Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние экспрессии гена легтемоглобина A сои на рост, дыхание и антиоксидантное состояние трансформированных растений

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние экспрессии гена легтемоглобина A сои на рост, дыхание и антиоксидантное состояние трансформированных растений"

005009289

Дмитрюкова Марина Юрьевна

ВЛИЯНИЕ ЭКСПРЕССИИДЕНА ЛЕГГЕМОГЛОБИНА А СОИ НА РОСТ, ДЫХАНИЕ И АНТИОКСИДАНТНОЕ СОСТОЯНИЕ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ

03.01.05 Физиология и биохимия растений 03.01.03 Молекулярная биология

Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п 5 2G12

Уфа 2012

005009289

Работа въшолнена на кафедре физиологии и биохимии растений Башкирского государственного университета

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Рахманкулова Зульфира Фаузиевна,

доктор биологических наук, Баймиев Алексей Ханифович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Топунов Алексей Федорович,

доктор биологических наук, профессор Шакирова Фарада Минихановна

Ведущая организация: Российский государственный аграрный

университет - МСХА им. К.А.Тимирязева, г. Москва

Защита диссертации состоится 16 февраля 2012 г. в 14-00 ч. на заседании диссертационного совета Д 212.013.11 при Башкирском государственном университете (450076, г.Уфа, ул. Заки Валиди, 32) в 332 ауд. Факс (347) 273-67-78, E-mail: disbiobsu@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного университета, с авторефератом - в сети интернет по адресу: http://www.bashedu.ru/avtoreferaty

Автореферат разослан января 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, цм .

д.б.н., профессор дЗЬмбм М.Ю. Шарипова

Актуальность темы. Оксигенный фотосинтез и аэробное дыхание - два фундаментальных процесса, обеспечивающих энергией клетки растений. Оба эти процесса связаны с окислительно-восстановительными превращениями молекулярного кислорода, в ходе которых, с одной стороны, происходит запасание энергии, с другой, постоянное образование активных форм кислорода (АФК) (Karuppanapandian et al., 2011).

Для модулирования таких кислород-зависимых процессов в растениях могут быть использованы кислород - переносящие белки - гемоглобины (Гб) (Bulow et al., 1999). Они широко распространены в природе и обнаружены у представителей всех царств живых организмов (Weber, Vinogradov, 2001). Растительные Гб делятся на две группы - симбиотические и несимбиотические Гб, различающиеся сродством к кислороду. Симбиотические гемоглобины (леггемоглобины, Лг) синтезируются в клубеньках бобовых растений и служат для переноса кислорода, необходимого для дыхания бактероидов, вместе с тем поддерживая концентрацию 02 на безопасном для нитрогеназы уровне. Наиболее изученным представителем этого семейства является леггемоглобин А сои, накапливающийся в больших количествах в инфицированной ткани и обладающий очень большим сродством к кислороду (Smagghe et al., 2009).

В последнее десятилетие представления о функциях симбиотических Гб расширились. Кроме транспортной функции, Лг может участвовать в модулировании NO сигнала, защите от окислительного и нитрозативного стресса. Так, есть данные, что Лг, вместе с несимбиотическими Гб может эффективно снижать содержание NO в клубеньках (Shimoda et al., 2005; Baudouin et al., 2006). Кроме того, показано, что Лг может переносить кислород и к митохондриям растений, т.е. оказывать влияние на интенсивность дыхания (Suganuma et al., 1983).

Основной функцией для большинства несимбиотических Гб является защита от разнообразных неблагоприятных факторов, в тоже время участие симбиотического Гб в метаболизме растения в неблагоприятных условиях, в частности, в условиях окислительного стресса, мало изучено. Другими словами, представляет интерес изучение влияния экспрессии гена Лг на основные кислород-зависимые процессы в растении, не только при нормальных условиях, но и при внесении в среду источника оксида азота (П) и токсических концентраций тяжелых металлов.

Целью работы явилось изучение влияния экспрессии гена леггемоглобина А сои на рост, кислородный обмен и антиоксидантное состояние тканей трансформированных растений в норме и при стрессе.

з

Задачи

1. Клонирование кодирующей области гена леггемоглобина А сои под управлением 35S промотора вируса мозаики цветной капусты в векторе pCambial301.

2. Получение трансгенных «бородатых» корней на растениях рапса и их использование в качестве модельной системы с целью проведения поисковых исследований и предварительного анализа наличия влияния экспрессии гена леггемоглобина А сои на рост и устойчивость растений к повреждающему действию кадмия.

3. Создание трансгенных растений табака путем агробактериальной трансформации.

4. Исследование влияния экспрессии гена Лг А сои на рост, кислородный и энергетический обмен трансгенных растений.

5. Изучение изменения антиоксидантного состояния (содержания конечных продуктов ПОЛ, показателей активности ферментов антиоксидантной защиты) под влиянием источника экзогенного N0 (нитропруссида натрия) и солей кадмия у трансформированных и нетрансформированных растений табака.

Научная новизна. Получены трансгенные по гену Iba леггемоглобина А сои растения табака. Впервые изучено влияние экспрессии гена леггемоглобина на энергетический статус растительных клеток не только в нормальных условиях, но и при внесении источника экзогенного N0 и окислительного стресса. Впервые показана повышенная устойчивость трансгенных растений к повреждающему действию кадмия, на фоне некоторого снижения скорости роста.

Научно-практическая значимость. Полученные данные расширяют представление о функциях леггемоглобина. Впервые показано влияние экспрессии гена леггемоглобина на энергетический статус растительных клеток.

Обнаружено, что трансгенным растениям свойственна более высокая устойчивость к повреждающему действию солей кадмия, по сравнению с нетрансформированными растениями. Поскольку эти результаты связаны не со специфическими факторами защиты, такими как фитохелатины, которые из-за недостаточной прочности комплексов с металлами и специфичности образования, не всегда могут играть существенную роль в детоксикации тяжелых металлов, экспрессия гена леггемоглобина может способствовать повышению устойчивости растений к широкому спектру загрязнителей. Создание трансгенных растений, способных расти при достаточно высоких концентрациях ТМ в почве, позволит проводить фиторемедиацию

4

промышленно загрязненных районов, а также найдет применение в цветоводстве, ландшафтном дизайне и других областях, где в первую очередь имеет значение устойчивость растений.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Школе-семинаре молодых ученых «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007), XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2009), симпозиуме «Растение и Стресс» (Москва, 2010), VII съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 12 печатных изданиях, из них 3 - из входящих в перечень ВАК.

Структура работы. Диссертация изложена на 138 страницах, содержит 30 рисунков, 2 таблицы. Состоит из введения, части I (Обзор литературы), части П (Описания методов исследования), части П1 (Результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы, включающего 233 источника.

Список использованных сокращений: Pg - гроссфотосинтез, R -темновое дыхание, Ra - адаптационная составляющая дыхания, SNP -нитропруссид натрия, АО - альтернативная оксидаза, АФК - активные формы кислорода, Гб - гемоглобин, Лг - леггемоглобин, ТМ - тяжелые металлы, ПОЛ - перекисное окисление липидов, МДА - малоновый диальдегид, MC среда -среда Мурасиге Скуга, ОСР - относительная скорость роста Объекты и методы исследования

Объектами исследования в данной работе служили рапс (Brassica napus L. var. napus) сорт Hanna и табак (Nicotiana tabaccum L.). В экспериментах использовали ген леггемоглобина А сои, как наиболее изученный представитель группы леггемоглобинов. Ген леггемоглобина (Iba), лишенный интронов, был предоставлен д.б.н. Топуновым А.Ф. (лаборатория биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха, г. Москва).

При проведении экспериментов по клонированию гена был использован штамм Е. coli XL-1 Blue. Для получения «бородатых» корней и трансформации растений были использованы штаммы A. rhizogenes 15834 и A. tumefaciens AGL0, несущие вектор pCambial301, содержащий ген леггемоглобина А сои.

В работе были использованы следующие методы. Выделение высокомолекулярной растительной и бактериальной ДНК проводили фенольно-детергентным способом (Graham, 1978). РНК выделяли набором Trizol Reagent (Invitrogen Corp., США). Выделение плазмидной ДНК, подготовку

5

компетентных клеток, их трансформацию плазмидной ДНК, а также электрофорез фрагментов ДНК проводили по лабораторному руководству Сэмбрука с соавт. (Sambrook et al., 1989). Рестрикционное расщепление ДНК и лигирование проводили в буферах, рекомендованных фирмами-поставщиками. Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 фирмы «Applied Biosystems» (США), используя наборы для секвенирования «Big Dye Terminator v.3.1». Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ «Lasergene» фирмы «DNASTAR, Inc.» (США). ПЦР проводили с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК. Трансформацию растений табака проводили по методу агробактериальной трансформации листовых эксплантов (Horsch et al., 1985). Отбор трансформированных растений проводили на среде МС, содержащей антибиотик гигромицин (50 мкг/мл). Гистохимический gus-анализ проводили по методу, описанному Jefferson (1987) с небольшими модификациями (Kosugi et al., 1990). Для экспериментов по оценке экспрессии гена леггемоглобина в трансгенных растениях, кДНК, комплементарную мРНК, получали при помощи фермента AMW ревертазы. В качестве контроля использовали нетрансформированные растения табака.

«Бородатые» корни получали введением суспензии A. rhizogenes 15834 в гипокотили проростков рапса. В качестве контроля использовали нетрансгенные «бородатые» корни, полученные при заражении проростков исходным штаммом A. rhizogenes.

Растения в возрасте одного месяца переносили на водную среду, содержащую 0,1 М раствор Хогланда-Арнона и содержались при следующих условиях: освещенность 120 Вт/м2, светопериод 16 часов, средняя температура воздуха 26±20С. В течение двух суток растения акклиматизировались, и после этого в питательную среду были внесены растворы ацетата кадмия или нитропруссида натрия. Для исследования влияния экзогенного источника NO был использован 0,5 М раствор нитропруссида натрия (Емец и др., 2009). Для оценки токсического действия кадмия был использован раствор ацетата кадмия 2,5 мг/л (1/2 от предельно допустимой концентрации (ПДК) Cd, (Перечень ПДК иОДК..., 1991; Дополнение №1..., 1994).

В ходе опытов регистрировали изменение сырой и сухой массы (W) и длины надземных и подземных органов. Сухую массу определяли после высушивания частей растений при 90°С в течение 24 ч. Относительную скорость роста (ОСР) рассчитывали по формуле ОСР=АW/W At, где: AW -прирост сухой массы; W - исходная масса, At - время, сутки. Интенсивность дыхания (R) определяли манометрическим методом на аппарате Варбурга

6

(Германия). Скорость дыхания выражали в мкл 02 / сут на растение (Гавриленко и др., 1975). Для измерения R использовали навески массой 250 мг, которые представляли собой среднюю пробу из 5-10 растений. Гросс-фотосинтез (Pg) рассчитывали как сумму AIV + R (Головко, 1983). Адаптационную составляющую дыхания (Ra) находили через анализ соотношений IR/Pg и ОСР в нормальных и неблагоприятных условиях (Рахманкулова, 2001).

С целью выяснения задействованное™ отдельных альтернативных путей проводили ингибиторный анализ. Для подавления работы цитохромоксидазного пути дыхания использовали NaN3 (2 мМ, рН 4.5). Ингибирование альтернативной оксидазы проводили с помощью салицилгидроксамовой кислоты (СГК) (15 мМ, рН 4.5). Растворы ингибиторов готовили в фосфатном буфере (Рахманкулова и др., 2003). Гликолатный путь определяли с использованием ингибитора изониазид (гидразид изоникотиновой кислоты) в концентрации 5мМ, в водном растворе. В ходе проведенных опытов определяли активность антиоксидантных ферментов: гваякол пероксидазы (Ермаков и др., 1987), каталазы (Королюк и др., 1988). Степень ПОЛ оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА) (Health, Packer, 1968). Содержание пигментов фотосинтетического аппарата определяли двухволновым методом в вытяжке в 100% ацетоне (Гавриленко, 1975). Эндогенное содержание NO определяли на спектрофотометре после реакции с реактивом Грисса (Green et al., 1982). Содержание кадмия определяли на вольтамперометрическом анализаторе Экотест-ВА (Россия).

Измерения проводили в 5-кратной биологической и 4-6-кратной аналитической повторности. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Excel пакета Microsoft Office.

Результаты и обсуждение 1. Клонирование гена леггемоглобина А сои в pCambial301

Ген леггемоглобина Iba был получен в составе плазмиды PMBL18+. Для подбора праймеров и амплификации гена была использована последовательность под номером V00453.1 из базы данных GeneBank. Для переклонирования ген был наработан амплификацией с использованием Pfu-полимеразы и праймеров: LbaF - TATGGTTGCTTTCACTGAGA, и LbaR -GATACTAATTATGCCTTCTT. Полученная последовательность ДНК имела длину 448 нуклеотидов. Амплификаты, полученные с использованием Pfu полимеразы, не имеют на концах выступающий нуклеотид аденозин, т.е. являются тупоконечными. Это позволяет клонировать полученный продукт без дополнительных обработок.

В вектор pCambia 1301 по сайту Smal была вставлена 35S кассета, несущая 35S промотор, Модифицированный вектор pCambia 1301 был расщеплен по сайту рестрикции Smal, после чего было проведено ненаправленное клонирование гена Iba. Поиск клонов со смысловой ориентацией целевых генов осуществляли при помощи комбинации праймеров 35SCambF и IbaR. Кроме этого, для проверки полученных генно-инженерных конструкций использовали рестрикционный анализ и секвенирование.

Полученная конструкция была перенесена в Agrobacterium rhizogenes и А. tumefaciens методом электропорации. Скрининг целевых клонов в агробактериях осуществляли при помощи ПЦР-анализа с праймерами IbaR и IbaF. Агробактериальные клоны, содержащие вектор pCambia 1301 с целевыми генами в верной ориентации были использованы для получения «бородатых» корней и трансформации листовых дисков табака.

2. Получение трансгенных «бородатых» корней и исследование влияния экспрессии гена Лг на рост и устойчивость к кадмию

Трансгенные «бородатые» корни - своеобразная модель корневой системы, которая вполне применима для изучения влияния экспрессии чужеродных генов на отзывчивость корневой системы растений к воздействию различных факторов окружающей среды (Вершинина с соавт., 2010).

Трансгенная природа полученных нами корней была подтверждена активностью гена глюкуронидазы и ПЦР анализом на ДНК, выделенной из корней. Также на уровне мРНК была доказана конститутивная экспрессия гена леггемоглобина в трансформированных корнях. После достижения «бородатыми» корнями длины 3-4 см, ^трансформированный корень был отрезан, и растения пересаживали в стерильный вермикулит. На полученных корнях были изучены скорость удлинения, а также устойчивость к действию кадмия. Так, нами было показано, что, несмотря на меньшую скорость удлинения (в 1,5 раза), трансгенным корням свойственна большая устойчивость к повреждающему действию кадмия, что проявлялось, во-первых, в меньшем снижении скорости удлинения (Рис. 1), и, во-вторых, значительно меньшем накоплении кадмия в вегетативных органах (Табл.1).

Табл. 1. Содержание кадмия в растениях, несущих нетрансгенные и трансгенные «бородатые» корни (мг/кг сухой массы).

Нетрансгенные корни Трансгенные корни

Корень 13,7 ± 1,5 7,9 ± 0,3

Лист 3,9 ± 0,5 0,21 ±0,1

Стебель 2,6 ± 0,3 0,24 ±0,1

Рис. 1. Скорость роста трансгенных и нетрансгенных «бородатых» корней после внесения ацетата кадмия до концентрации 2,5 мг/л. 1 - без внесения солей кадмия , 2 - после внесения солей кадмия О 1 -

Таким образом, наблюдалось уменьшение накопления кадмия в вегетативных органах и повышение устойчивости к действию тяжелого металла у трансгенных «бородатых» корнях, на фоне некоторого снижения роста. Однако, для детальной оценки влияния экспрессии гена леггемоглобина необходимо создание полностью трансгенных растений.

3. Получение трансформированных растений

Для проведения дальнейших исследований по влиянию экспрессии гена леггемоглобина А сои были получены трансгенные растения табака сорта Samsun.

Наличие гена леггемоглобина А сои в полученных растениях была подтверждена активностью содержащего интрон гена ß-D-глюкоуронидазы, а также ПЦР с использованием праймеров, фланкирующих участок гена леггемоглобина (Рис. 2). Также на уровне мРНК была доказана конститутивная экспрессия гена Jlr.

12 3 4

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов полимеразной цепной реакции ДНК растений табака. 1,2 ДНК растений, не несущих ген Iba, 3 — ДНК трансгенных растений, 4 -маркер, амплификат Iba.

Семена трансгенных растений табака, в которых обнаруживалась экспрессия гена леггемоглобина, были высеяны на среду MC, содержащую гигромицин. После прорастания устойчивые к антибиотику растения были перенесены на грунт и акклиматизированы. Был проведен гистохимический анализ маркерного гена giis и подтверждено наличие экспрессии целевого гена,

9

1 1,4 3 12

2 1.0 а

£ 0.8 и

1 0:6 Р, 0.4

л

е о.2

■ Нетранегенные корни о Трансгенные корни

Расщепление по признаку устойчивости к гигромицину составило 3:1, что говорит о единичной вставке гена в геном растений. Исследования проводились на первом поколении растений (Т1).

4. Влияние экспрессии гена леггемоглобина А сои на рост, энергетический обмен и уровень ПОЛ растений табака

Полученные нами трансгенные растения табака заметно отставали в росте от контрольных нетрансгенных растений. Анализ скорости роста целого растения показал, что экспрессия гена леггемоглобина ведет к снижению ростовых показателей у трансгенных растений на 23% (Рис. 3).

■ Нетрансгенные растения

□ Трансгенные растения

Рис. 3. Относительная скорость роста нетрансформированных и трансформированных растений.

Изучение пигментного состава показало снижение содержания хлорофилла а в тканях растений, несущих ген Iba (Рис. 4). Такое снижение содержания пигмента, вероятно, можно объяснить оттягиванием гема, необходимого для образования хлорофилла в синтезированные молекулы леггемоглобина.

:и го

1 I

о

а &

о °

о g

70 Г

60 f

2 50 [

О ! о

О S 40 I

55 И I

и Й' 30 Г

й Я о, R о

20

Нетрансгенные растения

о Трансгенные растения

Рис. 4. Концентрация хлорофилла а и эндогенного N0 у трансгенных и нетрансгенных растений.

Экспрессия гена леггемоглобина так же приводила к снижению содержания эндогенного N0 в тканях трансгенных растений на 22%. Известно, что Лг способен реагировать с N0 с образованием нитрозильных комплексов, снижая содержание оксида азота в реакционной среде. Видимо, нарушение передачи N0 сигнала является одной из причин, лежащих в основе торможения

10

роста трансгенных растений и «бородатых» корней, так как известно, что N0 занимает важное место в передаче сигнала в ходе органогенеза растений.

Продуктивность растений так же зависит от соотношения основных энерготрансформирующих процессов - фотосинтеза (Pg) и дыхания (R). Отношение суммарного темнового дыхания к гроссфотосинтезу (XR/Pg) является комплексным показателем физиологического состояния растения (Рахманкулова, 2002). Показано, что в оптимальных условиях выращивания растений данное соотношение достаточно консервативно и видонеспецифично. (Рахманкулова, Усманов, 2000; Рахманкулова и др., 2003).

На рисунке 5 представлены данные о влиянии экспрессии гена леггемоглобина А сои на соотношение дыхания и гроссфотосинтеза, а также на величину дыхательных затрат на адаптацию.

■ Нетраясгенные растеши

о Трансгенные растения

Рис. 5. Доля дыхательных затрат от гроссфотосинтеза и оценка дыхательных затрат на адаптацию у трансгенных и нетрансгенных растений табака.

Из рисунка видно, что для трансгенных растений характерно повышение величины соотношения ER/Pg, что свидетельствует о том, что экспрессия гена Лг сои у табака приводит к небольшой разбалансировке энергетических процессов в трансформированных растениях. Кроме того, была вычислена адаптационная составляющая дыхания (Ra), характеризующая затраты веществ и энергии на поддержание уже сформированных структур. Величина Ra у трансгенных растений составила 40%, что говорит о значительном возрастании дыхательных затрат при накоплении леггемоглобина внутри клеток.

Фотосинтез и фотодыхание - тесно связанные процессы, в основе которых лежит бифункциональная активность центрального фермента фотосинтеза - рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы. Снижение интенсивности дыхания при внесении ингибитора у трансгенных растений табака составило 48%. У нетрансгенных растений интенсивность дыхания снизилась на 25% при освещении (Рис. 6).

Таким образом, у растений, экспрессирующих ген Iba, наблюдается большее подавление светозависимых процессов. Кроме того, как упоминалось ранее, у трансгенных растений наблюдалось торможение относительной скорости роста. Известно, что в ходе фотодыхания происходят потери

11

фиксированного в ходе фотосинтеза углерода. Таким образом, полученные нами результаты говорят о возможном стимулировании фотодыхания, приведшем к снижению накопления биомассы.

■ Нетрансгенные растеши

□ Трансгенные растешм

Рис. 6. Интенсивность фотодыхания трансгенных и нетрансгенных растений в контроле (1) и после обработки изониазидом (5мМ) (2).

Известно, что дыхание

представляет собой многокомпонентный процесс, состоящий из нескольких биохимических путей, отличающихся по энергетической эффективности, - цитохромного, альтернативного цианидрезистентного и доли остаточного дыхания. Изучение соотношения составляющих дыхания позволяет косвенно судить об энергетической эффективности дыхания и устойчивости трансгенных и нетрансгенных растений.

100 90 80 70 60

Р 40

й' | 30

й Ц 2«

с? х

& я 10 п

И. 1

Рис. 7. Влияние экспрессии гена леггемоглобина а сои на соотношение

альтернативных путей дыхания у нетрансгенных (1) и трансгенных (2) растений табака. Ц -цитохромоксидазный путь; А-альтернативный цианидрезистентный путь; О - остаточное дыхание

Результаты ингибиторного анализа представлены на рисунке 7. Усиление альтернативного пути, вероятно, связано с активацией дыхания поддержания, которое, как известно, возрастает в неблагоприятных условиях и может быть связано или с затратами на адаптацию или с диссипацией невостребованной энергии (Усманов и др., 2001, с. 88). Кроме того, одной из функций альтернативной оксидазы (АО) и механизма разобщения является защита растения от активных форм кислорода (АФК), которые образуются и при нормальных условиях и вызывают перекисное окисление липидов ^ивгсгик, ЯусЫег, 2003, РкгвсИке, 2006).

Интенсивность процессов ПОЛ была оценена по содержанию малонового диальдегида. Уровень МДА в опытных образцах был снижен на

12

20% по сравнению с нетрансгенными растениями (Рис. 8). Данные по содержанию МДА, как показателя ПОЛ, согласуются с обнаруженной повышенной активностью альтернативного (цианидрезистентного) дыхания. Известно, что усиленная работа АО снижает содержание АФК в клетках (Moller, 2001).

■ Не1рансгенные растения

É 1.5

$ I 2 1Í

«0.5 i

ID О

о

<~j п

о Трансгенные растения

Рис. 8. Содержание МДА

активность

гваякол

пероксидазы у трансгенных и нетрансгенных растений

Автоокисление леггемоглобина или его взаимодействие с АФК ведет к потере свойств переносчика кислорода. Поэтому для поддержания Лг в активной форме необходимо наличие ферментов антиоксидантной защиты -пероксидаз. Мы изучили активность ферментов каталазы и гваякол пероксидазы. Наши исследования показали, что активность каталазы в опытных и контрольных образцах статистически не различалась. Подобные результаты были получены и на растениях картофеля (Chaparro-Gerata et al., 2000), и растениях табака (Barata et al., 2000) несущих трансгенные по гену леггемоглобина А сои пластиды. Активность гваяколпероксидазы в трансгенных растениях, несущих ген леггемоглобина А сои была снижена на 19% по сравнению с контрольными нетрансгенными растениями (рис. 8).

Таким образом, для полученных нами трансгенных растений характерно более стабильное антиоксидантное состояние, на фоне некоторого снижения ростовых показателей и разбалансировки энергетических процессов, вероятно, связанное с нарушением передачи N0 сигнала и некоторым стимулировании фото дыхания.

5. Влияние экзогенного источника N0 на рост и дыхание трансгенных и нетрансгенных растений табака

Как было показано ранее, для трансгенных растений характерна более низкая концентрация эндогенного монооксида азота. Для выяснения связи между экспрессией гена леггемоглобина и снижением содержания N0, мы исследовали влияние экзогенного источника N0 (нитропруссида натрия, в концентрации 0,5 М, на рост, энергетический обмен и уровень ПОЛ трансгенных и нетрансгенных растений.

13

Внесение нитропруссида натрия способствовало росту трансгенных и нетрансгенных растений (рис. 9). Как видно из рисунка, экспрессия гена Лг ведет к снижению стимулирующего влияния у трансгенных растений, что вероятно, связано с реакцией Лг с N0.

Рис. 9. Относительная скорость роста трансгенных и нетрансгенных растений до (1) и после внесения (2) нитропруссида натрия (0,5М)

Для оценки влияния экспрессии гена Лг на кислородный обмен в условиях присутствия источника N0, нами была изучена интенсивность дыхания трансгенных и нетрансгенных растений и рассчитано соотношение фотосинтеза и темнового дыхания Как видно из рисунка 10, внесение

БТЧР привело к возрастанию величины ЕЯ/^ у нетрансгенных растений на 11%, в то время как у трансгенных растений изменений не обнаружено. То есть, у нетрансгенных растений наблюдается некоторое разобщение окислительных процессов.

■ Нетрансгенные растения

п Травсгенные растеши

Рис. 10. Доля дыхательных затрат от гроссфотосинтеза (истинного фотосинтеза) у трансгенных и нетрансгенных растений табака при действии экзогенного источника N0. 1 -контроль, 2 - (0,5 М).

Для анализа причин изменения соотношения нами был проведен ингибиторный анализ дыхания. Исследование показало снижение вклада цитохромного (на 10%) и остаточного путей дыхания и некоторое возрастание альтернативного пути (15%) у нетрансгенных растений (Рис. 11). Известно, что внесение экзогенного источника N0 ингибирует окислительное фосфорилирование (Уатаза1и е1 а]., 2001). У трансгенных растений значительных изменений в соотношении путей дыханий обнаружено не было, что подтверждает данные о блокировании влияния N0 в присутствии Лг.

14

$ 90

g. SO

§ ?0

g 60

2 „

p 40

i 30

§ I 20

s a10

100 90

I 60- ^ ■

¡B Щ11

Рис. 11. Соотношение путей дыхания у нетрансгенных (1) и трансгенных (2) растений в контроле (I) и после внесения (0,5 М)(Н).

Известно, что внесение источника оксида азота снижает уровень ПОЛ

(Perazolli et al., 2006). Как и ожидалось, внесение SNP привело к снижению

процессов ПОЛ. Так, уровня МДА у нетрансгенных растений снизился на 26%,

у трансгенных - только на 18% (Рис. 12). Известно, что внесение гемоглобина

человека в среду роста растений вместе с источником монооксида азота

блокирует влияние NO на уровень ПОЛ (Boveris, Garata, 2000). Таким образом,

из наших результатов следует, что Лг так же обладает свойством снимать

действие экзогенного источника N0 на ПОЛ.

■ Нетрансгенные растения

1=8

U. 1.6

с: о 1.-4

к 1,2

<

И 1,0

& Я 0,8

1 0,6

«

аГ « 0,4

о

О 0.2

0

г I п Трансгеняые ■Ш' растения

11

1 -

Как упоминалось

Рис. 12. Влияние внесения нитропруссида натрия на содержание МДА в трансгенных и нетрансгенных растениях табака. 1 - контроль, 2 - БМР (0,5 М).

ранее, ферменты, участвующие в защите от окислительного стресса, могут участвовать в поддержании Лг в активной (восстановленной) форме. Добавление значительно не изменило уровень каталазы и гваякол пероксидазы у трансгенных и нетрансгенных растений.

Таким образом, экспрессия гена леггемоглобина уменьшает действие экзогенного оксида азота на физиологические процессы у трансгенных растений. Это согласуется с предположением, что Лг, вместе с несимбиотическими гемоглобинами, могут эффективно снижать содержание N0 в клубеньках (8Ытос1а е1 а1., 2005).

6. Устойчивость трансформированных и нетрансформированных растений табака к окислительному стрессу, вызванному ацетатом кадмия

Кадмий - относительно редкий элемент, не имеющий биологических функций и высокотоксичный для живых организмов. Для изучения влияния экспрессии гена Лг А сои на устойчивость к неблагоприятным условиям среды, в частности, к тяжелым металлам, была использована концентрация ацетата кадмия (2,5 мг/л) как 1/2 от ПДК.

■ Нетрансгеннь» растеши

о Трансгенные растения

Рис. 13. Влияние ацетата кадмия (2,5 мг/л) на относительную скорость роста трансгенных и нетрансгенных растений. 1 -контроль, 2 - ацетат кадмия.

Относительная скорость роста является одним из главных критериев экологических адаптивных стратегий, который отражает комплексную систему устойчивости данного растения к конкретному виду стресса (Семихатова, 1995). В результате добавления ацетата кадмия в среду роста, ОСР снизилась у нетрансгенных растений в 2,6 раз, у трансгенных в 1,8 раза. Иными словами, токсичная концентрация кадмия привела к более значительному торможению роста нетрансгенных растений (Рис. 13). Эти результаты согласуются с данными, полученными на трансгенных «бородатых» корнях рапса. ■ Нетрансгенные

растения

□ Травстеняые растеши

Рис. 14. Соотношение темнового дыхания и фотосинтеза у трансгенных и нетрансгенных растений в контроле и после внесения соли кадмия. 1 -контроль, 2 - ацетат кадмия. Яд -адаптационная составляющая дыхания.

В условиях стресса происходит перераспределение энергетических процессов, что отражается на интенсивности основного источника энергии в клетке - дыхания. На основании полученных данных по интенсивности дыхания и ростовым параметрам, было вычислено соотношение суммарного темнового дыхания и гросс-фотосинтеза (1Л/Р§) (Рис. 14). Известно, что стресс вызывает рассогласование основных физиологических процессов в целом

16

растении, в результате чего наблюдается увеличение соотношения ХЯЛ^. Степень увеличения зависит от устойчивости растения к стрессовым факторам - чем более устойчив организм, тем меньше изменяется величина ЕЯ/Р§ (Рахманкулова и др., 2003). Следовательно, трансгенные растения проявляли большую устойчивость.

Увеличение суммарного темнового дыхания при стрессе в значительной степени связано с повышением адаптационной составляющей суммарного дыхания (Яа) (Рахманкулова и др., 2003). При действии солей кадмия затраты на адаптацию у трансгенных растений были ниже и равны 66%, по сравнению с нетрансгенными (78%) (Рис.14). Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что для трансформированных растений характерна большая сбалансированность и устойчивость основных энерготрансформирующих процессов при действии токсических концентраций солей кадмия.

Изучение соотношения путей дыхания показало повышение интенсивности цианидрезистентного и остаточного долей дыхания, особенно у нетрансгенных растений (Рис. 15).

Рис. 15. Соотношение альтернативных путей дыхания у нетрансгенных (1) и трансгенных растений (2) в контроле (1) и после внесения ацетата кадмия (2,5 мг/л) (11).

Известно, что активация цианидрезистентного пути при действии тяжелых металлов связано с участием альтернативной оксидазы в защите от окислительного стресса, вызванного солями тяжелых металлов (^гсгик, Яус1иег, 2003). ТМ являются мощным индуктором окислительного стресса, ведущего к накоплению малонового диальдегида (УегЬп^еп й а]., 2009). Внесение соли кадмия привело к повышению уровня МДА у нетрансгенных растений на 25%, у трансгенных - на 18% (Рис. 16). То есть, при внесении солей кадмия трансгенные растения оказались более устойчивы к окислительному стрессу, чем нетрансгенные растения. Внесение солей кадмия ведет к повышению активности ферментов антиоксидантной защиты. У нетрансгенных растений активность каталазы и пероксидазы возросла в два раза сильнее, чем у трансгенных растений. Таким образом, в условиях окислительного стресса, вызванного действием солей кадмия, для трансгенных растений характерен более благоприятный антиоксидантный статус, проявляющийся в

незначительном повышении активности ПОЛ и ферментов окислительного стресса по сравнению с растениями дикого типа.

■ Нетраксгеяные растения

Рис. 16. Содержание МДА, активность каталазы и гваякол пероксидазы у нетрансгенных и трансгенных растений табака. 1 -контроль, 2 -после внесения ацетата кадмия

В результате трансформации растений табака конструкцией, несущей ген леггемоглобина, растения приобрели некоторые черты стресс-толерантности. Это проявляется, в первую очередь, в снижении интенсивности роста и повышении устойчивости, и сопровождается возрастанием активности цианидрезистентного пути дыхания и фотодыхания. Стимуляция этих процессов ведет к снижению накопления биомассы, но, вместе с тем, стабилизирует регуляторные механизмы и способствует повышению устойчивости организма. Как известно, фотодыхание и альтернативный цианидрезистентный путь являются важными факторами редокс-регуляции в растении (Рахманкулова, 2009, Foyer et al., 2009), которые способствуют поддержанию редокс-баланса в фотосинтезирующих органах в норме и при окислительном стрессе.

Результаты, показавшие повышение устойчивости трансгенных организмов, были получены на модельных образцах рапса посевного, несущих трансгенные по гену леггемоглобина А сои корни, что подтверждает возможность использования такого подхода для первоначального исследования экспрессии генов.

Повышение устойчивости растений, на фоне некоторого снижения продуктивности, может найти применение в таких областях, как городской ландшафтный дизайн, цветоводство и других, где первостепенное значение имеет именно устойчивость растений.

Выводы

1. Получена генетическая конструкция на основе вектора рСатЫа1301, содержащая в области Т-ДНК ген леггемоглобина А сои под управлением промотора 358 вируса мозаики цветной капусты.

2. На трансгенных «бородатых» корнях показано меньшее подавление роста растений, а также снижение накопления кадмия в органах при внесении в среду ацетата кадмия, на фоне некоторого торможения роста в нормальных условиях. Подтверждена возможность использования «бородатых» корней как модельной системы для исследования влияния экспрессии чужеродных генов на устойчивость к тяжелым металлам.

3. Созданы трансгенные растения табака, несущие ген леггемоглобина А сои. Показано торможение роста, возрастание окислительных процессов (альтернативного цианидрезистентного дыхания и фотодыхания) и снижение процессов ПОЛ у трансгенных растений.

4. Внесение экзогенного источника оксида азота (нитропруссида натрия) оказывало меньший, по сравнению с нетрансгенными, стимулирующий эффект на рост, энергетические процессы и уровень ПОЛ у трансгенных растений табака.

5. Показано, что в условиях повреждающего действия солей кадмия трансгенные растения проявляли большую устойчивость, чем нетрансгенные растения табака.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в научных журналах, рекомендованных ВАК МОИ РФ:

1. Дмитрюкова М.Ю., Баймиев А.Х., Федяев В.В., Рахманкулова З.Ф. Влияние экспрессии гена леггемоглобина А сои на рост, дыхание и антиоксидантное состояние растений табака в условиях повреждающего действия кадмия//Физиология растений. 2011. Т.58.№ 6. С.915-921.

2. Дмитрюкова М.Ю., Баймиев А. X., Федяев В. В., Рахманкулова 3. Ф. Изучение влияния экспрессии гена леггемоглобина А сои на устойчивость рапса к кадмию с использованием «бородатых» корней в качестве модельной системы// Вестник БашГУ. 2011.Т.З.С. 698-701.

3. Дмитрюкова М.Ю., Баймиев А.Х., Рахманкулова З.Ф. Влияние экспрессии гена леггемоглобина А сои на антиоксидантную систему трансгенных растений табака//Вестник ОГУ. 2010. Т. 12.С. 4-8.

Публикации в других научных изданиях и материалах конференций:

4. Вершинина З.Р., Дмитрюкова М.Ю., Баймиев Ал.Х. Получение облепихи с трансгенными корнями, несущими химерные гены лектинов

бобовых растений. // Материалы IV съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, 6-7 декабря 2006 г., г. Пущино, С. 24.

5. Вершинина З.Р., Дмитрюкова М.Ю., Баймиев Ал.Х. Разработка метода получения трансгенных «бородатых» корней, несущих гибридные лектины бобовых, на облепихе, рапсе и люцерне. //Научное и экологическое обеспечение современных технологий //Материалы докладов Ш Республиканской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, Уфа, 2006.

6. Дмитрюкова М.Ю., Вершинина З.Р., Баймиев Ал.Х. Разработка метода получения трансгенных «бородатых» корней и клубеньков на облепихе // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем», Саратов, 25-27 сентября 2007 г. С. 25

7. Вершинина З.Р., Дмитрюкова М.Ю., Баймиев А.Х. Получение трансгенных по гену лектина «бородатых» корней на люцерне, облепихе и рапсе // Материалы докладов Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар, 2007. Часть 3. С. 229-230.

8. Дмитрюкова М.Ю. Участие леггемоглобинов бобовых растений в защите от повреждающего действия тяжелых металлов//Аграрная Россия специальный выпуск 2009.С. 81-82

9. Баймиев А.Х., Дмитрюкова М.Ю. Дыхание растений с корнями, трансгенными по гену леггемоглобина А сои//Вестник новых медицинских технологий. 2009.Т.16. №1. С. 106-108.

10. Дмитрюкова М.Ю., Баймиев А.Х., Влияние экспрессии гена леггемоглбина А сои на рост «бородатых» корней на растениях рапса (Brassica napus var. napus).// Вестник новых медицинских технологий. 2009. Т.16. №1. С.108-110.

11. Дмитрюкова М.Ю., Баймиев А.Х., Рахманкулова З.Ф. Влияние нитропруссида натрия на трансгенные по гену леггемоглобина А сои растения табака//Материалы симпозиума «Растение и стресс». Москва, 2010. С . 131-132.

12. Дмитрюкова М.Ю., Баймиев А.Х., Рахманкулова З.Ф, Федяеев В .В. Влияние экспрессии леггемоглобина А сои на содержание пигментов фотсинтетического аппарата у трансгенных растений табака//Материалы VII съезда общества физиологов растений России «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий», Нижний Новгород, 2011.С.215-216.

Подписано в печать 28.12.11 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Тираж 100 экз. Заказ 580. Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1 п.л.Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дмитрюкова, Марина Юрьевна, Уфа

61 12-3/521

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет»

На правах рукописи

Дмитрюкова Марина Юрьевна

ВЛИЯНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ЛЕГГЕМОГЛОБИНА А СОИ НА РОСТ, ДЫХАНИЕ И АНТИОКСИДАННОЕ СОСТОЯНИЕ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ

03.01.05 - физиология и биохимия растений 03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук Рахманкулова Зульфира Фаузиевна

доктор биологических наук Баймиев Алексей Ханифович

Уфа 2012

Оглавление

Список сокращений ................................................................................................................................................................................................ 5

Введение............................................................................................................................................................................................................................................... 7

I. Обзор литературы

Глава 1. История открытия, классификация и структура леггемоглобинов.................................................................................................................................................................................................................12

1.1 История открытия и изучения леггемоглобинов..............................12

1.2 Классификация и структура гемоглобинов..................................................14

Глава 2. Эволюция гемоглобинов............................................................................................................................21

Глава 3. Физиологическая роль леггемоглобина

в клубеньке......................................................................................................................................................................................................................................24

Глава 4. Реакции с двухатомными молекулами........................................................................27

4.1 Взаимодействие с кислородом..................................................................................................28

4.2 Взаимодействие с монооксидом азота...................................................................30

4.3 Реакции с органическими лигандами..................................................................... 34

Глава 5. Окисление и восстановление леггемоглобина.........................................37

5.1 Окисление леггемоглобина.............................................................................................................37

5.2 Восстановление леггемоглобина........................................................................................43

5.2.1 Ферментативное восстановление.........................................................43

5.2.1 Неферментативное восстановление.............................................46

Глава 6. Основные кислород - зависимые процессы в растительной клетке............................................................................................................................................................................................49

6.1 Дыхание....................................................................................................................................................................................49

6.2 Соотношение темнового дыхания

и фотосинтеза...............................................................................................................................................................................................................................53

6.3 Альтернативные биохимические пути дыхательного обмена растений.........................................................................................................................................................55

6.4 Фотодыхание .............................................................................................................................................................56

II. Объекты и методы исследования

Глава 7. Реактивы и материалы....................................................................................................................................59

7.1 Объекты исследования и бактериальные

штаммы ...................................................................................................................................................................................................................................................59

7.2 Реактивы и материалы..............................................................................................................................60

Глава 8. Методы исследования......................................................................................................................................62

8.1 Создание генетической конструкции

для трансформации растений...................................................................................................................................................................62

8.2 Приготовление и трансформация компетентных клеток Е. соП и А&ч)Ьас1егшт Бр...........................................................................................................................67

8.3 Получение трансгенных «бородатых» корней......................................70

8.4 Трансформация растений табака........................................................................................70

8.5 Выделение тотальной растительной ДНК................................................... 73

8.6 Выделение тотальной растительной РНК................................................... 75

8.7 Проведение полимеразной цепной реакции

с обратной транскриптазой...........................................................................................................................................................................75

8.8 Гистохимический анализ.......................................................................................................................76

8.9 Измерение физиологических параметров.........................................................76

8.9.1 Условия выращивания растений...........................................................76

8.9.2 Измерение ростовых параметров..................................................... 77

8.9.3 Определение интенсивности дыхания манометрическим методом...........................................................................................................................................................................77

8.9.4 Ингибиторный анализ...................................................................................................77

8.9.5 Определение содержания продуктов ПОЛ

по реакции с тиобарбитуровой кислотой.....................................................................................................................78

8.9.6 Определение активности катал азы....................................................79

8.9.7 Определение активности гваяколпероксидазы 80

8.9.8 Измерение содержания пигментов фотосинтетического аппарата............................................................................................................................................................. 80

8.9.9 Определение содержания эндогенного N0...................81

III. Результаты и обсуждение

Глава 9. Исследование полученной генетической конструкции........82

Глава 10. Анализ роста и устойчивости к действию кадмия

трансгенных «бородатых» корней.............................................................................................................................................85

Глава 11. Создание трансгенных растений табака......................................................... 88

11.1 Исследование экспрессии гена леггемоглобина

у трансгенных растений табака.............................................................................................................................................................88

11.2 Исследование морфофизиологических параметров трансформированных растений.........................................................................................................................................................90

Глава 12. Влияние экзогенного источника N0 (нитропруссида натрия) на рост, дыхание и антиоксидантный статус

трансформированных растений табака..............................................................................................................................100

Глава 13. Устойчивость трансгенных и нетрансгенных растений табака к окислительному стрессу, вызванному действием

солей кадмия................................................................................................................................................................................................................................105

Заключение.......................................................................................................................................................................................................................................113

Выводы......................................................................................................................................................................................................................................................116

Список литературы.........................................................................................................................................................................................................117

Список сокращений

GSH - глутатион

GUS - ß-глюкуронидаза

LB-среда - среда Лурия-Бертани

MlbR - метлеггемоглобинредуктаза

N0 - монооксид азота

Pg - гроссфотосинтез

R - интенсивность дыхания

Ra - адаптационная составляющая дыхания

SNP - нитропруссид натрия

ТЕ - трис-ЭДТА буфер

W - сухая масса растения

АО - альтернативная оксидаза

АФК- активные формы кислорода

БАП - бензиламинопурин

Гб - гемоглобин

ДДС- натрия (SDS) додецилсульфат натрия

ИМК- индолилмасляная кислота

Лг - леггемоглобин

оксиЛг- оксигенированный Лг (Лг02)

метЛг- метлеггемоглобин (ЛгЗ+)Мг миоглобин

МДА- малоновый диальдегид

MC - среда Мугасиге-Скуга

НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный НУК- нафтилуксусная кислота ОСР - относительная скорость роста

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой ПБМ - перибактериальная мембрана ПОЛ - перекисное окисление липидов

ППЭ - промежуточный переносчик электронов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СГК - салицилгидроксамовая кислота

ТМ - тяжелый металл

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение

Актуальность темы. Оксигенный фотосинтез и аэробное дыхание - два фундаментальных процесса, обеспечивающих энергией клетки растений. Оба эти процесса связаны с окислительно-восстановительными превращениями молекулярного кислорода, в ходе которых, с одной стороны, происходит запасание энергии, с другой, постоянное образование активных форм кислорода (АФК) (Karuppanapandian et al., 2011). В фотосинтезирующих органах растений кислород определяет оксигеназную активность рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы, лежащую в основе гликолатного пути, функции и значимость которого в последнее время переосмысливаются (Hurry et al., 2005, Peterhansel et al., 2010). Так показано, участие фотодыхания в редокс-регуляции энергетического обмена (Foyer et al., 2009; Рахманкулова, 2009), в антиоксидантной защите и продуцировании АФК, установлено влияние гликолатного пути на рост, продуктивность и урожай растений (Foyer, Noctor, 2009, Peterhansel, Maurino, 2011).Для стимулирования таких кислород-зависимых реакций необходимо повысить доступность кислорода в клетке, для чего могут быть использованы кислород - переносящие белки - гемоглобины (Гб) (Bulow et al., 1999). Гб широко распространены в природе и встречаются у представителей всех царств живых организмов (Weber, Vinogradov, 2001). Растительные гемоглобины встречаются у всех представителей царства и обладают различным сродством к кислороду. Гемоглобины растений делят на две группы - симбиотические и несимбиотические. Симбиотические гемоглобины (леггемоглобины) синтезируются в клубеньках бобовых растений и служат для переноса кислорода, необходимого для дыхания бактеродов, вместе с тем поддерживая концентрацию 02 на безопасном для нитрогеназы уровне. Наиболее изученным представителем этого семейства является леггемоглобин А сои, накапливающийся в больших количествах в инфицированной ткани и обладающий очень большим сродством к кислороду (Arredondo -Peter, 1998). Несимбиотические гемоглобины растений делят на 2

класса: гемоглобины первого класса, имеющие очень высокое сродство к кислороду и второго класса, схожие с симбиотическими, с меньшим сродством к кислороду (Dordas, 2009).

Хотя основной функцией леггемоглобинов по-прежнему считается перенос кислорода к азотфиксирующим бактероидам, однако в свете последних открытий, функция Лг, видимо, этим не ограничивается (Космачевская, Топунов, 2009). Кроме транспортной функции, Лг может участвовать в модулировании N0 сигнала, защите от окислительного инитрозативного стресса. Так, есть данные, что леггемоглобин, вместе с несимбиотическими гемоглобинами может эффективно снижать содержание NO в клубеньках (Shimoda et al., 2005; Baudouin et al., 2006). Кроме того, имеются данные, что Лг может переносить кислород и к митохондриям растений (Топунов, Петрова, 2001). В свете этих данных представляет интерес изучение влияния экспрессии гена Лг на основные кислород - зависимые процессы в растении, не только при нормальных условиях, но и при внесении в среду источника оксида азота(Н).

Основной функцией для большинства несимбиотических Гб является защита от разнообразных неблагоприятных факторов, в тоже время участие симбиотического Гб на метаболизм растения в неблагоприятных условиях, в частности, в условиях окислительного стресса, мало изучено. Одним из факторов, индуцирующих окислительный стресс в клетке, являются тяжелые металлы (ТМ). Повреждающее действие ТМ разнообразно и связано с ингибированием ферментов, нарушением проницаемости мембран и работы ЭТЦ и пр. Одним из наиболее токсичных металлов является кадмий, не имеющий биологических функций и потому вызывающий повреждения даже в небольших концентрациях (Hatata et al., 2008). В настоящее время известны несколько конститутивных механизмов устойчивости к тяжелым металлам (белки теплового шока, лиганды, фитохелатины, металлотионеины и др.), позволяющих растениям аккумулировать токсичные элементы в метаболически

инертных органах и органеллах или включать их в хелаты и тем самым переводить в физиологически безопасные формы (Серегин, 2001).

Особое внимание при создании растений, устойчивых к тяжелым металлам, уделяется фитохелатинам. Однако из-за недостаточной прочности комплексов фитохелатинов с металлами и специфичности их образования, эти соединения не всегда могут играют существенной роли в детоксикации тяжелых металлов (Серегин, 2001).

В свете этих данных представляет интерес изучение влияния экспрессии гена Лг на основные кислород-зависимые процессы в растении, не только при нормальных условиях, но и при внесении в среду источника оксида азота(П) и токсических концентраций тяжелых металлов.

Целью работы явилось изучение влияния экспрессии гена леггемоглобина А сои на рост, кислородный обмен и антиоксидантное состояние тканей трансформированных растений в норме и при стрессе.

Задачи

1. Клонирование кодирующей области гена леггемоглобина А сои под управлением 358 промотора вируса мозаики цветной капусты в векторе рСатЫа1301.

2. Получение трансгенных «бородатых» корней на растениях рапса и их использование в качестве модельной системы с целью проведения поисковых исследований и предварительного анализа наличия влияния экспрессии гена леггемоглобина А на рост и устойчивость растений к повреждающему действию кадмия.

3. Создание трансгенных растений табака путем агробактериальной трансформации.

4. Исследование влияния экспрессии гена Лг А сои на рост, кислородный и энергетический обмен трансгенных растений.

5. Изучение изменения антиоксидантного состояния (содержания конечных продуктов ПОЛ, показателей активности ферментов

антиоксидантной защиты) под влиянием источника экзогенного NO (нитропруссида натрия) и солей кадмия у трансформированных и ^трансформированных растений табака.

Научная новизна. Получены трансгенные по гену Iba леггемоглобина А сои растения табака. Впервые изучено влияние экспрессии гена леггемоглобина на энергетический статус растительных клеток не только в нормальных условиях, но и при внесении источника экзогенного N0 и окислительного стресса. Впервые показана повышенная устойчивость трансгенных растений к повреждающему действию кадмия, на фоне некоторого снижения скорости роста

Научно-практическая значимость. Полученные данные расширяют представление о функциях леггемоглобина. Впервые показано влияние экспрессии гена леггемоглобина на энергетический статус растительных клеток.

Обнаружено, что трансгенным растениям свойственна более высокая устойчивость к повреждающему действию солей кадмия, по сравнению с ^трансформированными растениями. Поскольку эти результаты связаны не со специфическими факторами защиты, такими как фитохелатины, которые из-за недостаточной прочности комплексов с металлами и специфичности образования, не всегда могут играть существенную роль в детоксикации тяжелых металлов, экспрессия гена леггемоглобина может способствовать повышению устойчивости растений к широкому спектру загрязнителей. Создание трансгенных растений, способных расти при достаточно высоких концентрациях ТМ в почве, позволит проводить фиторемедиацию промышленно загрязненных районов, а также найдет применение в цветоводстве, ландшафтном дизайне и других областях, где в первую очередь имеет значение устойчивость растений.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Школе-семинаре молодых ученых «Биомика-наука XXI века» (Уфа, 2007),

XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, 2009), симпозиуме «Растение и Стресс» (Москва, 2010), VII съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 12 печатных изданиях, из них 3 - из перечня ВАК.

Структура работы. Диссертация изложена на 138 страницах, содержит 30 рисунков, 2 таблицу. Состоит из введения, части I (Обзор литературы), части II (описания методов исследования), части III (результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы, включающего 233 источника.

I. Обзор литературы

Глава 1. История открытия, классификация и структура леггемоглобинов

1.1 История открытия и изучения леггемоглобина

Впервые гемоглобин из клубеньков сои был описан в 1939 г. Тогда был представлен спектр абсорбции изолированного белка и высказано предположение о его гемопротеидной природе (Kubo, 1939). Позднее было доказано, что обнаруженный белок может функционировать как гемоглобин (Kellin, Wang, 1945), однако вплоть до середины 60-х годов существовала теория, что он может непосредственно участвовать в восстановлении азота. Дальнейшие исследования показали, что Гб с азотом не взаимодейс�