Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние антиоксидантов на состав липидов Cunninghamella japonica в норме и в состоянии стресса

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние антиоксидантов на состав липидов Cunninghamella japonica в норме и в состоянии стресса"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

УДК 582.281.2; 577.3.

КУЗНЕЦОВА Людмила Станиславовна

ВЛИЯНИЕ АНТИОКСИДАНТОВ НА СОСТАВ ЛИПИДОВ CUNNINGHAMELLA JAPONICA В НОРМЕ И В СОСТОЯНИИ СТРЕССА

03.00.07. — „Микробиология"

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —1990

Работа выполнена в Московском института прикладной биотехнологии и в Институте микробиологии АН СССР.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Э.Г. Розанцев, доктор биологических наук Е.П. Феофилова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук H.H. Сухарева,

доктор биологических наук О.Л. Озерецковская

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский

на заседании Специализированного совета К.053.05.П при Московском ГЬсударстБешюи Университето по адресу: 119399, г. Москва, Ленинские горы, ЫГУ, биологический факультет»

С диссертацией мояно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МТУ.

институт биосинтеза белковых веществ

Зшцита состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

И. А .Кондрата ева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСЖА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы в связи с расширением исследований в области олеобиотехнологии и дефицитом растительных масел усилился интерес к изучению липидов микроорганизмов, в том числе мицелиальных грибов. Этому способствовали также исследования,показавпше,что липиды служат не только структурными и запасными соединениями,но выполняют такие важнейшие функции, как барьерная,участвуют в мембранном транспорте,в координировании контрольных механизмов /Weete,I980;Kpenc,I98I/,B передаче информации в качестве вторичных мессенджеров /Berridge, 1984;Рас-муссен,1989/,в термосенсорных реакциях /Roff ot al .,1984/ и в адаптации организмов к стрессовым воздействиям /Куликов и др., 1988; Хочачка,Сомеро,1988;Шаотрeon et al .,1989/.

Эти данные о функциональном значении липидов позволяют с новых позиций подойти к изучения) процесса их свободнорадикального окисления (СРО) и роли антиоксидантов (АО) - важнейшего фактора, , определяющего интенсивность СРО. Удобную модель при проведении экспериментов представляют низшие эукариоты - мицелиальные грибы, способные быстро накапливать липидсодеркщую биомассу на относительно простых средах и обладагацие определенным сходством в составе мембранных липидов с высшими эуиариотами.

К началу настоящих исследований влияние природных АО на ли-пидообразование грибов было ограничено единичными данными /Haley, Jack,1977/,а работы по изучению действия синтетических АО на рост, образование и состав липидов мицелиальных грибов полностью отсутствовали. Теоретическая и практическая вачсность исс.чсдовашй в этом направлении диктовалась не только иироким использованием грн-бов в биотехнологии,но и особым интересом к АО как к соединениям, способным резко повышать устойчивость организмов к изменжо^лмсл

факторам внешней среды,т.е. являющихся адаптогенами.В связи с этим в задачу исследования входило также изучение влияния такого распространенного экологического фактора,как температура,на состав и физико-химические свойства липидов в норме и при добавлении АО. Установленные в этом направлении закономерности,помимо выяснения роли АО,могли также дать новую информацию о биохимических механизмах адаптации мицелиальных грибов к стрессовым воздействиям.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение влияния природных и синтетических АО на рост,образование и состав липидов у представителей низших эукариотов - мицелиальных грибов в условиях роста при оптимальной (норма) и неоптимальных температурах (стресс).Исследования проводились с муко-ровым грибом Cunninghamella Japónica »являющимся активным продуцентом липидов,способным накапливать до 40-5054 этих соединений от веса сухого мицелия. В связи с поставленной целью исследовали!

1. Изменение ряда физико-химических свойств липидов (антиокислительной активности (АОА),микровязкости,степени ненасыщенности (СН), состава полярных и нейтральных липидов) в процессе роста С.japónica.

2. Влияние АО (природных и синтетических) на рост С.japónica , образование и состав липидов.

3. Влияние различных температур культивирования на важнейшие физико-химические свойства липидов,интенсивность некоторых метаболических процессов и ультраструктуру мицелия 0.japónica.

4. Действие АО в условиях стресса на образование биомассы и состав липидов С.japónica»

5. На основании полученных данных, а также результатов опытов с использованием ингибитора синтеза белка и соединений,изме-

нягащих текучесть липидного бислоя,обсудить функциональную роль липидов в биохимических механизмах адаптации С. japónica к стрессовым воздействиям и значение АО в этом процессе.

Научная новизна полученных результатов. Показано, что у 0.japónica АОА полярных липидов - величина,отражающая содержание АО в мицелии - коррелирует с активностью ростовых процессов, интенсивностью липидообразования, определенным составом и микровязкостью липидов.

Природные и синтетические АО,введенные в среду выращивания 0.japónica »обладают общностью действия: в определенных условиях культивирования стимулируют рост мицелия, увеличивают ненасыщенность липидов,изменяют состав мембранных липидов в сторону увеличения содержания легкоокисляемых и более ненасыщенных фосфолипи-дов, в частности фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина.

Изучение роста и липидообразования С. japónica в условиях стресса позволило высказать предположение о функционировании у грибов ряда адаптационных механизмов,способствующих поддержанию ' состояния энантиостаза. Это: изменение ненасыщенности и длины ацильных цепей мембранных липидов,модификации изомерного состава линолевой и линоленовой кислот,изменение состава фосфолипидов,соотношения стерины/эфиры стеринов и количества свободных жирных кислот. На основании опытов с циклогексимидом установлено,что при понижении температуры происходит индукция синтеза пальмитоолеил--КоА-десатуразы и изменяется активность десатураз.участвующих в дегидрировании жирных кислот семейства Cjg. Данные,получегаше в опытах с 17р-эстрадиолдипропионатом и новокаином,позволяют высказать предположение,что индукция указанных контрольных механизмов у о.japónica регулируется модуляциями тисучести липидной компоненты мембран.

Функционирование этих термоадаптационных процессов в липид-ном бислое сопровождается характерными изменениями в ультраструктуре мицелия (в составе и морфологии клеточной стенки, липидных гранул и др.клеточных структур),а также в интенсивности ряда метаболических процессов (потреблении субстрата,образовании АТФ).

Введение АО в условиях стресса показало,что эти соединения существенно влияют на состав мембранных липидов,увеличивают их СН за счет модификаций в уровне Cjg.j и Cjg.g и способствуют росту мицелия после его адаптации.

Полученные результаты свидетельствуют о важной роли СРО в процессах роста и липидообраэования у мицелиальных грибов и дают новую информацию о механизме действия АО как адаптогенных мембра-нотропных соединениях.

Установленная выше способность АО влиять на состав липидов исследуемого гриба может найти практическое применение. Нами показана возможность использования липидов С.japónica при производстве косметических кремов с целью замены высокоолеинового оливкового масла (получен акт испытаний). При этом выход липидсодер-жащей биомассы с повышенным уровнем Cjg.j может быть увеличен введением АО при повышении температуры выращивания гриба.

Добавление АО и понижение температуры культивирования способствуют увеличению в составе липидов О.japónica содержания

необходимой для фармацевтической промышленности. В этих же условиях биомасса гриба обогащается высоконенасыщенными фосфо-липидами, которые необходимы при лечении ряда тяжелых наследственных заболеваний'.

Источником для получения природных АО может служить культу-ральная жидкость после выращивания мицелиальных грибов,что представляет интерес при создании безотходных биотехнологий.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на конференции молодых ученых и специалистов НПО"Комплекс"(Москва, 1984);на 711 съезде ВМО (Алма-Ата,1985);на Всесоюзном совещании . "Синтез и применение пищевых добавок"(Могилев,1985);на 1У Всесоюзной Межуниверситетской конференции молодых ученых по"Биологии клетки"(Тбилиси,1985);на II и III.Всесоюзных конференциях"Еиоан-тиоксидант" (Черюголовка, 1986; Москва, 1989); на конференциях молодых ученых биологического факультета МГУ (Москва,1986;1990); на Всесоюзном совещании"Химия запаха пищи"(Каунас,1987); на Всесоюзной конференции"Структурно-функциональная организация клеток микроорганизмов"(Г^щино,1987);на Всесоюзной конференции"Антропогенная экология микромицетов,охрана окружающей среды и аспекты математического моделирования"(Киев, 1990).Qiiui работ по материалам диссертации отмечен премией на конкурсе научных работ Института микробиологии АН СССР (1985 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста,содержит 13 таблиц и 48 рисунков.' Она состоит из введения,обзора литературы,описания объектов и методов исследования,экспериментальной части,обсуждения результатов,выводов.Список цитируемой литературы включает ^^наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД! ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Основным объектом исследования служил гетероталличный гриб Ounninghamella japonica BKMF 1204 (-).Ирн получении АО микробного происхождения были использованы грибы: Aspergillus niger BKMF-34, Penicillium lanosum (штамм ШМИ АН ССОР) .Peaicillium expansum (получен из коллекции культур грибов кафедры низших растений МГУ).Условия культивирования. O.japoaica

выращивали в колбах емкостью 250 мл и 3 л,содержащих 50 и 500 мл ферментационной среды соответственно. Культивирование проводили при 17°,220,28°и 33°С на качалках (160-170 об/мин). В работе использовали модифицированную среду 1Удвина/Михайлова и др.,1983/, при культивировании аскомицетных грибов использовали жидкую среду Чапека и среду ГУдвина с дрожжевым экстрактом.При сопоставлении результатов опытов контрольный и опытный мицелий находился в одной ростовой фазе.Изучение ультраструктуры о.japónica проводили методом ультратонких срезов.Мицелий фиксировали 1,5?4-ным раствором кМаО^ и В6-ным раствором ОеО^ в ацетат-вероналовом буфере.Далее мицелий заключали в агар,обезвоживали и заключали в ЭПОН-812.Срезы получали на микротоме 1КВ-8802А(Швеция) .Микроскопию проводили в электронном микроскопе ЛШ-ЮОС(Япония) .Липи-¿¡ы экстрагировали по Фолчу /íoloh et al .,1957/ и Кейтсу /Кейтс, 1975/.Общее содержание нейтральных и полярных липидов оценивали гравиметрически после их разделения холодным ацетоном /Кейтс, 1975/ и методом колоночной хроматографии на силикагеле ь 100/160 ("Chamapol ",ЧС®Р) с использованием систем растворителей,отличающихся по степени полярности Aateа. 1986/.Состав жирных кислот в виде их метиловых эфиров исследовали методом ПКХ /Кейтс, 1975/ на приборах фиршЧРаскагй "(#РГ)."Hewlett-Packard, "(модель 5830), "Хром-5" (ЧС35Р) и ЛХМ-8-МД с использованием фаз: Siiar-5CP,OV-I0I, SE-30 и полиэтиленгликольадипат.В качестве стандартов использовали смесь метиловых эфиров жирных кислот (МЗЖ) L-207("Serva"), а также смесь МЗЖ из биологических объектов,содержащих ^-Cjg.g (листья Succus kalanhoes и мицелий íusariua ер. ) и /-Cjg.g(TKa-ни животных и мицелий Мисог вр.). Идентификацию МЗНК проводили таете хроматомасс-спектрометрически на приборах: Varian-ilat 3IIA (США) иLSB-9000А(Швеция).Тэнкослойную хроматографии липидов про-

водили на пластинках с силикагелями: КСК и фирмыпИое1т "(ФРГ).Для хроматографии нейтральных липидов использовали систему растворителей: гексан-серный эфир-уксусная кислота(85:15:1).Дпя разделения фосфолипидов - двумерную хроматографию в системах растворителей: I)гексан-серный эфир-уксусная кислота(85:15:1) и 2)хлоро-форы-метанол-уксусная кислота-вода(25:15:4:2).Количество липидов на хроматограмме определяли по интенсивности их поглощения в видимой области на спектрофотометре'ТШ;асЫ" (Япония) »модель 557. Микровязкость липидов определяли методом ШР на приборе ЭПР-В производства ИХФ АН СССР.антиокислительную активность липидов - на модели окисления метилового эфира олеиновой кислоты /Вурлакова и др..1975/.содержание А1Ф - люциферин-люциферазным методом/UcElroy, Seliger »1964/ с помощью счетчика"ии;гоЪеЪа-1210%КВ с использованием люциферазы фирмы^егуа" (ФРГ) .Количество хитина в образцах биомассы С.japónica определяли гравиметрически,а также по содержанию в них D-глюкозамина /Феофилова и др.,1982/.Спектры хитина регистрировали на спектрофотометре"Зресога.-71" (ГДР).Содержание глюкозы в культуральной жидкости определяли на приборе "Giucose-Апа1увег-2"('Ьескпап").В качестве ингибитора синтеза белка использовали циклогексимид('Serva" fiVQ) ;в качестве соединений .изменяю'-ргх микровязкость мембранных липидов эукариотов,использовали новокаин и 170-эстрадиолдипропионат.В качестве синтетических АО использовали: б-ыетил-2-этил-З-оксипиридин хлоргидрат(ПХГ),полученный в ИХТ> АН СССР; ионол,танол(2,2,6,б-тетраметил-4-оксипиридин-1-оксил); 4,4»-дикумил-дифенил-азотокись,полученные от Розанцева Э.Г.(МИПС). В качестве природных АО использовали: ¿-токоферол,полученный методом' омыления токоферол-ацетата /Филлипович и др. ,1975/,передашого из НГО"Витамины";а также микробные АО,которые извлекали из культуральной жидкости после выращивания указанных выше грибов по схеме,

предложенной японскими учеными /Доуата et al..1982/.Статистическую обработку результатов проводили с использованием медианы/Аш-марин,Воробьев,1962/ при уровне надежности-95^.Повторность опытов составляла а=5-6,в электронно-микроскопических исследованиях статистически обрабатывали 30-40 измерений .Как дополнительную оценку существенности различий использовали критерий знаков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Изменения АРА и физико-химических свойств липидов в процессе роста 0.japónica.

Первая задача исследования состояла в установлении взаимосвязи между АОА - величиной,позволяющей судить о количестве АО в мицелии,интенсивностью ростовых процессов 0. japónica и важнейшими физико-химическими свойствами липидов.

Установлено,что значения АОА липидов тесно связаны с ростовыми 'фазами гриба,но характер изменения этой величины неоднозначен для мембранных и нейтральных липидов.Высокая АОА,свойственная активно растущему мицелию С. japónica (рис.IA) .коррелирует с определенным составом липидной компоненты мембран: высокой СН полярных липидов (ПЛ),преобладанием полиненасыщенных жирных кислот (среди которых помимо линолевой и линоленовой обнаружена ок-тадекатетраеновая кислота - Cjg.^)»высоким показателем преломления липидов (табл.1),доминирующим содержанием наиболее легкоокис-ляемых фосфолипидов - фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина, а также низкими значениями микровязкости липидов (рис.ПЗ).

Переход культуры О,japónica в стадию идиофазы сопровождается понижением АОА мембранных липидов (рис.IA)»изменением их состава,понижением (Л и показателя преломления липидов (табл.1), увеличением значений микровязкости липидного бислоя (рис.1Б).АОА

1000

500

-500

10

8

6

4 ■

20

ГиЛ0"10, с

16 24 48 72 96 120 144 168 Время, ч

Рис Л. Изменение антиокислительной активности (А) и микровязкости (Б) липидов в процессе роста С.japónica : I - общие липиды, 2 - полярные липиды, 3 - нейтральные липиды.

Таблица I.

Изменения жирнокислотного состава и показателя преломления полярных и нейтральных липидов в процессе роста С»;)ар<т1са.

Возраст} Сухая { } шсдоты, % „ суммы гуль ту-! биомас-1*____I »> ! ! Степень 1 ненасы- | ¡ценности ! Показатель

ры, ч { 1 са, г/л, , С1б:0| ! 1 1 С18:0! 1 °18:11 °1е:2! 1 ! С 1 18:31 1 преломления,

16 0,24 Ш НЛ 17,8 20,2 7,2 12,2 29,3 21,5 40,8 13,3 22,2 Н.4 1,40 1,03 1,4752 1,4665

24 2,14 ПЛ НЛ 16,5 19,4 8,7 14,7 35,6 19,4 44,3 10,9 18,8 8,2 1,31 0,93 1,4739 1,4649

48 6,48 Ш НЛ 13,1 15,8 9,9 15,4 51.1 16,2 48.2 9,7 7,5 5,8 1,08 0,88 1,4630 1,4559

8 81 ПЛ 14,3 6,1 44,3 22,8 9,6 1,19 1,4668

НЕ 18,1 13,1 47,9 12,5 5,6 0,91 1,4588

10 бд ПЛ 17,2 4,9 47,2 19,7 8,3 1,13 Не опр.

' НЛ 20,6 9,2 48,6 12,9 6,7 0,96 - " -

*^Данные о содержании от сухом жирных кислот) в таблицу не

включены.

нейтральных липидов(НЛ) и их СН на всех стадиях роста 0.japónica ниже,чем мембранных липидов (рис.1,табл.1),что,вероятно,связано с особой локализацией НЛ в мицелии и их функциональной ролью.

Полученные данные позволяют предположить,что АО могут влиять на интенсивность ростовых процессов 0.japónica и состав липидов. Для подтверждения этого положения дальнейшие исследования были посвящены изучению действия АО,которые вводили в среду выращивания гриба,на рост и липидообразование 0.japónica.

2. Влияние синтетических и природных АО на рост.образование липидов и их состав у О.japónica .

При изучении влияния АО на рост О.japónica обнаружена четкая тенденция - у исследуемого гриба под действием изученных синтетических и природных АО происходит увеличение выхода биомассы, причем наибольший ростостимулирующий эффект наблюдается при добавлении АО в среду выращивания О.japónica .находящейся в стадии ранней трофофазы.

Помимо интенсификации ростовых процессов АО оказывают значительное влияние и на жирнокислотный состав ШГ 0.japónica .При внесении АО в 16-часовую культуру гриба уже через 8 ч культивирования с АО повышается Ш мембранных липидов за счет снижения _доли Cjq.q и преимущественного увеличения уроиня линоленовой и линоле-вой кислот(табл.2).Стимулирующее действие изученных АО на образование этих ди- и гриеновых -жирных кислот проявляется неодинаково, что,вероятно,зависит от химической структуры используемых соеди-нений(например,под действием «¿-токоферола содержание Cjs-2 УВ0ЛИ~ чивается в среднем на 18# по сравнению с контролем,а Cjg^-na под влиянием танола количество С18.2 повышается на 13*5, а

CI8:3 " на

Таблица 2.

Изменение жирнокислотного состава полярных липидов С.japónica под действие)!

Жирные кислоты, % от суммы (Степень 1

i-,-,-г-,-,-,-,-|ненасы- j

hz:0\ CI4:0j CI6;0} CI6:l}CI8:0j cI8:l}cI8:2¡cI6;3 {ценности j таело

Контроль _хх) I.I 16,6 1,2 13,4 41,4 13,2 12,2 1,06 91,5

.¿-Токоферол (0|25в1(ГаЮ - 0,7 14,4 1.2 9,2 33,4 15,6 25,5 1,42 123,6

Ионол (0,45*10Г®Ю 0,5 0,8 17,0 3,6 6,6 44,6 11,6 15,3 1,17 101,8

Танол (1,1*10"®Ю - 9,6 15,7 2,4 9,9 31,0 14,9 16,5 1,13 97,9

4,4»-Детуши-Д11фе-ти-азотокиоь - 1.0 18,5 3,7 8.7 38,4 I4.I 15,6 I.I7 101,6

(0,45.10-Зм)

вносили в 16-чаоовую хультуру гриба, пробы отбирали через 8 ч культивирования с АО ^Знак (-) оакачает, что «та кислота в данном опыте не обнаружена

- 13 -

Все исследуемые АО влияют и на состав фосфолипидов (Ш) 0.japónica .Например,через 8ч после внесения ПХГ в концентрации 2'10~^М в активнораступую культуру гриба,когда в мицелии O.japo-lica интенсивно протекают процессы синтеза мембранных липидов,под влиянием АО увеличивается содержание (рис.2) наиболее ненасыщенных Ш - фосфатидилэтаноламина(ФЭА) и фосфатидилсерина(ФС)»уменьшается количество фосфатидилинозита(ФИ) и устойчивых к окислению холинсодержащих Ш - фосфатидилхолина(ЗЗС) и сфингомиелина(СМ).

i от суммы

605040 302010

О

контроль

- опыт

Di

л

ФЭА

«С

№

ЕС

СМ

Рис.2. Влияние ПХГ на состав фосфолипидов 0.japónica (АО вносили в 16-часовую культуру гриба).

Установленные изменения в составе ФЛ С. japónica сопровождаются снижением значений микровязкости липидов (в среднем на 20 -30?6) и увеличением соотношения стерины/ЗУГ.Ткким образом,под действием АО увеличивается содержание стеринов,которые наряду с гли-косфинголипидами играют у грибов решающую роль в модуляциях текучести мембран /Aaronson.Hartin ,1983/. АО оказывают влияние и на состав НЛ,например,под действием ¿-токоферола наблццается увеличение содержания триацилглицеринов (ТАГ).

В связи с тем,что в последнее время АО находят широкое при-

менение в различных отраслях народного хозяйствам нашей стране и за рубежом ведется усиленный поиск легкодоступных и экологически безопасных природных АО.В этой отношении интерес представляют АО, продуцируемые мицелиальными грибами.Поэтому из культуральной жидкости после выращивания грибов ( P.lanoBum,P.expaasum, A.niger, О.japónica ) были выделены АО и изучено их влияние на рост и ли-пидообразование 0.japónica .Установлено,что все полученные"гриб-ныеиА0 также стимулируют рост О.japónica .образование липидов и увеличивают их СН.Однако наибольшее увеличение биомассы и липидов О.japónica (на 10 и 20?4 соответственно) наблюдается под действием собственных АО,выделенных из культуральной жидкости после выращивания этого гриба.Установлено также,что в составе биоантиоксидан-тов 0.japónica «i-токоферол отсутствует.

Приведенные выше данные свидетельствуют о том,что у мицелиа-льных грибов АО являются мембраноактивными соединениями,которые в определенных условиях культивирования интенсифицируют ростовые процессы,повышают ненасыщенность ацильных цепей липидов,понижают значения микровязкости липидной компоненты мембран и увеличивают в ее составе уровень стеринов и легкоокисляемых фосфолипидов.

3. Влияние АО на рост и липидообразование С.japónica в условиях стресса.

Согласно современным представлениям,любое стрессовое воздействие активизирует СРО липидов и вызывает повышенный расход био-антиоксидантов /Журавлев,1982;Куликов и др.,1988;Гуляева и др., 1988,1989/.Поэтому следующая часть работы была посвящена изучению действия АО в условиях стресса, а именно в условиях неоптимальных . для-роста температур.

3.1. Влияние температуры культивирования на рост.состав липидов.интенсивность метаболизма и ультраструктуру мицелия 0. japónica»

- 15 -

Оптимальной температурой для роста О.japónica является t »20°.Повышение и понижение температуры культивирования гриба приводит к уменьшению в вдиофазе выхода биомассы (в среднем: при 33°-на 20*, при 17°-на 355«) и липидов (при 33°-на 69«, при 17°-на I8J<) по срштоииго с оптимальной темпоратурой.Наиболее низкая удельная скорость ¡юста гриба наблюдается при 17° и сопровождается неполным потребленном (менее 2/3) глокозы.

Температура выращивания оказываот влияние на ультраструктуру гиф 0.japónica .При 17° в мицелии содержится меньше липидных гранул,более мелких по размерам,чом при 33°(0,38 и 0,93 ыкм соответственно). При культивировании гриба при 33° увеличивается толщина клеточной стенки и повышается содержание в ней хитина, что, вероятно,связано с увеличением активности хитинсинтетазы,зависящей от температуры,а также интенсивности биосинтеза определенных фосфолипидов /Vermeulen,WeeEsls ,1983/.

Обнаружены новые температурозависимые изменения в составе липидов 0.japónica*

1) в изомерной составе.Использование для ТВХ. высокоразрешающих фаз Silar -5СР и OV-IOI показало,что при культивировании гриба при 17° преобладающим изомером является д9,12-линолевая кислота и наряду о ^-Cjg.g присутствует также «/-линоленовая кис-лота.При 33° в мицелии 0.japónica доминирует A6,9-Cjg:2 и идентифицируется ТОЛЬКО /"Cjg.g.

2) в образовании пальмитоолеиновой кислоты.При 33° соотноше-11110 ^16:0^^16*1 составляет 21,но при 17° эта величина уже соответствует 15, т.е. при понижении температуры выращивания гриба образуется бОЛЬШе Cjg.j.

3) в длине ацильных цепей. Выращивание O.japonica при 33° способствует появлению ряда дополнительных дтанноцепочечных жир-

ных кислот: кроме ^:о«9эд:1»922:0'922:1'^24:0 обнаружены Содр Cgg.o» наибольшее количество среди которых составляет Cj^.g (2,63,3* от суммы жирных кислот).

4) в составе нейтральных липидов при 33° увеличивается содержание эфиров стеринов и ТАГ.

5) в составе мембранных липидов при 17° уменьшается уровень ФХ и Ш, увеличивается содержание ФС, стеринов и свободных жирных кислот (СИК).

i

Установлено,что микровязкость HJI находится в прямой зависимости, со степенью ненасыщенности ацильных цепей,в то время как для мембранных липидов такая корреляция не наблюдается,что согласуется с современными представлениями о том,что микровязкость мембранных липидов является сложной интегральной величиной /Вурла-кова и др.,1982/,Текучесть липидного бислоя может регулироваться и количеством CffiK/Hamex"»Wills,I978;Klng,Spector ,1978/,которые изменяют СН и участвуют в разобщении процессов окисления и фосфо-рилирования /Войников,1987/. Это подтверждается нашими данными о повышении количества СЖ при 17° »увеличении СН мембранных липидов и одновременном значительном повышении АТФ в мицелии 0.japónica.

3.2. Влияние АО на липидообразование О.japónica при неоптимальных температурах выращивания.

При введении АО в среду выращивания 0.japónica при различных температурах культивирования происходит активация ростовых процессов,в частности под действием ПХГ выход биомассы увеличивается в среднем на 10-2096. Интенсификация роста гриба под действием АО сопровождается увеличением доли мембранных липидов»увеличением их СН за счет повышения количества Cjg.g и Схд.з-

При добавлении АО в составе мембранных липидов увеличивается уровень ФЭА,причем при 22° на фоне ионола повышается содержание

®,$С,СМ,а при 33°-®С.Кроме того,под действием АО увеличивается количество стеринов: при 22° соотношение стерины/эфиры стеринов составляет 1,09; при 33° эта величина соответствует 0,95.

Под влиянием АО наблюдаются изменения и в составе НЛ.Обнару-хено,что при введении ионола образуется меньше ТАГ (в среднем на 10-15^) как при 33°,так и при более низких температурах выращивания гриба,что может быть связано со способностью ТАГ использоваться в качестве предшественников в синтезе ФЛ /Taylor,Parks, 1979;Зинченко,1990/.В жирнокислотном составе НЛ при 22° под действием этого АО появляется значительное количество Cj^.q и Cj^.j, доля которых может составлять 1/4 от всех жирных кисло* НЛ,но при 33° количество Cj^.q не превышает

Учитывая,что рост О. japónica при выращивании в условиях не-оптиыальных температур лучше с добавлением АО,можно предположить, что АО создают такие модификации в составе липидной компоненты мембран, которые способствуют лучшему росту гриба в условиях стресса.

3.3. Влияние АО на рост и липидообразование 0..japónica при резком изменении температуры культивирования.

В дальнейших опытах 0.japónica культивировали при резкой смене температур: 24-часовой мицелий,растущий при 33°,переносили на 17°.1ккая постановка опытов позволила изучить начальную реакцию организма на стресс -по современной терминологии- "состояние шока" /Кириллов,1977/.

Показано,что в этот период стресса на фоне торможения процессов роста и образования липидов (рис.3) идет быстрая перестройка мембранных липидов: увеличивается содержание Cj-g.g, Cjg.g, Cj6;j,уменьшается доля Cjq.j и Cjg.g,повышается СН липидов.В составе липидной компоненты мембран резко уменьшается уровень Ш. и ФИ,понижаются значения индексов ФЛ/стерины и стерины/эфиры сте-

Биомасса,

л * i

8 : 16' 1

i

* 33°¡ tI7° ^ * T

6 • 12" i —г?"-

4 ■ 8 ■ i i i 1

24

30

36

Рис.3. Изменения в образовании биомассы (I) и липидов (2)

' С.japónica при резкой смене температуры культивирования.

ринов.Рост мицелия и накопление липидов возобновляются только после отмеченных выше изменений в составе мембранных липидов.

Обнаружен новый факт: в условиях более глубокого охлаждения (10°) отмечено появление в составе мембранных липидов CgQ'4 ® необычно высоких для 0.japónica количествах: 2,0t3,5# от суммы жирных кислот.

Модификации жирнокислотного состава ПЛ являются следствием в изменении уровня их десатурации.Дяя выяснения вопроса,являются ли эти изменения результатом активации десатураз или их синтеза de novo исследовали действие циклогексимида(ЦГ),который вносили в 1 концентрации 50 мкг/мл.Полученные данные (рис.4) позволяют предположить, что образование Cjg-ненасыщенных жирных кислот происходит,в основном,за счет активации существующих десатураз;в то же время ¿9-пальмитоолеил-КоА-десатураза (фермент,осуществляющий де-сатурацию Cjq.q) синтезируется de novo.

■ Для решения вопроса,является ли температура фактором,непосредственно контролирующим десатуразную активность,использовали соединения,изменяющие микровязкость липидного бислоя - 17^-эстра-диолдипропионат (0,002?6) и новокаин (0,01%).Результаты опытов

а 'В

о

*

S 3

ta

* 1 л

г

ч>

§ 0,4 §0,2

о 5 ч *

о г 2 a . 1 (6-

ч fr ■

i X ¡г 1 f» с? (О-

te

* - ^ е- о ь 1? ■

■ а ■ К ■ з-го-• ^ ° е> $ Ч- и «Г а-. -в р

~3 Р пробы

Рис.4. Изменения в жирнокислотном составе ПЛ С. japonic а в условиях низкотемпературного стресса под действием ЦГ.

Обозначения проб: I- 30-часовой мицелий »выращенный при 33°; 2- 24-часовой мицелий, выращенный при 33° и далее 6 ч при 17°; 3 - то же,что 2, но в присутствии ЦГ.

позволили заключить,что модификации в жирнокислотном составе ли. пидов связаны не с изменениями температуры культивирования, а с изменениями в текучести липидной компоненты мембран.

Введение АО при резких изменениях температуры культивирования о.japónica (с оптимальной до 33° и с оптимальной до 15°) вызывает специфические температурозависимые изменения в липидном бислое,способствующие лучшему росту мицелия после выхода из состояния стресса."Пак, АО увеличивают содержание мембранных липидов, повышают их СН, причем при низкотемпературном стрессе в липидах увеличивается уровень /'-Cjg^, а при высокотемпературном - происходит повышение содержания Cjg.j.

- 20 -

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Известно,что в зависимости от концентрации свободных радикалов СРО является не только патологией,но и процессом,обязательно протекающем в норме/Журавлев,1982;Бурлакова,Храпова,1986/.Поэтому исследование действия СРО представляет интерес не только в плане изучения антистрессовой"защиты"организмов,но и как фактора,позволяющего искать новые подходы к управлению клеточным метаболизмом.

Однако с этих позиций мицелиальные грибы до недавнего времени не пользовались вниманием исследователей,хотя,эти низшие эука-риоты все активнее доказывают свою значимость для современной биотехнологии /Bajbidor et al .,1988; Kazuhiro.Busuau,1989/.Поэтому представляется актуальной задача настоящей работы - изучить влияние АО на липидообразование и рост мицелиального гриба 0.japonice (потенциального продуцента липидов) в условиях нормы и при действии наиболее распространенного стрессового фактора - температуры» Отметим,что АО - это соединения,активно влияющие на интенсивность протекания процесса СРО в организмах /Бурдакова и др.,1982/.

В настоящей работе впервые показано,что АОА липидов,тесно связанная с количеством АО в мицелии.является величиной,позволяющей определить,в какой фазе роста находится организм,что может быть полезным критерием в биотехнологических процессах.Высокие ' значения АОА характерны для фазы активного роста гриба(трофофазы) и строго коррелируют с определенным составом мембранных липидов (преобладанием ФЭА и ®С),низкими значениями их микровязкости и высокой СН,обусловленной наличием полиеновых жирных кислот (Cjg.g,

• На модели низшего эукариота - О.japónica - получены новые данные о механизме действия синтетических и природных.АО,в том числе синтезируемых самим грибом.Добавление этих соединений как

бы "омолаживаёт" клетку: стимулирует ростовые процессы и соответствующим образом модифицирует состав мембранных липидов,увеличивает их ненасыщенность и повышает содержание стеринов.В специфике изменения липидного состава обнаружены некоторые отличия,связанные с химическим строением испытанных АО.

Изучение действия неоптимальных температур на рост,ультраст-руктуру и липидообразование О. japónica позволило высказать соображение о наличии у низших эукариотов -грибов- ряда биохимических механизмов адаптации к стрессу.Из них в плане новизны заслуживают внимания температурозависимые изменения изомерного состава ациль-ных цепей липидов,изменения в мембранах содержания Сзд-С^-кислот и появление повышенного количества CgQ.^ при резком охлаждении мицелия,а также модуляции в содержании пула 33! в связи с особой ролью фосфоинозитидов в передаче информации в клетке /Расмуссен, 1989/.Отмеченные температурозависимые изменения в содержании стеринов подтверждают важную роль этих липидов в процессах адаптации клетки Aates et al.,I984;Hodriques et al., 1955/.У С.japónica в условиях низкотемпературного стресса обнаружена десатурация Cjg.g и повышение уровня Cjg.j,т.е.наблюдается адаптационный механизм регуляции текучести липидного бислоя,ранее установленный только для силиат /Kasal et al . ,1985/.Показано,что у грибов,также как у растений /Войников,1988/ и животных /Куликов и др.,1988/, при адаптации к низким температурам увеличение количества CSK сопровождается усиленным синтезом ATO и цитологическими изменениями, в частности изменениемструктуры митохондр:гй. ,'

Использование ингибитора синтеза белка позволило получить данные о регуляции десатурации липидов при действии неоптимальных температур.На основании результатов опытов с ЦТ высказывается предположение, что основным контрольным механизмом при модификации

ацильных цепей является изменение активности десатураз,синтез этих ферментов ae novo отмечен только для пальмитоолеил-КоА-десатуразы. Следовательно,в этом отношении грибы отличаются от прокариотов, у которых основная- температурозависимая десатурация липидов осуществляется путем синтеза ферментов de novo /Хочачка,Сомеро,1988/. На основании данных о действии со единений, повышающих и понижающих текучесть липидного бислоя (эстрадиола и новокаина)»предполагается, что указшиые механизмы биохимической адаптации,в частности контролирующие состав ацильных цепей липидов,модулируются у мицелиаль-ных грибов изменениями в микровязкости липидной компоненты мембран.

Б настоящей работе получены данные,позволяющие считать АО антистрессовыми соединениями,способствующими более быстрому установлению состояния энантиостаза мембран.Об этом свидетельствуют: интенсификация ростовых процессов после выхода культуры из состояния стресса,увеличение СН липидов и активности адаптационных десатураз.

Установленные закономерности в действии АО,а именно роль этих соединений как модификаторов липидной компоненты мембран, может найти применение при создании биотехнологических разработок, основанных на новых подходах к управлению метаболизмом грибов. В более конкретном аспекте АО могут быть использованы как интенсификаторы ростовых процессов, для получения более ненасыщенных 56Л и увеличения выхода полиеновых жирных кислот.

ВЫВОДЫ

I.Установлена взаимосвязь между антиокислительной активностью (АОА) липидов,их физико-химическими свойствами и определенными фазами роста 'С.japonica . В трофофазе полярные липиды имеют высокую АОА,низкие значения микровязкости,высокую степень ненасыщенности. Замедление роста сопровождается уменьшением АОА.увеличени-

ем микровязкости и насыщенности липидов. Нейтральные липиды на всех стадиях роста 0.japónica имеют более низкую АОА и являются более насыщенными,чем полярные.

2.Исследованные синтетические (б-метил-2-этил-З-оксипиридин хлоргидрат, ионол, танол, 4,4'-дикумил-дифенил-азотокись) и при- . родные АО (¿-токоферол и полученные из 0.japónica и мицелиальных грибов порядка Asconycetales ) стимулируют рост С.japónica »синтез липидов и модифицируют состав липидной компоненты мембран: увеличивают степень ненасыщенности липидов.уровень фосфатидилэта-ноламина и стеринов,понижают содержание холинсодержащих липидов.

В составе биоантиоксидантов 0.japónica ¿-токоферол не обнаружен.

3.У 0.japónica обнаружены следатощие биохимические механизмы термоадаптации: изменение ненасыщенности и длины ацильных цепей мембранных липидов,модификации изомерного состава линолевой и ли-ноленовой кислот, изменение состава фосфолшщцов,соотношения стерины/эфиры стеринов и количества свободных жирных кислот.

На основании опытов с использованием циклогексимида установлено,что температурозависимая десатурация осуществляется главным образом путем индукции активности десатураз,синтез de novo наблюдается в случае десатурации Cjg.Q до С^.рИспользование соедине-? ний,изменяющих микровязкость липидного бислоя(новокаина и Г^д-эст-радиолдипропионата) »позволяет предположить,что индукция десатурации липидов контролируется модуляциями текучести липидного бислоя.

4.Температурозависимые модификации в составе липидной компоненты мембран взаимосвязаны с изменениями в ультраструктуре (например, в составе и морфологии клеточной стенки и липидных гранул) и метаболизме клеток, в частности потреблении субстрата, содержании А1Ф.

5.Введете АО при культивировании С.japónica в условиях стресса способствует интенсификации роста и делает мембранные -ти-

пздц более ненасыщенными,повышает в их составе долю фосфатидшгэ-таноламипа,изменяет содержание фосфатидилхолина.При этом отмечается определенная специфика в действии АО при резком изменении температурь1 культивирования: при высокотемпературном стрессе в мембранных липидах увеличивается содержание Cjg.j, а при низкотемпературном - Cjg.g.

6.Установление функциональной роли АО как модификаторов состава мембранных липидов и стимуляторов роста позволяет предложить ряд практических рекомендаций по их использованию в биотехнологии. АО могут применяться для увеличения выхода: липидсодержащей биомассы С,japónica .высоконенасыщенных фосфолипидов,полиненасыщенных жирных кислот.Культуральная жидкость после выращивания мицелиаль-ных грибов может использоваться для получения АО микробного происхождения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1.Кузнецова Л.С.Реактивность липидов Onnninghamella japónica и механизм адаптации к изменению температуры//Тр.1У Всесоюзн.конф. по "Втологии клетки".-Тбилиси,1985.-С. 358.

2.$еофилова Е.П. .Ермакова Е.Б. (Кузнецова Л.С. и др. Влияние синтетического антиоксиданта на образование липидов и их состав у Cunninghamella japónica //Прикладная биохимия и микробиология!-I986.-T.XXII, вып.2.-С. 248-253.

3.Феофилова Е.П. .Кузнецова Л.С..Розанцев Э.Г. .Широкова Е.А. Влияние температурных воздействий на состав липидов Cuimingh.amel-la japónica //Микробиология.-1986.-Т.55, вып.5.-С. 737-744.

4.Кузнецова Л.С..Феофилова Е.П. Изменения в составе липидов . Cvmninghamella japónica в ответ на температурные воздействия//

17 научи.конф.мол.ученых биол.фак.МГУ"Проблемы современной биологии".-М. ,1986.-4.1.-0. 96-100,- Деп. в ВИНИТИ.

Б.Феофилова Е.П. .Кузнецова JI.C. Влияние природных и синтети-lecKiix антиоксидантов на рост и липидообразование микроскопически грибов//Тез.докл.П Всесопзн.конф.пБяоантио:?сидянт".-Чер:ого-[овка,1986.-Т.1.-С. 46-47.

6.Кузнецова Л.С. .Полотебнова М.В..Шеофилова Е.П. и др. Из.ме-¡ення физико-химических свойств липидов в процессе роста мукоро-юго гриба Cunninghanella japónica //Биологические науки.-1987,-? 2.- С. 73 - 79.

7.1Сузнецова Л.С. .Зэофилова Е.П. .Григорян Г.Л..Пивоварова Т.Л. !лишшс теипоратургг культивирования на удьтраструкттру Ounningha-ella japónica и некоторое физико-химические свойства липидов// Ькробиологил, -7, 55, вып. б. -С. 995-1000.

8.?софилова Е.П..Еурлакова Е.Б. .Кузнецова Л.С. Значение реак-рй свободнорадикального окисления в регуляции роста и литтидообра-овшшя эукариотшас и прокариотннх организмов//Прикладаая биохи-кя и жт{робпслогия.-1937.-Т.ХлШ,вып.1.-С.З-13.

Э.ЗЬофилова Е.П..Кузнецова Л.С.,Когтев Л.С..Широкова Е.А. Бмлературний nroic и состав липидов мукорового гриба Cunninghamel-La japónica//'Прикладная биохимия и микробиология.-1969.-Т.ХХУ, пп.З.-С. 373 - 384.

ГО.Феофилога Е.П. .Вурлакова Е.Б. .Кузнецова Л.С. Значение ре-лщий свободнорадикальчого окисления в процессах роста и цитодиф->еронцировки зукариотных организмов //Тез.докл. III Всесоюзн. онф. "Втоантиоксидант".-М., 1989. -Т. I.-С. 86-87.

П.Фаофплова Е.П. .Кузнецова Л.С..Гряэнова М.В. и др. Биохими-еские механизмы адаптацга к тешературному стрессу и тергопротек-opu мицслиалмшх грибогУ/Всессгон.конф."Антропогенная экология икрожцетов, охрана окружавшей среди и аспекты математического мо-елирования".-Киев,1990.-С. 72-73.

Поцп, в веч. ¿O.üS.OOr. Тирзтс НО эпз, Заказ ü Б532

Централизованная типография ГА "Союзстройматериалов"