Ответные реакции микроорганизмов на одновременное воздействие нескольких стрессорных факторов: гипо- и гиперосмотических условий, гипоксии, неблагоприятных значений pH

Шелемех, Оксана Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ответные реакции микроорганизмов на одновременное воздействие нескольких стрессорных факторов: гипо- и гиперосмотических условий, гипоксии, неблагоприятных значений pH
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Ответные реакции микроорганизмов на одновременное воздействие нескольких стрессорных факторов: гипо- и гиперосмотических условий, гипоксии, неблагоприятных значений pH"

На правах рукописи

ШЕЛЕМЕХ ОКСАНА ВЛАДИМИРОВНА

Ответные реакции микроорганизмов на одновременное воздействие нескольких стрессорных факторов: гипо- и гиперосмотических условий, гипоксии, неблагоприятных значений рН

Специальность 03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

0Л .. — т"1^ О

О , ; | ^ов

Москва 2008

003451405

Работа выполнена в лаборатории нефтяной микробиологии Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.К. Плакунов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Г.И. Эль-Регистан доктор биологических наук, профессор Н.Б. Градова

Ведущая организация:

кафедра биологии почв факультета почвоведения

Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « /¿¿/с2008 года в часов на заседании диссертационного совета Д.002.224.61 в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117332, г. Москва, Проспект 60-летия Октября, д. 7, к. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН.

Автореферат размещен на сайте: http://wvyw.inmi.ru/dissovet.php

2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук:

Т.В. Хижняк

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В «экстремальных» условиях среды микроорганизмы, как правило, подвергаются влиянию не одного, а нескольких стрессовых факторов, действующих одновременно или последовательно. Например, термофильные микроорганизмы подвергаются не только тепловому воздействию, но часто также высокой концентрации солей или кислой реакции среды.

Между тем, в многочисленных исследованиях последствий экстремальных воздействий, как правило, стрессовые факторы используют по отдельности, создавая условия «моностресса». Широко известны работы, посвященные таким стрессовым факторам, как гипертермия [Тэнси и Брок, 1981, Hottiger et al, 1987; Collinson and Dawes, 1992; Mutoh et al, 1995; Mojica et al, 1997; Kilstrup et al, 1997; Macario et al, 1999 и т.д.], факторам, вызывающим окислительный стресс [Fridovich, 1975; Wilkins et al, 1978; Гаенко с соавт., 1985; Imlay et al, 1988; Jamieson, 1995; Tran et al, 1993], гипо- или гиперосмотическим воздействиям [Larsen, 1962; Brown and Simpson, 1972; Shindler, 1976; Lukas et al, 1990; Van Zyl et al, 1990; Galinski and Truper, 1994] и др.

Однако, последствия воздействия на метаболизм единичных стрессовых факторов могут существенно отличаться от последствий, вызываемых одновременным их воздействием. Последнее явление пока еще изучено недостаточно. Наибольшее внимание уделяется таким сочетаниям, как гипертермия и неоптимальные концентрации NaCl [Кунтиков и Горленко, 1998; Leblanc et all, 2000; Periago et all, 2002a, 2002b], углеродное голодание, гипертермия и осмотические стрессоры [Мссапп, 1993; Murata, 1999; Herbert and Foster, 2001], осмотические стрессоры и Н2О2 [Hartke et all, 1995; Browne and Dowds, 2001], воздействие ультрафиолетового излучения и углеродное голодание [Srinivasan and Kjelleberg, 2001] и др. Изучение же механизмов адаптации к совместному действию стрессоров находится на начальной стадии. Весьма распространенным сочетанием стрессовых факторов в естественных условиях обитания микроорганизмов является высокое осмотическое давление (в частности, избыток NaCl) и недостаток кислорода. Исследования в этом направлении были начаты в лаборатории нефтяной микробиологии ИНМИ РАН [Арзуманян с соавт., 2000]. Настоящая диссертация является продолжением и развитием этого направления.

Очевидно, что изучение влияния гипоксии и повышенных концентраций NaCl на микроорганизмы, выделенные из различных экосистем, а также механизмов адаптации к такому воздействию представляет большой научный интерес.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования явилось изучение последствий и механизмов адаптации к одновременному воздействию гипо- или гиперосмотического шока и гипоксии (или неблагоприятного pH) у микроорганизмов, изолированных из экотопов, где, как правило, эти стрессовые агенты являются факторами внешней среды.

Задачи исследования:

1. Изучение зависимости скорости роста микроорганизмов от повышенного содержания NaCl в условиях нормоксии и гипоксии.

2. Изучение влияния NaCl на дыхание микроорганизмов, выращенных в условиях нормоксии и гипоксии.

3. Изучение влияния комбинированного действия NaCl и гипоксии на ферменты, защищающие клетку от окислительного стресса (каталазу и супероксиддисмутазу).

4. Изучение изменений состава дыхательной цепи у микроорганизмов в условиях гипоксии и гиперосмотического шока.

5. Изучение возможности противодействия гипоосмотическому шоку у экстремально галофильных бактерий.

Научная новизна. Впервые детально изучены рост и дыхательная активность ряда эукариотных (Candida lipolytica, Rhodotorula aurantiaca, Candida rhagii, Debaryomyces hansenit) и прокариотных (Rhodococcus erythropolis, Shewanella sp., Halobacterium salinarum) микроорганизмов в условиях одновременного воздействия двух стрессовых факторов: гипо- или гиперосмотического шока и гипоксии (или неблагоприятного рН).

Впервые продемонстрировано ингибиторное действие соли на активность ферментов, защищающих клетку от окислительного шока (каталазы, супероксиддисмутазы), а также обнаружено в условиях гипоксии явление активации (индукции) каталазы, менее чувствительной к ингибиторному действию соли.

Впервые обнаружено явление переключения на альтернативные дыхательные механизмы, менее чувствительные к соли, в условиях одновременного воздействия гиперосмотического шока и гипоксии, на примере дыхательной цепи Debaryomyces hansenii.

Впервые обнаружено защитное действие протонов в условиях гипоосмотического шока на примере растущей культуры Halobacterium salinarum.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты уточняют, а в ряде случаев раскрывают, механизмы защитных реакций микроорганизмов в условиях одновременного воздействия стрессовых факторов, характерных для их природных экотопов. Результаты работы позволяют дать рекомендации по более эффективному применению микроорганизмов в системах биологической очистки и повышения нефтеизвлечения в экстремальных условиях. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на школе - конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), 21st International Specialized Symposium on Yeasts "Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Ecology of Non-conventional Yeasts (NCY)". (Lviv, Ukraine. August 2001), 1-м Съезде микологов России (Москва, 2002), XV Международной зимней молодёжной научной школе (Москва, 10-14 февраля 2003), 1-м Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 20-21 февраля 2003), 23rd International Specialised Symposium on Yeasts "Interactions between Yeasts and other

Organisms" (Budapest, Hungary. 26 - 29 August. 2003). 1-м Международном конгрессе по биотехнологии, Москва, 2003; Int. Symposium for subsurface Microbiology. ISEB XVIII. 2005.; Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2005. Публикации. По теме диссертации, опубликовано 11 печатных работ, из них 5 экспериментальных статей и обзоров, а также 6 тезисов. .

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на-^С¿страницах машинописного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы (/•^источников). Текст проиллюстрирован рисунками и таблицей.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность руководителю работы д.б.н.. проф. Плакунову В.К., а также моим соавторам д.б.н., проф. С.С.Беляеву, д.б.н. В.Г.Арзуманян, и к.б.н. О.В.Гейдебрехту за консультации и помощь в работе, к.б.н. Е.П.Лукашеву за помощь при регистрации дифференциальных спектров цитохромов.

Работа проводилась при частичном финансировании в рамках проекта РФФИ 01-04-48275, подпроекта "Биотехнология повышения нефтеизвлечения" ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения", Государственных контрактов с Минпромнауки РФ № 43.106.11.0009 и № 43.073.11.2515 и Проекта MAC РФФИ, 01-04-48275,2003 г.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Объектами исследования были 8 штаммов про- и эукариотных микроорганизмов: Halobacterium salinarum (штамм S9) получена от prof. D. Oesterhelt (Институт Макса Планка, Германия); Shewanella sp. CN32 получена от Dr. Belyaev A.S. (Nat.Lab.,Oak-Ridge, USA); Rhodococcus erythropolis выделен из пластовых вод Бондюжского нефтяного месторождения (Татарстан), получена от к.б.н. Е. И. Милехиной (ИНМИ РАН). Candidaf Yarrowia) lipolytica (штамм 367 -3), получена как и предыдущая культура. Rhodotorula aurantiaca (штамм 786), выделена из соленой воды Сакского лимана (Крым). Malassezia sp. (штамм 607), выделена с поверхности кожи здорового человека, получена из коллекции Института вакцин и сывороток им. Мечникова. Candida rhagii (ВКМ Y-2339), выделена из активного осадка на нефтехимическом заводе г. Ангарск, получена из ВКМ. Debaryomyces hansenii (ВКМ Y-116), выделена из муки семян хлопка, получена из ВКМ.

Методы культивирования и анализа. Дрожжевые и бактериальные культуры поддерживали на глюкозо-пептон-дрожжевом агаре [Yarrow, 1998], рН 5.4 для дрожжей (поддерживали с помощью калий-фосфатного буфера, 1,1 мМ); рН 7,0 -7,2 для бактерий, a Malassezia sp. - на модифицированной агаризованной среде Диксона [Guillot et al, 1996]. В среды, на которых культивировали дрожжи,

добавляли антибиотик цифран (ципрофлоксацин) (0,2 мг/мл) для подавления случайного роста бактерий. Н. salinarum выращивали и поддерживали на модифицированной пептонной среде состава (г/л дистиллированной воды): пептон «Oxoid» (Англия) - 10; MgS04x7H20 - 20; KCl - 2; трехзамещенный цитрат натрия - 3; NaCl - 200; pH - 7,2.

Культивирование микроорганизмов проводили во флаконах объемом 100 мл, содержащих 20 мл жидкой среды на качалке при скорости вращения 150 об/мип, температуре 26-27°С (кроме галобактерий). Галобактерии выращивали при 37-38°С. Для контроля кислотности сред использовались рН-метры: рН-340 или PICCOLO Ш 1290.

При аэробном культивировании микроорганизмы выращивали под ватными пробками. Для создания микроаэробных условий флаконы закрывали резиновыми пробками, проколотыми шприцевыми иглами диаметром 0,8 мм с неплотными ватными шариками. При микроаэробном выращивании среду во флаконах предварительно барботировали аргоном. Содержание кислорода в газовой фазе на начальном этапе культивирования не превышало 1-2 %. Применение сульфитного метода определения интенсивности аэрации [Егоров, 1976] показало, что степень аэрации в микроаэробных условиях составляет около 1% от аэробных условий. Контроль чистоты культур осуществлялся в световом бинокулярном микроскопе CARLZEISS JENA и путем высева на твердые среды. Рост культур измеряли по сухой биомассе, оптической плотности, содержанию белка и углерода. Измерение условной оптической плотности (светопоглощение + светорассеяние) проводили при длине волны (X) 540 нм на нефелометре КФК-2-УХЛ 4.2. Определение содержания белка проводили по методу Лоури [Lowry et al, 1951]. Определение содержания органического углерода проводили по модифицированному методу Паникова [Паников с соавт, 1988]. Качественное и количественное содержание аминокислот определяли методом тонкослойной хроматографии [Плакунов и Волкова, 1991] и на аминокислотном анализаторе.

Определение активности каталазы проводили манометрическим методом [Хазиев, 1976]. Для опытов использовали 4-х суточные отмытые суспензии клеток. В опытах с очищенным ферментом вносили 80 ми/мл каталазы [Е.С.1.11.1.6; ICN],

Потребление кислорода клетками определяли амперометрическим методом [Шольц, Островский, 1965] на полярографе LP-7 с хлорсеребряным и платиновым электродами. Рабочий объём ячейки составлял 2 мл. Суспензии клеток дрожжей (4-х суточные) готовили непосредственно перед измерением. Клеточную биомассу центрифугировали при 7000 об/мин, ресуспендировали в калий-фосфатном буфере, содержащем количество NaCl, соответствующее среде культивирования, и выдерживали 15 мин. для уравновешивания концентрации соли внутри и вне клеток. Измерение проводили в калий-фосфатном буфере, содержащем 1% глюкозы (С. lipolytica, С. rhagii, Rh. aurantiaca, D. hansenii) или 1% бычьей желчи, 1% Tween 40, 0,1% аспарагина (Malassezia sp.), в присутствии изучаемых концентраций NaCl или без добавления NaCl. Азид натрия и салицилгидроксамовую кислоту (СГК) вносили до конечных концентраций 2 мМ и 4 мМ соответственно.

Определение концентрации кислорода в газовой фазе над культурами проводили на газовом хроматографе CS 3300, объем пробы составлял 200 мкл.

Дифференциальные спектры цитохромов (восстановленная дитионитом форма минус форма, окисленная перекисью водорода или воздухом) при комнатной температуре снимали на двулучевом спектрофотометре Н1ТАСШ-557, сопряженным с компьютером. Скорость сканирования - 60 нм/мин. Для уменьшения светорассеяния к суспензии, содержащей 0.05-0.2 г клеток/мл (в пересчете на сухую биомассу), добавляли 20% сахарозы.

Низкотемпературные дифференциальные спектры получали с использованием модифицированного спектрофотометра на базе Unicam SP.1800, снабженного специальным сосудом Дьюара, размещенным вплотную к фотоумножителю. К суспензии добавляли глицерин до концентрации 50% и замораживали в жидком азоте. Затем суспензии давали оттаять до просветления и вновь замораживали в жидком азоте. Скорость сканирования 60 нм/мин.

Графическую визуализацию спектров осуществляли при помощи программы «Origin 7.5» с использованием процесса «Smoothing, FTP filter». Положение максимумов устанавливали при помощи инструмента «Pick peaks». Статистическая достоверность результатов основана на использовании результатов типичных опытов, полученных из 5-7 статистических повторностей. В необходимых случаях коэффициенты корреляции, стандартное отклонение и др. статистические параметры рассчитывали по методам, заложенным в Microsoft Excel, пользуясь пособием Платонова [Платонов, 2000].

Уточнение систематического положения изучаемых микроорганизмов

Родовую и видовую идентификацию дрожжей Candida (Yarrowia) sp. и Rhodotorula sp. осуществляли классическими методами путем проведения культуральных, морфо-цитологических и физиолого-биохимических тестов [Бабьева и Голубев, 1979, Yarrow, 1998] с использованием компьютерной программы "Yeast identification program. Version 4" [Barnett et all, 1996]. Результаты идентификации подтверждали методом ПЦР генов рибосомной РНК, осуществленным на базе Венгерской национальной коллекции микроорганизмов (Будапешт) [Lieckfeldt et all, 1993].

Результаты и их обсуждение

Воздействие на изучаемые микроорганизмы двух стрессовых факторов: гипоксии и осмотического шока.

В литературе мы не обнаружили сведений, касающихся последствий одновременного воздействия на аэробные микроорганизмы гипоксии и осмотического стресса. Хотя имеются отдельные данные, характеризующие отношение к солям изучаемых нами микроорганизмов, мы сочли необходимым уточнить эти показатели для конкретных использованных штаммов и в конкретных условиях наших экспериментов. Полученные результаты представлены на рис. 1-4. Рост каждой культуры измеряли в динамике, и на

графике представлены данные, соответствующие фазе замедления активного роста (достижения максимальной биомассы).

Поскольку ряд изучаемых микроорганизмов в природных условиях часто обнаруживается в экотопах с пониженным содержанием кислорода, а в лаборатории их обычно культивируют в аэробных условиях, мы исследовали влияние разных уровней аэрации на степень галофильности (галотолерантности) данных культур.

ОП^

Nad, %

Рис.1. Рост микроорганизмов в аэробных условиях с перемешиванием при разных концентрациях NaCl.

1 - Shewanella sp. CN32, 2 — Rhodococcus erythropolis,

3 - Candida lipolytica, 4 - Halobacterium salinarum S9

Для сохранения масштаба рисунка данные для Y. lipolytica уменьшены в 10 раз.

Согласно общепринятой классификации [Кашнер, 1981], Shewanella sp. CN32 и Rh. erythropolis следует рассматривать как слабых галофилов (оптимальная концентрация NaCl для роста составляет 1-3%), С. lipolytica является галотолерантом, а Н. salinarum - экстремальным галофилом (оптимальная концентрация NaCl - 20%).

ОПдо (в % х контролю)

Рис. 2. Рост БИем/алеНа вр. С№2 при разных режимах аэрации и концентрациях КаС1.

1 - культура в аэробных условиях с перемешиванием,

2 - культура в аэробных условиях без перемешивания (стационарная),

3 - культура в микроаэробных условиях.

Здесь и на рисунках 3-4 контролем служили кулыуры, выращиваемые при тех же режимах аэрации, но без добавления ЫаС1.

Бкем'апеИа эр. СЫ32 относится к факультативным анаэробам, и ее рост в аэробных условиях с перемешиванием сопровождается последующим лизисом клеток, а без перемешивания культура, достигнув стационарной фазы, может сохраняться достаточно долго. Рост в микроаэробных условиях протекает со скоростью в 1,5-2 раза меньшей, чем с перемешиванием, однако за 72-96 ч культура достигает такой же плотности, что и в условиях интенсивной аэрации. При этом степень ее галофильности повышается настолько (оптимальная концентрация №С1 составляет 5-6%, рис.2), что эту культуру уже можно рассматривать как умеренного галофила.

Юг. ггу^гороШ является облигатным аэробом, и его рост в анаэробных условиях невозможен. Переход от перемешиваемой культуры к стационарной заметно снижает скорость роста, а в микроаэробных условиях культура растет почти в 10 раз медленнее, чем при перемешивании. Однако, оптимальная концентрация ЫаС1 в микроаэробных условиях по сравнению с условиями интенсивной аэрации повышается столь заметно (от 1 до 5%, рис.3), что эту культуру, как и предыдущую, следует относить не к слабым, а к умеренным галофилам.

ОПдо (в % к контролю)

160 т

Рис. 3. Рост ЮюсЬсоссш егуИтгороИз при разных режимах аэрации и концентрациях ЫаС1.

1 - культура в аэробных условиях с перемешиванием,

2 - культура в аэробных условиях без перемешивания (стационарная),

3 - культура в микроаэробных условиях.

ОПзд (в % г контролю)

300 Л

Рис. 4. Рост Candida lipolytica при разных режимах аэрации и концентрациях NaCl. 1,2- культура в аэробных условиях с перемешиванием, 3,4 - культура в микроаэробных условиях.

1.3 - на 9-е сутки роста

2.4 - на 4-е сутки роста

№С!.%

Дрожжи С. Иро1уИса относятся к типичным аэробам и галотолерантам. В условиях перемешивания культура способна расти до концентрации КаС1, равной 15%. В стационарных, и особенно, микроаэробных условиях скорость ее

роста уменьшается в 10 раз, однако при этом не только повышается галотолерантность (до 20% КаС1), но и появляется зависимость роста от концентрации соли, т.е. культура приобретает свойства галофила (с оптимумом роста при 10% №С1), причем этот эффект не зависит от возраста культуры (рис.4).

Интересные результаты были получены с культурой Я тИпагит 89. Этот экстремально галофильный микроорганизм растет в средах с концентрацией КаС1, близкой к насыщению (34%, рис.1). Однако и в этом случае галофильность культуры в стационарных и микроаэробных условиях несколько увеличивается. Хотя оптимальной остается концентрация ЫаС1, равная 20%, различия в росте при 20% и 25% ЫаС1 сглаживаются, и при концентрациях до 30% относительная скорость роста при снижении аэрации выше, чем при перемешивании. В последнем случае, из-за сравнительно небольшого эффекта, а также, чтобы избежать артефактов за счет изменения мутности суспензии при изменении объема клеток, рост характеризовали не только показателем оптической плотности, но и содержанием белка. Аналогичные контрольные эксперименты по содержанию сухой биомассы или белка клеток в отдельных пробах были проведены и с другими изучаемыми культурами. Все они подтвердили результаты, полученные при измерении оптической плотности культур.

Таким образом, можно сделать вывод о достаточно широкой распространенности явления зависимости галофильности (галотолерантности) микроорганизмов от парциального давления кислорода. Это явление обнаруживается как у слабых, так и экстремально галофильных бактерий, а также у представителей галотолерантных дрожжей.

Что касается биохимических основ обнаруженного феномена, то в силу его сложности (в подобную системную регуляцию обычно вовлекается множество метаболических звеньев) трудно ожидать, что он может быть объяснен каким-либо одним механизмом. Это обстоятельство заставило нас провести разносторонние исследования для выявления механизмов данного явления.

Ранее в нашей лаборатории были получены данные о том, что №С1 подавляет дыхание у некоторых бактерий, вызывает окислительный шок и переключает метаболизм на пути, менее зависимые от кислорода (Арзуманян с соавт. 2000). Поскольку при воздействии на микробную клетку факторов, приводящих к окислительному стрессу, во многих случаях наблюдается изменение синтеза защитных ферментов (каталазы, супероксиддисмутазы), были проведены исследования активности каталазы у дрожжей С. Иро1уйса, Ш. аигапйаса, Ма1аззе21а ¡р., С. rhagU и Д Иагаепп, выращенных в аэробных и микроаэробных условиях при разных концентрациях №С1.

В качестве контроля (100%) использовали активность каталазы клеток, выращенных без добавления ИаС1 в среду культивирования, измеренную без внесения ИаС1 в среду инкубации. На рис. 5 приведены данные для Д ИажепИ.

Рис.5. Активность каталазы ОеЬагуотусея Ьатгпи при аэробном (А) и микроаэробном

(Б) выращивании при разных концентрациях ЫаС1 (% к контролю).

Контроль - активность каталазы у культуры, выращенной и тестированной без №С1.

1 -Остаточная активность каталазы'. культуру выращивали без добавления ИаС1, измерение проводили в присутствии 5,10 или 15% №С1;

2 - реальная активность каталазы: среда инкубации при определении активности фермента содержала такое же количество №С1, как и среда культивирования;

3 - потенциальная активность каталазы: активность каталазы культур, выращенных при 5,10 или 15% ЫаС1, определяли в отсутствие соли.

Хотя синтез каталазы сильно подавляется с повышением уровня КаС1, как в аэробных, так и в микроаэробных условиях, у дрожжей, у которых степень галофильности (галотолерантности) заметно повышается в микроаэробных условиях (С. Иро1уНса, С. rhagii, Д Исшет:/), индуцируется (или активируется) каталазная активность, позволяющая противостоять окислительному стрессу. Дополнительные эксперименты, проведенные с чистым препаратом каталазы, показали, что №С1 хотя и подавляет активность фермента, но этот эффект выражен значительно слабее, чем в случае дрожжевых клеток. Это с высокой степенью вероятности указывает на существование не только прямого ингибиторного действия №С1 на активность этого фермента, но и опосредованного эффекта, обусловленного, например, изменением конформации или энергизации клеточных мембран (плазмалеммы или вакуолярной мембраны).

Эксперименты, проведенные с Н. ¡аПпагит, показали, что активность и другого защитного фермента - супероксидцисмутазы - подавляется солью. Точная количественная оценка этих экспериментов затруднена наличием у Н. ваИпагит Б9 нескольких типов супероксиддисмутаз, однако, общая тенденция изменений показывает, что с увеличением концентрации соли активность этих ферментов падает на 50-80% Хотя соль подавляет активность супероксиддисмутаз как в аэробных, так и в микроаэробных условиях, в последнем случае рост микроорганизма возможен в связи с низким содержанием кислорода.

Таким образом, одной из причин повышения галофильности (т.е. снижения ростингибирующего действия соли) микроорганизмов при переходе в микроаэробные условия может быть ослабление токсичного действия кислорода за счет уменьшения его парциального давления в окружающей среде. Это позволяет противодействовать дефициту защитных ферментов, создаваемому присутствием соли.

Эффект снижения уровня кислорода дополняется индукцией (или активацией) защитных ферментов (каталазы) в микроаэробных условиях.

Другая возможность возрастания галофильности в микроаэробных условиях, как предполагали ранее [Арзуманян с соавт. 2000], состоит в повышении внутриклеточного пула низкомолекулярных продуктов метаболизма, которые могут выполнять функции осмопротекторов за счет подавления их окисления при недостатке кислорода. Как показали наши эксперименты (рис. 6), количество внутриклеточных растворимых органических веществ у ЯН.егуШгоро^ и С. Иро1уйса возрастает в микроаэробных условиях по сравнению с аэробными в 1,31,5 раз, причем особенно значительно увеличивается количество аминокислот (главным образом аспарагиновой кислоты, а также пролина и лизина).

Рис. 6. Содержание свободных аминокислот в клетках Candida lipolytica, выращенных без добавления NaCl (серые столбики), а также при 4% (черные столбики) и 8% (белые столбики) NaCl.

Культура выращена в аэробных (А) и микроаэробных (Б) условиях. Ось ординат -содержание аминокислот, % относительно контроля без NaCl.

Мы предположили, что существует и третий механизм, основанный на так называемой «кислородной регуляции» метаболизма в условиях перехода от аэробиоза к микроаэробиозу. Суть феномена состоит в том, что организмы подвергаются стрессовым воздействиям как при переходе от аэробных условий

(нормоксии) к микроаэробным (гипоксии) и далее к анаэробным (аноксии), так и при обратной последовательности событий. Естественно, что такие процессы сопряжены с массированной регуляцией экспрессии многих генов. Эти гены можно подразделить на две большие категории: «гены аэробиоза», экспрессия которых максимальна в аэробных условиях, и «гены гипоксии», которые максимально экспрессируются в микроаэробных или анаэробных условиях [Kwast, 1998].

Объектом более детального исследования нами изменений системы аэробного дыхания при комбинированном стрессовом воздействии (гипоксия + осмотический шок) послужил дрожжевой организм Debaryomyces hansenii, многие физиологические функции которого хорошо изучены.

Большинство представителей дрожжей D. hansenii относятся к типичным умеренным галофилам с оптимумом роста при концентрации солей 4-6% (0.8-1.0 М) [Prista, 2005]. В наших экспериментах культивирование этого микроорганизма в микроаэробных условиях существенно расширяло диапазон концентраций NaCl, в котором возможен рост данной культуры (рис. 7).

Хотя при лимитировании кислорода скорость роста и максимальный уровень накопления биомассы снижались, эти показатели практически не зависели от концентрации соли до 18% (около 3.0 М) №С1, тогда как в аэробных условиях рост существенно замедлялся при 10-12% (около 1.5-2М)КаС1.

Измерение интенсивности дыхания клеток В. ИатепН, осуществляли для культур, выращенных в аэробных и микроаэробных условиях, без добавления №С1 в среду, а также при наличии соли в оптимальной (6%) и в явно неблагоприятной концентрации (15%) (таблица).

Условия эксперимента* Скорость дыхания нг-ат.О/мин.ед.ОП Степень ингибирования азидом, % Степень ингибирования СПС, % Совместное ингибирование: азид + СГК, %

Рост в аэробных условиях

6-6 480 37.8 30 69.8

6-» 15 190 28.5 29 73.3

6-0 450 32.4 37.2 78

Рост в микроаэробных условиях

6-6 400 57.3 16 59.9

6 -»15 390 58.5 12.6 60.4

6 — 0 405 61 11.6 61.8

Рост в аэробных условиях

0 — 0 340 34.7 44.3 73.4

0 — 15 90 23.5 41.5 68.8

15—15 250 37.7 27.5 71.5

15—0 510 48.6 22.3 71.3

Рост в микроаэробных условиях

0-0 240 60.3 10.3 65.8

0—15 230 60.3 10.5 58

15 — 15 390 59.8 11.5 56.8

15-0 450 60.7 5 63

Примечание. В таблице приведены средние данные 3-4 повторностей опытов. ♦Первая цифра - содержание ЫаС1 в ростовой среде; вторая цифра - содержание ЫаС1 в инкубационной среде при измерении скорости дыхания.

Клетки, выращенные при оптимальном содержании соли (6%) в аэробных условиях, обнаружили высокую скорость дыхания (вариант 6 —» 6, таблица). Избыток ЫаС1 (15%) в инкубационной среде приводил к подавлению дыхания (вариант 6 —» 15), как и в случае других, исследованных нами микроорганизмов. Выращивание без добавления №С1 (вариант 0 —>• 0) несколько снижало скорость дыхания. В этом варианте выращивания процесс дыхания сохранял чувствительность к избытку №С1 (вариант 0 —<• 15). Скорость дыхания клеток культуры, выращенной при избытке соли (15%) в среде (вариант 15 —» 0), характеризовалась показателями, близкими к варианту 6 —» 0, но существенно снижалась в присутствии 15%КаС1 в инкубационной среде (вариант 15 —► 15).

Выращивание в микроаэробных условиях приводило к некоторому подавлению дыхания, но существенно уменьшало его чувствительность к избытку №С1 (например, вариант 6 —»15 для микроаэробных условий).

Эти данные указывали на некоторые изменения в системе дыхания при одновременном воздействии гипоксии и осмотического шока. Для выяснения природы этих изменений были применены ингибиторы дыхания: ингибитор цитохром-с-оксидазы азид натрия (который дает более стабильные результаты, чем цианид калия), а также салицилгидроксамовая кислота - ингибитор альтернативной цианидустойчивой оксидазы.

Оказалось, что действие ингибиторов дыхания обнаруживает сложную картину, которая не поддается однозначной интерпретации (таблица). Однако, с учетом имеющихся в литературе данных эти результаты в наилучшей степени можно объяснить, допустив, что у данного микроорганизма существует, по крайней мере, три типа аэробных дыхательных цепей, которые могут функционировать одновременно, но с разной скоростью, в зависимости от условий выращивания культуры.

1) В аэробных условиях при оптимальной концентрации №С1 (6%) функционируют как дыхательная цепь с участием цитохромоксидазы (азид-и цианидчувствительная или «классическая» дыхательная цепь, КДЦ). о чем свидетельствует ингибирование азидом на 30-40%, так и азид- и цианидустойчивая, или «альтернативная» дыхательная цепь (АДЦ) (ингибирование дыхания СГК на 30-40%). Неполное ингибирование дыхания при совместном использовании ингибиторов (азид + СГК) указывает на возможное функционирование третьей, дополнительной, дыхательной цепи (ДЦЦ), которая будет рассмотрена далее.

2) В условиях гипоксии (при выращивании культуры в микроаэробных условиях) (при оптимальной концентрации 6% ЫаС1) возрастает роль КДЦ (ингибирование азидом составляет около 60%) и снижается роль АДЦ (ингибирование СГК составляет 11-16%). Подавление дыхания при совместном действии ингибиторов остается неполным.

3) Гипоосмотический шок в результате выращивания культуры без добавления ЫаС1 в аэробных условиях не вызывает заметного изменения чувствительности дыхательной цепи к ингибиторам. Гипоосмотический шок в микроаэробных условиях приводит к преимущественному функционированию КДЦ (степень ингибирования азидом — 60%) и несколько снижает ингибиторный эффект в варианте азид+СГК.

4) Наконец, гиперосмотический шок (15% ЫаС1 при выращивании культуры) в условиях гипоксии приводит к явному преобладанию дыхания, обеспечиваемого КДЦ (ингибирование азидом около 60%).

Поскольку действие ингибиторов не является абсолютно специфичным, для более точной характеристики механизмов дыхания при различных сочетаниях стрессовых воздействий необходимо было получить данные о составе дыхательной цепи в указанных вариантах опытов.

II. is

Рис 8. Дифференциальные спектры цитохромов (область 400-700 нм) клеток О.Ьапзепи, выращенных в присутствии 6% ЫаС1 в аэробных (1) и микроаэробных (2) условиях. На врезке в увеличенном виде представлены спектры в области 490-570 нм.

400 450 500 55(1 6Ш (>50 7(И)

}.. им

Анализ дифференциальных спектров цитохромов показал, что наибольшие изменения проявляются у вариантов, выращенных в микроаэробных условиях (гипоксия), по сравнению с аэробными вариантами (нормоксия). Эти выводы можно проиллюстрировать следующими примерами.

На рис.8 показаны дифференциальные спектры клеток D. hansenii, выращенных в аэробных и микроаэробных условиях при оптимальном содержании соли (6%). Можно видеть, что гипоксия вызывает сдвиги в спектрах поглощения (в районе у-максимумов) в длинноволновую область, а также изменение соотношения цитохромов Ъ и с (что нагляднее представлено на врезке).

При действии гипо- или гиперосмотического шока в аэробных условиях изменений цкгохромного состава по сравнению с оптимальным уровнем соли не наблюдается.

Совместное воздействие осмотического шока и гипоксии вызывает такой же эффект, как и сама по себе гипоксия.

В связи с тем, что в спектрах, полученных при комнатной температуре, происходит наложение максимумов поглощения цитохромов бис, для выявления и идентификации изменившихся цитохромных компонентов были использованы низкотемпературные дифференциальные спектры. Результаты представлены на рис.9.

0.044 -0.092 " 0.090 ■ 0.0X8 -0.0X6 -0.0Н4 • 0.082 -0.08» 0.07Х -0.076 4X0

549.5.

Рис. 9.

Низкотемпературные дифференциальные спектры цитохромов (область 490-570 нм) клеток £>. Иатепи, выращенных в аэробных (а) и микроаэробных (б) условиях в

присутствии 6% КаС1.

500

520

540

560 580 X. нм

Следует отметить, что полное совпадение числовых значений максимумов поглощения цитохромов с классическими образцами возможно только после получения этих белков в изолированном гомогенном состоянии. При измерении спектров целых клеток наблюдается отклонение числовых величин в ту или иную сторону в зависимости от величины светорассеяния измеряемой суспензии и многих других факторов. Например, в низкотемпературных спектрах происходит сдвиг максимумов поглощения на 1-4 нм в коротковолновую область. Мы старались использовать клетки в нативном состоянии, избегая обработки (в том числе и выделения митохондрий), которая может привести к потери лабильных компонентов. Поэтому при дальнейшем обсуждении мы будет оперировать округленными числовыми значениями максимумов поглощения.

Таким образом, в клетках, выращенных в аэробных условиях при оптимальном содержании соли (6%), обнаруживается присутствие цитохромов следующих классов (рис. 9а):

1) классического цитохрома с с максимумом а-полосы около 550 (548.5 -549.5) нм, а также цитохрома Ci (а-полоса около 553 нм). Оба цитохрома имеют максимумы ß-полосы около 520 нм и у-полосы около 415 нм.

2) цитохрома типа b с максимумом а-полосы около 555 нм. Хотя в литературе описан цитохром es с близким максимумом, однако до сих пор он был обнаружен лишь в клетках Azotobacter [Moore, 1987]. К тому же, связанная с данным цитохромом ß-полоса имеет максимум при 530 нм (а у-полоса при 430 нм), что характерно именно для цитохромов Ь. Поэтому данный компонент можно рассматривать как классический цитохром Ь, входящий в ¿>с7-комплекс. «Плечо» около 560 нм, скорее всего, соответствует другому типу цитохрома Ь.

Выращивание в условиях гипоксии приводит к заметному сдвигу в соотношении цитохромов бис (рис. 96), прежде всего за счет резкого увеличения относительного количества цитохрома Ьщ.

Цитохромоксидазная часть дыхательной цепи лучше всего может быть охарактеризована дифференциальными спектрами в области 590-640 нм (рис. 10).

0.142 0.140 ■ ОЛлК 0.136 -0.134 -0.132 -0.1.in -0.12Х 0.126 -0.125 -(1.124 0.123 -0.122 0.121 -I). 12(1 ■ 0.119 O.IIS 0.117 <1.116

Рис.10.

Дифференциальные спектры цитохромов (область 590-640 нм) клеток И. Иагиепи, выращенных в присутствии 6% ЫаС1 в аэробных (а) и микроаэробных (б) условиях.

590

600

610 (СО

630

<>40 нм

В дифференциальных спектрах культур, выращенных как в аэробных, так и в микроаэробных условиях, обнаруживаются три а-максимума, расположенных около 600, 620 и 630 нм. Максимум при 600 нм, по-видимому, соответствует митохондриальной цитохром-с-оксидазе aas, хотя у дрожжей С. parapsilosis

описана также цитохромоксидаза, аналогичная по спектру бактериальному цитохрому ah имеющая а-максимум при 590 нм [Guerin et al., 1986].

Сложнее идентифицировать максимумы при 620 и 630 нм. При регистрации дифференциальных спектров цитохромов дрожжей авторы крайне редко используют область, выходящую за пределы 610 нм, поскольку максимум а-полосы классической цитохромоксидазы расположен около 605 нм. По литературным данным, спектральными характеристиками, близкими к найденным нами у D. hansenii, обладают цитохром-М-убихинолоксидаза Е. coli (а-максимум около 630 нм) [Junemann et al., 1995], а также цитохром cdi (а-максимум около 620 нм), обнаруженный у ряда денитрификаторов, в том числе у Paracoccus denitrificans, близкого по составу дыхательной цепи к митохондриям [De Gier et al., 1994].

Хотя точную природу обнаруженных у D. hansenii цитохромных компонентов можно будет установить только после изолирования и изучения их гемов, предварительное рассмотрение спектров показывает, что в условиях гипоксии заметно изменяется соотношение компонентов с максимумами при 620 и 630 нм, причем в пользу увеличения количества последнего (рис 106).

Общее заключение, по данному разделу работы, которое следует из анализа полученных нами и литературных данных, можно сформулировать следующим образом.

В настоящее время накапливается все больше свидетельств в пользу того, что регуляция процесса переноса электронов под влиянием изменений внешней среды, выходящих за пределы так называемых «оптимальных» условий (или, иначе говоря, при действии стрессовых факторов), осуществляется не путем полного «переключения» с одной электронтранспортной цепи на другую (как упрощенно принимали ранее), а путем изменения соотношения одновременно функционирующих дыхательных механизмов.

Множественность путей транспорта электронов в дыхательных системах дрожжей убедительно продемонстрирована на примере С. parapsilosis [Milani et al., 2001]. У этих дрожжей в процессе дыхания одновременно функционируют четыре цепи переноса электронов, в которых участвует три типа конечных оксидаз: альтернативная цианидустойчивая оксидаза, классическая цитохром-с-оксидаза, а также дополнительная цитохром-с-оксидаза, ингибируемая только высокими концентрациями цианида (10 мМ).

Учитывая все эти данные, можно предложить для D. hansenii следующую схему процесса переноса электронов и влияния на него изучаемых стрессовых факторов и ингибиторов (рис. 11). Мы считаем необходимым предложить такую схему, поскольку она дает полезный материал для планирования дальнейших исследований, хотя и остается во многом спекулятивной.

СГК

> Цианидрезистентная оксидаза

> 02

Доноры Пул электронов^ убихино

MOHO-

> Цитохромы ¿560, с—► Цитохромоксидаза 620-► Ог

> Убихинол-цитохромоксидаза бзо-► 02

Рис. 11. Схема цепей переноса электронов у О. Натепп. 1 - классическая дыхательная цепь (КДЦ); 2 - альтернативная цианидрезистентная дыхательная цепь (АДК); 3 -дополнительные дыхательные цепи (ДДК). Пунктиром показаны места действия ингибиторов.

У этого организма, по-видимому, функционируют три (или, скорее, четыре) цепи переноса электронов, как оказалось при изучении действия ингибиторов дыхания (таблица). Все они получают электроны от общего пула восстановленного(ых) убихинона(ов).

КДЦ включает классические митохондриальные цитохромы с^о, с1ц2 и, вероятно, Ьц5. Завершается эта цепь цитохром-с-оксидазой типа ааЗюо, чувствительной к низким концентрациям азида.

АДЦ также относится к классическому типу и не включает цитохромов. Компонентом, чувствительным к СГК, обычно является убихинолоксидаза.

Остальной поток электронов нечувствителен к действию СГК и азида и может опосредоваться одной (или двумя) ДДЦ.

Состав ДДЦ остается наименее определенным, но, скорее всего, один путь включает вместо цитохрома Ьщ цитохром Ъш, а в качестве конечной оксидазы выступает компонент, близкий к цитохрому с(И62о-

Другой путь определяется наличием компонента с максимумом поглощения при 630 нм, что может предполагать участие в переносе электронов цитохрома типа Ьс1630 (получающего электроны непосредственно ог пула восстановленных убихинонов), также практически нечувствительного к СГК и азиду.

В аэробных условиях при оптимальном уровне соли (6%) удельный вклад этих систем примерно одинаков (таблица), что позволяет использовать широкий круг доноров электронов. Гипоосмотический шок мало влияет на дыхание и соотношение компонентов дыхательных цепей. Возможно, это связано с тем, что «фоновое» содержание соли в питательной среде (около 0,3%) достаточно для обеспечения основных физиологических потребностей. Гиперосмотический шок

в аэробных условиях также достоверно не изменяет удельный вклад этих систем в дыхание (таблица).

В микроаэробных условиях (в состоянии гипоксии), с одной стороны, должны активироваться системы дыхания с повышенным сродством к кислороду. При этом возрастает роль КДЦ, что выражается не только в увеличении степени ингибирования азидом, но и в резком повышении удельного содержания цитохрома Ьщ (таблица, рис. 96). С другой стороны, можно ожидать индукции (или активации) ДДЦ, особенно той из них, которая непосредственно использует пул восстановленного убихинона, в связи с тем, что в условиях гипоксии степень восстановленное™ этого компонента увеличивается. Поскольку эти системы оказываются малочувствительными к КаС1, организму удается преодолевать последствия гиперосмотического шока, что выражается в повышении степени галофильности микроорганизмов, обнаруженном нами ранее.

Защитное действие протонов от гипоосмотического шока у Н. тИпатит.

Ранее было описано явление, характерное для галофильных бактерий и получившее условное название "галодеадаптация" (под которым подразумевается комплекс процессов, позволяющих бактериям приспособиться к условиям с низкой соленостью) по аналогии с классическим понятием "галоадаптации" (т. е. приспособления к условиям с высокой соленостью) [Матвеева с соавт., 1990]. Оказалось, что стабилизация клеток галобакгерий может быть достигнута при замене катионов натрия на протоны, после чего клетки галобактерий выдерживают даже промывание дистиллированной водой [Плакунов, Кокоева, 1994]. Поскольку влияние рН на степень осмочувствительности галобактерий ранее изучали только в острых опытах, представляло интерес выяснение возможности существования такого же эффекта в растущих культурах этих организмов.

При всех значениях рН максимум скорости роста Н. ¡аИпагит наблюдался при 20% ЫаС1. Однако при снижении концентрации соли, культуры, выращиваемые при разных рН, вели себя по-разному. При рН 7.0 и особенно при рН 8.0 наблюдалось резкое падение скорости роста (в последнем случае в 56 раз при 15% ЫаС1), тогда как при рН 6.0 скорость роста при 15%№С1 почти не отличалась от оптимальной, наблюдаемой при 20% №С1.

Еще более наглядно этот эффект проявляется при сравнении относительных скоростей роста при каждой концентрации №С1, выраженных в процентах от скорости роста той же культуры при оптимальном рН 7.0 (рис. 12).

ОП540. % к контролю

200

250 г

150

100

Рис. 12. Зависимость относительной скорости роста НлаИпагит от рН среды при разных концентрациях ЯаС1 1 -15,2%; 2 -18,5%; 3 - 20%. Контроль -культура при той же солености, но при рН 7.0.

рН

В этом случае вблизи рН 6.0 проявляется четкий максимум относительной скорости роста культуры при содержании в среде 15% №С1, тогда как при других концентрациях соли максимум относительной скорости роста остается вблизи рН 7.0. Таким образом, подкисление среды, т.е. увеличение в ней концентрации протонов, действительно оказывает стабилизирующее действие на рост культуры Н. хаИпагит при сниженном содержании солей.

Полученные результаты заставляют по-новому оценить возможность существования экстремально галофильных архей в пластовых флюидах нефтяных месторождений Волжско-Камского региона, локализованных в отложениях верхнего девона, откуда эти организмы были выделены [Звягинцева с соавт., 1998]. Как показано в нашей работе, близкие к анаэробным условия, характерные для нефтяных месторождений, способствуют возрастанию способности галобактерий переносить повышенную соленость (до насыщения в расчете на №С1). С другой стороны, слабокислая среда, обусловленная накоплением жирных кислот при окислении компонентов нефти, должна способствовать выживанию галобактерий при гипоосмотическом шоке. Таким образом, сочетание этих экстремальных условий (дефицит кислорода и кислая среда), как это ни парадоксально, должно способствовать выживанию галобактерий в очень широком диапазоне солености, что может обеспечить их участие в метаболических превращениях продуктов деградации нефти.

Выводы:

1. Установлено, что при повышенной солености, выходящей за пределы физиологической нормы для изучаемых микроорганизмов (т.е. при гиперосмотическом шоке), снижение парциального давления кислорода (гипоксия) оказывает защитное действие, приводящее к возрастанию степени галофильности (галотолерантности) данных микроорганизмов (Rhodococcus erythropolis, Shewanella sp., Candida lipoiytica, Rhodotorula aurantiaca, Candida rhagii, Debaryomyces hansenii). Антагонизм указанных стрессовых факторов (повышенной концентрации солей и гипоксии), характерных для ряда экотопов (в том числе, для некоторых нефтяных месторождений), объясняет возможность существования и функционирования в этих условиях слабо галофильных (галотолерантных) микроорганизмов.

2. Изучены биохимические механизмы антагонизма гипоксии и гиперосмотического шока, и показано, что в их основе лежит принцип множественного взаимодействия регуляторных механизмов, когда один из стрессовых факторов вызывает изменение метаболизма, компенсирующее отрицательное воздействие другого стрессового фактора. Примерами могут служить обнаруженные нами повышение внутриклеточного пула осмопротекторных веществ в результате подавления дыхания при гипоксии, индукция или активация в условиях гипоксии ферментов (каталазы), а также альтернативных дыхательных цепей, менее чувствительных к ингибиторному действию солей.

3. Изучена природа изменений цитохромного состава дыхательной системы D. hansenii под влиянием данных стрессовых факторов и предложена схема, предполагающая одновременное функционирование трех (или четырех) цепей переноса электронов: классической дыхательной цепи с участием цитохром-с-оксидазы, альтернативной дыхательной цепи, включающей цианид- и азидустойчивую оксидазу, а также дополнительных дыхательных цепей, включающих оксидазы, устойчивые к соли, азиду и СГК. Таким образом, природа антагонистических взаимоотношений гипоксии и гиперосмотического шока в данном случае заключается в перераспределении потока электронов между чувствительными и нечувствительными к соли дыхательными системами, активируемыми (индуцируемыми) в микроаэробных условиях.

4. Обнаружен еще один случай антагонизма стрессовых факторов: повышенной концентрации протонов и гипоосмотического шока в растущих культурах галобактерий, в результате чего понижение рН предотвращает лизис этих микроорганизмов при снижении концентрации солей в среде.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

Экспериментальные статьи и обзоры

1. Арзуманян В. Г., Воронина Н. А., Гейдебрехт О. В., Маслова О. В., Плакунов В. К., Беляев С. С. Антагонистическое взаимодействие стрессорных факторов при росте микроорганизмов в условиях, имитирующих параметры их природных экотопов // Микробиология. 2002. Т. 71. № 2. С. 160-165.

2. Шелемех О.В., Плакунов В.К., Беляев С.С. Защитная роль протонов при гипоосмотическом стрессе у экстремально галофильной археи, Halobacterium salinarum II Микробиология. 2002. Т. 71. № 6. С. 858-859.

3. Heidebrecht O.V., Shelemekh O.V., Plakunov V.K., Aizumanyan V.G., Belyaev S.S. Viability and metabolic activity of microorganisms under conditions emulating natural habitats // Biotechnology and the environment including biotechnology. 2004. Nova Science Publishers, Inc. New York. P. 161-170.

4. Плакунов B.K., Гейдебрехт O.B., Шелемех O.B. Множественный стресс у микроорганизмов: зло или благо? (обзор). Труды ИНМИ РАН. Вып. XII. 2004. М: Наука. С. 361-375.

5. Шелемех О.В., Гейдебрехт О.В., Плакунов В.К., Беляев С.С. «Кислородная регуляция» состава дыхательной цепи дрожжей Debaryomyces hansenii при множественном стрессе // Микробиология. 2006. Т. 75. № 4. С. 562-569

Тезисы докладов

6. Гейдебрехт О.В., Шелемех О.В., Арзуманян В.Г. Роль внешней липидной оболочки в галопротекции облигатно липофильных дрожжей рода Malassezia // XV Международная зимняя молодёжная научная школа. Москва, Россия. 10-14 февраля 2003.

7. Arzumanian V. G., Heidebrecht О. V., Shelemekh О. V. Outer lipid layer of lipophilic yeast Malassezia and its role in halotolerance // 23rd International Specialised Symposium on Yeasts "Interactions between Yeasts and other Organisms" Budapest, Hungary. 26-29 August 2003.

8. Гейдебрехт O.B., Шелемех O.B., Арзуманян В.Г. Взаимосвязь галотолерантности дрожжей рода Malassezia с наличием внешней липидной оболочки // 1-й Всероссийский конгресс по медицинской микологии. Москва, Россия. 20-21 февраля 2003. Том 1. С. 19

9. Плакунов В.К., Шелемех О.В., Беляев С.С. Антагонизм стрессорных факторов при их одновременном действии на нефтеокисляющие микроорганизмы // 2-й Московский, международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Тезисы докладов. Москва. 2003. Ч. 2. С. 260-261.

10. Belyaev S., Heidebrecht О., Shelemekh О., Plakunov V. Influence of extreme environment on oil-oxidizing microorganisms // Int. Symposium for subsurface Microbiology. ISEB XVIII. 2005. P. 63.

11.Шелемех O.B., Гейдебрехт O.B., Плакунов B.K. Варьирование состава дыхательной цепи нефтеокисляющих микроорганизмов в условиях, моделирующих условия их природных экотопов. 1-я Межд. молодежная школа-конференция. Москва. 2005. Тезисы докладов. С. 113-114.

Подписано в печать 14.10.2008 г. Печать трафаретная

Заказ №943 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шелемех, Оксана Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ответные реакции микроорганизмов на одновременное воздействие нескольких стрессорных факторов: гипо- и гиперосмотических условий, гипоксии, неблагоприятных значений pH"

1.2. Сочетание температурного и осмотического воздействия.12

1.3. Сочетание воздействия неблагоприятных значений рН и концентраций солей.19

1.4. Сочетание воздействия высоких концентраций солей и окислительных условий.20

1.5. Сочетание воздействия повышенной температуры и окислительных условий.21

1.6. Сочетание воздействия повышенной температуры и неблагоприятных значений рН.22

1.7. Сочетание воздействия голодания и других неблагоприятных факторов.23

1.8. Сочетание воздействия высоких концентраций солей и гипоксии.23

1.9. Общий ответ на стресс.25

Глава 2. Кислородная регуляция метаболизма.29

2.1. Общая характеристика феномена "кислородной регуляции" метаболизма.29

2.2. Кислородная регуляция у дрожжей.31

2.3. Кислородная регуляция у прокариот.50

Заключение к литературному обзору.56

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.58

Глава 3. Объекты и методы исследования.58

3.1. Объекты исследования.58

3.2. Методы культивирования и анализа.59

3.3. Статистическая обработка результатов.62

Глава 4. Зависимость роста изучаемых микроорганизмов от концентрации NaCl в среде в условиях нормоксии и гипоксии.64

Глава 5. Активность защитных ферментов у изучаемых микроорганизмов, выращенных в аэробных и микроаэробных условиях при разных концентрациях NaCl.72

Глава 6. Содержание свободных аминокислот в клетках Candida lipolytica, выращенных в условиях нормоксии и гипоксии при разных концентрациях NaCl.77

Глава 7. Кислородная регуляция состава дыхательной цепи Debaryomyces hansenii при одновременном воздействии двух стрессовых факторов: гипоксии и осмотического шока.79

Глава 8. Защитное действие протонов от гипоосмотического шока у H.salinarum.94

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.98

ВЫВОДЫ.101

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.103

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. При рассмотрении так называемых "экстремальных" условий среды в качестве стрессовых для обитающих в них микроорганизмов следует учитывать некоторую условность такого подхода. Аборигенная микрофлора адаптирована к этим условиям, и они являются для нее физиологически нормальными. Стрессовыми же являются не сами условия, а их непостоянство, характерное для природных экотопов. Это непостоянство может быть закономерно повторяющимся (смена времен года) или спонтанным, без четких закономерностей (выпадение осадков в аридных зонах). Очевидно, что труднее всего происходит адаптация к внезапным изменениям условий, и механизмы этой адаптации представляют наибольший интерес, так как требуют включения быстродействующих регуляторных механизмов.

В природных условиях среды микроорганизмы, как правило, подвергаются влиянию нескольких стрессовых факторов, действующих одновременно или последовательно. Например, термофильные микроорганизмы подвергаются не только тепловому воздействию, но часто также высокой концентрации солей или кислой реакции среды.

Между тем, в исследованиях последствий экстремальных воздействий, стрессовые факторы в основном используют по отдельности, создавая условия "моностресса". Однако последствия воздействия на метаболизм отдельных стрессовых факторов могут существенно отличаться от последствий их сочетанного воздействия. Иногда при одновременном воздействии двух или более стрессовых факторов повреждения оказываются менее выраженными, чем при их воздействии по отдельности. Это явление называется перекрёстной адаптацией, кроссадаптацией или антагонизмом стрессовых факторов, и изучено недостаточно. Изучение же механизмов адаптации к совместному действию стрессоров находится на начальной стадии.

Весьма распространенным сочетанием стрессовых факторов в естественных условиях обитания микроорганизмов является высокое осмотическое давление (в частности, избыток NaCl) и недостаток кислорода. Исследования в этом направлении были начаты в лаборатории нефтяной микробиологии ИНМИ РАН [Арзуманян с соавт., 2000]. Настоящая диссертация является продолжением и развитием этого направления.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования явилось изучение последствий и механизмов адаптации к одновременному воздействию гипо- или гиперосмотического шока и гипоксии (или неблагоприятных значений рН) у микроорганизмов, изолированных из экотопов, где, как правило, эти стрессовые агенты являются факторами внешней среды. Задачи исследования:

2. Изучение влияния NaCl на дыхание микроорганизмов, выращенных в условиях нормоксии и гипоксии.

5. Изучение возможности противодействия гипоосмотическому шоку у экстремально галофильных бактерий.

Научная новизна. Впервые детально изучены рост и дыхательная активность ряда эукариотных (Candida lipolytica, Rhodotorula aurantiaca, Candida rhagii, Debaryomyces hansenii) и прокариотных (Rhodococcus erythropolis, Shewanella sp., Halobacterium salinarum) микроорганизмов в условиях одновременного воздействия двух стрессовых факторов: гипо-или гиперосмотического шока и гипоксии (или неблагоприятного рН).

Научно-практическая значимость. Полученные результаты уточняют, а в ряде случаев раскрывают механизмы защитных реакций микроорганизмов в условиях одновременного воздействия стрессовых факторов, характерных для их природных экотопов. Результаты работы позволяют дать рекомендации по более эффективному применению микроорганизмов в системах биологической очистки и повышения нефтеизвлечения в экстремальных условиях.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000); 21st International Specialized Symposium on Yeasts "Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Ecology of Non-conventional Yeasts (NCY)"

Lviv, Ukraine, 2001); 1-м Съезде микологов России (Москва, 2002); XV Международной зимней молодёжной научной школе (Москва, 2003); 1м Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003); 1

23 International Specialized Symposium on Yeasts "Interactions between Yeasts and other Organisms" (Budapest, Hungary, 2003); 1-м Международном конгрессе по биотехнологии (Москва, 2003); Int. Symposium for subsurface Microbiology ISEB XVIII, 2005; Всероссийской молодежной школе-конференции "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 5 экспериментальных статей и обзоров, а также 6 тезисов.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит разделы: "Введение", "Обзор литературы", "Экспериментальная часть", "Заключение", "Выводы" и "Список литературы" (включающий 150 источников). Текст проиллюстрирован 16 рисунками и таблицей.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шелемех, Оксана Владимировна

выводы

1. Установлено, что при повышенной солености, выходящей за пределы физиологической нормы для изучаемых микроорганизмов (т.е. при гиперосмотическом шоке), снижение парциального давления кислорода (гипоксия) оказывает защитное действие, приводящее к возрастанию степени галофильности (галотолерантности) данных микроорганизмов (Rhodococcus erythropolis, Shewanella sp., Candida lipolytica, Rhodotorula aurantiaca, Candida rhagii, Debaryomyces hansenii). Антагонизм указанных стрессовых факторов (повышенной концентрации солей и гипоксии), характерных для ряда экотопов (в том числе, для некоторых нефтяных месторождений), объясняет возможность существования и функционирования в этих условиях слабо галофильных (галотолерантных) микроорганизмов.

3. Изучена природа изменений цитохромного состава дыхательной системы D, hansenii под влиянием данных стрессовых факторов и предложена схема, предполагающая одновременное функционирование трех (или четырех) цепей переноса электронов: классической дыхательной цепи с участием цитохром-с-оксидазы, альтернативной дыхательной цепи, включающей цианид- и азидустойчивую оксидазу, а также дополнительных дыхательных цепей, включающих оксидазы, устойчивые к соли, азиду и СГК. Таким образом, природа антагонистических взаимоотношений гипоксии и гиперосмотического шока в данном случае заключается в перераспределении потока электронов между чувствительными и нечувствительными к соли дыхательными системами, активируемыми (индуцируемыми) в микроаэробных условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из актуальных проблем микробиологии, важной для понимания экофизиологических особенностей микроорганизмов, является часто наблюдаемое (для микроорганизмов, выделенных из природных субстратов) несовпадение "оптимальных" условий культивирования в лаборатории с условиями природных экотопов.

Ниже перечислены основные возможности, позволяющие реально представить поведение микроорганизмов в "неоптимальных" условиях.

Во-первых, микроорганизмы могут лишь "выживать" в условиях экотопа, образуя те или иные виды "покоящихся" клеток, обладающих низкой метаболической активностью.

Во-вторых, микроорганизмы способны изолироваться в "микронишах". Например, в нефтяных месторождениях такую нишу может представлять нефтяная фаза, где условия ближе к "оптимальным" лабораторным, чем к типичным условиям экотопа из-за высокой растворимости кислорода и низкой растворимости солей в нефти.

В-третьих, представления о неблагоприятном характере условий экотопа могут быть преувеличенными, и микроорганизмы в этих экотопах способны не только выживать, но и проявлять значительную метаболическую активность. Причиной, смягчающей стрессовое воздействие одного фактора, может служить наличие других стрессовых факторов, т.е. несколько стрессовых факторов при их сочетании могут действовать не аддитивно или синергидно, а антагонистично.

В последнее время получен ряд экспериментальных данных, подтверждающих возможность антагонизма стрессовых факторов, примером которого являются и результаты настоящей работы.

При рассмотрении комбинированного действия двух и более стрессоров следует учитывать, что они могут действовать одновременно или последовательно. Так как в природных условиях последовательное действие стрессоров, как правило, разделено большим промежутком

98 времени (суточные, погодные или сезонные изменения), то оценить их взаимодействия сложно. Модельные опыты в лаборатории, в которых воздействие стрессоров следует непосредственно одно за другим, очевидно, далеки от условий природного экотопа. Поэтому основное внимание мы уделили одновременно действующим стрессорам.

В литературе не удалось обнаружить работ, посвященных одновременному действию повышенной концентрации солей и гипоксии. Между тем, такое сочетание является достаточно обычным для ряда природных экотопов, в частности, нефтяных месторождений.

В случае нефтяных месторождений, изучение механизмов адаптации микроорганизмов важно не только для понимания сути микробиологических процессов, а также разработки рекомендаций по увеличению нефтеотдачи. При этом необходимо обеспечить метаболическую активность эндогенных или введенных извне микроорганизмов. Основным пищевым субстратом в этих условиях являются углеводороды нефти или продукты их превращений. Подавляющее большинство нефтеоокисляющих микроорганизмов представлено аэробными формами, однако содержание кислорода в данных экотопах лимитировано, кроме того, его растворимость в водной фазе часто снижена из-за высокой минерализации пластовых вод.

Возникает вопрос, в каком состоянии находятся аэробные, слабо или умеренно галофильные (галотолерантные) микроорганизмы в условиях резкого ограничения доступности кислорода, сопровождающегося высокими концентрациями солей, часто превышающими пределы, допустимые для их роста?

Были проведены исследования с прокариотными (Rhodococcus, Shewanella, Halobacterium) и эукариотными (Candida, Rhodotorula, Debaryomyces) микроорганизмами, выделенными из различных экотопов, для которых характерно сочетание таких стрессовых факторов как высокие концентрации соли и гипоксия (в том числе, пластовых вод нефтяных месторождений).

Исследования показали, что в условиях одновременного действия указанных стрессовых факторов (высоких концентраций солей и дефицита кислорода) между ними наблюдается антагонизм, что выражается в повышении степени галофильности (галотолерантности) микроорганизмов в микроаэробных условиях, причем слабо галофильные организмы переходят в разряд умеренно галофильных, а некоторые галотолеранты приобретают свойства галофилов.

Детальные исследования биохимических механизмов этого явления показали, что повышенные концентрации NaCl подавляют дыхание и синтез ферментов, защищающих клетки от окислительного шока (каталазы и супероксиддисмутазы). Таким образом, соль вызывает не только осмотический, но и окислительный шок. Перевод клеток в микроаэробные условия снижает его последствия и позволяет микроорганизмам функционировать при более высокой концентрации соли, чем в аэробных условиях.

Одновременно при переходе к условиям гипоксии в клетках происходит существенная перестройка метаболизма. Изменяется природа дыхательной цепи, особенно на конечном, цитохромоксидазном участке, индуцируется (или активируется) каталаза, менее чувствительная к ингибиторному действию соли, и, наконец, повышается внутриклеточное содержание веществ, выполняющих роль осмопротекторов (аминокислот).

Все это обеспечивает адаптацию клеток к действующим стрессовым факторам и может объяснить высокую частоту изолирования слабо галофильных облигатно аэробных микроорганизмов из экотопов с низким парциальным давлением кислорода и повышенным содержанием солей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шелемех, Оксана Владимировна, Москва

1. Акименко В.К. Цианидрезистентное дыхание микроорганизмов // Успехи микробиологии. 1981. №16. С. 3-30.

2. Акименко В.К., Аринбасарова А.Ю., Смирнова М.Н, Меденцев А.Г. Альтернативная оксидаза в митохондриях дрожжей Yarrowia lipolytica не способна конкурировать за электроны с цитохромным путём // Микробиология. 2003. Т. 72. №4. С. 453-458.

3. Акименко В.К., Меденцев А.Г. О появлении цианидрезистентного дыхания у дрожжей Candida lipolytica П Микробиология. 1976. Т. 45. №1 С. 146-150.

4. Андреищева Е.Н., Соарес М.И.М., Звягильская М.А. Энергетический обмен дрожжей Candida (Yarrowia) lipolytica в норме и при солевом стрессе // Физиология растений. 1997. Том 44. №5. С. 658-664.

5. Арзуманян В.Г., Воронина Н.А., Плакунов В.К., Беляев С.С. Степень галофильности Rhodococcus erythropolis и Halobacterium salinarum определяется парциальным давлением кислорода // Микробиология. 2000. Т. 68. №2. С. 290-292.

6. Бабьева И.П., Голубев В.И. Методы выделения и идентификации дрожжей // М. Пищевая промышленность. 1979. С. 52.

7. Гейдебрехт О.В., Арзуманян В.Г., Плакунов В.К., Беляев С.С. Влияние степени аэрации среды на галотолерантность дрожжей родов Candida, Rhodotorula и Malassezia II Микробиология. 2003. Т. 72. №3. С. 312-319.

8. Головлев E.JI. Введение в биологию стационарной фазы бактерий: механизм общего ответа на стрессы // Микробиология. 1999. Т. 68. №5. С. 623-631.

9. Доронина Н.В., Сахаровский В.Г., Драчук С.В., Троценко Ю.А. Органические осмопротекторы аэробных умеренно галофильных метилобактерий //Микробиология. 1998. Т. 67. №4. С. 458-463.

10. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. Учебное пособие. М.: МГУ. 1976. С. 180- 182.

11. Звягинцева И.С, Кострикина Н.А., Беляев С.С. Обнаружение галофильных Archaea в верхнедевонских нефтяных месторождениях Татарстана // Микробиология. 1998. Т. 67. №6. С. 827-831.

12. Звягинцева И.С., Тарасов AJI. Экстремально галофильные бактерии из засоленных почв // Микробиология. 1987. Т. 56. №5. С. 839-844.

13. Кокоева М. В., Плакунов В. К. Возможность модификации осмочувствительности экстремально галофильных архебактерий // Микробиология. 1993. Т. 62. №5. С. 825-824.

14. Комарова Т.И., Поршнева О.В., Коронелли Т.В. Образование трегалозы клетками R- и S-вариантов Rhodococcus erythropolis II Микробиология. 1998. Т. 67. №3. С. 428-431.

15. Куличевская И.С, Звягинцева И.С., Тарасов AJL, Плакунов В.К. Экстремально галофильные архебактерии из некоторых засоленных экотопов // Микробиология. 1992. Т. 61. №1. С. 7075.

16. Кунтиков Е. И., Горяенко В. М. Взаимозависимость гало- и термотолерантности у аноксигенных фототрофных бактерий // Микробиология. 1998. Т. 67. №3. С. 298-304.

17. Матвеева Н.И, Воронина Н.А., Борзенков И.А., Плакунов В.К., Беляев С.С. Состав и количественное содержание осмопротекторов в клетках нефтеокисляющих бактерий при разных условиях культивирования // Микробиология. 1997. Т. 66. №1. С. 32-37.

18. Матвеева Н.И., Николаев Ю.А., Плакунов В.К. Зависимость транспорта аминокислот в клетки галофильных и-галотолерантных бактерий от содержания NaCl и осмолярности среды//Микробиология. 1990. Т. 59. №1. с. 5-11.

19. Матыс В.Ю., Барышникова Л.М., Головлев Е.Л. Адаптация к стрессовым условиям у представителей родов Rhodococcus и Gordona П Микробиология. 1998. Т. 67. №6. С. 743-747.

20. Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. Регуляция и физиологическая роль цианидрезистентной оксидазы у грибов и растений //Биохимия. 1999. Т. 64. № 11. С. 1457-1472.

21. Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. Адаптация фитопатогенного гриба Fusarium decemcellulare к окислительному стрессу //Микробиология. 2001. Т. 70. №1. С. 34-38.

22. Милехина Е.И., Борзенков И.А., Звягинцева И.С., Кострикина Н.А., Беляев С.С. Эколого-физиологические особенности аэробных эубактерий из нефтяных месторождений Татарстана // Микробиология. 1998. Т. 67. №2. С. 208-214.

23. Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В. Редокс-регуляция клеточных функций // Биохимия. 2007. Т. 72. Вып. 2. С. 158-174.

24. Паников Н.С., Шеховцева Н.В., Дорофеев А.Г., Звягинцев Д.Г. Количественные исследования динамики отмирания голодающих микроорганизмов //Микробиология. 1988. Т. 57. №.6. С. 983-991.

25. Плакунов В. К., Арзуманян В. Г., Воронина Н. А., Беляев С. С. Взаимосвязь кинетики роста и дыхания у родококков в присутствии высоких концентраций солей // Микробиология. 1999. Т. 68. №1. С. 40-44.

26. Плакунов В.К., Кокоева М.В. Осмостабилизация клеток галобактерий и получение их сухой биомассы, не содержащей солей //Микробиология. 1994. Т.63. Вып. 4. С.597-603.

27. Плакунов В. К., Волкова И. М. Быстрый метод количественного определения кислых аминокислот // Микробиология. 1991. Т. 60. №3. С. 565-567.

28. Платонов А.Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. М.: Изд-во РАМН. 2001.52 С.

29. Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Киселева В.А., Войников В.К. Изменение дыхания при действии теплового шока на дрожжи Saccharomyces cerevisiae II Микробиология. 2001. Т. 70. №4. С. 531-535.

30. Селъе Г. На уровне целого организма. М.: Мир. 1972.

31. Смирнова Г. В., Закирова О. Н., Октябрьский О. Н. Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Escherichia coli на тепловой шок//Микробиология. 2001. Т. 70. №5. С. 595-601.

32. Терешина В.М., Меморская А.С., Морозова Е.В., Козлов В.П., Феофилова Е.П. Изменения в составе углеводов цитозоля спор грибов в связи с температурой обитания и в процессе хранения // Микробиология. 2000. Т. 69. Вып. 4. С. 511-517.

33. Феофилова Е.П. Трегалоза, стресс и анабиоз // Микробиология. 1992. Т.61. Вып. 5. С. 741-755.

34. Феофилова Е.П., Кузнецова JI.C. Влияние антиоксидантов на рост и состав липидов Cunninghamella japonica в норме и поддействием стрессора // Микробиология. 1996. Т.65. №.4. С. 467473.

35. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Хохлова Н.С., Меморская А.С. О различных механизмах биохимической адаптации мицелиальных грибов к температурному стрессу: изменения в составе углеводов цитозоля//Микробиология. 2000. Т. 69. Вып. 5. С. 606-611.

36. Хазиев Ф. X. Ферментативная активность почв. М. Наука. 1976. С. 180.

37. Шольц К. Ф., Островский Д. Н. Полярографическая ячейка для количественного определения растворённого кислорода. // Лаб. дело. 1965. №6. С. 375-378.

38. Abramova N.E., Sertil O., Mehta S., Lowry C.V. Reciprocal regulation of anaerobic and aerobic cell wall mannoprotein gene expression in Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 2881-2887.

39. Apte S.K., Fernandes Т., Badran H., Ballal A. Expression and possible role of stress-responsive proteins in Anabaena II J. Biosciences (Bangalore). 1998. V. 23 №4. P. 399-406.

40. Azachi M., Sadlca A., Fisher M., Goldshlag P., Gokhman I., Zamir A. Salt induction of fatty acid elongase and membrane lipid modifications in the extreme halotolerant alga Dunaliella salina И Plant Physiol. 2002. Vol. 129. P. 1320-1329.

41. Barnett J.A., Payne R.W., Yarrow D. Yeast identification PC Program version 4. 1996.

42. Benov L., Fridovich I. Superoxide dismutase protects against aerobic heat shock in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1995. V. 177. № 11. P. 3344-3346.

43. Boekhout Т., Renting M., Scheffers W.A., Bosboom R. The use of karyotyping in the systematics of yeasts // Antonie van Leeuwenhoek. 1993. V. 63. P. 157-163.

44. Bose S., Dutko J.A., Zitomer R.S. Genetic factors that regulate the attenuation of the general stress response of yeast // Genetics. 2005. V. 169. P. 1215-1226.

45. Bourdineaud J.P., De Sampaio G., Lauquin G.J. A Roxl-independent hypoxic pathway in yeast. Antagonistic action of the repressor Ordl and activator Yapl for hypoxic expression of the srpl/tirl gene // Mol. Microbiol. 2000. V. 38. P. 879-890.

46. Browne N., Dowds B.C.A. Heat and salt stress in the food pathogen Bacillus cereus II J. Appl. Microbiol. 2001. V. 91 № 6. P. 1085-1094.

47. Bunn H.F., Poyton R.O. Oxygen sensing and molecular adaptation to hypoxia//Physiol. Rev. 1996. V. 76. P. 839-885.

48. Burke P.V., Raitt D.C., Allen L.A., Kellogg E.A., Poyton R.O. Effects of oxygen concentration on the expression of cytochrome с and cytochrome с oxidase genes in yeast // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 14705-14712.

49. Causton H.C., Ren В., Koh S.S., Harbison C.T., Kanin E., Jennings E.G., Lee T.I., True H.L., Lander E.S., Young R.A. Remodeling of yeast genome expression in response to environmental changes // Mol. Biol. Cell. 2001. V. 12. P. 323-337.

50. Cho B.K., Knight E.M., Palsson B.O. Transcriptional regulation of the fad regulon genes of Escherichia coli by ArcA // Microbiology. 2006. V. 152. P. 2207-2219.

51. Davidson J.F., Schiestl R.H. Cytotoxic and genotoxic consequences of heat stress are dependent on the presence of oxygen in Saccharomyces cerevisiae //J. Bacteriol. 2001. V. 183. №15. P. 4580-4587.

52. Davidson J.F., Whyte В., Bissinger P.H., Schiestl R.H. Oxidative stress is involved in heat-induced cell death in Saccharomyces cerevisiae II Proc.Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93 № 10 P. 5116-5121.

53. Davies B.S.J., Rine J. A role for sterol levels in oxygen sensing in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 2006. V. 174 № 1. P. 191-201.

54. De Gier J.W.L., Lubben M., Reijnders W.N.M., Tipker C.F., Slotboom D.J., Van Spanning R.J.M., Stouthamer A.H., Van der Oost J. The terminal oxidases of Paracoccus denitrificans II Mol. Microbiol. 1994. V. 13. P. 183-196.

55. Flahaut S., Frere J., Boutibonnes P., Auffray Y. Relationship between the thermotolerance and the increase of DnaK and GroEL synthesis in Enterococcus faecalis ATCC 19433 // J. Basic Microbiol. 1997. Vol. 37. P. 251-258.

56. Friedman S.M., Malik M., Dilica K. DNA super coiling in a thermotolerant Escherichia coli II Mol. Gen. Genet. 1995. V. 248. P. 417-422.

57. Garren D. M. Acid tolerance responses and acid shock responses of Escherichia coli 0157:h7 and non-0157:h7 strains (lactic acid) Ph. D. Thesis. University of Georgia. 1996. 106 P.

58. Gasch A.P., Spellman P.T., Kao C.M., Carmel-Harel O., Eisen M.B., Storz G., Botstein D., Brown P.O. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes // Mol. Biol. Cell. 2000. V. 11. P. 4241-4257.

59. Gilles-Gonzalez M.A., Gonzalez G. Regulation of the kinase activity of heme protein FixL from the two-component system FixL/FixJ of Rhizobium meliloti II J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 16293-16297.

60. Gilles-Gonzalez M.A., Gonzalez G. Signal transduction by heme-containing PAS-domain proteins // J. Appl. Physiol. 2004. V. 96. P. 774-783.

61. Gilles-Gonzalez M.A., Gonzalez G. Perutz M.F., Kiger L., Marden M.C., Poyart C. Heme-based sensors, exemplified by the kinase FixL, are a new class of heme protein with distinctive ligand binding and autoxidation//Biochem. 1994. V. 33. P. 8067-8073.

62. Gong W., Нао В., Mansy S.S., Gonzalez G., Gilles-Gonzalez M.A., Chan M.K. Structure of a biological oxygen sensor: a new mechanism for heme-driven signal transduction // PNAS Biochem. 1998. V. 95. P. 15177-15182.

63. Gouesbet G., Jan G., Boyaval P. Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus thermotolerance // Lait. 2001 V. 81. №1-2. P.301-309.

64. Grishin A.V., Rothenberg M., Downs M.A., Blumer K.J. Mot3, a Zn-finger transcription factor that modulates gene expression and attenuates mating pheromone signaling in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 1998. V. 149. P. 879-892.

65. Guerin M.G., Camougrand N.M. Partitioning of electron flux between the respiratory chains of the yeast Candida parapsilosis: parallelworking of the two chains I I Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1184. P. 111-117.

66. Guerin M.G., Camougrand N.M. The alternative oxidase of Candida parapsilosis //Eur. J. Biochem. 1986. V. 159. P. 519-524.

67. Guillot J., Gueho E., Lesourd M., Midgley G., Chevrier G., Dupont B. Identification of Malassezia species: a practical approach // J. Mycol. Med. 1996. V.6.P.103-110.

68. Gustafsson C.M., Myers L.C., Li Y., Redd M.J., Lui M., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Kornberg R. D. Identification of Rox3 as a component of mediator and RNA polymerase II holoenzyme // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 48-50.

69. Helmerhorst E.J., Murphy M.P., Troxler R.F., Oppenheim F.G. Characterization of the mitochondrial respiratory pathways in Candida albicans II Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1556. P. 73-80.

70. Herbert K.C., Foster S J. Starvation survival in Listeria monocytogenes: Characterization of the response and the role of known and novel components //Microbiology. 2001 V. 147. №8. P. 2275-2284

71. Hickman M.J., Winston F. Heme levels switch the function of Hap 1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor // Mol. Cel. Biol. 2007. V. 27. №21. P. 74147424.

72. Hitoshi M. Characteristics of stress response in a mushroom-pathogenic bacterium, Pseudomonas tolaasii, during the interaction with Pleurotus ostreatus and carbon/nitrogen starvation in vitro // Mycoscience. 1999. V. 40. №1. P. 81-85.

73. Hon Т., Dodd A., Dirmeier R., Gorman N., Sinclair P.R., Zhang L., Poyton R.O. Multiple oxygen-responsive steps in the heme biosynthetic pathway affect Hapl activity // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. №50. P. 50771-50780.

74. Hon Т., Lee H.C., Hu Z., Iyer V.R., Zhang L. The heme activator protein Hapl represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae II Genetics. 2005. V. 169. P. 1343-1352.

75. Hounsa C.G., Brandt E. , Thevelein J., Hohmann S., Prior B.A. Role of trehalose in survival of Saccharomyces cerevisiae under osmotic stress //Microbiology. 1998. Vol. 144. P. 671-680.

76. Hughes A.L., Todd B.L., Espenshade P J. SREBP pathway responds to sterols and functions as an oxygen sensor in fission yeast // Cell. 2005. V. 120. P. 831-842.

77. Jarosz-Wilkolazka A., Fink-Boots M., Malarczyk E., Leonowicz A. Formaldehyde as a proof and response to various kind of stress in some Basidiomycetes // Acta Biologica Hungarica. 1998. V. 49 № 2-4. P. 393-403.

78. Jenkins D. E., Chaisson S. A., Matin A. Starvation-induced cross protection against osmotic challenge in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1990. Vol. 172. №. 5. P. 2779-2781.

79. Jiang Y., Vasconcelles M.J., Wretzel S., Light A., Martin C.E., Goldberg M.A. MGA2 is involved in the low-oxygen response element-dependent hypoxic induction of genes in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cel. Biol. 2001. V. 21. №18. P. 6161-6169.

80. Johnston J. R., Mortimer R. K. Electrophoretic karyotyping of laboratory and commercial strains of Saccharomyces and other yeasts // Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. V. 36. P. 569-572.

81. Junemann S., Wrigglesworth J.M. Cytochrome bd oxidase from Azotobacter vinelandii II J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 16213-16220.

82. Kastaniotis A.J., Mennella T.A., Konrad C., Torres A.M., Zitomer R.S. Roles of transcription factor Mot3 and chromatin in repression of the hypoxic gene ANB1 in yeast // Mol. Cell. Biol. 2000. V. 20. P. 70887098.

83. Keleher C.A., Redd M.J., Schultz J., Carlson M., Johnson A.D. Ssn6-Tupl is a general repressor of transcription in yeast // Cell. 1992. V. 68. P. 709-719.

84. Knijnenburg T.A., de Winde J.H., Daran J.-M., Daran-Lapujade P., Pronk J.T., Reinders M.J.T., Wessels L.F.A. Exploiting combinatorial cultivation conditions to infer transcriptional regulation // BMC Genomics. 2007. V. 8 P. 25.

85. Koga Т., Sakamoto F., Yamoto A., Takumi K. Acid adaptation induces cross-protection against some environmental stresses in Vibrio parahaemolyticus II J. Gen. Appl. Microbiol. 1999. V. 45 P. 155-161.

86. Krantz M., Nordlander В., Valadi H., Johansson M., Gustafsson L., Hohmann S. Anaerobicity prepares Saccharomyces cerevisiae cells for faster adaptation to osmotic shock // Eukaryot. Cell. 2004. V. 3. №6. P. 1381-1390.

87. Kwast K.E., Burke P.V., Poyton R.O. Oxygen sensing and the transcriptional regulation of oxygen responsive genes in yeast // J. Exp. Biol. 1998. V. 201. P. 1177-1195.

88. Lai L.C., Kosorukoff A.L., Burke P.V., Kwast K.E. Metabolic-state-dependent remodeling of the transcriptome in response to anoxia and subsequent reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae II Eukaryot. Cell. 2006. V. 5. № 9. p. 1468-1489.

89. Lamarlc Т., Rolcenes Т., McDougall J., Strom A.R. The complex bet promoters of Escherichia coli: regulation by oxygen (ArcA), choline (Betl), and osmotic stress // J. Bacteriol. 1996. V. 178.№6. P. 16551662.

90. Lan C., Lee H.C., Tang S., Zhang L. A novel mode of chaperone action: heme activation of Hapl by enhanced association of Hsp90 with the repressed Hsp70-Hapl complex II J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 27607-27612.

91. Laplace J.M., Sauvageot N., Hartke A., Auffray Y. Characterization of Lactobacillus collinoides response to heat, acid and ethanol treatments //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 51 № 5. P. 659-663.

92. Laz T.M., Pietras D.F., Sherman F. Differential regulation of the duplicated iso-cytochrome с genes in yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 4475-4479.

93. Leblanc L., Leroi F., Hartke A., Auffray Y. Do stresses encountered during the smoked salmon process influence the survival of the spoilingbacterium Shewanella putrefaciensl II Lett. Appl. Microbiol. 2000. V. 30 № 6. P. 437-442.

94. Lee H.C., Hon Т., Zhang L. The molecular chaperone Hsp90 mediates heme activation of the yeast transcriptional activator Hapl // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 7430-7437.

95. Lieckfeldt E., Meyer W., Borner T. Rapid identification and differentiation of yeasts by DNA and PCR fingerprinting // J. Basic Microbiol. 1993. V.33. P.413-25.

96. Lorca G.L., de Valdez G.F. The effect of suboptimal growth temperature and growth phase on resistance of Lactobacillus acidophilus to environmental stress // Cryobiology. 1999. V. 39. P. 144-149.

97. Macario A.J. L., Lange M., Ahring B.K., De Macario E.C. Stress genes and proteins in the Archaea II Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. Vol. 63. No. 4 P. 923-967.

98. Mccann M. P. The role of katf in Escherichia coli starvation protein synthesis and stress survival // Ph.D. Thesis. 1993. Stanford University. 128 P.

99. Milani G., Jarmuszkiewicz W., Sluse-Goffart C.M., Schreiber A.Z., Vercesi A.E., Sluse F.E. Respiratory chain network in mitochondria of Candida parapsilosis: ADP/O appraisal of the multiple electron pathways // FEBS Lett. 2001. V. 508. P. 231-235

100. Moskvin O.V., Kaplan S., Gilles-Gonzalez M.A., Gomelsky M. Novel heme-based oxygen sensor with a revealing evolutionary history // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. №39. P. 28740-28748.

101. Nanasombat S. Heat adaptation induced cross-protection against osmotic stress in Salmonella typhimurium DTI04 and its survival in dried foods // Ph.D. Thesis. 2001. University of Georgia. 109 P.

102. Nishi Т., Yagy T. Efflux of sodium ions by a Na+/H+ antiporter during salt stress in the salt-tolerant yeast Zygosaccharomyces rouxii II J. Gen. Appl. Microbiol. 1995. V. 41. № 1. P. 87-97.

103. Park J.J. Cellular responses to freeze-thaw stress // Ph. D Thesis. University of New South Wales (Australia). 2000.

104. Park S.H., Oh K.H., Kim C.K. Adaptive and cross-protective responses of Pseudomonas sp. DJ-12 to several aromatics and other stress shocks II Current Microbiology. 2001. V. 43 № 3. P. 176-181.

105. Parsell D.A., Lindquist S. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins // Annu. Rev. Genet. 1993. V. 27. P. 437-496.

106. Periago P.M., van Schaik W., Abee Т., Wouters J.A., Identification of proteins involved in the heat stress response of Bacillus cereus ATCC 14579 // Appl. Envir. Microbiol. 2002. V. 68. P. 3486-3495.

107. Rodriguez-Valera F., Ruiz-Berraquero F., Ramoz-Cormenzana A. Isolation of extreme halophiles from seawater // Apl. Envir. Microbiol. 1979. V. 38. P. 164-165.

108. Salmon K.A., Hung S.-P., Steffen N.R., Krupp R., Baldi P., Hatfield G.W., Gunsalusa R.P. Global gene expression profiling in Escherichia coli К12. Effects of oxygen availability and AcrA // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. №15. P. 15084-15096.

109. Schmidt G., Zink R. Basic features of the stress response in three species of bifidobacteria: B.longum, B.adolescentis, and B. breve II Int. J. Food Microbiol. 2000 V. 55 P. 41-45.

110. Sertil O., Kapoor R., Cohen B.D., Abramova N., Lowry C.V. Synergistic repression of anaerobic genes by Mot3 and Roxl in Saccharomyces cerevisiae II Nucleic Acids Research. 2003. V. 31. № 20. P. 5831-5837.

111. Sertil O., Vemula A., Salmon S.L., Morse R.H., Lowry C.V. Direct role for the Rpd3 complex in transcriptional induction of the anaerobic dan/tir genes in yeast // Mol. Cell. Biol. 2007. V. 27. №6. P. 20372047.

112. Sousa E.E.S., Tuckerman J.R., Gonzalez G., Gilles-Gonzalez M.A. DosT and DevS are oxygen-switched kinases in Mycobacterium tuberculosis II Protein Sci. 2007. V. 16. P. 1708-1719.

113. Srinivasan S., Kjelleberg S. Signal-responsive carbon starvation genes of marine Vibrio angustum S14 // Abstracts of the General Meeting of the American Society for Microbiology. 2001. 101. P. 606.

114. Sugiyama K., Izawa S., Inoue Y. The Yaplp-dependent induction of glutathione synthesis in heat shock response of Saccharomyces cerevisiae И J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 20. P. 15535-15540.

115. Svensater G., Sjogreen В., Hamilton I.R. Multiple stress responses in Streptococcus mutans and the induction of general and stress-specific proteins //Microbiol.-UK. 2000. V. 146. Part 1. P. 107-117.

116. Taormina P. J., Beuchat L. R. Survival and heat resistance of Listeria monocytogenes after exposure to alkali and chlorine // Appl. Envir. Microbiol. 2001. V. 67 № 6. P. 2555-2563.

117. Todd B.L., Stewart E.V., Burg J.S., Hughes A.L., Espenshade P.J. Sterol regulatory element binding protein is a principal regulator of anaerobic gene expression in fission yeast // Mol. Cel. Biol. 2006. V. 26. №7. P. 2817-2831.

118. Tzamarias D., Struhl K. Distinct TPR motifs of Cyc8 are involved in recruiting the Cyc8-Tupl corepressor complex to differentially regulated promoters // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 821-831.

119. Van Zyl P.J., Kilian S J., Prior B.A. The role of an active mechanism in glycerol accumulation during osmoregulation by Zygosaccharomyces rouxii II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. V. 34 № 2. P. 231-235.

120. Varanasi U.S., Klis M., Mikesell P.B., Trumbly R.J. The Cyc8(Ssn6)-Tupl corepressor complex is composed of one Cyc8 and four Tupl subunits //Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. P. 6707-6714.

121. Veiga F., Arrabaca J.D., Sansonetty F., Ludovico P., Corte-Real M., Loureiro-Dias M.C. Energy coupled to cyanide-resistant respiration in the yeast Pichia membranifaciens and Debaryomyces hansenii IIFEMS Yeast Res. 2003. V. 3. P. 141-148.

122. Veiga A., Arrabaca J.D., Veiga F., Loureiro-Dias M.C. Cyanide-resistant respiration, a very frequent metabolic pathway in yeasts // FEMS Yeast Res. 2003. V. 3. P. 239-245.

123. Vriezen J.A.C., de Bruijn F.J., Niisslein K. Responses of Rhizobia to desiccation in relation to osmotic stress, oxygen, and temperature // Appl. Envir. Microbiol. 2007. V. 73. №11. P. 3451-3459.

124. Walker D.C., Girgis H.S., Klaenhammer T.R. The groESL chaperone operon of Lactobacillus johnsonii И Appl. Envir. Microbiol. 1999. V. 65 №7. P. 3033-3041.

125. Waterland R.A., Basu A., Chance В., Poyton R.O. The isoforms of yeast cytochrome с oxidase subunit V alter the in vivo kinetic properties of the holoenzyme // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P.- 41804186.

126. Webster K.A. Evolution of the coordinate regulation of glycolytic enzyme genes by hypoxia // J. Exp. Biol. 2003. V. 206. P. 2911-2922.

127. Winkler K., Kienle I., Burger M., Wagner L.-C., Holzier H. Metabolic regulation of the trehalose content of vegetative yeast // FEBS Lett. 1991. V. 291. №2. P. 269-272.

128. Woojin K.S., Perl L., Hyeon P.J., Tandianus J.E., Noel D.W. // Assessment of stress response of the probiotic Lactobacillus acidophilus. Current Microbiol. 2001. V. 43. № 5. P. 346-350.

129. Yarrow D. Methods for the isolation, maintenance and identification of yeasts // The yeasts, a taxonomic study. 1998. Elsevier. Ed. by Kurtsman С. P, Fell J.W. P. 77-100.

130. Zitomer R.S., Limbach M.P., Rodriguez-Torres A.M., Balasubramanian В., Deckert J., Snow P.M. Approaches to the study of Roxl repression of the hypoxic genes in the yeast Saccharomyces cerevisiae II Methods. 1997. V. 11. P. 279-288.

131. Zitomer R.S., Lowry C.V. Regulation of gene expression by oxygen in Saccharomyces cerevisiae II Microbiol. Reviews. 1992. V. 56. №1. P. 1-11

Информация о работе

Шелемех, Оксана Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Ответные реакции микроорганизмов на одновременное воздействие нескольких стрессорных факторов: гипо- и гиперосмотических условий, гипоксии, неблагоприятных значений pH - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы