Механизмы галоадаптации микроорганизмов в условиях гипоксии

Гейдебрехт, Олег Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы галоадаптации микроорганизмов в условиях гипоксии
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы галоадаптации микроорганизмов в условиях гипоксии"

На правах рукописи

ГЕЙДЕБРЕХТ Олег Викторович

МЕХАНИЗМЫ ГАЛОАДАПТАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИИ

Специальность 03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2003

Работа выполнена в Институте микробиологии РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Плакунов В. К.

Научный консультант: доктор биологических наук

Арзуманян В. Г.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Горленко В. М.

доктор биологических наук, профессор Ивановский Р. Н.

Ведущая организация: Кафедра биологии почв почвенного

факультета МГУ

Защита диссертации состоится 8 декабря 2003 года в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д.002.224.01 в институте микробиологии РАН по адресу: 117332, г. Москва, Проспект 60-лет Октября, д. 7, к. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН.

Автореферат разослан " " ноября 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

л. Е. Никитин

331ÏÏ A i

Актуальность темы. Естественная среда обитания (микро)организмов характеризуется совокупностью множества физических, химических и биологических факторов. Не вызывает сомнений, что естественные места обитания не всегда являются оптимальными для роста и размножения организмов, т. е. в природе на микроорганизмы часто действует хотя бы один фактор, который можно охарактеризовать как стрессорный (стрессовый). Изучение жизни микроорганизмов в условиях неблагоприятных воздействий является важной задачей микробиологии и издавна привлекало исследователей [Кашнер, 1981]. На сегодняшний день основным подходом в изучении стрессорных воздействий остается исследование действия какого-либо одного стрессора на рост и метаболизм бактериальной или дрожжевой монокультуры. Такой принцип исследования важен и оправдывает себя простотой постановки экспериментов и интерпретации полученных данных. Имеется множество работ, посвященных изучению воздействия на микроорганизмы одиночных стрессорных факторов и механизмов адаптации к ним [Кашнер, 1981; Гусев и Минеева, 1992]. Наиболее изученными являются такие стрессоры, как гипертермия [Тэнси и Брок, 1981, Hottiger et all, 1987; Collinson and Dawes, 1992; Mutoh et all, 1995; Mojica et all, 1997; Kilstrup et all, 1997; Macario et all, 1999], неоптимальные концентрации NaCl [Larsen, 1962; Brown and Simpson, 1972; Shindler, 1976; Lukas et all, 1990; Van Zyl et all, 1990; Galinski and Truper, 1994], факторы, вызывающие окислительный стресс [Fridovich, 1975; Wilkins et all, 1978; Гаенко с соавт., 1985; Imlay et all, 1988; Tran et all, 1993; Jamieson, 1995].

кроссадаптацией/защитой или антагонизмом стрессорных факторов [Leblanc et all, 2000; Nanasombat, 2001; Park Sang-Ho et all, 2001; Kim Woojin et all, 2001]. При этом может происходить увеличение

степени толерантности к определенному стрессору (стрессорам), иногда перерастание толерантности в зависимость ("-фильность"). Явление перекрестной адаптации на сегодняшний день изучено недостаточно. Сейчас только происходит накопление данных о сочетанием воздействии стрессоров. Наибольшее внимание уделяется таким сочетаниям, как гипертермия и неоптимальные концентрации NaCl [Кунтиков и Горленко, 1998; Leblanc et all, 2000; Periago et all, 2002a, 2002b], углеродное голодание, гипертермия и осмотические стрессоры [Мссапп, 1993; Murata, 1999; Herbert and Foster, 2001], осмотические стрессоры и Н202 [Hartke et all, 1995; Browne and Dowds, 2001], воздействие ультрафиолетового излучения и углеродное голодание [Srinivasan and Kjelleberg, 2001] и др. Изучение же механизмов адаптации к совместному действию стрессоров находится в начальной стадии.

Весьма распространенным сочетанием стрессорных факторов в естественных условиях обитания микроорганизмов является высокое осмотическое давление (в частности, избыток NaCl) и недостаток кислорода. Примерами экосистем, характеризующихся высоким содержанием NaCl и низким парциальным давлением кислорода, могут служить пластовые воды нефтяных месторождений, почвы мангровых лесов, морские донные экосистемы и др. Кроме того, подобные же условия могут возникать при очистке загрязненных почв или сточных вод с высокой соленостью. Сочетанное воздействие гипоксии и гиперосмотических условий на микроорганизмы практически не изучено, по крайней мере, нам не удалось обнаружить таких работ. Исследования в этом направлении проводились только в лаборатории нефтяной микробиологии ИНМИ РАН [Арзуманян с соавт., 2000], которые и послужили отправной точкой для данной диссертации.

Таким образом, очевидна актуальность изучения влияния гипоксии и повышенных концентраций NaCl на микроорганизмы, выделенные из различных экосистем, а также актуальность изучения механизмов адаптации к такому воздействию.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования явилось изучение параметров роста и жизнедеятельности эукариотных и прокариотных микроорганизмов в условиях повышенных концентраций NaCl и гипоксии.

Задачи исследования:

1. Идентификация неколлекционных штаммов микроорганизмов, исследованных в данной работе.

2. Изучение одновременного влияния на рост микроорганизмов повышенного содержания NaCl и низкого содержания кислорода в среде.

3. Изучение дыхания микроорганизмов при высоком содержании NaCl и низком содержании кислорода в среде.

4. Изучение влияния комбинированного действия NaCl и гипоксии на каталазу микроорганизмов, как один из белков общего стрессорного ответа.

5. Изучение состава внутриклеточных аминокислот у микроорганизмов в условиях гипоксии и гиперосмотического стресса.

Научная новизна. Впервые проведено исследование сочетанного действия высоких концентраций хлорида натрия и низкого парциального давления кислорода на эукариотные и прокариотные микроорганизмы.

Проведено изучение роста, дыхания, активности каталазы и состава внутриклеточных аминокислот в этих условиях. Впервые показано усиление галофильных/галотолерантных свойств для Candida lipolytica, Rhodotorula aurantiaca, Candida rhagii, Debaryomyces hansenii и Rhodococcus erythropolis в микроаэробных гиперсолёных условиях. Показано, что при росте на богатых средах микроорганизмы (на примере Candida lipolytica) значительно лучше адаптируются к стрессорным условиям, чем при росте на синтетических, даже содержащих осмопротекторы (глицерин).

Впервые обнаружено, что в микроаэробных гиперсолёных условиях происходит усиление дыхания микроорганизмов, клетки которых изначально находились в стрессорных условиях (для всех видов). При этом гипоксия нивелирует действие высокой концентрации соли, т.е. проявляет антагонистический эффект. Для неадаптированных клеток показано подавление дыхания.

Впервые показано, что микроаэробных гиперсолёных условиях, наблюдается значительное усиление активность каталазы для культур изначально находившихся в стрессорных условиях (для Candida lipolytica, Rhodotorula aurantiaca, Candida rhagii и Debaryomyces hansenii). Для неадаптированных клеток обнаружен обратный эффект.

Впервые показано, что при сочетанием действии высокого содержания NaCl в среде и низкого парциального давления кислорода, происходит заметное увеличение внутриклеточного пула большинства аминокислот.

Впервые экспериментально показана осмопротекторная роль внешней липидной оболочки для дрожжей рода Malassezia..

Научно-практическая значимость. Полученные результаты расширяют представление о поведении микроорганизмов в сложных стрессорных условиях и о механизмах защиты от сочетанного действия гипоксии и осмостресса. Результаты работы позволят дать рекомендации по более эффективному применению микроорганизмов в системах биологической очистки в экстремальных условиях; по методам антимикробной обработки материалов, используемых в разных сферах жизнедеятельности человека, а также пищевых продуктов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Школе

- конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), 21st International Specialized Symposium on Yeasts "Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Ecology of Non-conventional Yeasts (NCY)". (Lviv, Ukraine. August 2001), 1-й Съезде микологов России (Москва, 2002), XV Международной зимней молодёжной научной школе (Москва, 10-14 февраля 2003), 1-й Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 20-21 февраля 2003), 23rd International Specialised Symposium on Yeasts "Interactions between Yeasts and other Organisms" (Budapest, Hungary. 26 - 29 August. 2003).

Публикации. По теме диссертации, включая тезисы, опубликовано 9 печатных работ, из них 2 полнотекстовых статьи и 7 тезисов; 1 тезисы приняты к публикации.

Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 157 страницах и включают 2 фотографии, 27 рисунков и 12 таблиц. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Экспериментальная часть" (включающая главы "Объекты и методы исследования" и "Результаты и обсуждения"), "Заключение", "Выводы" и "Список литературы", который содержит 82 работы отечественных и 106 зарубежных авторов.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность всем сотрудникам лаборатории нефтяной микробиологии ИНМИ РАН, особенно K.6.H. Б. И. Милехиной, к.б.н. И. А. Борзенкову, к.б.н. А. Л. Тарасову и зав. лаб. д.б.н. С. С. Беляеву; сотрудникам National Collection of Agricaltural and Industrial Microorganisms dr. Judit Tomai-Lehoczki, dr. Denes DIauchy и dr. Gâbor Péter; д.б.н. В. M. Горленко и д.б.н. Р. Н. Ивановскому любезно согласившимся оппонировать работу.

Особую признательность автор выражает научному руководителю д.б.н. В. К. Плакунову за огромную помощь в работе вообще и объяснении теоретических аспектов в частности, д.б.н. В. Г. Арзуманян за постоянное внимание и помощь в практической области, массу ценных советов и замечаний, О. В. Шелемех за серьёзную помощь в работе.

Работа проводилась при частичном финансировании в рамках проекта РФФИ 01-04-48275, подпроекта "Биотехнология повышения нефтеизвлечения" ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения", Государственных контрактов с Минпромнауки РФ № 43.106.11.0009 и № 43.073.11.2515 и MAC 03-04-06288.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования были 6 штаммов про- и эукариотных микроорганизмов:

1 и 2. Rhodococcus erythropolis (штамм 367 - 6) и Candida lipolytica

(штамм 367 - 3), выделены из пластовых вод Бондюжского нефтяного месторождения Татарстана (содержание солей до 272 г/л). Получены от к.б.н. Е. И. Милехиной (ИНМИ РАН);

3. Rhodotorula aurantiaca (штамм 786), выделена из соленой воды Сакского лимана (Крым). Получена от д.б.н. В. Г. Арзуманян (ИНМИ РАН);

4. Malassezia sp. (штамм 607), выделена с поверхности кожи здорового человека. Получена из коллекции Института вакцин и сывороток им. Мечникова;

5. Candida rhagii (ВКМ Y-2339), выделена из активного осадка на нефтехимическом заводе г. Ангарск. Получена из ВКМ;

6. Debaryomyces hansenii (ВКМ Y-116), выделен из муки семян хлопка. Получена из ВКМ

Методы культивирования и анализа. Микроорганизмы поддерживали на глюкозо-пептон-дрожжевом агаре [Yarrow, 1998], а Malassezia sp. - на модифицированной агаризованной среде Диксона [Guillot et all, 1996]. В среды, на которых культивировали дрожжи, добавляли антибиотик цифран (0,2 мг/мл) для подавления случайного роста бактерий.

R. erythropolis, С. lipolytica, С. rhagii, R. aurantiaca и D. hansenii выращивали в жидкой среде ГПД, либо в синтетической среде, состоящей из солевой основы с добавлением углеродного субстрата -глюкозы или глицерина. Malassezia sp. - в жидкой среде Диксона, содержащей Tween 40 в качестве основного источника углерода [Guillot et all, 1996]. В среды, на которых культивировали дрожжи, добавляли антибиотики (бензилпенициллина натриевая соль, 2,5 мг/мл).

Культивирование микроорганизмов проводили во флаконах объемом 100 мл, содержащих 20 мл жидкой среды на качалке при скорости вращения 150 об/мин, температуре 27-28° С, рН 7.2 для R. erythropolis и рН 5.4 для дрожжей (поддерживали с помощью калий-фосфатного буфера, 1,1 мМ). Для контроля кислотности сред использовались рН-метры рН-340 или PICCOLO Ш 1290.

При аэробном культивировании микроорганизмы выращивали под ватными пробками.

Для создания микроаэробных условий флаконы закрывали резиновыми пробками, проколотыми шприцевыми иглами диаметром 0,8 мм с неплотными ватными шариками. При микроаэробном выращивании среду во флаконах предварительно барботировали аргоном. Содержание кислорода в газовой фазе на начальном этапе культивирования не превышало 1 -2 %. Применение сульфитного метода определения интенсивности аэрации [Егоров, 1976] показало, что степень аэрации в микроаэробных условиях составляет около 1% от аэробных.

Различные концентрации соли в среде культивирования создавали

добавлением ЫаС1 (вес/объем). Флаконы со средами стерилизовали при 1 атм. в течении 30 мин.

Контроль чистоты культур осуществлялся в световом бинокулярном микроскопе САНЬгЕКБ ЛЯ<1А. Для определения количества выросших колоний в экспериментах с Л/а/гшег/а эр. использовали бинокулярную лупу МБС-10.

Рост культур измеряли по сухой биомассе, оптической плотности, содержанию белка и углерода. Измерение условной оптической плотности (светопоглощение + светорассеяние) проводили при длине волны (А,) 540 нм на нефелометре КФК-2-УХЛ 4.2. В качестве контроля использовали дистиллированную воду. Определение содержания белка проводили по методу Лоури [Ъошгу е1 а1, 1951]. Определение содержания органического углерода проводили по модифицированному методу Паникова [Паников с соавт., 1988].

Качественное и количественное содержание аминокислот определяли методом тонкослойной хроматографии [Плакунов и Волкова, 1991] и на аминокислотном анализаторе.

Определение активности катал азы проводили манометрическим методом [Хазиев, 1976]. Для опытов использовали 4-х суточные отмытые суспензии клеток дрожжей. В 5 мл 0,5 М раствора калий-фосфатного буфера рН 5,4 добавляли биомассу до достижения оптической плотности 0,33 ед. и 0,25 мл 10% Н2О2. Конечный объём реакционной смеси - 5,25 мл. В опытах с очищенным ферментом вносили 80 ми/мл каталазы [Е.С. 1.11.1.6; 1СЫ].

Потребление кислорода клетками определяли амперометрическим методом [Шольц и Островский, 1965] на полярографе ЬР-7 с хлорсеребряным и платиновым электродами. Рабочий объём ячейки 2 мл. Суспензии клеток дрожжей (4-х суточные) готовили непосредственно перед измерением. Клеточную биомассу центрифугировали при 7000 об/мин и ресуспендировали в калий-фосфатном буфере, содержащем количество ЫаС1, соответствующее среде культивирования. Измерение проводили в калий-фосфатном буфере, содержащем 1% глюкозы (С. Иро1уНса, С. гка^г, ДА. аигапНаса, £). ИапьепЩ или 1% бычьей желчи, 1% Т\уееп 40, 0,1% аспарагина (МаШБЫа ¿р.), в присутствии 15% ЫаС1 или без добавления ЫаС1. Азид натрия и салицилгидроксамовую кислоту (СГК) вносили до конечных концентраций 2 мМ и 4 мМ соответственно.

Определение концентрации кислорода в газовой фазе над опытной культурой /?. егуйьгороШ проводилось на газовом хроматографе СБ 3300. Пробы отбирали микрошприцем объемом 500 мкл, объем пробы составлял 200 мкл.

Методы статистики. Большинство иллюстраций в данной работе отражает результаты типичных экспериментов, выбранных из 5-7 повторностей опытов, в таблицах приведены средние данные

нескольких опытов. Коэффициенты корреляции, стандартное отклонение и др. рассчитывали по методам, заложенным в Microsoft Excel, пользуясь пособием Платонова {Платонов, 2000].

Результаты и обсуждение 1. Идентификация исследованных микроорганизмов

1 2 3 4 5 б

II * :

* АкЛ

Рис.1. ПЦР диагностика штаммов дрожжей родов Candida, Rhodotorula.

1,6- маркер Sigma Р-9577;

2 - Rhodotorula sp., исследуемый штамм,

3 - Rhodotorula aurantiaca NCAIM1123;

4 - Candida sp., исследуемый штамм;

5 - Candida lipolytics NCAIM 1087

Справа указаны применённые рестриктазы.

Родовую и видовую идентификацию дрожжей

Candida (Yarrowia) sp. и Rhodotorula sp. осуществляли классическими методами путем проведения культуральных, морфо-цитологических и

физиолого-биохимических тестов [Бабьева и Голубев, 1979, Yarrow, 1998] с использованием компьютерной программы "Yeast identification program. Version 4" [Barnett et all, 1996]. Результаты идентификации подтверждали методом ПЦР генов рибосомной ДНК, осуществленным на базе Венгерской национальной

коллекции микроорганизмов (Будапешт) [Lieckfeldt et all, 1993].

Для исследования

использовали 1-суточную

биомассу, клетки помещали в буфер СТАВ (2 % гексадецилтриметил аммоний бромид, 100 мМ Трис-HCl рН 8,0, 1,2 М NaCl, 20 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотрейтол), с меркаптоэтанолом и подвергали трёхкратному последова-

тельному замораживанию в жидком азоте, чередующемуся с оттаиванием в термостате при 60°, после чего смесь центрифугировали. Испытуемые образцы подвергали обработке (с

центрифугированием и отделением жидкой фазы после каждой стадии) раствором хлороформа-изоамилового спирта (дважды), изопропанола (дважды), ТЕ буфером (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5). Полученный образец объёмом ~ 10 мкл, помещали в ТЕ буфер для последующего анализа или хранения при -20°.

Для ПЦР анализа генов рибосомной РНК образцы помещали в смесь, содержащую 50 мМ КС1,10 мМ Трис-HCl (рН 9,0), 1% Тритон X-100, 0,2 мМ dNTP, 2мМ MgCl2, 20 нг каждого праймера и Tag-DNA-полимеразу (1 ед) (Promega М-1861). Использовалась пара праймеров NS1/TTS2. Амплификацию проводили на циклере Techne Progene Thermal Cycler с денатурацией при 93° (3 мин и 22 цикла по 1 мин), отжигом при 55° (1 мин) и элонгацией при 72° (2 и 5 мин). В работе использовали стандартный набор рестриктаз Нае Ш, Msp I, Alu I. Электрофорез фрагментов проводили на агарозном геле с ПЦР маркером Sigma Р-9577. Гели окрашивали бромистым этидием (0,5 мкг/мл), отмывали дистиллированной водой, фотографировали, сканировали и результаты переводили в цифровую форму для последующего анализа в программе Molecular Analyst Fingerprint 1.0.

ПЦР анализ подтвердил ранее установленную видовую принадлежность штамма Rhodotorula aurantiaca. Штамм, первично определённый как Yarrowia lipolyíica, был идентифицирован как Candida lipolytica (рис. 1), что подтверждено также отсутствием способности к образованию аскоспор.

Видовую идентификацию липофильных дрожжей Malassezia проводили по методу липидных добавок [Guillot et all, 1996]. Результаты, полученные данным методом, уточняли путем кариотипирования ядерной ДНК [Johnston et all, 1986; Boekhout et all, 1993] на базе Венгерской Национальной коллекции микроорганизмов (Будапешт).

Для исследования использовали 3-х суточную биомассу, клетки осаждали центрифугированием, промывали дистиллированной водой и ресуспендировали в 0,05 М ЭДТА, рН 8,0. Конечный объем проб составлял 0,5-0,8 мл. К суспензиям клеток добавляли зимолазу до конечной концентрации 6 мг/мл и 0,5 мл высокоочшценной агарозы до концентрации 1%. Смесь заливали в пластиковый контейнер (гребенку) для полимеризации на 20 мин при 4°С. Образцы геля помещали в буфер, содержащий 0.5 М ЭДТА, 0.01 М Трис-HCl, 7.5% меркаптоэтанола (рН 7,5) и инкубировали 16 ч. Затем образцы промывали трижды по 15 мин 0,05 М ЭДТА (рН 8,0) и инкубировали 16 ч при 50° в буфере, содержащем 0,01 М Трис-HCl, 0,5 М ЭДГА, 1% лаурилсаркозина и протеиназу К (1 мг/мл), рН 7,5. После 15 мин отмывания в 0,05 М ЭДТА образцы хранили при 4° в течение месяца.

Chromosome, slzefkb)

9 10 11

XII 2200

IV 1600

XV,VII 1125

XVI 1020

ХП1 945

&» В25 785

X «8

XI 680

V 610

«II 565

IX 450

ш 365

VI 2В5

I 225

Рис. 2. Кариотипирование хромосомной ДНК Malassezia sp.

1 - S. cerevisiae YNN 295 (Biorad standard);

2 - Malassezia slooffiae7 CBS 7956;

3 - Malassezia sympodialis7 CBS 7222;

4, 8-11 - образцы Malassezia из коллекций NCAIM (Budapest) и НИИВС им.Мечникова РАМН

6 - 7 - Malassezia sp., исследуемый штамм;

Слева указаны тип хромосомы и размер в т.п н.

Образцы, содержащие интактную хромосомную ДНК, заливали 1% раствором агарозы для фиксации в новом геле. Затем после застывания проводили пульс-электрофорез в буфере следующего состава: 45 мМ Трис-основание, 45 мМ борная кислота и 1 мМ ЭДТА при 14° в течение 16-18 ч. Гели окрашивали

бромистым этидием (0.5 мкг/мл) и отмывали дистиллированной водой, затем фотографировали на трансиллюминаторе при 300 нм. В качестве метчиков использовали стандартные наборы фирмы "Вшаб" (рис. 2).

По совокупности применённых методов нельзя сделать однозначного заключения о видовой принадлежности штамма. Он обладает как признаками М.

sympodialis (способностью образовывать симподиальные почки), так и признаками М. furfur. Вероятно это новый вид рода Malassezia.

2. Параметры роста

Одним из основных показателей отношения организма к условиям окружающей среды являются ростовые характеристики - скорость роста, максимум накопления биомассы в определённых условиях и в определённой фазе, диапазон наилучшего роста, соответствующий определённому диапазону концентраций субстрата и др. На ростовых показателях в зависимости от содержания №С1 в среде основано

разделение микроорганизмов на галотолерантные, галофильные и негалофильные [Ьагееп, 1962; Кашнер, 1981]. Использование нескольких методов измерения роста исследуемых культур (по сухой биомассе, оптической плотности, содержанию белка и углерода) показало наличие между ними высокой степени корреляции (коэффициент корреляции по Пирсону 0,97-0,99), что позволило нам остановится на наиболее удобном - оптической плотности.

Согласно полученным нами данным для исследованных культур дрожжевых микроорганизмов характерны разные закономерности изменения параметров роста в аэробных и микроаэробных условиях при возрастании концентрации №С1 в среде. Как показано на рис. 3, в аэробных условиях С. Иро1уИса проявляла себя как галотолерантный микроорганизм. Ма1авзе21а $р. и Я. аигапйаса занимают промежуточное положение, их можно охарактеризовать как слабых галофилов -галотолерантов. Остальные культуры - С. и О. катепи - показали

себя как слабые или умеренные галлофилы.

Очевидно, можно разделить микроорганизмы на две группы по характеру зависимости накопления биомассы от концентрации №С1. В первую группу входят С. Иро1уйса, С. гЬаф и £>. Натеки - они проявляют высокую толерантность к содержанию соли в среде, что выражается в наличии платообразного участка на кривой роста. Вторую группу составляют Я аигапйаса и Ма/аиел'а вр. - эти микроорганизмы также достаточно устойчивы к действию КаС1 и по абсолютным величинам накопления биомассы опережают первую группу, но ничего похожего на плато у них не наблюдается - при концентрациях соли в среде, больших, чем оптимальные, происходит пропорциональное снижение величин накопления биомассы с увеличением содержании

При выращивании данных культур в микроаэробных условиях отношение к ИаС1 меняется (рис. 3 и табл. 1). Наиболее значительные перемены происходят с С. Нро1уНса - культура из галотолерантной превращается в умеренно галофильную. У культуры Б. капзепН происходит смещение оптимума роста - микроорганизм становится ещё большим галофилом, чем в аэробных условиях. А/а/а&уегиз! «р. в микроаэробных условиях, наоборот, растёт хуже - диапазон оптимального роста сокращается. К аигапНаса в микроаэробных условиях становится менее зависимой от ЫаС1, но при высоких концентрациях ЫаС1 рост в микроаэробных условиях более выражен чем в аэробных. С. гкав микроаэробных условиях становится ещё более толерантна к ЫаС1 - диапазон оптимального роста расширяется.

контроля

Ось ординат - оптическая плотность, % относительно контроля Ось абсцисс - ИаС1, %

1 - аэробные условия культивирования

2 - микроаэробные условия культивирования Контроль - клетки выращенные в отсутствие ЫаС1

Таблица 1. Определённый статус исследованных видов

Вид „. аэробный рост нифоаэробныйфос*

СалсМа ИрЫуЧса галотолерант умеренный галофил

яг/юЛ><ош/а аигапИаса слабый гешофил - галотолерант

Ма/азйегю эр. слабый галофил - галотолерант

СагмИс1а гЬадп слабый - умеренный галофил

ОеЬагуотусвв ЬапзвпН слабый галофил умеренный галофил

3. Дыхание

Как показано многими исследованиями при различных видах стрессорных воздействий [Акименко и Меденцев, 1976; Michea-Hamzerhpour and Tunan, 1987; Habel et all, 1991; Rallies et all, 1998; цикл работ Рихванова с соавт., 2001-2003], в том числе при осмострессе [Андреищева с соавт., 1997] и гипоксии [Акименко, 1981], происходит изменение дыхательной системы микроорганизмов. При этом отмечаются неоднозначные отношения между цитохромоксидазой и цианидрезистентной оксидазой. Получены свидетельства того, что при некоторых стрессорных условиях в клетке может происходит переключение на дыхание по цианидрезистентному пути (данный путь, как и саму цианидрезистентную оксид азу, часто называют альтернативным, что верно лишь отчасти, поскольку существуют и другие оксидазы и пути дыхания). При этом известно, что цитохромоксидаза обладает значительно большим сродством к

кислороду [Moore and Siedow, 1975], а исследование Акименко с соавт. [2003] показало участие цианидрезис-

тентного пути в клетке только при высоком уровне энергообеспеченности процессов метаболизма в клетке. Таким образом, переключение на цианид-резистентный путь дыхания можно охарактеризовать не как общий механизм защиты от стрессорных воздействий, а как видоспецифичный. Особенностью цитохром-оксидазного пути дыхания, которую необходимо

отметить как важное обстоятельство для

интерпретации наших

данных, является

обязательное образование активных форм кислорода контроль - клетки выращенные и [Уайт с соавт., 1981].

инкубированные в аэробных условиях в Нами проведено

отсутствие NaCI исследование скорости

Таблица 2. Скорость дыхания микроорганизмов в аэробных и микроаэробных условиях, в зависимости от содержания ЫаС1 в среде культивирования и инкубации, % относительно контроля.

NaCI в

среде роста

инкубации

Условия культивирования

0=> 0

15=> 15

15=> 0

0=> 15

Аэробные

С. lipolytica

100 261,4 151,6 29,4

R. aurantiaca

100

198,8

129,9

19,3

М sp.

100

134,8

125,9

103,1

С. rhagii

100

171,0

222,3

22,6

D. hansenii

100

149,1

167,6

13,6

Микроаэробные

С. lipolytica 148,5 208,5 157,9 24,8

R. aurantiaca 129,4 197,1 51,9 38,9

M. sp. 107,5 108,0 68,9 92,5

C. rhagii 125,4 191,8 196,6 89,6

D. hansenii 61,0 103,2 135,4 37,6

Таблица 3. Оксидазы, выявленные ингибиторным анализом.

дыхания микро-

организмов при разных условиях аэрации и концентрациях NaCI в среде, и влияния на этот процесс ингибиторов -азида натрия и салицилгидроксамовой кислоты.

Полученные нами данные, обобщённые в таблицах 2 и 3, позволяют выявить следующие закономерности в процессе дыхания исследованных микроорганизмов:

для клеток, неадаптированных к высоким концентрациям NaCI, показано

подавление дыхания в гиперсолёных условиях, для клеток, адаптированных к высоким концентрациям NaCI, показано

подавление дыхания, при переносе в благоприятные условия (из 15% NaCI в 0% NaCI) по сравнению с постоянными условиями (из 15% NaCI в 15% NaCI). Это может быть обусловлено особенностями воздействием осмотического стресса на мембранные ферменты. В микроаэробных условиях роста исследованные виды сохраняют тенденции, характерные для клеток аэробных вариантов. Для С. rhagii и D. hansenii в аэробных и микроаэробных условиях роста выявлено физиологически обоснованное усиление дыхания,

- в микроаэробных условиях скорость дыхания Candida lipolytica, Rhodotorula aurantiaca, Malassezia sp., Candida rhagii возрастает, наблюдается усиление роли цитохромоксидазы в процессе дыхания,

- в гиперсолёных условиях скорость дыхания всех изученных видов возрастает, происходит значительное усиление роли цитохромоксидазы

Условия роста NaCI в среде роста=> инкубации цо цро X

Вкладе дыхание, %

С. lipolytica аэробные 0=>0 15=>15 94,1 «4,5 35,5

микроаэробные 0=>0 15=>15 65,4 81,6 8,6 26,0 12,3

R. aurantiaca аэробные 0=>0 15=>15 43 96,5 37,7 19,3

микроаэробные 0=>0 15=>15 59,3 100 31,2 9,5

М. sp. аэробные 0=>0 15=>15 80,0 78,3 11,3 36,5 10,4

микроаэробные 0=>0 15=>15 157,7 70,7 29,3 42,7

С. rhagii аэробные 0=>0 15=>15 9,9 44,6 62,3 38,8 27,8 16,6

микроаэробные 0=>0 15=>15 10,8 81,6 71,9 17,3 14,6

D. hansenii аэробные 0=>0 15=>15 91,7 82,5 17,5

микроаэробные 0=>0 15=>15 62,3 78,2 18,8 11,9 18,9 9,9

цо - цитохромоксидаза

цро - цианидрезистентная оксидаза

х - неизвестная оксидаза

и подавление путей дыхания основанных на других оксидазах, т.е. рост в присутствии соли приводит к индукции (или активации) дыхательной системы, нечувствительной к ингибиторному действию соли или даже активируемой солью,

- в микроаэробных условиях присутствие NaCl в среде культивирования приводит к усилению дыхания всех видов, наиболее значительно это выражено для Candida lipolytica, Rhodotorula aurantiaca, Candida rhagii, происходит значительное усиление роли цитохромоксидазы и подавление путей дыхания основанных на других оксидазах. Цианидрезистентная и третья оксидазы, в условиях сочетанного действия стрессорных факторов, присутствуют у 4 видов против 2 при галострессе, т. е. их роль в процессе дыхания несколько возрастает, что может свидетельствовать об ускорении процессов метаболизма и/или увеличении энергообеспеченности клеток, приводящим к возможности участия в дыхании не только цитохромоксидазы.

Таким образом, в гиперсолёных условиях гипоксия как дополнительный стрессорный фактор, нивелирует действие высокой концентрации NaCl, проявляя антагонистический характер взаимодействия.

4. Активность каталазы

остаточная активность каталазы - культуру выращивали без добавления NaCl в среду культивирования, в среду инкубации при измерении вносили 5, 10 или 15% NaCl; реальная активность каталазы - среда инкубации при определении активности фермента содержала такое же количество NaCl, как и среда культивирования; потенциальная активность каталазы - активность каталазы культур, выращенных при 5, 10 или 15% NaCl, определялась в отсутствие соли в среде инкубации.

Первый вариант позволяет выявить непосредственное действие соли на активность фермента. Второй позволяет установить действительную активность каталазы, синтезированной при различных концентрациях NaCl, в присутствии этих концентраций. Третий вариант

позволяет определить максимально возможную (потенциальную)

ИаС1. ^ Р ? Р пр р

Обобщив полученные данные (табл. 4), все кулкпфь voжнo условно разделить на три группы' по характеру зависимости активности каталазы от условий роста культуры и

4. Активность

ЫаС\ в среде роста и \

.1^1 в среде- •ростзг ®> Остат. акт. кат. Реальная акт. кат. Потенциал, акт. кат.

Г о=> .15 5=>-5 1;0=>: 10 . 15=> .15 • 15=> ■ 0 \ ,10=> ] •0'. ' 15=> 0

Аэробные условия культивирования

С. Кросса 76.4 49.1 25.9 72.1 66.7 37.3 111.0 126.5 2'5.5

К. аигапйаса 91.7 75.4 52.5 99.2 98.0 58.0 200.0 200.0 612.5

М. зр. 65.9 34.0 19.5 45.5 12.7 3.5 79.7 37.5 13.1

С. гЬади 80.9 58.8 57.9 71.7 60.7 58.3 100.9 110.3 131.4

0.Ьапзепк 50.2 46.1 33.0 86.4 41.2 35.4 531.6 432.1 89.8

Микроаэробные условия культивирования

С. Нро1уйса 60.4 38.1 23.5 72.0 62.4 40.1 116.4 115.6 308.9

14. аигапйаса 80.9 68.9 65.6 80.9 79.6 64.7 327.3 691.3 537.2

М..р. 94.1 50.5 19.6 69.9 21.8 4.1 92.3 46.2 20.7

С. гьади 57.1 49.8 42.5 61.5 51.3 48.7 102.6 115.4 128.8

О.Ьапвепи 53.9 44.7 34.3 50.6 39.8 28.2 87.4 88.9 88.9

контроль - активность каталазы культуры выращенной без внесения №С1 в

^р. Остаточная, этой культуры

культивирования и/или инкубации, несмотря на то, что клетки

при 0% НаС1, обладают самой высокой

Ко второй группе можно отнести Як сшгстйаса, С. Иро1уПса и С гка§П. Остаточная и реальная активность каталазы данных культур при увеличений концентрации ЫаС1 в среде и/или инкубации, потенциальная увеличивается. Наиболее ярко тенденции

с увеличением концентрации КаС1 в среде культ е у КЬ. аигапйаса - до 500 - 700% относительно контрольного

К третьей группе можно отнести культуру D. hansenii. Остаточная и реальная активность катал азы данной культуры уменьшается при увеличении концентрации NaCJ в среде культивирования и/или инкубации. Максимум потенциальной активности клеток, выращенных в аэробных условиях, смещен к середине оптимального для роста диапазона концентраций NaCl. Значения потенциальной активности клеток, выращенных в микроаэробных условиях, практически одинаковы во всем исследуемом диапазоне концентраций NaCl.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что у дрожжей, у которых степень галофильности (галотолерантности) заметно повышается в микроаэробных условиях, наряду с включением в дыхание альтернативной дыхательной цепи, индуцируется (или активируется) каталазная активность, позволяющая противостоять окислительному стрессу, возникающему в результате подавления в присутствии солей активности защитного фермента каталазы.

Эксперименты, проведенные с чистым препаратом каталазы, показали, что NaCl хотя и подавляет активность фермента, но этот эффект выражен значительно слабее, чем в случае дрожжевых клеток. Это с высокой степенью вероятности указывает на существование не только прямого ингибиторного действия NaCl на активность этого фермента, но и опосредованного эффекта, обусловленного, например, изменением конформации или энергизации клеточных мембран (плазмалеммы или вакуолярной мембраны).

5. Роль состава среды и пула свободных внутриклеточных аминокислот в защите от сочетанного стресса

Исследованы дополнительные способы защиты клеток от сочетанного действия гипоксии и высокой концентрации NaCl. Как показано для многих микроорганизмов [Jenkins et all, 1990; Guimaraes et all, 1997; Калюжин, 1998; Murata, 1999], различный состав среды может оказывать разное влияние на устойчивость к стрессорам - одиночным и множественным. Считается, что лучший рост многих микроорганизмов в стрессовых условиях на богатых средах обусловлен несколькими факторами, в том числе наличием в этих условиях веществ, которые непосредственно поглощаются и используются клетками как протекторные или же предшественников этих соединений [Феофилова и Кузнецова, 1996]. Одними из основных органических протекторных соединений, при разных видах стрессов, являются аминокислоты [Garren, 1996; Матвеева с соавт., 1997].

У С. lipolytica антагонизм между высокой концентрацией NaCl и низким парциальным давлением кислорода, выражен наиболее сильно среди исследованных нами видов. Поэтому, мы изучили, изменяется ли

антагонизм данных стрессоров и состав свободных аминокислот в клетках С. Иро1уНса, при росте на разных средах в условиях осмостресса, гипоксии и совместном воздействии обоих факторов.

Показано (таб. 5), что в целом обнаруженные ранее тенденции сохраняются, т. е. при увеличении возраста культуры и в микроаэробных условиях роста, толерантность к ЫаС1 возрастает. При этом более убедительные результаты получены при культивировании на богатой среде (ГПД), чем на синтетических (с глицерином и глюкозой, в качестве источника энергии и углеводов). Данный факт, вероятно можно обьяснить тем, что при росте на среде ГПД, С. \ipolytica поглощает органические соединения, которые служат предшественниками для синтеза осмопротекторных веществ или сами являются таковыми. Интересно отметить, что несмотря на широко известную роль глицерина, как одного из главных осмопротекторов, богатые среды, с избыточным содержанием аминокислот и витаминов, позволяют Таблица 5. Концентрация N301 (%) микроорганизмам лучше снижающая на 50 % скорость роста С. Иро1уНса при культивировании на разных

стрессорные

Аэробный Микроаэробный

______РОСТ рост

Возраст культур, сут

4 в 4 9 • „

ГПД 12 14-15 14-15 15-16

Глицерин 7,5-10 12-14 12 14-16

Глкжоза 5-7,5 5-7,5 10-12 12-14

переносить условия.

Обнаружено, что в общем пуле аминокислот наибольшие доли

принадлежат глутамину, аланину, аспарагину, лизину и гистидину. В совокупности эти вещества составляют 73-87% от общего количества

исследованных аминокислот в аэробном варианте культивирования и 60-68% в микроаэробном.

Показано, что в условиях гипоксии и при солевом стрессе (8% ЫаС1) в аэробном варианте культивирования происходит значительное снижение содержания абсолютного большинства аминокислот в клетках.

Данные, полученные в условиях комбинированного стрессорного воздействия, недостатка кислорода и избытка КаС1, показывают значительное изменение количества аминокислот в клетках. В микроаэробных условиях С. Иро1уйса является умеренным галофилом и, как видно на рис. 4, в этом случае возрастание количества ЫаС1 в среде приводит к скачкообразному росту (более 100-600%) количества абсолютного большинства аминокислот по отношению к контролю. Таким образом, одним из механизмов противодействия осмотическому стрессу в микроаэробных условиях является возрастание пула осмопротекторов - внутриклеточных аминокислот.

Аэроб

ный

рост

4% КаС!

8% КаО

Микро аэроб ный рост

700 600 500 -' 400 -300 -1 200 -100

# 8 I # * I I # I

Сумма амино кислот

0 % ШС1

4 »/.N201

8 % КаС!

Микроаэробный рост Аэробный рост

Рис. 4. Свободные внутриклеточные аминокислоты С Нро1уИса Ось ординат - содержание аминокислот, % относительно контроля Контроль - культура, выращенная без №С1

6. Физиологические особенности дрожжей Ма1а8вег!а ер.

Особенностью экосистемы обитания дрожжей рода Ма/амеггд является наличие множества стрессорных факторов, таких как высокие и низкие температуры, солнечная радиация, периодически возникающие недостаток воды и избыток солей и многое другое. Уникальным и

наиболее известным свойством Malassezia, принципиально отличающим данный род от других родов дрожжей, является их липофильность. Наличие же уникального, для дрожжей вообще и микрофлоры кожи млекопитающих в частности, внешнего липидного слоя позволяет предположить некоторую его роль в защите клеток от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды. Это предположение давно выдвигалось исследователями [Barfatani et al, 1964; Mittag, 1995], но сих пор не имело экспериментального подтверждения.

Объектом исследования была 2-суточная культура дрожжей Malassezia sp., выращенная на среде Диксона "при 32°С. Суспензии клеток дрожжей инкубировали при концентрациях NaCl 0% (контроль) и 34% (насыщенный раствор) в течение 2 часов при 28° С. Для удаления внешней липидной оболочки использовали способ, при котором клетки,

после 25 минутной обработки 1% раствором додецил-сульфата натрия (SDS) при 50°С, полностью сохраняли жизнеспособность и

целостность цитоплазмати-ческой мембраны [Арзуманян и Ожован, 2002]. Клетки без внешней липидной оболочки инкубировали без соли и при 34% NaCl аналогичным образом. После инкубации интактных и обработанных SDS клеток в присутствии и в отсутствие NaCl производили высевы на плотную среду, а спустя 2 дня учитывали количество выросших

колоний, т.е. жизнеспособных особей в единице объема суспензии. Число колоний в контроле (0% соли) принимали за 100%.

В результате были получены следующие идентичные данные (рис. 5). После 2-часовой обработки интактных клеток Malassezia насыщенным раствором NaCl количество жизнеспособных особей составило 81,6 ± 15,6 % по сравнению с контролем. В то же время после аналогичной обработки клеток Malassezia, лишенных внешней липидной оболочки, количество живых клеток составило 7,8 ±5,4 %. Очевидно, что 7 - 10-кратное снижение устойчивости клеток к действию насыщенного раствора соли

Рис. 5. Роль внешней липидной оболочки в галопротекции Malassezia sp.

Ось ординат - количество клеток, %

I - контроль, интактные клетки дрожжей, 100%

II - клетки дрожжей, обработанные насыщенным раствором NaCl в течение 2 часов, % от контроля

III- клетки дрожжей, лишенные липидного слоя, затем обработанные NaCl, % от контроля

в результате обработки вОв обусловлено отсутствием внешней липидной оболочки. Таким образом, нами было показано, что у дрожжей рода МаШэЫа яр. внешняя липидная оболочка действительно выполняет функцию галопротектора.

7. Шюёососсш егу№горо№

Я. егуЛгороШ является одним из наиболее часто выделяемых микроорганизмов при исследовании нефтяных месторождений, особенно тех, пластовые воды которых характеризуются высокой концентрацией 1^аС1. Это позволяет отнести его к одним из доминирующих представителей данных экотопов, в связи с чем нам было интересно сравнить данные, полученные при раздельном и одновременном воздействии на дрожжевые микроорганизмы изучаемых стрессорных факторов, с воздействием их на данный бактериальный вид.

Данный вид относится к слабым галофилам с оптимумом роста 1-3% ЫаС1 и уже при 5% мы наблюдали выраженное уменьшение накопления биомассы, при 7% соли разница с контролем достигала 50% (рис. 6.1).

Снижение накопления биомассы происходило и при гипоксии - в условиях недостатка кислорода

регистрируемое нами

количество биомассы

составляло всего 5-10 % от нормальных условий. При одновременном же действии

Рис. 6. Накопление биомассы и дыхание №ос/ососсиз егуИтроГт в стрессорных условиях.

1) Накопление биомассы, % от контроля а - культура, выращенная в аэробных условиях, 5-е сутки роста

т - культура, выращенная в микроаэробных условиях, 14-е сутки роста

2) Потребление кислорода на единицу биомассы в микроаэробных условиях культивирования, 1-е сутки роста, % от контроля

Контроль - культура, выращенная без №С1.

мы наблюдали значительное смещение диапазона концентраций №С1, при которых накопление биомассы максимально. При одновременном воздействии на Я. егуЛтороШ двух стрессорных факторов максимум накопления биомассы приходился на 5-6% соли в среде, т.е. из категории слабых галофилов он переходит в категорию умеренных галофилов.

В связи с особенностями поведении Д. егуЛгороШ в микроаэробных условиях мы также провели изучение дыхания этого микроорганизма при сочетанном действии на него двух стрессорных факторов (рис. 6.2). Обнаружено, что в микроаэробных условиях "добавление" солевого стресса приводит к увеличению потребления кислорода клетками. Такое явление наблюдалось не только при оптимальных для роста в микроаэробных условиях концентрациях №С1, но и при содержании ЫаС1 выше оптимального. Можно полагать, что это явление обусловлено механизмами, сходными с механизмами, характерными для дрожжевых микроорганизмов.

Таким образом, основные закономерности, обнаруженные нами при одновременном действии двух стрессорных факторов на дрожжи, сохраняются и в случае прокариотного организма, выделенного из нефтяного месторождения, т.е. имеют универсальный характер.

Заключение

Определение параметров роста дрожжей в условиях гипоксии показало, что все изучаемые виды резко снижают скорость роста при недостатке кислорода. По отношению к ИаС1 все виды оказались либо слабыми (умеренными) галофилами, либо галотолерантами. Наиболее интересные данные получены при сочетанном действии обоих факторов. Обнаружено, что все дрожжи (кроме А/а/огаегга «/?.), а также КНойососсш ег^кгороШ увеличили устойчивость к соли, т. е. их галофильность (галотолерантность) возросла.

В наших исследованиях показано, что для всех исследованных видов гиперсолёные условия (15% ИаС1), гипоксия и сочетание этих стрессоров приводят к увеличению скорости дыхания. В то же время контрольные клетки всегда показывают обратный эффект. При этом ингибиторный анализ обнаружил, что происходит значительное повышение роли цитохромоксидазы и подавление других оксидаз, что свидетельствует о глубоком изменении механизмов дыхания. Показано, что сколько-нибудь серьёзную роль цианидрезистентная оксидаза (а также оксидаза, обнаруженная нами) играет только в аэробных условиях, без избытка ЫаС1 в среде инкубирования.

Обнаружено, что в гиперсоленых условиях и при сочетанном действии гипоксии и ЫаС1 происходит значительное усиление активности катал азы для большинства исследованных видов. Как и в

случае с дыханием неадаптированные клетки всегда показывают обратный эффект. Эти данные хорошо соотносятся с результатами ингибиторного анализа. Как известно, при дыхании по цитохромоксидазному пути всегда образуются активные формы кислорода, в отличии от цианидрезистентного [Уайт с соавт., 1981]. Таким образом, значительное увеличение доли цитохромоксидазы, наряду с усилением дыхания, вероятно привело к дополнительному образованию АФК и ответному усилению синтеза антиокислительного фермента катал азы.

Таким образом, нашими исследованиями показано наличие перекрёстного защитного эффекта при одновременном действии на про-и зукариотные микроорганизмы низкого парциального давления кислорода и высокой концентрации №С1. Полученные данные по скорости дыхания, соотношению оксид аз и активности антиокислительного фермента каталазы, а также данные по аминокислотам и внешнему липидному слою Мг/аюегг'а можно связать воедино схемой, приведенной на рис. 7. Очевидно, что данная схема ещё далека от логического завершения и требует дополнительных исследований.

Рис. 7. Механизмы влияния и защиты от сочетанного действия гипоксии и высоких концентраций №С1.

Выводы

1- Осуществлена идентификация некоторых дрожжей, выделенных из разных экотопов, с повышенным содержанием NaCI, в том числе из нефтяных месторождений. Методами ПЦР и кариотипирования показано, что эти дрожжи относятся к Candida lipolytica, Rhodotorula aurantiaca, Malassezia sp.

2. Впервые показано, что при совместном действии осмостресса и гипоксии на нефтеокисляющие и другие галофильные микроорганизмы (Rhodococcus erythropolis, Candida lipolytica, Rhodotorula aurantiaca, Candida rhagii, Debaryomyces hansenii), наблюдается антагонизм этих стрессорных факторов, в результате чего в микроаэробных условиях степень галофильности (галотолерантности) исследованных микроорганизмов повышается.

3. Изучение биохимических причин антагонизма стрессорных факторов показало, что высокие концентрации NaCI подавляют дыхание микроорганизмов и активность каталазы, вызывая состояние окислительного стресса. Микроаэробные условия в этом случае уменьшают последствия окислительного стресса и способствуют выживанию микроорганизмов при высоких концентрациях соли.

4. Выращивание в присутствие соли дрожжей, у которых в наибольшей степени проявляется эффект повышения галофильности (галотолерантности) в микроаэробных условиях, приводит к образованию или активации альтернативной дыхательной системы, нечувствительной к действию NaCI, и повышению активности каталазы, что также противодействует окислительному стрессу. Дополнительным фактором, способствующим выживанию дрожжей в присутствии соли в микроаэробных условиях, является повышение внутриклеточной концентрации аминокислот, выполняющих роль осмопротекторов. Для дрожжей рода Malassezia установлена осмопротекторная роль внешней липидной оболочки.

5. Все эти механизмы в достаточной степени объясняют высокую частоту изолирования слабо галофильных облигатно аэробных микроорганизмов из экотопов с низким парциальным давлением кислорода и высоким содержанием солей, и должны учитываться при разработке микробиологических методов очистки в системах с высокой минерализацией.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Арзуманян В. Г., Воронина Н. А., Гейдебрехт О. В., Маслова О. В., Плакунов В. К., Беляев С. С. Антагонистическое взаимодействие стрессорных факторов при росте микроорганизмов в условиях, имитирующих параметры их природных экотопов // Микробиология. 2002. Т. 71. №2. С. 160-165.

2. Гейдебрехт О. В., Арзуманян В. Г., Плакунов В. К., Беляев С. С. Влияние степени аэрации среды на галотолерантность дрожжей родов Candida, Rhodotorula и Malassezia // Микробиология. 2003. Т. 72. № 3. С. 312-319.

3. Гейдебрехт О. В., Арзуманян В. Г. "Изменение степени галотолерантности дрожжей Yarrowia lipolytica при лимитировании роста кислородом" // Школа - конференция "Горизонты физико-химической биологии". Пущино, Россия. 2000. Том 2. С. 101

4. Heidebrecht О., Arzumanian V., Plakunov V., Mysiakina I. Yeast Malassezia spp is an extreme halotolerant // 21st International Specialized Symposium on Yeasts "Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Ecology of Non-conventional Yeasts (NCY)". Lviv, Ukraine. August 2001. P. 96.

5. Гейдебрехт O.B., Арзуманян В.Г. Параметры роста дрожжей в состоянии осмотического стресса и гипоксии. // 1-й Съезд микологов России. Москва, Россия. 2002. С. 144

6. Гейдебрехт О.В., Шелемех О.В., Арзуманян В.Г. Роль внешней липидной оболочки в галопротекции облигатно липофильных дрожжей рода Malassezia // XV Международная зимняя молодёжная научная школа. Москва, Россия. 10-14 февраля 2003.

7. Arzumanian V. G., Heidebrecht О. V., Shelemekh О. V. Outer lipid layer of lipophilic yeast Malassezia and its role in halotolerance // 23rd International Specialised Symposium on Yeasts "Interactions between Yeasts and other Organisms" Budapest, Hungary. 26-29 August 2003.

8. Гейдебрехт O.B., Шелемех O.B., Арзуманян В.Г. Взаимосвязь галотолерантности дрожжей рода Malassezia с наличием внешней липидной оболочки // 1-й Всероссийский конгресс по медицинской микологии. Москва, Россия. 20-21 февраля 2003. Том 1. С. 19

9. Плакунов В.К., Гейдебрехт О.В., Арзуманян В.Г. Выживаемость и метаболическая активность микроорганизмов в условиях, имитирующих условия нефтяных месторождений // 2-ой Московский Международный Конгресс 'БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития" Москва, Россия. Ноябрь 2003. Приняты в печать.

Объем 1,5 п.л.

Зак. 503

Тираж 100 экз.

АНО «Издательство МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

РНБ Русский фонд

2006-4 33177

/ г i, г ^

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гейдебрехт, Олег Викторович

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1.1. Стресс у микроорганизмов

Глава 1.2. Гипо- и гипероксия гипероксия (окислительный стресс)

Гипоксия

Глава 1.3. Осмотический стресс. Галостресс

Глава 1.4. Температурный стресс (тепловой шок/гипертермия, холодовой шок/ гипотермия)

Глава 1.5. Множественное стрессорное воздействие. Перекрёстно-адаптивное (антагонистическое) взаимодействие неродственных видов стрессорных воздействий

Глава 1.6. Заключение по обзору литературы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2.1. Объекты и методы исследования

Объекты

Методы культивирования и анализа

Методы статистики

Глава 2.2. Идентификация исследованных микроорганизмов

Идентификация Candida lipolytica и Rhodotorula auranti ас а

Идентификация Malassezia sp.

АДАПТАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ К СОЧЕТАННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ ГИПОКСИИ И ОСМОТИЧЕСКОГО СТРЕССА

Глава 3.1. Параметры роста

3.1.1. Candida lipolytica

3.1.2. Rhodotorula aurantiaca

3.1.3. Malassezia sp.

3.1.4. Candida rhagii

3.1.5. Debaryomyces hansenii

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы галоадаптации микроорганизмов в условиях гипоксии"

Актуальность темы. Естественная среда обитания (микро)организмов характеризуется совокупностью множества физических, химических и биологических факторов. Не вызывает сомнений, что естественные места обитания не всегда являются оптимальными для роста и размножения организмов, т. е. в природе на микроорганизмы часто действует хотя бы один фактор, который можно охарактеризовать как стрессорный (стрессовый). Изучение жизни микроорганизмов в условиях неблагоприятных воздействий является важной задачей микробиологии и издавна привлекало исследователей [Кашнер, 1981]. На сегодняшний день основным подходом в изучении стрессорных воздействий остается исследование действия какого-либо одного стрессора на рост и метаболизм бактериальной или дрожжевой монокультуры. Такой принцип исследования важен и оправдывает себя простотой постановки экспериментов и интерпретации полученных данных. Имеется множество работ, посвященных изучению воздействия на микроорганизмы одиночных стрессорных факторов и механизмов адаптации к ним [Кашнер, 1981; Гусев и Минеева, 1992]. Наиболее изученными являются такие стрессоры, как гипертермия [Тэнси и Брок, 1981, Hottiger et al., 1987; Collinson and Dawes, 1992; Mutoh et al., 1995; Mojica et al., 1997; Kilstrup et al., 1997; Macario et al., 1999], неоптимальные концентрации NaCl [Larsen, 1962; Brown and Simpson, 1972; Shindler, 1976; Lukas et al., 1990; Van Zyl et al., 1990; Galinski and Truper, 1994], факторы, вызывающие окислительный стресс [Fridovich, 1975; Wilkins et al., 1978; Гаенко с соавт., 1985; Imlay et al., 1988; Jamieson, 1995; Tran et al., 1993].

Однако, как показывают работы последних лет, это лишь одна сторона проблемы. В естественных условиях обитания микроорганизмы испытывают сочетанное воздействие нескольких стрессоров. Например, микроорганизмы, обитающие в экосистемах средней полосы, 3 сталкиваются с суточными и сезонными колебаниями температуры, влажности, солнечной радиации, солёности и пр. Показано значительное отличие ответной реакции и состояния микробной клетки от таковых при монострессе. Для принципиально разных стрессоров обнаружено, что предварительное воздействие (часто в сублетальных дозах) одного стрессора повышает устойчивость клеток к воздействию другого. Это явление получило название преадаптации [Flahaut et al., 1996, 1997; Lorca and de Valdez, 1999; Schmidt and Zink, 2000; Gouesbet et al., 2001; Periago et al., 2002a, 2002b], В условиях одновременного воздействия нескольких стрессорных факторов между ними может возникать антагонизм, снижающий вредные последствия. Такое явление обычно называют перекрёстной адаптацией/защитой, кроссадаптацией/защитой или антагонизмом стрессорных факторов [Leblanc et al., 2000; Nanasombat, 2001; Park Sang-Ho et al., 2001; Kim Woojin et al., 2001]. При этом может происходить увеличение степени толерантности к определенному стрессору (стрессорам), иногда перерастание толерантности в зависимость ("-фильность"). Явление перекрестной адаптации на сегодняшний день изучено недостаточно. Сейчас только происходит накопление данных о сочетанном воздействии стрессоров. Наибольшее внимание уделяется таким сочетаниям, как гипертермия и неоптимальные концентрации NaCl [Кунтиков и Горленко, 1998; Leblanc et al., 2000; Periago et al., 2002a, 2002b], углеродное голодание, гипертермия и осмотические стрессоры [Мссапп, 1993; Murata, 1999; Herbert and Foster, 2001], осмотические стрессоры и Н202 [Hartke et al., 1995; Browne and Dowds, 2001], воздействие ультрафиолетового излучения и углеродное голодание [Srinivasan and Kjelleberg, 2001] и др. Изучение же механизмов адаптации к совместному действию стрессоров находится в начальной стадии.

Задачи исследования:

1. Идентификация неколлекционных штаммов микроорганизмов, исследованных в данной работе.

3. Изучение дыхания микроорганизмов при высоком содержании NaCl и низком содержании кислорода в среде.

Впервые показано, что при сочетанном действии высокого содержания NaCl в среде и низкого парциального давления кислорода, происходит заметное увеличение внутриклеточного пула большинства аминокислот.

Впервые экспериментально показана осмопротекторная роль внешней липидной оболочки для дрожжей рода Malassezia.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на Школе - конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), 21st International Specialized Symposium on Yeasts "Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Ecology of Non-conventional Yeasts (NCY)". (Lviv, Ukraine. August 2001), 1-й Съезде микологов России (Москва, 2002), XV Международной зимней молодёжной научной школе (Москва, 10-14 февраля 2003), 1-й Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 20-21 февраля 2003), 23rd International Specialised Symposium on Yeasts "Interactions between Yeasts and other Organisms" (Budapest, Hungary. 26 - 29 August. 2003), 2-ой Московский Международный Конгресс "БИОТЕХНОЛОГИЯ: состояние и перспективы развития" Москва, Россия. 10-14 Ноября 2003.

Публикации По теме диссертации, включая тезисы, опубликовано 9 печатных работ, из них 2 полнотекстовых статьи и 7 тезисов.

Объём и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 157 страницах и включают 2 фотографии, 27 рисунков и 12 таблиц. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Экспериментальная часть" (включающая главы "Объекты и методы исследования" и "Результаты и обсуждения"), "Заключение", "Выводы" и "Список литературы", который содержит 82 работы отечественных и 116 зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Гейдебрехт, Олег Викторович

Выводы

1. Осуществлена идентификация некоторых дрожжей, выделенных из разных экотопов, с повышенным содержанием NaCl, в том числе нефтяных месторождений. Методами ПЦР и кариотипирования показано, что эти дрожжи относятся к Candida lipolytica, Rhodotorula aurantiaca, Malassezia sp.

3. Изучение биохимических причин антагонизма стрессорных факторов показало, что высокие концентрации NaCl подавляют дыхание микроорганизмов и активность каталазы, вызывая состояние окислительного стресса. Микроаэробные условия в этом случае уменьшают последствия окислительного стресса и способствуют выживанию микроорганизмов при высоких концентрациях соли.

4. Выращивание в присутствие соли дрожжей, у которых в наибольшей степени проявляется эффект повышения степени галофильности галотолерантности) в микроаэробных условиях, приводит к образованию или активации альтернативной дыхательной системы, нечувствительной к действию NaCl, и повышению активности каталазы, что также противодействует окислительному стрессу. Дополнительным фактором, способствующими выживанию дрожжей в присутствии соли в микроаэробных условиях, является повышение внутриклеточной концентрации аминокислот, выполняющих роль осмопротекторов. Для

134 дрожжей рода Malassezia установлена осмопротекторная роль внешней липидной оболочки.

Заключение

Проведено изучение дрожжей и бактерий, выделенных из разнообразных мест обитания — высокоминерализованных пластовых вод нефтяного месторождения, морской воды, кожи здорового человека, хлопковой муки и активного осадка нефтеперерабатывающего предприятия. Для вновь изолированных штаммов с неясной видовой принадлежностью путем использования традиционных методов классификации, а также метода ПЦР генов рибосомной ДНК и метода кариотипирования ядерной ДНК показана принадлежность к Candida lipolytica, Rhodotorula aurantiaca и Malassezia sp. Показано, что штамм, ранее относимый к роду Yarrowia, принадлежит роду Candida.

Определение параметров роста дрожжей в условиях гипоксии показало, что все изучаемые виды резко снижают скорость роста при недостатке кислорода. По отношению к NaCl все виды оказались либо слабыми (умеренными) галофилами, либо галотолерантами. Наиболее интересные данные получены при сочетанном действии обоих факторов. Обнаружено, что все дрожжи (кроме Malassezia sp.), а также Rhodococcus erythropolis увеличили устойчивость к соли, т. е. их галофильность (галотолерантность) возросла. Такое явление, под названием кросспротекторного (перекрестная защита) или антагонистического взаимодействия стрессоров в настоящее время известно для целого ряда воздействий [Кунтиков и Горленко, 1998; Nanasombat, 2001; Kim Woojin et al., 2001; Taormina and Beuchat, 2001; Herbert and Foster, 2001; Srinivasan and Kjelleberg, 2001; Periago et al., 2002a, 2002b], но при сочетании гипоксии и осмостресса показано впервые. Влияние гипоксии и осмостресса на дрожжи и возможные механизмы защиты нами были исследованные более подробно.

Как показано многими исследованиями при различных видах стрессорных воздействий [Kallies et al., 1998; Habel et al., 1991, Michea-Hamzehpour and Turian, 1987; Акименко и Меденцев, 1976; цикл работ Рихванова с соавт., 2001-2003], в том числе при осмострессе [Андреищева с соавт., 1997] и гипоксии [Акименко, 1981], происходит перестройка дыхательной системы микроорганизмов. При этом отмечаются неоднозначные отношения между цитохромоксидазой и цианидрезистентной оксидазой. Получены свидетельства того, что при некоторых стрессорных условиях в клетке может происходить переключение на дыхание по цианидрезистентному пути (данный путь, как и саму цианидрезистентную оксидазу, часто называют альтернативным, что верно лишь отчасти, поскольку существуют и другие оксидазы и пути дыхания). При этом известно, что цитохромоксидаза обладает значительно большим сродством к кислороду [Moore and Siedow, 1975], а исследование Акименко с соавт. [2003] показало участие цианидрезистентного пути в клетке только при высоком уровне энергообеспеченности процессов метаболизма в клетке. Таким образом, переключение на цианидрезистентный путь дыхания можно охарактеризовать не как общий механизм защиты от стрессорных воздействий, а как видоспецифичный. Особенностью цитохромоксидазного пути дыхания, которую необходимо отметить как важное обстоятельство для интерпретации наших данных, является обязательное образование активных форм кислорода.

В наших исследованиях показано (табл. 4-1.), что для всех исследованных видов гиперсолёные условия (15% NaCl), гипоксия и сочетание этих стрессоров приводят к увеличению скорости дыхания. В то же время контрольные клетки всегда показывают обратный эффект (см. главу 3.2). При этом ингибиторный анализ обнаружил, что происходит значительное повышение роли цитохромоксидазы и подавление других

129 оксидаз, что свидетельствует о глубоком изменении механизмов дыхания. Показано, что сколько-нибудь серьёзную роль цианидрезистентная оксидаза (а также оксидаза, обнаруженная нами) играет только в аэробных условиях, без избытка NaCl в среде инкубирования. Эти данные согласуются с приведенными выше о неконкурентноспособности цианидрезистентной оксидазы по сравнению с цитохромоксидазой.

Большое количество исследований, посвященных стрессорам, показало, что значительную роль в защите клеток от губительного действия высокой температуры, окислителей, различных видов радиации, множественных стрессов принадлежит системам антиоксидантной защиты [Mitchell et al., 1983; Феофилова, 1994; Davidson et al., 1996; Аминова и Троценко, 1998; Swiecilo et al., 2000; Меденцев с соавт., 2001; Подкопаева с соавт., 2003]. Поэтому было проведено изучение активности одного из основных элементов антиоксидантной системы аэробных микроорганизмов - каталазы. Как было показано в наших экспериментах (табл. 4-1.) в гиперсоленых условиях и при сочетанном действии гипоксии и NaCl (в таблице - 15%) происходит значительное усиление синтеза каталазы для большинства исследованных видов. Как и в случае с дыханием неадаптированные клетки всегда показывают обратный эффект (см. главу 3.3). Эти данные хорошо соотносятся с результатами ингибиторного анализа. Как известно при дыхании по цитохромоксидазному пути всегда образуются активные формы кислорода, в отличии от цитохромрезистентного. Таким образом, значительное увеличение доли цитохромоксидазы, наряду с усилением дыхания, привело к дополнительному образованию АФК и усилению синтеза антиокислительного фермента каталазы.

Исследованы дополнительные способы защиты клеток от сочетанного действия гипоксии и высокой концентрации NaCl. Так, анализ состава внутриклеточных аминокислот показал резкое увеличение концентрации практически всех аминокислот в таких условиях. Эти данные, а также лучший рост на богатой среде, с большим количеством аминокислот, хорошо согласуются со сведениями об их защитной роли при различных стрессах [Матвеева с соавт., 1997; Garren, 1996]. Также нами была впервые экспериментально доказана защитная роль внешней липидной оболочки для дрожжей рода Malassezia.

Таким образом, нашими экспериментами показано наличие перекрёстного защитного эффекта при одновременном действии на микроорганизмы низкого парциального давления кислорода и высокой концентрации NaCl. Полученные данные по скорости дыхания, соотношению оксидаз и активности антиокислительного фермента каталазы (а также данные по аминокислотам), представленные в табл. 4-1. можно связать воедино схемой, приведенной на рис. 4-1. Очевидно, что данная схема ещё очень далека от логического завершения и требует дополнительных исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гейдебрехт, Олег Викторович, Москва

1. Акименко В. К., Аринбасарова А. Ю., Смирнова М. Н, Меденцев А. Г. Альтернативная оксидаза в митохондриях дрожжей Yarrowia lipolytica не способна конкурировать за электроны с цитохромным путём // Микробиология. 2003. Т. 72. № 4. С. 453-458.

2. Акименко В. К. Цианидрезистентное дыхание микроорганизмов // Успехи микробиологии. 1981. № 16. С. 3-30.

3. Акименко В. К., Меденцев А. Г. О появлении цианидрезистентного дыхания у дрожжей Candida lipolytica // Микробиология. 1976. Т. 45. № 1 С. 146-150.

4. Александров В. Я., Кислюк И. М. Реакция клетки на тепловой шок: физиологический аспект// Цитология. 1994. Т. 36. № 1. С. 5-59.

5. Аминова Л. Р., Троценко Ю. А. Особенности метаболизма метанола и ксилозы у каталазонегативного мутанта дрожжей Hansenula polymorpha при росте на смешанных субстратах // Микробиология. 1998. Т. 67. № 4. С. 452-457.

6. Андреищева Е. Н., Соарес М. И. М., Звягильская М. А. Энергетический обмен дрожжей Candida (Yarrowia) lipolytica в норме и при солевом стрессе // Физиология растений. 1997. Т. 4. № 5. С. 658-664.

7. Арзуманян В. Г., Ожован И. М. Модифицированный метод оценки целостности цитоплазматической мембраны клеток эукариот // Бюллетень эксперим. биологии и медицины. 2002. № 7. С.118.

8. Арзуманян В. Г., Воронина Н. А., Плакунов В.К., Беляев С. С.

9. Степень галофильности Rhodococcus erythropolis и Halobacterium salinarum определяется парциальным давлением кислорода// Микробиология. 2000. Т. 68. № 2. С. 290-292.

10. Бабьева И. П., Голубев В. И. Методы выделения и идентификации дрожжей//М. Пищевая промышленность. 1979. С. 52.

11. Баснакьян И. А. Стресс у бактерий. М. Медицина. 2003. С. 136.

12. Брюханов A. JL, Тауэр Р. К., Нетрусов А. И. катал аза и супероксиддисмутаза в клетках строго анаэробных микроорганизмов // Микробиология. 2002. Т. 71. № 3. С. 330-335.

13. Воробьёва JI. И., Чердынцева Т. А Индуцированная под действием 4-нитрохинолин-1-оксида адаптивная и перекрёстная устойчивость к ультрафиолетовому излучению и налидиксовой кислоте у Enterococcus faecalis // Микробиология. 1998. Т. 67. № 4. С. 522-526.

14. Гаенко Г. П., Решетникова И. В., Дуда В. И. Супероксиддисмутаза в спорах Clostridium butyricum // Микробиология. 1985. Т. 54. № 2. С. 322324.

15. Гейдебрехт О. В., Арзуманян В. Г., Плакунов В. К., Беляев С. С. Влияние степени аэрации среды на галотолерантность дрожжей родов Candida, Rhodotorula и Malassezia // Микробиология. 2003. Т. 72. № 3. С. 312-319.

16. Головлев Е. JI. Введение в биологию стационарной фазы бактерий: механизм общего ответа на стрессы // Микробиология. 1999. Т. 68. № 5. С. 623-631.

17. Гусев М. В, Минеева JL А. Микробиология. М. МГУ. 1992.

18. Доронина Н. В., Сахаровский В. Г., Драчук С. В., Троценко Ю. А. Органические осмопротекторы аэробных умеренно галофильных метилобактерий //Микробиология. 1998. Т. 67. № 4. С. 458-463.

19. Егоров Н. С. Практикум по микробиологии. Учебное пособие. М.1. МГУ. 1976. С. 180- 182.

20. Калюжин В. А. Влияние 2,4-динитрофенола на устойчивость турбидостатной культуры дрожжей к тепловому шоку // Микробиология. 1998. Т. 67. №4. С. 476-482.

21. Калюжин В. А. Влияние быстрой смены рН на рост турбидостатной культуры Saccharomyces cerevisiae//Микробиология. 1986. Т. 48. № 4. С. 37-40.

22. Калюжин В. А. Лимитированная турбидостатная культура дрожжей в условиях теплового стресса // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1989. №. 5. С. 786791.

23. Калюжин В. А. Ответная реакция турбидостатной культуры дрожжей на быстрое однократное изменение температуры культивирования // Микробиология. 1987. Т. 56. №. 1. С. 78-83.

24. Калюжин В. А. Рост турбидостатной культуры дрожжей в условиях теплового стресса при различных рН среды // Микробиология. 1989. Т. 58. №. 4. С. 591-595.

25. Калюжин В. А. Рост турбидостатной культуры дрожжей при высокой концентрации веществ в стационарном режиме и в условиях осмотического шока//Микробиология. 1998. Т. 67. №. 5. С. 607-612.

26. Калюжин В. А. Термотолерантность дрожжей и её экологическое значение //Журн. общ. биол. 1987. Т. 48. № 2. С. 195-199.

27. Кашнер Д. Жизнь микроорганизмов при высоких концентрациях солей и растворённых веществ: галофильные бактерии // Жизнь микробов вэкстремальных условиях. Под. ред. Кашнера Д. М. МИР. 1981. С. 365-415.

28. Кокоева М. В., Плакунов В. К. Возможность модификации осмочувствительности экстремально-галофильных архебактерий // Микробиология. 1993. Т. 62. № 5. С. 825-824.

29. Комарова Т. И., Поршнева О. В., Коронелли Т. В. Образование трегалозы клетками R- и S-вариантов Rhodococcus erythropolis // Микробиология. 1998. Т. 67. № 3. С. 428-431.

30. Кунтиков Е. И., Горленко В. М. Взаимозависимость гало- и термотолерантности у аноксигенных фототрофных бактерий // Микробиология. 1998. Т. 67. № з. с. 298-304.

31. Лотарева О. В. Физиологические эффекты солнечного света на штаммы Bacillus subtilis с различной способностью к репарации фотопродуктов // Микробиология. 1996. Т. 65. № 1. С. 74-78.

32. Лупашин В. В., Кононова С. В., Ратнер Е. Н., Циоменко А. Б., Кулаев И. С. Новый секретируемый белок дрожжей Saccharomyces cerevisiae, стимулируемый тепловым шоком // Докл. АН. СССР. 1991. Т. 317. № 5. С. 1257-1260.

33. Матвеева Н. И, Воронина Н. А., Борзенков И. А., Плакунов В. К., Беляев С.С. Состав и количественное содержание осмопротекторов в клетках нефтеокисляющих бактерий при разных условиях культивирования //Микробиология. 1997. Т. 66. № 1. С. 32-37.

34. Матыс В. Ю., Барышникова Л. М., Головлев Е. Л. Адаптация к стрессовым условиям у представителей родов Rhodococcus и Gordona // Микробиология. 1998. Т. 67. № 6. С. 743-747.

35. Меденцев А. Г., Аринбасарова А. Ю., Акименко В. К Адаптация фитопатогенного гриба Fusarium decemcellulare к окислительному стрессу //Микробиология. 2001. Т. 70. № 1. С. 34-38.

36. Меденцев А. Г., Аринбасарова А. Ю., Акименко В. К. Регуляция ифизиологическая роль цианидрезистентной оксидазы у грибов и растений // Биохимия. 1999. Т. 64. № 11. С. 1457-1472.

37. Мелехов Е. И. О возможном принципе регуляции повреждения и защитной реакции клетки // Журн. общей биологии. 1983. Т. 44. № 3. С. 386-397.

38. Мелехов Е. И. Принцип регуляции скорости процесса повреждения клетки и реакции защитного торможения метаболизма (РЗТМ) // Журн. общей биологии. 1985. Т. 46. № 2. С. 174-189.

39. Милехина Е. И., Борзенков И. А., Звягинцева И. С., Кострикина Н. А., Беляев С. С. Эколого-физиологические особенности аэробных эубактерий из нефтяных месторождений Татарстана // Микробиология. 1998. Т. 67. №2. С. 208-214.

40. Никитин Д. И., Слабова О. И., Питрюк И. А., Сорокин В. В., Оранская М. С. Отклик на температурные условия психроактивных олиготрофных бактерий с необычным составом клеточных липидов // Микробиология. 1998. Т. 67. № 1. С. 65-72.

41. Николаев Ю. А. Множественный защитный эффект экзометаболита (экзометаболитов), выделяемого Escherichia coli при обработке тетрациклином //Микробиология. 1996. Т. 65. № 6. С. 749-752.

42. Николаев Ю. А. Обнаружение двух новых внеклеточныхадаптогенных факторов у Escherichia coli К-12 // Микробиология. 1997. Т. 66. № 6. С. 785-789.

43. Николаев Ю. А. Сравнительное изучение свойств двух внеклеточных протекторов, выделяемых Escherichia coli при повышенной температуре // Микробиология. 1997. Т. 66. № 6. С. 790-795.

44. Николаев Ю. А. Участие экзометаболитов в адаптации Escherichia coli к стрессам // Микробиология. 1997. Т. 66. № 1. С. 38-41.

45. Николаев Ю. А., Воронина Н. А. Перекрёстное действиевнеклеточных факторов адаптации к стрессу у микроорганизмов // Микробиология. 1999. Т. 68. № 1. С. 45-50.

46. Николаев Ю. А., Проссер Дж. И., Паников Н. С. Внеклеточные факторы адаптации к неблагоприятным условиям среды в периодической культуре Pseudomonas fluorescens // Микробиология. 2000. Т. 69. № 5. С. 629-635.

47. Паников Н. С., Шеховцева Н. В., Дорофеев А. Г., Звягинцев Д. Г. Количественные исследования динамики отмирания голодающих микроорганизмов//Микробиология. 1988. Т. 57. №. 6. С. 983-991.

48. Пивоварова Т. А., Джансугурова Р. С., Каравайко Г. И. Роль экзометаболитов в устойчивости Thiobacillus ferrooxidans к молибдену // Микробиология. 1991. Т. 60. № 4. С. 609-615.

49. Плакунов В. К., Волкова И. М. Быстрый метод количественного определения кислых аминокислот// Микробиология. 1991. Т. 60. № 3. С. 565-567.

50. Плакунов В. К., Арзуманян В. Г., Воронина Н. А., Беляев С. С. Взаимосвязь кинетики роста и дыхания у родококков в присутствии высоких концентраций солей //Микробиология. 1999. Т. 68. № 1. С. 40-44.

51. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. М. Изд-во РАМН. 2000. 51 С.

52. Подкопаева Д. А., Грабович М. Ю., Дубинина Д. А. Окислительный стресс и системы антиоксидантной защиты клеток у микроаэрофильной бактерии Spirillum winogradskii // Микробиология. 2003. Т. 72. № 5. С. 600608.

53. Рихванов Е. Г., Варакина Н. Н, Русалева Т. М., Раченко Е. И., Киселева В. А., Войников В. К. Влияние азида натрия на устойчивость к тепловому шоку Saccharomyces cerevisiae и Debaryomyces vanriji //

54. Микробиология. 2001. Т. 70. № 3. С. 300-304.

55. Рихванов Е. Г., Варакина Н. Н., Русалева Т. М., Раченко Е. И., Киселева В. А., Войников В. К. Изменение дыхания при действии теплового шока на дрожжи Saccharomyces cerevisiae // Микробиология.2001. Т. 70. №4. С. 531-535.

56. Рихванов Е. Г., Варакина Н. Н., Русалева Т. М., Раченко Е. И., Войников В. К. Изучение действия азида натрия на термоустойчивость дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans // Микробиология.2002. Т. 71. № 6. С. 768-772.

57. Рихванов Е. Г., Варакина Н. Н., Русалева Т. М., Раченко Е. И., Войников В. К. Действие ингибиторов цитохромоксидазного комплекса на термоустойчивость дрожжей // Микробиология. 2003. Т. 72. № 2. С. 174179.

58. Рихванов Е. Г., Варакина Н. Н., Русалева Т. М., Раченко Е. И., Войников В. К. Действие малоната натрия на термотолерантность дрожжей // Микробиология. 2003. Т. 72. № 5. С. 616-620.

59. Романовская В. А., Рокитко П. В., Малашенко Ю. Р., Криштаб Т. П., Черная Н. А. Чувствительность к стрессорным факторам почвенных бактерий, изолированных из зоны отчуждения Чернобыльской АЭС // Микробиология. 2003. Т. 72. № 2. С. 174-179.

60. Романовская В. А., Соколов И. Г., Малашенко Ю. Р., Рокитко П. В. Мутабельность эпифитных и почвенных бактерий рода Methylobacterium и их резистентность к ультрафиолетовому и ионизирующему излучению // Микробиология. 1998. Т. 67. № 1. С.106-115.

61. Рощина Е. К., Петров JI. Н. Выделение белка во внеклеточное пространство как неспецифическая реакция Escherichia coli на стресс // Микробиология. 1997. Т. 66. № 2. С. 179-184.

62. Самойлова К. А. Действие ультрафиолетовой радиации на клетку. JL Наука. 1967. С. 146.

63. Смирнова Г. В., Закирова О. Н., Октябрьский О. Н. Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Escherichia coli на тепловой шок // Микробиология. 2001. Т. 70. № 5. С. 595-601.

64. Смирнова Г. В., Музыка Н. Г., Глуховченко М. Н., Октябрьский О. Н. Перекись водорода модулирует внутриклеточные уровни тиолов и калия в клетках Escherichia coli // Микробиология. 1998. Т. 67. № 5. С. 594-600.

65. Скулачев В. П. Трансформация энергии в биомембранах. М. Наука, 1972. 204 с.

66. Терешина В. М., Меморская А. С., Морозова Е. В., Козлов В. П., Феофилова Е. П. Изменения в составе углеводов цитозоля спор грибов с связи с температурой обитания и в процессе хранения // Микробиология. 2000. Т. 69. №. 4. С. 511-517.

67. Ткаченко А. Г.„ Салахетдинова О. Я., Пшеничнов М. Р. Обмен путресцина и калия между клеткой и средой как фактор адаптации Escherichia coli к гиперосмотическому шоку//Микробиология. 1997 . Т. 66.3. С. 329-334.

68. Ткаченко А. Г.,, Сапахетдинова О. Я., Пшеничнов М. Р. Роль транспорта путресцина и калия в адаптации Escherichia coli к голоданию по аммонию // Микробиология. 1996 . Т. 65. №. 6. С. 740-744.

69. Тэнси М., Брок Т. Жизнь микроорганизмов при высоких температурах: экологические аспекты // Жизнь микробов в экстремальных условиях. Под. ред. Кашнера Д. М. МИР. 1981. С. 365-415.

70. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии Т. 1. М. Мир. 1981 С. 518-523.

71. Феофилова Е. П. Биохимическая адаптация грибов к температурным воздействиям // Микробиология. 1994. Т. 63. №. 5. С. 757-776.

72. Феофилова Е. П. Трегалоза, стресс и анабиоз // Микробиология. 1992. Т. 61. №. 5. С. 741-755.

73. Феофилова Е. П., Кузнецова JI. С. Влияние антиоксидантов на рост и состав липидов Cunninghamella japonica в норме и под действием стрессора // Микробиология. 1996. Т. 65. №. 4. С. 467-473.

74. Феофилова Е. П., Терешина В. М., Хохлова Н. С., Меморская А. С. О различных механизмах биохимической адаптации мицелиапьных грибов к температурному стрессу: изменения в составе углеводов цитозоля // Микробиология. 2000. Т. 69. №. 5. С. 606-611.

75. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии М. Мир. 1981. С. 532.

76. Хазиев Ф. X. Ферментативная активность почв. М. Наука. 1976. С. 180.

77. Циоменко А. Б., Туйметова Г. П. Секреторные белки теплового шока дрожжей: новое семейство стрессорных белков? // Биохимия. 1995. Т. 60. №. 6. С. 837-842

78. Шелемех О. В., Плакунов В. К., Беляев С. С. Защитная роль протоновпри гипоосмотическом стрессе у экстремально галофильной археи, Halobacterium salinarum // Микробиология. 2002. Т. 71. №.6. С. 858-859.

79. Шольц К. Ф., Островский Д. Н. Полярографическая ячейка для количественного определения растворённого кислорода. // Лаб. дело. 1965. № 6. С. 375-378.

80. Al-Hasan R. Н, Ghannoum М. A, Sallal АК, Abu-Elteen КН, and Radwan S.S. Correlative changes of growth, pigmentation and lipid composition of Dunaliella salina in response to halostress // J. Gen. Microbiol. 1987. V. 133. P. 2607-2616.

81. Apte S. K., Fernandes Т., Badran H., Ballal A. Expression and possible role of stress-responsive proteins in Anabaena // J. Biosciences (Bangalore). 1998. V. 23 №4. P. 399-406.

82. Asad L., de Carvalho A. A., Felzenszwalb I., Leitao A. C. Asad N. R. H202-induced cross-protection against UV-C killing in Escherichia coli is blocked in a lexA (Def) background // J. Photochem. Photobiol. В Biology. 2000. V. 54 № l.P. 67-71.

83. Azachi M., Sadka A., Fisher M., Goldshlag P., Gokhman I., Zamir A. Salt Induction of Fatty Acid Elongase and Membrane Lipid Modifications in the Extreme Halotolerant Alga Dunaliella salina // Plant Physiol. 2002. V. 129. P. 1320-1329.

84. Barnett J.A., Payne R.W., Yarrow D.: Yeast identification PC Program version 4. 1996.

85. Barfatani M., Munn R. J., Schjeide O. A. An ultrastructural study of Pityrosporum orbiculare // J. Invest. Derm. 1964 V. 43. P. 231-233.

86. Benov L., Fridovich I. Superoxide dismutase protects against aerobic heat shock in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1995. V. 177. № 11. P. 3344-3346.

87. Bergy D., Holt J. G., Krieg N. R., Sneath P. H. A. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology // 9th Edition. Baltimor. Lippincott, Williams &1. Wilkins. 1994.

88. Boekhout Т., Renting M., Scheffers W.A., Bosboom R. The use of karyotyping in the systematics of yeasts.//Antonie van Leeuwenhoek. 1993. V. 63. P. 157-163.

89. Boon C., Dick T. Mycobacterium bovis BCG Response Regulator Essential for Hypoxic Dormancy // J. Bacteriol. 2002. V. 184. №. 24. P. 67606767.

90. Brown A. D., Simpson J. R. Water relations of sugar tolerant yeasts: the role of intracellular polyols //J. Gen. Microbiol. 1972. V. 72. P. 589-591.

91. Browne N., Dowds В. C. A. Heat and salt stress in the food pathogen Bacillus cereus // J. Appl. Microbiol. 2001. V. 91 № 6. P. 1085-1094.

92. Chauhan S., O'Brian M. R. Transcriptional Regulation of Aminolevulinic Acid Dehydratase Synthesis by Oxygen in Bradyrhizobium japonicum and Evidence for Developmental Control of the hemB Gene // J. Bacteriol. 1997. V. 179. № 11. P. 3706-3710.

93. Collinson L. P., Dawes I. W. Inducibility of the response of yeast cell to peroxide stress // J. Gen. Microbiol. 1992. V. 138. № 2. P. 329-335.

94. Cunningham A. F., Spreadbury C. L. Mycobacterial Stationary Phase Induced by Low Oxygen Tension: Cell Wall Thickening and Localization of the 16-Kilodalton a-Crystallin Homolog//J. Bacteriol. 1998. V. 180. №. 4. P. 801808.

95. Davidson J. F., Whyte В., Bissinger P. H., Schiestl R. H. Oxidative stress is involved in heat-induced cell death in Saccharomyces cerevisiae // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. № 10. P. 5116-5121.

96. Dillon J. G., Tatsumi С. M., Tandingan P. G. Castenholz R. W. Effect of environmental factors on the synthesis of scytonemin, a UV-screening pigment, in a cyanobacterium (Chroococcidiopsis sp.) // Arch. Microbiol. 2002. V. 177 P. 322-331.

97. Elliot В., Futcher B. Stress resistance of yeast cells is largely independent of cell cycle phase // Yeast. 1993. V. 9. № 1. P. 33-42.

98. Esposito D., Del Vecchio P., Barone G. Interaction with natural polyamines and thermal stability of DNA. A DSC study and a theoretical reconsideration // J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 2606-2613.

99. Fell J. W. Rapid identification of yeast species using three primers in a polymerase chain reaction. // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1993. V. 2. P. 174180.

100. Fernandez R., Pizarro R. A. Pseudomonas aeruginosa UV-A-induced lethal effect: Influence of salts, nutritional stress and pyocyanine // J. Photochem. Photobiol. В Biology. 1999. V. 50. P. 59-65.

101. Flahaut S., Benachour A., Giard J-C., Boutibonnes P. Auffray Y. Defense against lethal treatments and de novo protein synthesis induced by NaCl in Enterococcus faecalis ATCC 19433 // Arch. Microbiol. 1996. V. 165 № 5. P. 317-324.

102. Flahaut S., Frere J., Boutibonnes P., Auffray Y. Relationship between the thermotolerance and the increase of DnaK and GroEL synthesis in Enterococcus faecalis atccl9433 //J. Basic Microbiol. 1997. V. 37. P. 251-258.

103. Flahaut S., Hartke A., Giard J. C., Benachour A., Boutibonnes P., Auffray Y. Relationship between stress response towards bile salts, acid and heattreatment in Enterococcus faecalis // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 138. № 1 P. 49-54.

104. Flahaut S., Laplace J-M., Frere J., Auffray Y. The oxidative stress response in Enterococcus faecalis: Relationship between H202 tolerance and H202 stress proteins // Lett. Appl. Microbiol. 1998. V. 26 № 4. 259-264.

105. Flink I., Petijohn D. E. Polyamines stabilize DNA folds // Nature. 1975. V. 253. P. 62-63.

106. Fridovich I. Supuroxide dismutases // Ann. Rev. Biochem. 1975. V. 44. № 1. P. 147-159.

107. Friedman S. M., Malik M., Dilica K. DNA super coiling in a thermotolerant Escherichia coli // Mol. Gen. Genet. 1995. V. 248. P. 417-422.

108. Galinski E. A., Truper H. G. Microbial behavior in salt stress ecosystems //FEMS Microbiol. Rev. 1994. V. 15. P. 95-108.

109. Garren D. M. Acid tolerance responses and acid shock responses of Escherichia coli 0157:h7 and non-0157:h7 strains (lactic acid) Ph. D. Thesis. University of Georgia. 1996. 106 P.

110. Gouesbet G., Jan G., Boyaval P. Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus thermotolerance // Lait. 2001 V. 81. № 1-2. P.301-309.

111. Gregory E. M., Moore W. E., Holdeman L. V. Superoxide dismutase in anaerobes: survey //Appl. Environ. Microbiol. 1978. V. 35. № 5. P. 988-991.

112. Gresikova M., Ferianc P., Toth D., Mistrikova J., Polek B. Heat shock resistance in filial generations of marine Vibrio S14 // Biologia (Bratislava). 1997. V. 52. №6. P. 717-722.

113. Guillot J., Gueho E., Lesourd M., Midgley G., Chevrier G., Dupont B. Identification of Malassezia species: a practical approach // J. Mycol. Med. 1996. V. 6. P.103-110.

114. Habel D., Plesofsky-Vig N., Brambl R. The Respiratory Response to Heat Shock in Neurospora crassa // FEMS Microbiol. Lett. 1991. V. 81. P. 317-322.

115. Heidelbach M., Skladny H., Schairer H. U. Heat shock and development induce synthesis of a low-molecular-weight stress-responsive protein in the myxobacterium Stigmatella aurantiaca // J. Bacterid. 1993. V. 175. № 22. P.7479.7482.

116. Herbert К. C., Foster S. J. Starvation survival in Listeria monocytogenes: Characterization of the response and the role of known and novel components // Microbiology. 2001 V. 147. № 8. P. 2275-2284.

117. Hewitt J., Morris J. G. Superoxide dismutase in some obligately anaerobic bacteria//FEBS Lett. 1975. V. 50. № 3. P. 315-318.

118. Hounsa C. G., Brandt E. V, Thevelein J., Hohmann S., Prior B. A. Role of trehalose in survival of Saccharomyces cerevisiae under osmotic stress // Microbiology. 1998. V. 144. P. 671-680.

119. Hottiger Т., Schmutz P., Wiemkin A. Heat-induced accumulation and futile cycling of trehalose in Saccharomyces cerevisiae // J. Bacterid. 1987. V. 169. № 12. P. 5518-5522.

120. Imlay J. A., Chin S. M., Lin S. Toxic DNA damage by hydrogen peroxidethrough the Felton reaction in vivo and in vitro // Science. 1988. V. 240. № 4852. P. 640-642.

121. Jamieson D. J., Oxidative stress responses of Saccharomyces cerevisiae // Redox. Rep. 1995. V. 1. № 1. P. 89-95.

122. Jarosz-Wilkolazka A., Fink-Boots M., Malarczyk E., Leonowicz A. Formaldehyde as a proof and response to various kind of stress in some Basidiomycetes // Acta Biologica Hungarica. 1998. V. 49. № 2-4. P. 393-403.

123. Jenkins D. E., Chaisson S. A., Matin A. Starvation-Induced Cross Protection against Osmotic Challenge in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1990. V. 172. №.5. P. 2779-2781.

124. Johnston J. R., Mortimer R. K. Electrophoretic karyotyping of laboratory and commercial strains of Saccharomyces and other yeasts// Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. V. 36. P. 569-572.

125. Kashiwagi K., Kobayashi H., Igarashi K. Apparently polyamine transport by proton motive in force in polyamine-deflcient Escherichia coli // J. Bacteriol. 1986. V. 165. P. 972-977.

126. Kallies A., Gebauer G., Rensing L. Heat shock effects on secondary messenger systems ofNeurospora crassa// Arch. Microbiol. 1998. V. 170. P. 191-200.

127. Kilstrup M., Jacobsen S., Hammer K., Vogensen F. K. Induction of Heat

128. Shock Proteins DnaK, GroEL, and GroES by Salt Stress in Lactococcus lactis // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 179. № 17. P. 5471-5481.

129. Kim Woojin S., Perl L., Park Ji Hyeon, Tandianus Jade E, Dunn Noel W. Assessment of stress response of the probiotic Lactobacillus acidophilus // Current Microbiol. 2001. V. 43. № 5. P. 346-350.

130. Koga Т., Sakamoto F., Yamoto A., Takumi K. Acid adaptation induces cross-protection against some environmental stresses in Vibrio parahaemolyticus // J. Gen. Appl. Microbiol. 1999. V. 45. P. 155-161.

131. Laplace J. M., Sauvageot N., Hartke A., Auffray Y. Characterization of Lactobacillus collinoides response to heat, acid and ethanol treatments // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 51 № 5. P. 659-663.

132. Larsen H. Halophilism // In: The Bacteria (Eds. Gunsalus I. C., Stanier R. Y.), Academic Press, New York and London. 1962. V. 4. P. 297-342,

133. Leblanc L., Leroi F., Hartke A., Auffray Y. Do stresses encountered during the smoked salmon process influence the survival of the spoiling bacterium Shewanella putrefaciens? // Lett. Appl. Microbiol. 2000. V. 30. № 6. P. 437-442.

134. Lieckfeldt E., Meyer W., Borner T. Rapid identification and differentiation of yeasts by DNA and PCR fingerprinting // J. Basic Microbiol. 1993. V. 33. P. 413-25.

135. Lorca G. L., de Valdez G. F. The effect of suboptimal growth temperature and growth phase on resistance of Lactobacillus acidophilus to environmental stress // Cryobiology. 1999. V. 39. P. 144-149.

136. Lowry О. H., Rosenbrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265275.

137. Lukas C., Da Costa M., Van Uden N. Osmoregulatory Active Sodium-glycerol Co-Transport in the Halotolerant Yeast Debaryomyces hansenii //

138. Yeast. 1990. V. 6. № 3. P. 187-191.

139. Lyte M., Frank C. D., Green В. T. Production of an autoinducer of growth by norepinefrine cultured Escherichia coli 0157:H7 // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 139. P. 155-159.

140. Nanasombat S. Heat adaptation induced cross-protection against osmotic stress in Salmonella typhimurium DTI04 and its survival in dried foods // Ph.D. Thesis. 2001. University of Georgia. 109 P.

141. Macario A. J. L., Lange M., Ahring В. K., De Macario E. C. Stress Genes and Proteins in the Archaea // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. V. 63. №. 4. P. 923-967.

142. Mathews M. M., Krinsky The relationship between carotenoid pigments and resistance to radiation in non-photosynthetic bacteria // Photochem. Photobiol. 1965. V. 4. P. 813-817.

143. Mccann M. P. The role of katf in Escherichia coli starvation protein synthesis and stress survival // Ph.D. Thesis. 1993. Stanford University. 128 P.

144. Michea-Hamzehpour L. M., Turian G. GMP-stimulation of the cyanide-insensitive mitochondrial respiration in heat-shocked conidia of Neurospora crassa //Experientia. 1987. V. 43. № 4. P. 439-440.

145. Minagawa N., Koga S., Nakano M., Sakajo S., Yoshimoto A. Possible involvement of superoxide anion in the induction of cyanide-resistant respiration in Hansenula anomala// FEBS Lett. 1992. V. 302. P. 217-219.

146. Mirret J. J., Nainudel S., Goldemberg S. H. Altered heat shock response in polyamine-depleted bacteria // FEBS Lett. 1986. V. 200. P. 117-122.

147. Mitchell J. В., Russo A. Thiol, thiol depletion, and thermosensitivity // Radiat. Res. 1983. V. 95. P. 471-485.

148. Mittag H. Fine structural investigation of Malassezia furfur: II. The envelope of the yeast cells // Mycoses. 1995. V. 38. P. 13-21.

149. Mongkolsuk S., Vattanaviboon P., Praituan W. Induced adaptive andcross-protection responses against oxidative stress killing in a bacterial phytopathogen, Xanthomonas oryzae pv oryzae // FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 146. №2. P. 217-222.

150. Moore A. L., Siedow J. N. The regulation and nature of the cyanide-resistant alternative oxidase of plant mitochondria // Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 1059. № l.P. 121-140.

151. Murata H. Characteristics of stress response in a mushroom-pathogenic bacterium, Pseudomonas tolaasii, during the interaction with Pleurotus ostreatus and carbon/nitrogen starvation in vitro // Mycoscience. 1999. V. 40. № 1. P. 8185.

152. Mutoh N., Nakagawa C. W., Hayashi Y. Adaptive response of Schizosaccharomyces pombe to hydrogen peroxide // FEMS. Microbiol. Lett. 1995. V. 132. № 1-2. P. 67-72.

153. Nelson D. R., Sadlowski Y., Eguchi M., Kjelleberg S. The starvation-stress response of Vibrio (Listonella) anguillarum// Microbiol. 1997. V. 143. № 7. P. 2305-2312.

154. Nishi Т., Yagy T. Efflux of sodium ions by a Na+/H+ antiporter during salt stress in the salt-tolerant yeast Zygosaccharomyces rouxii // J. Gen. Appl. Microbiol. 1995. V. 41. № 1. P. 87-97.

155. Norkrans B. Regulation of the potassium to sodium and of the osmoticpotential in relation to salt tolerance in yeast // J. Bacterid. 1969. V. 100. № 2. P. 836-845.

156. Okereke A., Thompson S. S. Induced acid-tolerance response confers limited nisin resistance on Listeria monocytogenes Scott A. // J. Food Protection. 1996. V. 59. № 9. P. 1003-1006.

157. Pannekoek Y., van Putten J.P. Dankert J. Identification and molecular analysis of a 63-kilodalton stress protein from Neisseria gonorrhoeae // J. Bacteriol. 1992. V. 174. № 21. P. 6928-6937.

158. Park J. J. Cellular responses to fireeze-thaw stress // Ph. D Thesis. University of New South Wales (Australia). 2000.

159. Park Sang-Ho, Oh Kye-Heon, Kim Chi-Kyung Adaptive and cross-protective responses of Pseudomonas sp. DJ-12 to several aromatics and other stress shocks // Current Microbiology. 2001. V. 43. № 3. P.l 76-181.

160. Parsell D. A., Lindquist S. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins // Annu. Rev. Genet. 1993. V. 27. P. 437-496.

161. Periago P.M., Abee Т., Wouters J. A. Analysis of the heat-adaptive response of psychrotrophic Bacillus weihenstephanensis // Int. J. F. Microbiol. 2002. V. 79. P. 17-26.

162. Periago P. M., van Schaik W., Abee Т., Wouters J.A., Identification of proteins involved in the heat stress response of Bacillus cereus ATCC 14579 // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 3486-3495.

163. Piper P. W. Molecular events associated with the acquisition of heat tolerance in the yeast Saccharomyces cerevisiae // FEMS Microbiol. Re. 1993. V. 11. P. 1-11.

164. Ramos-Gonzalez M. I., Molin S. Cloning, sequencing, and phenotypic characterization of the rpoS gene from Pseudomonas putida KT2440 // J. Bacteriol. V. 180. № 13. 1998. 3421-3431.

165. Riley P. A. Free radicals in biology: oxidative stress and the effect of ionizing radiation // Int. J. Radiat. Biol. 1994. V. 65. № 1. P. 27-33.

166. Rowe M. T. Kirk R. An investigation into the phenomenon of cross-protection in Escherichia coli 0157:H7 // Food Microbiol. (London). 1999. V. 16. №2. P. 157-164.

167. Ryu J.-H., Beuchat L. R. Influence of acid tolerance responses on survival, growth, and thermal cross-protection of Escherichia coli 0157:H7 in acidified media and fruit juices // Int. J. Food Microbiol. 1998. V. 45. № 3. P. 185-193.

168. Shindler D. B. Physiology and enzymatic aspects of moderately halophilic microorganisms // Ph. D. Thesis, University of Ottawa. 1976.

169. Schmidt G., Zink R. Basic features of the stress response in three species of bifidobacteria: B-longum, B-adolescentis, and B-breve // Int. J. Food Microbiol. 2000. V. 55. P. 41-45.

170. Selye H. A syndrome produced by diverse nocuous agents // Nature1.ndon). 1936. V. 138. P. 32.

171. Sugiyama K., Izawa S., Inoue Y. The Yaplp-dependent induction of glutathione synthesis in heat shock response of Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 20. P. 15535-15540.

172. Srinivasan S., Kjelleberg S. Signal-responsive carbon starvation genes of marine Vibrio angustum S14 // G. Meet. Am. Soc. Microbiol. 2001. V. 101. P. 606.

173. Svensater G., Sjogreen В., Hamilton I. R. Multiple stress responses in Streptococcus mutans and the induction of general and stress-specific proteins // Microbiol.-UK. 2000. V. 146. Part 1. P. 107-117.

174. Swiecilo A., Krawiec Z., Wawryn J., Bartosz G., Bilinski T. Effect of stress on the life span of the yeast Saccharomyces cerevisiae // Acta Bioch. Polonica. 2000. V. 47. № 2. P. 355-364.

175. Tang Y., Hollingsworth R. I. Regulation of Lipid Synthesis in Bradyrhizobium japonicum: Low Oxygen Concentrations Trigger Phosphatidylinositol Biosynthesis // Appl. Env. Microbiol. 1998. V. 64. №. 5. P. 1963-1966.

176. Taormina P. J., Beuchat L. R. Survival and heat resistance of Listeria monocytogenes after exposure to alkali and chlorine // Appl. Env. Microbiol. 2001. V. 67. № 6. P. 2555-2563.

177. Tran L. Т., Inoue Y., Kimura A. Oxidative stress response in yeast: purification and some properties of a membrane-bound glutathione peroxidase from Hansenula mrakii // Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1164. P. 166-172.

178. Van Zyl P. J., Kilian S. J., Prior B. A. The role of an active mechanism inglycerol accumulation during osmoregulation by Zygosaccharomyces rouxii // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. V. 34. № 2. P. 231-235.

179. Wagner A. M., Moore A. L. Structure and function of the plant alternative oxidase: its putative role in the oxygen defence mechanism. // Biosci. Rep. 1997. V. 17. №3. P. 319-333.

180. Walker D. C., Girgis H. S., Klaenhammer T. R. The groESL chaperone operon of Lactobacillus johnsonii // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. № 7. P. 3033-3041.

181. Wang J. Y., Syvanen M. DNA twist as a transcriptional sensor for environmental changes//Mol. Microbiol. 1992. V. 614. P. 1861-1866.

182. Wilkins T. D., Wagner D. L., Veltry B. J., Gregory E. M. Factors affecting production of catalase by Bacteroides // J. Clin. Microbiol. 1978. V. 8. № 5. P. 553-557.

183. Winkler K., Kienle I., Burger M., Wagner L.-C., Holzier H. Metabolic regulation of the trehalose content of vegetative yeast // FEBS Lett. 1991. V. 291. №2. P. 269-272.

184. Yarrow D. Methods for the isolation, maintenance and identification of yeasts // In: The Yeasts, A Taxonomic Study. 1998. Elsevier. Ed. by Kurtsman C.P,FellJ.W. P. 77-100.

Информация о работе

Гейдебрехт, Олег Викторович
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.07

Диссертация

Механизмы галоадаптации микроорганизмов в условиях гипоксии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы