // Проблемы криобиологии. 2003. Т. 2. С. 62-83

29. Цуцаева A.A., Попов В.Г., Сыткник K.M. Криобиология и биотехнология. 1987. Наукова Думка. Киев. 216 с.

30. Чекурова Н.Р. Действие криопротекторов на электрические характеристики клеточной мембраны: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Москва. 1992. 16с.

31. Чекурова Н.Р., Кислов А.Н., Вепринцев Б.Н. Действие некоторых криопротекторов на ионные каналы мембраны нейронов. // Криобиология. 1987. №1. С. 21-25

32. Чекурова Н.Р. Использование электрофизиологического метода для изучения механизмов криоповреждений и способов криозащиты. // Биофизика живой клетки. 1994. Т.6. С. 121-126

33. Acker J.P., McGann L.E. Cell-cell contact affects membrane integrityafter intracellular freezing. // Cryobiology. 2000. Vol. 40(1). P. 54-63

34. Amorim C.A., Curaba M., Van Langendonckt A., Dolmans M.M., Donnez J., Gritti A., Galli R., Vescovi A.L. Vitrification as an alternative means of cryopreserving ovarian tissue. // Reprod. Biomed. Online. 2011. Vol. 23(2). P. 160-186

35. Asher I.M. Effects of DMSO on the electrical response of Homarus nerves frozen to -20 °C, -30 °C and at room temperature. // Cryobiology. 1972. Vol. 9(3). P. 153-162

36. Baudot A., Alger L., Boutron P. Glass-forming tendency in the system water-dimethyl sulfoxide. //Cryobiology. 2000. Vol. 40(2). P. 151-158

37. Bell H.J., inoue T., Shum K., Luk C., Syed N.I. Peripheral oxygen-sensing cells directly modulate the output of an identified respiratory central pattern generating neuron. // Eur. J. Neurosci. 2007. Vol. 25(12). P. 3537-3550

38. Benjamin P.R., Winlow W. The distribution of three wide-acting inputs to identified neurons in the isolated brain of Lymnaea stagncilis. II Comp. Biochem. Physiol. 1981. Vol. 70A. P. 293-307

39. Ben-Hur T., Tdelson M., Khaner H., Pera M., Reinhartz E., Ttzik A., Reubinoff B.E. Transplantation of human embryonic stem cell-derived neural progenitors improves behavioral deficit in Parkinsonian rats. // Stem. Cells. 2004. Vol. 22. P. 1246-1255.

40. Bithell A., Williams B.P. Neural stem cells and cell replacement therapy: making the right cells.//Clinical Science. 2005. Vol. 108. P. 13-22

41. Bray D. Membrane biophysics: the dynamics of growing axons. // Curr. boil. 1996. Vol. 6(3). P. 241-243

42. Brunei J-F., Pellerin L., Magostretti P., Villemure J-G. Cryopreservation of human brain tissue allowing timely production of viable human brain cells for autologous transplantation. // Cryobiology. 2003. Vol. 47(2). P. 179-183

43. Brundin P., Karlsson J., Emgard M., Schierle G.S., Hansson O., Petersen A., Castilho R.F. Improving the survival of grafted dopaminergic neurons: a review over current approaches. // Cell Transplant. 2000. Vol. 9(2). P. 179-195

44. Cai Ch., Grabel L. Directing the Differentiation of Embryonic Stem Cells to Neural Stem Cells. // Develop. Dynam. 2007. Vol. 236. P. 3255-3266

45. Choi J., Bischof J.C. Review of biomaterial thermal property measurements in the cryogenic regime and their use for prediction of equilibrium and non-equilibrium freezing applications in cryobiology. // Cryobiology. 2010. Vol. 60(1). P. 52-70

46. Collier T.J., Gash D.M., Sladek J.R.Jr. Transplantation of norepinephrine neurons into aged rats improves performance of a learned task. // Brain. Res., 1988. Vol. 448(1). P. 77-87

47. Collier T.J., Gallagher M.J., Sladek C.D. Cryopreservation and storage of embryonic rat mesencephalic dopamine neurons for one year: comparison to fresh tissue in culture and neural grafts. // Brain. Res. 1993. Vol. 623(2). P. 249256

48. Decherchi P., Lammari-Barreault N., Cochard P., Carin M., Rega P., Pio J., Pellissier J-F., Ladaique P., Novakovitch G., Gauthier P. CNS Axonal Regeneration within Peripheral Nerve Grafts Cryopreserved by Vitrification:

49. Cytological and Functional Aspects. // Cryobiology. 1997. Vol. 34. P. 214-239

50. De Loecker W., Koptelov V.A., Geshenko V.I., De Loecker P. Effects of cell concentration on viability and metabolic activity during cryopreservation. // Cryobiology. 1998. Vol. 37. P. 103-109

51. Dinsmore J.H. Treatment of neurodegenerative diseases with neural cell transplantation. // Expert. Opin. Investig. Drugs. 1998. Vol. 7(4). P. 527-534

52. Fahy G.M., MacFarlane D.R., Angell C.A., Meryman FI.T. Vitrification as an approach to cryopreservation. // Cryobiology 1984. Vol. 21. P. 407-426

53. Fahy, G.M. The relevance of cryoprotectant «toxity» to cryobiology. // Cryobiology. 1986a. Vol. 23. P. 1-13

54. Fahy, G.M. Vitrification: A new approach to organ cryopreservation. In «Progress in Clinical and Bological Research. Transplantation: Approaches to Graft Rejection» (T. H. Meryman, Ed.). 1986. A.R. Liss. New York. Vol. 224. P. 305-335

55. Fahy G.M., Wowk B., Wu J., Paynter S. improved vitrification solutions based on the predictability of vitrification solution toxicity. // Cryobiology. 2004a. Vol. 48. P. 22-35

56. Fahy G.M., Wowk B., Wu J., Phan J, Rasch Ch., Chang A., Zendejas E., Cryopreservation of organs by vitrification; perspectives and recent advances // Cryobiology. 2004. V. 48(2). P. 157-178

57. Fahy GM. Cryoprotectant toxicity neutralization. // Cryobiology. 2010 Vol. 60(3 Suppl). P. 45-53

58. Fujikawa S., Steponkus P. L. Plasma membrane ultrastructural changesby vitrification procedures. // Jpn. J. Freezing Drying. 1991. Vol. 37. P. 25-29

59. Gewartowska M., Olszewski W.L. The new approaches to preservation of graft cell integrity in preservation for transplantation. // Ann Transplant. 2005. Vol. 10(4). P.6-10

60. Gritti A., Galli R., Vescovi A.L. Clonal analyses and cryopreservation of neural stem cell cultures. //Methods Mol Biol. 2008. Vol. 438. P. 173-184

61. Ha S.Y., Jee B.C., Suh C.S., Kim H.S., Oh S.K., Kim S.H., Moon S.Y. Cryopreservation of human embryonic stem cells without the use of a programmable freezer. // Hum. Reprod. 2005. Vol. 20. P. 1779-1785

62. Hancock C.R., Wetherington J.P., Lambert N.A., Condie B.G. Neuronal differentiation of cryopreserved neural progenitor cells derived from mouse embryonic stem cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. Vol. 271 P. 418-421

63. Heng B.C., Kuleshova L.L., Bested S.M., Liu II., Cao T. The cryopreservation of human embryonic stem cells. // Biotechnol. Appl. Biochem. 2005. Vol. 41 P. 97-104

64. I-Iiggins A.Z., Cullen D.K., LaPlaca M.C., Karlsson J.O. Effects of freezing profile parameters on the survival of cryopreserved rat embryonic neural cells. //J. Neurosci. Methods. 2011 Vol. 201(1) P. 9-16

65. Ishiguro H, Kataori A, Nozawa M. Three-dimensional microscopic behavior of ice crystals and cells during directional solidification of muscle tissues treated with DMSO // Cryobiology. 2009. Vol. 59. P. 410

66. Ishine N, Rubinsky B, Lee C.Y. Transplantation of mammalian livers following freezing: vascular damage and functional recovery. // Cryobiology. 2000. Vol. 40(1). P. 84-89

67. Jensen S, T. Sorensen, A.G. Moller, J. Zimmer. Intraocular grafts of fresh and freeze-stored rat hippocampal tissue: a comparison of survivability and histological and connective organization. // J. Comp. Nerol. 1984. Vol. 227. P. 558-568

68. Kuleshova L.L, Goulc S.S, Hutmacher D.W. Vitrification as a prospect for cryopreservation of tissue-engineered constructs. // Biomaterials. 2007. Vol.28. P. 1585-1596

69. Lane M., Maybach J.M., Gardner D.K. Addition of ascorbate during cryopreservation stimulates subsequent embryo development. // Human Reproduction. 2002. Vol. 17(10). P. 2686-2693

70. Lawson A., Ahmad H., Sambanis A. Cytotoxicity effects of cryoprotectants as single-component and cocktail vitrification solutions. // Cryobiology. 2011. Vol. 62. P. 115-122

71. Lindvall O., Bjorlclund A. Cell replacement therapy: helping the brain to repair itself. //NeuroRx. 2004. Vol. 1(4). P. 379-381

72. Luyet B.J. The vitrification of organic colloids and protoplasm. // Biodinamica. 1937. Vol. 29. P. 1-14

73. Luyet B., Gonzales F. Growth of nerve tissue after freezing in liquid nitrogen. //Biodynamica. 1953.V. 7, p. 171-173.

74. Ma X.H., Shi Y., Hou Y., Liu Y., Zhang L., Fan W.X., Ge D., Liu T.Q., Cui Z.F. Slow-freezing cryopreservation of neural stem cell spheres with different diameters. // Cryobiology. 2010. Vol. 60(2). P. 184-191

75. Magoski N.S., Bulloch A.G.M. Dopamine activates two different receptors to produce variability in sign at an identified synapse. // J.Neurophys. 1999. Vol. 81(3). P. 1330-1340

76. Meryman H.T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. // Transfusion. 2007. Vol. 47(5). P.935-945

77. Martinez-Paramo S., Barbosa V., Perez-Cerezales S., Robles V., Herraez M.P. Cryoprotective effects of antifreeze proteins delivered into zebrafish embryos. // Cryobiology. 2009. Vol. 58(2). P. 128-133

78. Matthes G., Hubner U., Granz M., Schutt M., Hackensellner H.A. Antioxidants increase the cryoresistance of GM-CFC. // Folia Haematologica. 1987. Vol. 114(4). P. 482-483.

79. Mattson M.P., Kater S.B. Isolated hippocampal neurons in cryopreserved long-term cultures: development of neuroarchitecture and sensitivity to NMDA. // Int. J. Dev. Neurosci. 1988. Vol. 6. P. 439-452

80. Mattson M.P., Rychlik B. Cell culture of cryopreserved human fetal cerebral cortical and hippocampal neurons: neuronal development and responses to trophic factors. // Brain Res. 1990. Vol. 522. P. 204-214

81. Mazur P. Causes of injury in frozen and thawed cells. // Fed. Proc. 1965. Vol. 24. P. 175

82. Mazur P. Cryobiology: the freezing of biological systems // Science. 1970. Vol. 168(3933). P. 939-949

83. Mazur P. The role of intracellular freezing in the death of cells cooled at supraoptimal rates. // Cryobiology. 1977. Vol. 14. P. 254.

84. Mazur P., Rail W.F., Rigopoulos N. The relative contributions of the fraction of unfrozen water and of salt concentration to the survival of slowly frozen human erythrocytes. // Biophys. J. 1981. Vol. 36. P. 653

85. Mazur P., Cole K.W. Influence of cell concentration on the contribution of unfrozen fractions and salt concentration to the survival of slowly frozen human erythrocytes. // Cryobiology/ 1985. Vol. 22. P. 509-536

86. Mazur P. Equilibrium quasi-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos // Cell Biophysics. 1990. Vol. 17. P. 53-92

87. Milosevic J., Storch A., Schwarz J. Cryopreservation does not affect proliferation and multipotency of murine neural precursor cells. // Stem Cells. 2005. Vol. 23. P. 681-688

88. Mori S., Choi J., Devireddy R.V., Bischof J.C. Calorimetric measurement of water transport and intracellular ice formation during freezing in cell' suspensions. // Cryobiology. 2012 Vol. 65(3). P. 242-255

89. Muir J.K., Raghupathi R., Saatman K.E., Wilson C.A., Lee V.M.,

90. Trojanowski J.Q. Terminally differentiated human neurons survive and integrate following transplantation into the traumatically injured rat brain. // J. Neurotrauma. 1999. Vol. 16. P. 403-414

91. Muldrew K., McGann L.E. The osmotic rupture hypothesis of intracellular freezing injury. // Biophysical Journal. 1994. Vol. 66. P. 532-541

92. Miiller-Schweinitzer E. Cryopreservation of vascular tissues. // Organogenesis. 2009. Vol. 5(3). P. 97-104

93. Murthy S.S.N. Some Insight into the Physical Basis of the Cryoprotective Action of Dimethyl Sulfoxide and Ethylene Glycol. // Cryobiology. 1998. Vol. 36(2). P. 84-96

94. Negishi T., Ishii Y., Kawamura S., Kuroda Y., Yoshikawa Y. Cryopreservation of brain tissue for primary culture. // Exp.Anim. 2002. Vol. 51(4). P. 383-390

95. Neronov A.J., Mihailova-Boiadjieva A. Cryopreservation of rabbit cornea with polyethylene oxide-400. A scanning electron microscopy study // Cryo-Letters. 1989. Vol. 10. P. 279-288

96. Noday D.A., Steif P.S., Rabin Y. Viscosity of cryoprotective agents near glass transition: a new device, technique, and data on DMSO, DP6, and VS55 // Exp. Mech. 2009 Vol. 49(5). P. 663-672

97. Otto F., Gortz P., Fleischer W., Siebler M. Cryopreserved rat cortical cells develop functional neuronal networks on microelectrode arrays. // J. Neurosci. Methods. 2003. Vol. 128. P. 173-81

98. Pascoe J.E., The survival of the rat's superior cervical ganglion after cooling to -76 °C. //Proc.R. Soc. Ser. 1957. Vol. B(147). P. 510-519

99. Pasic M., De Sa Faria Lj. Effects of cryoprotective agents and freezing on abdominal ganglia of Aplysia // Cryobiology. 1979. Vol. 16(4). P. 390-400

100. Paynter S.J. Principles and practical issues for cryopreservation of nervecells. // Brain Res Bull. 2008. Vol. 75(1). P. 1-14

101. Pegg D.E. Ice crystals in tissues and organs. // In: The Biophysics of Organ Cryopreservation. D.E. Pegg, A.M. KarowJr. (Eds.). Plenum Publishing Corporation. 1978. P. 117-136

102. Pegg D.E., Diaper M.P. The packing effect in erythrocyte freezing. // Cryo-letters. 1983. Vol. 4. P. 129-136

103. Pegg D.E., Wang L., Vaughan D., Hunt C.J. Cryopreservation of articular cartilage. Part 2: mechanisms of cryoinjury. // Cryobiology. 2006.Vol. 52. P. 347-359

104. Pegg D.E. Principles of cryopreservation. // Methods Mol Biol. 2007. Vol. 368. P. 39-57

105. Pegg D.E. The relevance of ice crystal formation for the cryopreservation of tissues and organs. // Cryobiology. 2010. Vol. 60(3 Suppl). P. 36-44

106. Pichugin Y., Fahy G.M., Morin R. Cryopreservation of rat hippocampal sliccs by vitrification. // Cryobiology. 2006. Vol. 52. P. 228-240

107. Poncet J.M., Lebel J.M. Influence of cryoprotective agent and cooling rate on frozen and thawed hemocytes from the Mollusk Haliotis tuberculata. // Cryobiology. 2003 Vol. 47(2). P. 184-189

108. Rabin Y., Bell E. Thermal expansion measurements of cryoprotective agents. Part II: measurements of DP6 and VS55, and comparison with DMSO. //Cryobiology. 2003. Vol. 46(3). P. 264-270

109. Rabin Y., Steif P.S., Hess K.C., Jimenez-Rios J.L., Palastro M.C. Fracture formation in vitrified thin films of cryoprotectants. // Cryobiology. 2006. Vol. 53. P. 75-95

110. Rahman A.S., Parvinjah S., Hanna M.A., Helguera P.R., Busciglio J. Cryopreservation of cortical tissue blocks for the generation of highly enriched neuronal cultures. //J. Vis. Exp. 2010. Vol. 11(45). P. 2384

111. Rail W. F. Factors affecting the survival of mouse embryo cryopreserve by vitrification. // exobiology. 1987. Vol. 24. P. 367-402

112. Reynolds B.A., Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. // Science. 1992. Vol. 255. P. 1707-1710

113. Robbins R.J., Torres-Alemán I., Leranth C., Bradberry C.W., Deutch A.Y., Welsh S., Roth R.I I., Spenser D., Redmond E., Naftolin F. Cryopreservation of human brain tissue. // Exp. Neurology. 1990. Vol. 107. P. 208-213

114. Rubinsky B., Arav A., DeVries A.L. The cryoprotective effect of antifreeze glycopeptides from Antarctic fishes. // Cryobiology. 1992. Vol. 29. P. 69-79.

115. Sauer H., Frodl E.M., Kupsch A., ten Bruggencate G., Oertel W.H. Cryopreservation, survival and function of intrastriatal fetal mesencephalic grafts in a rat model of Parkinson's disease. // Exp. Brain Res. 1992. Vol. 90. P. 54-62

116. Sautter J., Strecker S., Kupsch A., Oertel W.H. Methylcellulose during cryopreservation of ventral mesencephalic tissue fragments fails to improve survival and function of cell suspension grafts. // J. Neurosci. Methods. 1996. Vol. 64(2). P. 173-179

117. Schock S.C., Jolin-Dahel K.S., Schock P.C., Theiss S., Arbuthnott G.W., Garcia-Munoz M., Staines W.A. Development of dissociated cryopreserved rat cortical neurons in vitro. //Neurosci Methods. 2012. Vol. 205(2). P. 324-333

118. Seki S., Mazur P. The temperature and type of intracellular ice formation in preimplantation mouse embryos as a function of the developmental stage. // Biol. Reprod. 2010. Vol. 82(6). P. 1198-1205

119. Sengoku R. The current state of the New York Brain Bank and a proposal for the establishment of the brain bank network in Japan. // Brain Nerve. 2010. Vol. 62(10). P. 1035-1042

120. Seth G. Freezing mammalian cells for production of biopharmaceuticals. //Methods. 2012. Vol. 56(3). P. 424-431

121. Sharon J. Paynter. Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells. // Brain Research Bulletin. 2008. Vol. 75. P. 1-14

122. Shear D.A., Tate M.C., Archer D.R., Hoffman S.W., Hulce V.D., Laplaca M.C., Stein D.G. Neural progenitor cell transplants promote long-term functional recovery after traumatic brain injury. // Brain Res. 2004. Vol. 1026(1). P. 11-22

123. Silani V., Pizzuti A., Strada O., Falini A., Buscaglia M., Scarlato G. Human neuronal cell viability demonstrated in culture after cryopreservation. // Brain Res. 1988. Vol. 473. P. 169-174

124. Sinclair B.J., Renault D. Intracellular ice formation in insects: unresolved after 50 years? // Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 2010. Vol. 155(1). P. 14-18

125. Spencer G.E, Lukowiak K, Syed N. I. Transmitter-receptor interactions between growth cones of identified Lymnaea neurons determine target cell selection in vitro. // J. of Neurosc. 2000. Vol. 20(21). P. 8077-8086

126. Spindler R, Rosenhahn B, Hofmann N, Glasmacher B. Video analysis of osmotic cell response during cryopreservation. // Cryobiology. 2012. Vol. 64(3). P. 250-260

127. Steif P.S, Noday D.A, Rabin Y. Can thermal expansion differences between cryopreserved tissue and cryoprotective agents alone cause cracking? // Cryo Letters. 2009. Vol. 30(6). P. 414-421

128. Sweet J.W, Paramore C.G, Turner D.A. Quantitative estimation of cryopreservation viability in rat fetal hippocampal cells. // Exp Neurol. 1994. Vol. 129(2). P. 330-334

129. Syed N.I, Bulloch A.G, Lukowiak K. In vitro reconstruction of the respiratory central pattern generator of the mollusk Lymnaea II Science. 1990. Vol. 250. P. 282-285

130. Syed N.I, Winlow W. Coordination of locomotor and cardiorespiratory networks of Lymnaea stagnalis by a pair of identified interneurones. // J. Exp. Biol. 1991. Vol. 158. P. 37-62

131. Sorensen T, Jensen S, Moller A, Zimmer J. Intracephalic transplants of freeze-stored rat hippocampal tissue. // J. Comp. Neurol. 1986. Vol. 252. P. 468-482

132. Tan F.C., Lee K.H., Gouk S.S., Magalhaes R., Poonepalli A., Hande M.P., Dawe G.S., Kuleshova L.L. Optimization of cryopreservation of stem cells cultured as NSC spheres: comparison between vitrification. // Cryo Letters. 2007. Vol. 28. P. 445-460

133. Taylor M.J. Biology of Cell Survival in the Cold: The Basis for Biopreservation of Tissues and Organs. Ch 2. // In: Baust, J.G., and Baust, J.M. (eds). Advances in Biopreservation. Boca Raton. CRC Taylor &Francis. 2006. P. 15-62

134. Taylor M.J., Pegg D.E. The effect of ice formation on the function of smooth muscle tissue stored at -21°C or -60°C. // Cryobiology. 1983. Vol. 20. P. 36-40

135. Toner M., Cravalho E.G., Stachecki J., Fitzgerald T., Tompkins R.G., Yarmuch M.L., Armant D.R. Nonequilibrium freezing of one-cell mouse embryos. //Biophys. J. 1993. Vol. 64. P. 1980-1921

136. Trad F.S., Toner M., Biggers J.D. Effects of cryoprotectants and iceseeding temperature on intracellular freezing and survival of human oocytes. // Hum. Reprod. 1999. Vol. 14(6). P. 1569-1577

137. Vasudevan A., Bhide P.G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. // Cell Adh. Migr. 2008 Vol. 2(3). P. 167-169

138. Walker P.A., Shah S.K., Harting M.T., Cox Jr.C.S. Progenitor cell therapies for traumatic brain injury: barriers and opportunities in translation. // Dis. Model. Mech. 2009. Vol. 2. P. 23-38

139. Ware C., Nelson A.M., Blau C.A. Controlled-rate freezing of human ES cells. //BioTechniques. 2005. Vol. 38. P. 879-883

140. Wildering W. C., Hermann P. M., Bulloch A.G.M. Lymnaea Epidermal Growth Factor Promotes Axonal Regeneration in CNS Organ Culture. // J. of Neurosc. 2001. Vol. 21(23). P. 9345-9354

141. Wong R.G., Hadley R.D., Kater S.B., Hauser G.C. Neurite outgrowth in molluscan organ and cell cultures: the role of conditioning factor (s). // The J. of Neuros. 1981. Vol. 1(9,). P. 1008-1021

142. Wowk B., Leitl E., Rasch C.M. Vitrification enhancement by synthetic ice blocking agents. // Cryobiology. 2000. Vol. 40. P. 228-236

143. Yavin S., Arav A. Measurement of essential physical properties of vitrification solutions. // Theriogenology. 2007. Vol. 67. P. 81-89

144. Yoshimoto Y., Date I., Ohmoto T. Improved cryopreservative medium suitable for the freeze-storage and transplantation of fetal neural tissues. // Res. Neurol. Neurosci. 1993. Vol. 6. P. 73-81

145. Younis A.I., Rooks B., Khan S., Gould K.G. The effects of antifreeze peptide III (AFP) and insulin transferrin selenium (ITS) on cryopreservation of chimpanzee {Pan troglodytes) spermatozoa. // J. of Andrology. 1998. Vol. 19(2). P. 207-214

146. Zachariassen K.E. Physiology of cold tolerance in insects. // Physiological Reviews. 1985. Vol. 65. P. 799-832

147. СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ1. ДМСО диметилсульфоксид1. ЭГ этиленгликоль1. ФА формамид1. НС нервная система

148. НСК нервные стволовые клетки

149. НПК нервные прогениторные клетки

150. Л/П БГ левый и правый буккальные ганглии

151. Л/П ЦеГ правый и левый церебральные ганглии

152. Л/П ПеГ левый и правый педальные ганглии

153. Л/П ПлГ левый и правый плевральные ганглии

154. Л/П ПаГ левый и правый париетальные ганглии

155. ВГ непарный висцеральный ганглий1. МП мембранный потенциал1. ПД потенциал действия

156. ВПСП возбуждающий постсинаптиеский потенциал ТПСП - тормозной постсинаптический потенциал МКЧЛ - микрочастица льда

157. КСНП культуральная среда для нейронов прудовика Ь-15 - среда для культивирования (ЬеШохуИг) Т8КУ - пептид ТЪг-Бег-Ьуз-Туг

158. Л/П Б1, Б2, БЗ, Б4, Б4кл -буккальный первый, второй, третий, четвёртый и кластерные нейроны в области Б4 нейрона в левом или правом буккальных ганглиях

159. ВД1, ВД4 висцеральный дорзальный первый и четвёртый нейроны в висцеральном ганглии

160. Л/П ПеД1 -педальный дорзальный первый нейрон в левом или правом педальном ганглии

161. Л/П ЦеЦ1 -церебральный первый нейрон в левом или правом церебральном ганглии

162. Л/П ПеАкл нейроны А-кластера в левом или правом педальном ганглии ВАкл - нейроны А-кластера в висцеральном ганглии.

163. Низкий поклон Марине Александровне Костенко, которая открыла для меня удивительный и красивый мир нейрона в культуре in vitro. За поддержку на начальном этапе исследований благодарю Владимира Николаевича Казаченко.

Информация о работе

Ивличева, Наталья Александровна
кандидата биологических наук
Пущино, 2013
ВАК 03.01.02

Диссертация

Функциональная и регенеративная активность нейронов после криоконсервации изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Функциональная и регенеративная активность нейронов после криоконсервации изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы