Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние обработки регуляторами роста на устойчивость растений кукурузы к гипо- и гипертермии

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние обработки регуляторами роста на устойчивость растений кукурузы к гипо- и гипертермии"

На правах рукописи

КАШТАНОВА Наталья Николаевна

ВЛИЯНИЕ ОБРАБОТКИ РЕГУЛЯТОРАМИ РОСТА НА УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ КУКУРУЗЫ К ГИПО- И ГИПЕРТЕРМИИ

Специальность 03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ 5 ДЕК 2013

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

005543003

Работа выполнена на кафедре ботаники и физиологии растений Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва»

Научный руководитель: доктор биологических наук профессор

Лукаткин Александр Степанович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Пухальская Нина Витальевна,

зав. лабораторией агрохимии фосфора и калия Всероссийского НИИ агрохимии им. Д.Н. Прянишникова

кандидат биологических наук с.н.с. Фомина Ирина Ремовна,

с.н.с. группы экологии и физиологии автотрофных организмов Института фундаментальных проблем биологии РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского»

Защита состоится «18» декабря 2013 г. в «1630 » часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.08 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 15 (тел./факс: 8(499)976-24-92), e-mail: dissovet@timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К.А. Тимирязева

Автореферат разослан « ноября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

C.JI. Белопухов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время растения подвергаются нарастающему воздействию абиотических и антропогенных неблагоприятных факторов среды [Лукаткин, 2005; Кошкин, 2010]. Неблагоприятные температуры являются одним из наиболее распространенных абиотических стрессоров, определяющим географическое распространение растений и их продуктивность. На 40% территорий умеренного климата Земли растения испытывают влияние повышенных или пониженных стрессовых температур [Усманов и др., 2001].

Гипотермия является ведущим стрессовым фактором при возделывании теплолюбивых растений [Генкель, Кушниренко, 1966; Wang, 1982; Лукаткин, 2002; Кошкин, 2010]. Действие пониженных температур в умеренном климате приводит к снижению или полной потере урожая, вследствие прямого повреждения либо замедленного созревания; даже небольшие понижения температуры, не вызывающие видимых повреждений теплолюбивых растений, приводят к снижению продуктивности до 50% [Коровин, 1984; Лукаткин, 2002].

Высокотемпературный стресс - один из наиболее значимых абиотических факторов, определяющих урожайность сельскохозяйственных культур. Гипертермия (превышение температуры воздуха 40°С) наблюдается на более чем 23% территории [Кошкин, 2010], и сельскохозяйственные культуры по устойчивости к высоким температурам относятся к группе нежаростойких.

Для успешного выращивания растений в неблагоприятных условиях необходимо знание физиологических механизмов повреждения и адаптации растений и их клеток. Поскольку неблагоприятные абиотические факторы вызывают сверхпродукцию активированных форм кислорода (АФК) и возникновение окислительного стресса [Лукаткин, 2002], то активность антиоксидантной системы является одним из основных механизмов защиты растений [Деви, Пра-сад, 2003; Sytar et al., 2013].

Реализация максимальной продуктивности культурных растений при попадании в условия абиотического стресса может быть осуществлена посредством использования биологически активных веществ (БАВ), в т.ч. регуляторов роста (РР) [Гамбург и др., 1979; Genisel et al., 2013; Kanwar et al., 2013]. В настоящее время созданы новые БАВ и синтетические РР, которые можно использовать для повышения устойчивости растений к стрессорным факторам. Особенностью действия новых РР является то, что они интенсифицируют физиолого-биохимические процессы в растениях и одновременно повышают устойчивость к стрессам и болезням [Прусакова и др., 2005]. Показана возможность антиоксидантного действия некоторых синтетических регуляторов роста, особенно при стрессорных воздействиях [Лукаткин, 1999; Al-Hakimi, 2007; Ramakrishna, Rao, 2013]. Однако плохо выяснены закономерности направленного повышения резистентности растений к различным стрессорам синтетическими и природными РР, а также механизмы их действия, особенно в плане воздействия на про/антиоксидантную активность растительных клеток.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение эффективности и механизмов повышения резистентности растений кукурузы к неблагоприятным температурам посредством обработки семян экзогенными регуляторами роста. Для решения цели поставлены следующие задачи:

- изучить физиологические и биохимические процессы, лежащие в основе повреждения растений кукурузы стрессирующими факторами (гипо- и гипертермией) и направленного повышения резистентности растений экзогенными регуляторами роста различной природы;

- проанализировать влияние предпосевной обработки семян кукурузы регуляторами роста различной природы на прорастание семян, рост и проницаемость мембран растений при действии неблагоприятных температур;

- исследовать влияние обработки семян регуляторами роста на проокси-дантную активность в растениях кукурузы;

- изучить влияние экзогенных регуляторов роста на антиоксидантную способность растений (общую и ферментативную);

- провести отбор концентраций регуляторов роста, индуцирующих повышенную термоустойчивость растений.

Научная новизна. Проведено комплексное исследование физиологических и биохимических процессов в растениях кукурузы при действии гипо- и гипертермии. Показано возникновение окислительного стресса при действии неблагоприятных температур на растения, характеризующееся усилением генерации потенциально опасных АФК и снижением антиоксидантной активности.

Доказано, что синтетические регуляторы роста цитокининовой природы (цитодеф, тидиазурон, 6-бензиламинопурин), а также эпибрассинолид и природные регуляторы - Рибав-Экстра и иммуноцитофит - способствовали улучшению физиологических и биохимических характеристик культурных растений как в оптимальных условиях, так и при действии стрессоров — неблагоприятных (пониженной и повышенной) температур. Впервые показано повышение антиоксидантной активности вследствие обработки регуляторами роста. Выявлено, что эффективность РР, как в нормальных, так и в стрессовых условиях, зависит от особенностей растений, условий их выращивания, а также от стрессора и его дозы (интенсивности и длительности).

Научно-практическая значимость работы. Разработаны методологические подходы к оценке действия стрессорных температур на растения по изменениям физиологических и биохимических параметров, а также способов повышения стрессоустойчивости растительных объектов. Степень повреждения растений, определяемая величиной коэффициента повреждаемости (по выходу электролитов из высечек листьев), может быть использована как критерий сравнительной стрессоустойчивости сортов и гибридов кукурузы.

Выявлены оптимальные концентрации синтетических и природных регуляторов роста, максимально снижающие стрессовые ответы растительных клеток. Использование РР в целях повышения стрессоустойчивости растительных организмов может быть перспективным на территориях с высокой вероятностью возникновения температурных стрессов.

Полученные результаты могут быть использованы при разработке технологий повышения стрессоустойчивости и продуктивности культурных растений, в адаптивных системах растениеводства; в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторных занятий по курсам «Физиология растений», «Растение и стресс», «Экологическая физиология растений», «Регуляция роста и развития растений» и др.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Неблагоприятные воздействия как гипотермии, так и гипертермии вызывают в клетках растений кукурузы сходные ответные реакции, характеризующиеся торможением роста, нарушением физиологических процессов, возникновением окислительного стресса.

2. Синтетические и природные РР могут ослаблять тяжесть стрессорных воздействий, главным образом через изменение про/антиоксидантного состояния клетки.

3. Концентрационные эффекты регуляторов роста сильно зависят от физиологических (сортовых и возрастных) особенностей и условий выращивания растений, и варьируют на фоне различных доз стрессора.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на научных конференциях: VII Международной конференции молодых ученых «Біологія: від молекули до біосфери» (Харков, 2012); XII международной конференции «Научные, прикладные и образовательные аспекты физиологии, генетики, биотехнологии растений и микроорганизмов» (Киев, 2012); международной научной конференции «Регионы в условиях неустойчивого развития» (Кострома-Шарья, 2012); X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биодиагностика состояния природных и природно-техногенных систем» (Киров, 2012); научной конференции ХІЛ Огаревские чтения (Саранск, 2012); международной научно-практической конференции «Клеточная биология и биотехнология растений» (Минск, 2013); Всероссийской научно-практической конференции — выставки экологических проектов с международным участием «Бизнес. Наука. Экология родного края: проблемы и пути их решения» (Киров, 2013); Всероссийской (с международным участием) научной конференции «Актуальные проблемы экологии и физиологии живых организмов» (Саранск, 2013); Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновацинные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013); I международном симпозиуме «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Казань, 2013).

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, в числе которых 5 статей в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложены на 146 страницах печатного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа включает 27 рисунков и 34 таблицы. Список литературы содержит 237 источников, 99 из них на иностранных языках.

Объекты и методы исследования

В качестве объектов исследования были использованы молодые растения кукурузы (2еа тау.9 Ь.) гибридов Коллективный 160 МВ, Коллективный 172 МВ, Краснодарский 194 МВ, РОСС 199 МВ, РОСС 299 МВ.

В работе использованы следующие регуляторы роста: 6-бензиламинопурин (6-БАП) фирмы КЫ (США); тидиазурон (ТДЗ) - [Ы-фенил-(1,3,5тиазол-5ил)мочевина] (ДРОПП) - препарат фирмы, «Шеринг» (Германия); цитодеф (1-фенил-3-(1,2,4-триазол-4-ил)мочевина), разработанный во ВНИИ химических средств защиты растений; эпибрассинолид (ЭБ) - препарат Эпин-Экстра (производитель - ННПП «НЭСТ М», Москва); Рибав-Экстра (РЭ) - 60% спиртовой экстракт продуктов метаболизма микоризных грибов, выделенных из корней женьшеня, который содержит комплекс природных аминокислот и биологически активных веществ (ЗАО «Сельхозэкосервис», Москва); иммуно-цитофит (ИЦФ) - смесь этиловых эфиров высших жирных кислот и мочевины (ЗАО «Агропромышленная компания «ГИНКГО»),

Постановка эксперимента. Семена замачивали 8-12 ч в различных концентрациях регуляторов роста, промывали водой и проращивали в растильнях на воде при оптимальной (около 25°С) или пониженной (от 10 до 16°С) температуре. Растения выращивали в рулонной культуре на растворе Кнопа [Журбиц-кий, Ильин, 1968] или в почвенной культуре (среднесуглинистый деградированный чернозем, 2 кг/сосуд) при температуре 25°С, освещении люминесцентными лампами (плотность потока фотонов около 80 мкМ м'2 с"1), фотопериоде 16 ч. При изучении действия и последействия гипо-и гипертермии часть сосудов с 7-дневными растениями подвергали действию пониженных (2-3°С) или повышенных (43-45°С) температур (20 ч или 24 ч), контроль выдерживали при температуре 25°С; определения физиологических параметров проводили сразу после завершения стрессового воздействия, а также спустя 1 или 6 суток после возврата растений в оптимальную температуру. В ряде опытов проводили обработку 7-дневных растений регуляторами роста перед стрессовым воздействием. Часть опытов проводили на высечках листьев, которые помещали в стрессовые условия (неблагоприятные температуры) на короткие интервалы времени (до 4 ч), после чего проводили биохимические измерения.

Методы исследования. Определение прорастания семян и характеристик роста проводили спустя 3 суток после закладки опыта (энергия прорастания), 7 суток (всхожесть) и 10 суток. До и после стрессорного воздействия у 10 растений каждой группы определяли высоту стебля (надземной части), количество листьев, а также степень повреждения листовой поверхности.

Проницаемость клеточных мембран определяли по выходу электролитов из высечек листьев в дистиллированную воду на кондуктометре ОК-Ю2 («11а-ёеЦав» Венгрия) по методике [Зауралов, Лукаткин, 1985; Гришенкова, Лукат-кин, 2005]. Устойчивость к стрессору оценивали по степени повреждения клеточных мембран после воздействия неблагоприятного фактора, рассчитывая «коэффициент повреждаемости» (КП): КП =( Ьп - Ь0)/ (100 - Ьо)'100%, где Ь0

- выход электролитов из ткани, подвергнутой стрессу, в процентах от полного* выхода электролитов; L0 - выход электролитов из ткани контрольных растений, в процентах от полного выхода электролитов.

Интенсивность ПОЛ в листьях растений оценивали по накоплению продуктов реакции с тиобарбитуровой кислотой [Лукаткин, Голованова, 1988].

Скорость генерации супероксидного анион-радикала определяли по окислению адреналина в адренохром [Purvis et al., 1995] с использованием коэффициента молярной экстинкции (е = 4020 М'''см"').

Активность каталазы {КФ 1.11.1.6) определяли по ([Kumar, Knowles, 1993] с модификациями) по снижению концентрации Н2О2 с использованием коэффициента молярной экстинкции е = 39,4 мМ"'см"'.

Активность СОД (КФ 1.15.1.1) определяли в цитозольной фракции по ([Kumar, Knowles, 1993] с модификациями) по восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ) супероксидным радикалом. За единицу активности СОД принимали 50% ингибирование образования формазана.

Активность аскорбат-пероксидазы (КФ 1.11:1.11) определяли по методике ([Nakano, Asada, 1981] с модификациями) по окислению аскорбата в присутствии перекиси водорода.

Активность глутатиоиредуктазы определяли в присутствии окисленного глутатиона (GSSG) и NADPH* по изменению оптической плотности при длине волны 340 нм, с последующим пересчетом на концентрацию оставшегося в смеси окисленного глутатиона по калибровочной кривой [Okane et al., 1996].'

Определение o6u¡eii антиоксидантной активности проводили по цветной: реакции радикалов 1,1-дифенил-2-пикрилгидрацила (DPPH) с полифенолами [Jainu, Shyamala Devi, 2005; Coban, Konuklugil, 2005; Manosroi et al., 2005]. Процент ингибирования радикалов DPPH образцами рассчитывали по формуле:

Ингибирование DPPH (%) - [(Ас(0) - АА(о) / Ас(0)] х 100%, где Ас(0)- оптическая плотность контроля; Ад(1) - оптическая плотность опыта со световым инкубированием реакционной смеси 30 минут.

Повторности и статистическая обработка результатов. Опыты проводили не менее 3 раз, в каждом опыте было от 3 до 20 биологических повторно-стей. Результаты обрабатывали статистически по стандартным методикам [JIa-' кин, 1980] с использованием компьютерных программ Statistica, BIÓSTAT, Microsoft Excell. В таблицах и на Трафиках представлены средние арифметические из всех повторностей опытов с их стандартными ошибками. Сравнение вариантов проводили по t-критерию Стьюдента при 5% уровне значимости

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Изучение действия гипо- и гипертермии на физиологические и биохимические процессы в растениях'

Пониженные температуры (10-16 °С) оказали существенное тормозящее влияние на прорастание семян теплолюбивой кукурузы и длину осевых органов. 20-часовое воздействие температур 43-45 или 3°С на растения кукурузы

приводило в последующем к снижению роста, увеличению выхода электролитов и появлению визуальных повреждений листа (подсыханию краев и кончиков листовой пластинки). Выдерживание растений кукурузы при пониженных температурах (2-3 °С, 24 ч) повышало проницаемость мембран, интенсивность ПОЛ, генерацию супероксидного анион-радикала О; в листьях, но снижало антиоксидантную активность и изменяло активность антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионредуктазы, аскорбатпероксидазы. В динамике охлаждения растений и высечек листьев выявлен нелинейный характер происходящих при неблагоприятных температурах физиологических и биохимических изменений.

Показано, что повышение проницаемости мембран вследствие гипотермии растений кукурузы различалось у разных гибридов (табл. 1). Высокие значения выхода электролитов и коэффициента повреждаемости зарегистрированы у гибрида РОСС 299 МВ, который на этом основании можно считать слабо устойчивым к пониженной температуре; средние значения - у гибридов Коллективный 172 МВ и РОСС 199 МВ (следовательно, относительно холодоустойчивых), и наименьшие - у гибридов Коллективный 160 МВ и Краснодарский 194 МВ, которые на этом основании считаем наиболее холодоустойчивыми.

Таблица 1

Влияние охлаждения (2°С) на выход электролитов из листовой ткани различных гибридов

Гибрид Выход электролитов, % от полного КП, %

До охлаждения После охлаждения

РОСС 299 МВ 5,31±0,68 12,37±1,53 7,46

Коллективный 172 МВ 4,56±0,49 10,26±1,15 5,97

РОСС 199 МВ 4,88±0,74 9,73±1,06 5,10

Коллективный 160 МВ 6,63±0,53 9,36±0,78 2,92

Краснодарский 194 МВ 4,66±0,53 7,39±0,84 2,86

Степень изменений физиологических показателей зависела от возраста растений, а также интенсивности и длительности стрессового воздействия. Неконтролируемое усиление генерации АФК (02~), происходящее в растениях в неблагоприятных температурных условиях, индуцирует возникновение в клетках окислительного стресса. Антиоксидантная система растений кукурузы "вовлечена в противодействие окислительному стрессу.

Влияние регуляторов роста на устойчивость растений кукурузы к неблагоприятным температурам

Изучение влияния синтетических цитокининовых препаратов на устойчивость кукурузы к гипо- и гипертермии. Предпосевная обработка семян кукурузы гибрида Краснодарский 194 МВ препаратом 6-БАП с последующим выдерживанием растений в стрессовых температурах стимулировала (в концентрации 10 нМ) рост побега (только при высокой температуре) и корня. Интен-

сивность ПОЛ в последействии всех температурных режимов существенно снижена (рис. 1). Наименьшее содержание МДА на фоне пониженной температуры (3°С) выявлено в проростках кукурузы, семена которых были обработаны препаратом 6-БАП в концентрациях 1 и 5 мкМ, а повышенной (45°С) температуры - 1 мкМ. Это свидетельствует об эффективности 6-БАП как термопротекторного соединения. Механизмы такого действия 6-БАП включают его влияние на состояние мембран [Лукаткин, 2002а], активацию работы белоксинтезирую-щего аппарата [Титов, Таланова, 2009], экспрессию генов, участвующих в раннем ответе на температурный стресс [Романов, 2009], способность активировать антиоксидантные ферменты [Wang et al., 2009].

i 4 5 3 < и Ч

г!3 % 2 X

| 1 ф

а

5 0

вода 1 нМ 10 нМ 0,1 мкМ 1мкМ 5мкМ

Концентрация 6-БАП

|а250си30са450с]

Рисунок 1. Содержание МДА в листьях кукурузы гибрида Краснодарский 194 МВ в зависимости от концентраций препарата 6-БАП и температурных условий при прорастании семян.

Оптимальными при низкотемпературном проращивании семян кукурузы гибрида Коллективный 172 МВ оказались концентрации тидиазурона 10"к—10"'' М, где наблюдалась тенденция к повышению энергии прорастания и всхожести семян. В последействии кратковременной (20 ч) гипо- и гипертермии, приводящей к торможению роста и повреждению листьев, обработка ТДЗ увеличивала (или проявляла тенденцию к возрастанию) рост корня, побега и листьев, и снижала повреждение листьев, максимально - в концентрации 10"'°М, а также уменьшала температуро-индуцированный выход ионов из клеток, особенно в концентрации 10"" М. Количественная оценка повреждающих эффектов температуры на состояние клеточных мембран (на основе КП) показала прогрессирующее с уменьшением концентрации ТДЗ снижение величины КП относительно водного контроля после прогрева или охлаждения растений, особенно выраженное в самой малой концентрации - 10'" М (рис. 2).

Препарат цитодеф положительно повлиял на прорастание семян, рост корня и побега кукурузы гибрида РОСС 299 МВ при температурах 25°С и 16°С, особенно в концентрации 10 '' М. Выход электролитов из высечек листьев подвергнутых охлаждению проростков (а также КП) были самыми низкими при обработке цитодефом в концентрации 10"9 М. Это свидетельствует о высокой термопротекторной эффективности синтетических цитокнниновых препаратов.

Сходные эффекты уменьшения проницаемости клеточных мембран и образования МДА получены в опытах с обработкой молодых растений кукурузы

гибрида РОСС 199 МВ тидиазуроном (10"к М) и цитодефом (10"' М/л) перед 24-часовым воздействием температуры 2°С. Более эффективным при обработке растений перед гипотермией оказался цитодеф.

Рис. 2. Коэффициент повреждаемости клеток листьев кукурузы, обработанной разными концентрациями тидиазурона, после воздействия температуры 43°С (А) или 3°С (Б).

Влияние эпибрассинолида на устойчивость кукурузы к неблагоприятным температурам. После обработки семян гибрида Коллективный 172 МВ растворами ЭБ (от 10"7 до 10"'°М) наблюдали тенденцию к повышению энергии прорастания и всхожести при концентрациях 10"8-10"10 М ЭБ. Воздействие температур 43°С или 3°С приводило к снижению роста корней и побегов относительно 25°С; обработка ЭБ почти во всех вариантах показала тенденцию к усилению роста, максимально при Ю'10 М. Степень повреждения листовой поверхности после прогрева проростков была самой низкой вследствие обработки 10"10 М ЭБ, после охлаждения - 10"8 и Ю"10 М. Прирост осевых органов был максимальным при концентрации 10"9 М ЭБ в условиях оптимальной температуры, 10"9М (прирост корня) и 10"'°М (прирост побега) после повышенных температур (43°С), и 10"9М ЭБ в последействии охлаждения (3°С) (табл. 2).

Предпосевная обработка эпибрассинолидом способствовала снижению индуцированного температурой выхода ионов из клеток (особенно в концентрации Ю"|0М). Величина КП после прогрева или охлаждения в вариантах с обработкой ЭБ была на уровне водного контроля или ниже его. В последействии теплового стресса величина КП снижалась прогрессирующе с уменьшением

концентрации ЭБ. При действии пониженной температуры ЭБ был высокоэффективен в дозах 10"9 и 10"'°М. Таким образом, термопротекторная эффективность препарата ЭБ (по состоянию клеточных мембран) наиболее высока в на-номолярной дозе 10"'°М.

Таблица 2

Влияние регулятора роста эпибрассинолида на прирост осевых органов кукурузы гибрида Коллективный 172 МВ в последействии обработки различными температурами_

Концентрация, М Температура Прирост корня Прирост побега

мм % к исх. мм % к исх.

0 (Н20) 25°С 97±14,8 167 272±16,7 402

10"8 104±15,1 139 266±22,3 408

10* 183±23,2 428 344±13,4 638

10-ш 179±17,4 264 323±25,1 614

0 (Н20) 43°С 67±11,7 116 201±14,8 297

Ю-8 69±12,4 92 216±19,1 330

ю-,; 114±22,1 267 288±22,9 534

10"ш 154±26,3 227 331±11,7 629

0 (Н2о) 3°С 64±9,7 110 242±19,5 358

ю-8 122±19,1 162 227±17,1 347

10'" 165±22,9 386 272±11,8 505

,0-Ю 170±17,6 251 243±12,4 462

Влияние Рибав-Экстра иа устойчивость растений к неблагоприятным температурам. Рибав-Экстра - препарат, который стимулирует развитие микоризы, усиливая рост корневой системы и улучшая состояние растений [Толмачева, Михеева, 2008]. Оптимальной для прорастания семян кукурузы гибрида Коллективный 172 МВ (как при оптимальной, так и пониженной температурах) оказалась концентрация РЭ 1 мкл/л, где наблюдали повышение энергии прорастания и всхожести относительно контроля, а также увеличение длины корня и побега. Препарат РЭ положительно повлиял на состояние растений кукурузы после температурного стресса (43 или 3°С). В последействии охлаждения длина корня была максимальной в варианте 1 мкл/л РЭ, побега - от 0,1 до 10 мкл/л РЭ. После экспозиции растений при 43°С обработка РЭ также проявила тенденцию к улучшению роста осевых органов и листьев, снижению степени повреждения листовой поверхности, наиболее эффективно при дозе РЭ 1 мкл/л. Предпосевная обработка некоторыми концентрациями РЭ способствовала снижению индуцированного температурой выхода электролитов из клеток (особенно в дозе 0,1 мкл/л). Расчет КП показал высокую эффективность препарата Рибав-Экстра в концентрации 0,1 мкл/л как сразу после прогрева или охлаждения, так и в последействии неблагоприятной температуры (рис. 3).

Интенсивность ПОЛ, выраженная в % к водному контролю, изменялась в проростках кукурузы при обработке РЭ (табл. 3). При комнатной температуре минимальный уровень ПОЛ отмечен при концентрации Рибав-Экстра 0,1 мкл/л. Однако после воздействия пониженной и повышенной температур более эффективными оказались концентрации 100 мкл/л (для обеих температур), а также 0,01 (3°С) и 0,0001 мкл/л (43°С).

Вода І 0.1 0.01

Копіїсіпраїшя, мкл/л

І □ Сразу после тсміїсраіуриого вотлсйсгеня □ В иослслснсівіні |

Б

і ж 4 '-И

і^

Вола 1 0.1 0.01

Концентрации, мкп/л

□ Сразу после температурного воздействия □ В последействии |

Рисунок 3. Коэффициент повреждаемости листьев кукурузы гибрида Коллективный 172 МВ, обработанной разными концентрациями препарата Рибав-Экстра, после воздействия температуры 43°С (А) или 3°С (Б).

Таблица 3

Интенсивность ПОЛ (% к водному контролю) молодых растений кукурузы гибрида РОСС-299 в зависимости от концентраций регулятора роста Рибав-Экстра и температуры

Концентрация Рибав-Экстра, мкл/л Температурный вариант опыта, °С

25 3 43

0,0001 173 ± 10 179 ±8 60 ±5

0,001 193 ± 13 128 ± 5 140 ± 7

0,01 80 ±5 86 ±5 93 ±5

0,1 73 ±5 107 ±6 101 ± 5

1 87 ±5 107 ±6 82 ±5

10 120 ±8 93 ±5 61 ±5

100 180 ± 10 43 ±4 43 ±5

Таким образом, на основании анализа действия и последействия температурных стрессоров на клеточные мембраны можно видеть термопротекторный эффект препарата РЭ, наиболее значительный - в нанодозе 0,1 мкл/л.

Влияние иммуноцитофита на устойчивость растений кукурузы гибрида РОСС 299 МВ к гипо- и гипертермии. При подборе эффективных концентраций ИЦФ использовали диапазон от 2><10"'2 М до 2x10"7 М. Положительное влияние ИЦФ на рост корней и побегов кукурузы выявлено при пониженной (3°С) температуре, наиболее эффективной оказалась концентрация 2x10"'°

М. При повышенной температуре (44°С) обработка ИЦФ не оказала эффекта. По интенсивности ПОЛ, как косвенного признака повреждений, при пониженных температурах эффективны были две концентрации - 2хІ0"12 и 2x10"'° М, при повышенной температуре - только доза 2><10"12 М. При выражении интенсивности ПОЛ в процентах к температурному контролю лучший результат показал препарат в дозах 2х 10"'2 и 2хЮ"10М (рис. 4).

I

1 160

2 140

контроль 2*10" 2*10''° 2*10* 2*10" 2*10"' I (вода) Концентрация ИЦФ, М

Ч] пониженная температура (З'С ) ¡3 повышенная температура (44*С)

Рисунок 4. Влияние различных концентраций регулятора роста Иммуноцитофит на интенсивность ПОЛ в листьях проростков кукурузы после температурного стресса.

Таким образом, все изученные препараты (как синтетические, так и природные РР) оказали положительное воздействие на молодые растения кукурузы на фоне пониженных и повышенных температур. Однако эффективные концентрации РР, максимально повышающие термоустойчивость проростков, сильно варьировали в зависимости от температурного воздействия, стадии развития (возраста) растения, сорта, что необходимо учитывать при разработке рекомендаций к практическому использованию.

Использование изученных препаратов в целях повышения термоустойчивости кукурузы может быть перспективным на территориях с высокой вероятностью попадания растений на ранних этапах развития в условия стрессовых температур (как пониженных, так и пониженных).

МЕХАНИЗМЫ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ПОВЫШЕННУЮ СТРЕССО-УСТОЙЧИВОСТЬ ДЕЙСТВИЯ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА

Влияние регуляторов роста па возникновение и интенсивность окислительного стресса при действии гипо- и гипертермии

Как было показано в предыдущих разделах, в основе стрессорных реакций растений кукурузы при действии как гипо-, так и гипертермии лежит возникновение окислительного стресса. Поэтому для выяснения механизмов индуцирующего повышенную стрессоустойчивость действия регуляторов роста анализировали генерацию потенциально опасной АФК - 02~ в разных условиях.

Обработка семян кукурузы (гибрид Краснодарский 194 МВ) регулятором 6-БАП оказала положительный эффект на снижение генерации Ог' на фоне всех температур; в последействии неблагоприятных температур эффективность препарата выражена сильнее, особенно при низких концентрациях (1-100 нМ) (рис. 5). Почти все концентрации 6-БАП оказали положительное действие на подавление генерации 02' , однако эффекты концентраций препарата различались при температурных обработках: при действии пониженной температуры наименьшая скорость генерации 02' наблюдалась при дозе 6-БАП 0,1 мкМ, а повышенной температуры - 1 и 10 нМ 6-БАП.

120 -

вода 1 нМ 10 нМ 0.1 мкМ 1мкМ 5мкМ

Концентрация 6-БАП

[□25°С ЕЭ 3 °С В 45 "С ]

Рис. 5. Скорость генерации 02'~ в листьях кукурузы (гибрид Краснодарский 194 МВ) в зависимости от концентраций 6-БАП и температурных условий опыта, нормированная к водному контролю.

При обработке семян кукурузы гибрида Коллективный 160 МВ тидиазу-роном концентраций 10""-10"6 М, дальнейшем выращивании в водной культуре до возраста 7 суток и воздействии гипо- и гипертермии уровень 02~ варировал; предпосевная обработка растворами тидиазурона почти всегда уменьшала скорость генерации ОГ, и в большинстве вариантов уровень супероксида был ниже водного контроля. Наиболее эффективно ослабляла влияние гипо- и гипертермии на генерацию 02~ обработка тидиазуроном в концентрации 10"" М. В листьях растений, обработанных тидиазуроном, концентрация МДА почти всегда была достоверно ниже необработанного варианта (табл. 4). Обработка семян тидиазуроном наиболее эффективно снижала уровень МДА на фоне гипотермии в концентрации Ю"10 М, а после гипертермии - в концентрации 10" М.

Таблица 4

Влияние тидиазурона на интенсивность ПОЛ в листьях кукурузы гибрида Коллективный 160 МВ после температурного воздействия, мкМ МДА/ г сырой массы_

Температура, °С Вода Концентрация тидиазурона

10 6 М 10"8М 10-уМ 10",иМ 10"" М

25 2,93±0,31 2,71±0,22 3,02±0,29 2,88±0,26 2,45±0,24 2,54±0,18

3 4,16±0,43 3,29±0,36 3,47±0,19 3,09±0,27 2,36±0,17 2,58±0,20

43 3,28±0,23 3,59±0,44 3,36±0,27 3,11±0,18 2,44±0,31 2,09±0,16

Обработка 7-дневных растений кукурузы гибрида РОСС 199 МВ, выращенных в почвенной культуре, растворами тидиазурона (10 нМ) или цитодефа (100 нМ) перед гипертермией (43°С, 24 ч), привела к значительному понижению генерации 02~ и образования МДА относительно водного контроля; более высокая эффективность на снижение окислительного стресса, вызванного прогревом, показана для тидиазурона.

При обработке семян кукурузы гибрида Коллективный 172 МВ препаратом Рибав-Экстра (от 10"4 до 10'8 %) с последующим действием неблагоприятных температур большинство концентраций РЭ снижало образование 02'~. В варианте пониженной (3°С) температуры наименьшая скорость генерации О2' наблюдалась при концентрациях 10" и ю -6% , а повышенной (45°С) - 10"7 %. Выявлена интересная тенденция влияния концентраций Рибав-Экстра на интенсивность ПОЛ: при оптимальной температуре эффективность препарата повышалась со снижением дозы РЭ (минимальное содержание МДА - при концентрации 10"8%); в последействии пониженной температуры выявлено два пика-при самой низкой и самой высокой дозах РЭ; а в последействии повышенной температуры эффективность препарата повышалась с увеличением дозы РЭ. Т. е. единой закономерности влияния разных концентраций регулятора роста Ри-бав-Экстра на уровень ПОЛ при действии гипо- и гипертермии не выявлено.

Таким образом, обработка семян регуляторами роста способствовала лучшей адаптации растений кукурузы к действию гипо- и гипертермии, снижая стационарный уровень супероксида и возрастающего на основе АФК ПОЛ.

Влияние регуляторов роста на антиоксидаитную активность растительных клеток после воздействия неблагоприятных температур. Обработка семян кукурузы гибрида РОСС 299 МВ различными концентрациями регуляторов роста (6-БАП, РЭ, ИЦФ) изменяла АОА при действии температурных стрессоров. Так, в проростках кукурузы, выращенных из обработанных 6-БАП семян, при оптимальной температуре (25°С) антиоксидантная активность препарата проявлялась лишь в двух концентрациях - 10 нМ и 0,1 мкМ (рис. 6).

Концентрация 6-БАП

|-А-25 °С 3 °С - - * - -45°с]

Рис. 6. Влияние обработки ссмян препаратом 6-БАП и последействия разных температур на АОА в проростках кукурузы.

Однако в последействии пониженной (3°С) и повышенной (45°С) температур АОА достоверно повышалась почти при всех концентрациях 6-БАП, наиболее сильно - при концентрациях 0,1 мкМ и 10 нМ (3°С) , 1 нМ и 10 нМ (45°С).

Предпосевная обработка семян различными концентрациями Иммуноци-тофита повлияла на антиоксидантную активность в листьях кукурузы (табл. 5). При оптимальной и повышенной температуре эффективна концентрация 2x10" М, тогда как при пониженной температуре - 2x10"10 М.

Таблица 5

Антиоксидантная активность молодых растений кукурузы в зависимости от концентраций регулятора роста Иммуноцитофит и температуры, % к водному контролю_

Условия опыта, °С концентрация Иммуноцитофита, М

Контроль(вода) 2x10"" 2*Ю-Ш 2x10""

3 100 160 ±8 168 ±8 140 ±6

44 100 133 ±6 47 ±5 73 ±5

Антиоксидантная активность кукурузы, выращенной из обработанных препаратом Рибав-Экстра семян, варьировала в зависимости от действия температурного стресса (рис. 7). Если при комнатной температуре наибольшее влияние на уровень АОА оказала концентрация 10"7 % РЭ, то после пониженной температуры - концентрации 10"8 и 10" %, а повышенной - 10"б%.

Таким образом, обработка семян кукурузы синтетическими и природными регуляторами роста способствовала значительному повышению антиокси-дантной активности в проростках кукурузы в последействии неблагоприятных температурных условий и ТМ. Очевидно, что это может быть одним из основных механизмов противодействия растений стрессовым факторам, индуцируемого обработкой регуляторами роста; повышение АОА в клетках растений позволяет эффективно снижать тяжесть стрессового воздействия.

300

□ комнатная температура (25°С) Концентрация Рибав-Экстра, % й пониженная температура (3°С) н повышенная температура (44°С)

Рис. 7. Уровень АОА в растениях кукурузы в зависимости от концентрации РЭ и температуры.

Влияние регуляторов роста па активность антноксидашпных ферментов в условиях стрессорных воздействий. Одна из причин повреждающего действия гипо- и гипертермии - возникновение окислительного стресса, выражающееся в появлении больших доз АФК. Основную роль в элиминации АФК играют антиоксидантные ферменты, в первую очередь СОД, которая снижает концентрацию 02' в 104раз, а также АПО и каталаза, устраняющие избыток перекисей, образованных СОД из 02 [Мерзляк, 1989; Лукаткин, 2002].

Обработка семян кукурузы гибрида РОСС 199 МВ цитокининовыми РР (10" М тидиазуроном и Ю"10 М цитодефом) приводила к изменению активности антиоксидантных ферментов после 24-часового охлаждения 7-дневных растений (табл. 6). При этом предпосевная обработка тидиазуроном индуцировала более высокую активность СОД и каталазы, а цитодефом - более выраженную нормализацию АПО (относительно необработанного РР варианта) в растениях кукурузы, подвергнутых гипотермии. Наиболее значительное воздействие цитокиновых препаратов выявлено для глутатионредуктазы, активность которой значительно возрастала (относительно водного контроля) вследствие обработки тидиазуроном и цитодефом, как при нормальной температуре, так п после гипотермии. Возможно, цитокининовые препараты (в больше степени тидиазурон) оказывают противодействие окислительному стрессу через активацию глутатиоиового цикла. Сравнение цитокининовых препаратов по влиянию на активность антиоксидантных ферментов у растений кукурузы при гипотермии показало более высокую эффективность тидиазурона.

Таблица 6

Влияние цитокининовых препаратов на активность антиоксидантных ферментов в листьях

Вариант опыта СОД, сд. акт./г Каталаза, мкМ/г-мин АПО, мМ/г-мин ГР, мМ/г

Без охлаждения 79±5,0 166±11,7 0,64±0,03 38,3±2,6

Охлаждение 2°С 47±3,4 139±14,7 1,05±0,05 22,4±2,1

Тидиазурон, 0,01 нМ 71±2,8 204±8,9 0,52±0,02 49,6±1,8

Тидиазурон + охлаждение 63±3,2 172±10,2 0,96±0,04 54,2±4,4

Цитодсф, 0,1 нМ 76±4,2 183±12,0 0,59±0,03 46,1±3,0

Цитодеф+ охлаждение 58±4,4 156±10,3 0,76±0,03 42,7±4,1

В опыте с 20-часовой гипо- или гипертермией кукурузы гибрида Коллективный 172 МВ спустя 6 суток выявлено небольшое понижение (не всегда достоверное) активности СОД, каталазы и глутатионредуктазы, и повышение -АПО (табл. 7). Обработка семян кукурузы эпибрассинолидом (10"'° М) и Ри-бав-Экстра (0,1 мкл/л) (концентрации выбраны как оптимальные на основании предыдущих опытов) способствовала повышению активности антиоксидантных ферментов в листьях кукурузы относительно водного контроля, как в оптимальных температурных условиях, так и после кратковременного выдерживания в условиях неблагоприятных температур. Активность СОД в последействии прогрева при 43°С наиболее значительно (почти в два раза к водному кон-

тролю) усилил эпибрассинолид (после гипотермии различия между РЭ и ЭБ недостоверны). Обработка ЭБ и РЭ несколько повышала активность каталазы, но до уровня неохлажденного контроля активность в большинстве вариантов опыта не возвращалась (различий между РР не обнаружено).

Таблица 7

Активность антиоксидантных ферментов в листьях кукурузы гибрида Коллективный 172 MB

Вариант опыта, концен- СОД, ед. Катал аза, АПО, ГР, мМ/г

трация акт./г мкМ/г-мин мМ/г-мин

25°С

Без РР (вода) 94±6,2 206±14,2 1,07±0,05 43,8±4,4

ЭБ, 0,1 нМ 103±4,4 228±11,3 1,34±0,03 84,1 ±3,4

РЭ, 0,1 мкл/л 109±4,9 219±21,0 1,46±0,04 73,2 ± 2,8

Прогрев 43°С, 20 ч

Без РР (вода) 76±8,6 169±10,3 1,72±0,07 32,6±4,0

ЭБ, 0,1 нМ 143±7,2 197±16,2 1,60±0,03 97,6 ±5,8

РЭ, 0,1 мкл/л 124±4,9 189±15,3 1,68±0,06 88,6 ± 4,9

Охлаждение 3°С, 20 ч

Без РР (вода) 61±6,3 160±8,5 1,96±0,09 26,3±5,6

ЭБ, 0,1 нМ 116±8,0 201±14,7 1,54±0,06 89,7 ± 3,8

РЭ, 0,1 мкл/л 107±5,6 193±12,0 1,69±0,05 86,2 ± 4,2

Активность АПО в проростках кукурузы после гипо- и гипертермии существенно превышала водный контроль, что свидетельствует об усилении синтеза изоформ фермента, направленных на снижение концентрации перекиси и защиту от окислительного стресса [Лукаткин, 2002; Edwin, Sheeja, 2005]. Предварительная обработка семян кукурузы регуляторами роста несколько снижала (более значительно ЭБ) активность фермента относительно водных вариантов соответствующих температурных обработок. Очевидно, стабилизация активности АПО указывает на снижение тяжести окислительного стресса в клетках листьев кукурузы, подвергнутой гипо- и гипертермии, вследствие обработки РР.

Активность глутатионредуктазы в листьях кукурузы после гипо- и гипертермии значительно снижалась. Предварительная обработка семян регуляторами роста (эпибрассинолидом и Рибав-Экстра) повышала активность ГР, т.е. способствовала нормализации активности фермента.

Таким образом, кратковременное действие неблагоприятных температур (как гипо-, так и гипертермии) индуцирует окислительный стресс в растениях кукурузы, проявляющийся увеличением уровня АФК и интенсивности ПОЛ; при этом в клетках включаются защитные механизмы, и типичный ответ растений на возникновение окислительного стресса - активация антиоксидантной защиты (в т.ч. ферментативной). При обработке регуляторами роста реакция на действие гипо- и гипертермии выражена слабее, чем в контроле. Очевидно, РР могут повышать резистентность растений к абиотическим стрессорам посредством снижения соотношения про/антиоксидантов в растительных клетках.

Заключение

В последнее время достигнуты существенные успехи в выяснении физио-лого-биохимических реакций растений на действие неблагоприятных факторов среды, которые проявляются в изменениях на клеточном, субклеточном и МО-лекулярно-генетическом уровнях. Эффекты абиотических факторов на растения является следствием комбинированного воздействия конкретного стрессора на метаболизм и структуры растительных клеток. Полученные данные показывают, что окислительный стресс, индуцированный неблагоприятными температурами, является одним из компонентов (возможно, наиболее важным) сложного механизма стрессорного воздействия на растения. Окислительный стресс в растениях, подвергнутых действию неблагоприятных температур, тесно связан и с другими механизмами повреждения. Перекисное окисление мембранных липи-дов приводит к изменениям транспортных характеристик клеточных мембран у растений, подвергнутых температурному стрессу, способствует деструкции клеточных органелл.

Регулирование роста и развития растений с помощью физиологически активных веществ позволяет оказывать направленное влияние на этапы онтогенеза с целью мобилизации генетических возможностей растительного организма и, в конечном итоге, повышать продуктивность и качество урожая сельскохозяйственных культур. Кроме стимуляции роста и развития, регуляторы роста играют большую роль в становлении защитных реакций к стрессам (в том числе к воздействию неблагоприятных температур); они позволяют индуцировать у растений комплексную устойчивость ко многим неблагоприятным факторам среды. В настоящее время уделяется большое внимание разработке и применению регуляторов роста растений нового поколения, обладающим широким спектром физиологической активности. При этом анализируются как синтетические препараты, так и РР на основе природным веществ, которые получены из высших растений, грибов и микроорганизмов.

В работе продемонстрировано, что изменения физиологических и биохимических процессов в клетках растений кукурузы при действии абиотического (температурного) стрессового фактора связаны с индукцией окислительного стресса. Представлены исследования по влиянию наномолярных концентраций РР на растения кукурузы при гипо- и гипертермии. Действие изученных регуляторов роста на растения кукурузы неоднозначно и зависело от исходного окислительного статуса. Обнаружено сходное воздействие РР, принадлежащих к разным классам, на снижение тяжести стрессового воздействия, в основе которого лежит противодействие окислительному стрессу. На этой основе нами предложена схема предполагаемого действия экзогенных РР на адаптацию растений к действию неблагоприятных факторов среды (рис. 8), включающая следующие этапы: обработка регулятором роста - кратковременное действие стрессора - активация антиоксидантной защиты - повышение уровней низкомолекулярных антиоксидантов и активности антиоксидантных ферментов -развитие толерантности к последующему, более сильному действию стрессора

той же природы - формирование кросс-адаптации (устойчивости к другим стресс-факторам) - развитие устойчивости растений к действию стресс-факторов абиотической и антропогенной природы. Предложенная схема может быть использована для обоснования способов направленного повышения стрес-соустойчивости растений экзогенными воздействиями.

Рис.8. Предполагаемая схема действия экзогенной обработки регуляторами роста на адаптацию растений к действию неблагоприятных факторов среды

Выводы

1 Выявлено стрессорное воздействие гипо- и гипертермии на изменения физиологических и биохимических параметров у растений кукурузы, проявлявшееся в снижении морфофизиологических показателей, значительном повышении проницаемости клеточных мембран в листьях, усилении генерации активированных форм кислорода и перекисного окисления липидов, снижении общей антиоксидантной активности, изменениях активности антиоксидантных ферментов. Совокупность выявленных изменений свидетельствует о возникновении в клетках кукурузы окислительного стресса при гипо- и гипертермии.

2 Синтетические регуляторы роста цитокининовой природы (6-бензнламинопурин, цитодеф, тидиазурон), а также эпибрассинолид и природные регуляторы - Рибав-Экстра и иммуноцитофит - способствовали улучшению физиологических и биохимических характеристик растений кукурузы как в оптимальных условиях, так и при стрессорном действии и последействии гипо- и гипертермии. При этом отмечены различия в эффективности препаратов, зависящие от генотипа растения и его возраста, интенсивности стрессового воздействия, а также концентрации препарата.

3 Предпосевная обработка регуляторами роста различной природы индуцировала повышенные всхожесть, рост и сниженную проницаемость мембран растений кукурузы, подвергнутых действию неблагоприятных температур.

4 Обработка семян регуляторами роста приводила к ослаблению тяжести окислительного стресса при гипо- и гипертермии, что выявлено по интенсивности генерации активированных форм кислорода (супероксидного анион-радикала) и перекисного окисления липидов в листьях кукурузы.

5 Экзогенные регуляторы роста способствовали возрастанию общей ан-тиоксидантной активности тканей кукурузы, особенно выраженному при гипо-и гипертермии, и нормализации активности антиоксидантных ферментов при действии стресса.

6 Проведен скрининг регуляторов роста, способствующих повышению термоустойчивости растений, и подобраны оптимальные концентрации: тидиа-зурон - Ю'10 и 10'" М, 6-БАП - 10 нМ и 0,1 мкМ, цитодеф - 10"9 и 10"'° М, эпибрассинолид - 10" и Ю-10 М, Рибав-Экстра - 10"5и 10'6%, иммуноцитофит -2x10"'° и 2x10"" М. Эффективные концентрации зависели от физиологических особенностей растений, стрессирующего воздействия и его интенсивности.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Лукаткин A.C., Погодина Д.Н., Каштанова H.H., Лукаткин A.A., Сакалау-скайте ІО., Духовскис_П. Влияние б-бензиламииопурина на проростки кукурузы при действии неблагоприятных температур // Агрохимия. — 2013. — № 2.- С. 42-48.

2. Лукаткин A.C., Каштанова H.H., Котлова Т.А. Влияние препарата Рибав-Экстра на рост и проницаемость мембран у проростков кукурузы в условиях температурного стресса // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского.-2013.-№1,ч. 1.-С. 151-157.

3. Лукаткин A.C., Каштанова H.H., Духовскис П. Влияние эпибрассинолида на термоустойчивость проростков кукурузы // Агрохимия. - 2013. — № 6. — С. 24-31.

4. Лукаткин А. С., Каштанова Н. Н. Влияние тидиазурона на термоустойчивость растений кукурузы // Труды Карельского научного центра РАН. - 2013. —№ 3-С. 129-135.

5. Лукаткин A.C., Каштанова H.H., Духовскис П. Изменение роста и проницаемости мембран у проростков кукурузы под влиянием эпибрассинолида и тяжелых металлов //Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2013. № 3. С. 1618.

Публикации в других изданиях

1.Каштанова H.H. Модификация ответа культурных растений на абиотические стрессы действием синтетических регуляторов роста // Біологія: від молекули до біосфери». Матеріали VII Міжнародної конференції молодих учених (20 - 23 листопада 2012 р., м. Харків, Україна). — Харків: ФОП Шаповалова Т.М., 2012 — С. 212

2. Лукаткин A.C., Погодина Д.Н., Каштанова H.H. Модификация про- и антиоксидантною активности в листьях кукурузы при действии температуры и регуляторов роста // Естествознание в регионах: проблемы, поиски, решения : материалы между-нар. науч. конф. «Регионы в условиях неустойчивого развития» (Кострома - Шарья, 1-3 ноября 2012 г.) : в 2 т. Т. 1 / сост. и отв. ред. Ю.А. Дорогова, И.Г. Криницын, С.А.

Кусманов, А.П. Липаев, К.С. Ситников. - Кострома : КГУ им. Н. А. Некрасова, 2012. -С. 181-182.

3. Семенова A.C., Каштанова H.H., Гарькова H.H., Лукаткии A.C. Влияние обработки гербицидом паракват на интенсивность перекисного окисления липидов в листьях злаков // Биодиагностика состояния природных и природно-техногенных систем: Материалы X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Книга 1. (г. Киров, 4-5 декабря 2012г.). -Киров: ООО «Лобань», 2012. -С. 194-196.

4. Лукаткин A.C., Каштанова H.H., Семенова A.C. Экзогенный эпибрассинолид способствует адаптации проростков кукурузы к неблагоприятным условиям выращивания // Биодиагностика состояния природных и природно-техногенных систем: Материалы X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Книга 1. (г. Киров, 4-5 декабря 2012г.). - Киров: ООО «Лобань», 2012. - С. 170-173.

5. Каштанова H.H. Синтетические регуляторы роста снижают токсические эффекты тяжелых металлов на растения огурца и кукурузы // XII международная конференция «Научные, прикладные и образовательные аспекты физиологии, генетики, биотехнологии растений и микроорганизмов». - Киев, 2012. - С. 72-73.

6. Каштанова H.H., Лукаткин A.C. Влияние синтетических аналогов цитокини-нов на проявления окислительного стресса в клетках огурца при действии неблагоприятных факторов среды // Клеточная биология и биотехнология растений: тез. докл. Междунар. науч.-практич. конф., 13-15 февр. 2013 г., Минск, Беларусь = International conference «Plant Cell Biology and Biotechnology», Minsk, February 13-15, 2013 / ред. совет: B.B. Демидчик [и др.]. —Минск : Изд. центр БГУ, 2013.- С. 72.

7. Каштанова H.H., Лукаткин А. С. Влияние обработки семян огурца тидиазу-роном на про- и антиоксидантные свойства проростков при действии тяжелых металлов // Бизнес Наука. Экология родного края: проблемы и пути их решения: Матер. Всеросс. науч.-практич. конф.-выставки экологических проектов с междунар. участием (г. Киров, 18-20 апреля 2013 г.). - Киров: Изд-во ООО «Веси», 2013 - С. 183-185.

8. Каштанова H.H., Стржалка К., Лукаткин A.C. Анализ резистентности растений огурца к тяжелым металлам при действии экзогенных регуляторов роста // Актуальные проблемы экологии и физиологии живых организмов: материалы Всерос. (с междунар. участием) науч. конф., Саранск, 15-17 мая 2013 г.- Саранск: Изд-во Мордов. унта, 2013.-С. 92-95.

9. Каштанова H.H., Сазанова К.А., Семенова A.C., Лукаткин А. С. Экзогенные регуляторы роста повышают резистентность растений к абиотическим стрессорам посредством изменения про/антиоксидантного состояния // Инновацинные направления современной физиологии растений: тез. докл. Всерос. науч. конф. с междунар. участием. Москва, Россия, 2-6 июня 2013 г. - М., 2013. С. 282.

10. Каштанова H.H., Лукаткин A.C. Активация кислорода в клетках растений абиотическими стрессорами и ее подавление экзогенными регуляторами роста // Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений: Первый международный симпозиум (Казань, 17-20 сентября 2013 г.). Тез. докл.-Казань: Изд-во "ФизтехПРЕСС" КФТИ КазНЦ РАН, 2013,- С. 75.

Подписано в печать 12.11.13. Объем 1,25 и. л. Тираж 100 экз. Заказ .V» 1562.

Типография Издательства Мордовского университета 430005, г. Саранск, ул. Советская, 24

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каштанова, Наталья Николаевна, Саранск

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва»

На правах рукописи

04201365280

КАШТАНОВА Наталья Николаевна

ВЛИЯНИЕ ОБРАБОТКИ РЕГУЛЯТОРАМИ РОСТА НА УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ КУКУРУЗЫ К ГИПО- И ГИПЕРТЕРМИИ

Специальность 03.01.05 - физиология и биохимия растений

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель — Заслуженный деятель науки Республики Мордовия, доктор биологических наук, профессор Лукаткин Александр Степанович

Саранск - 2013

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................4

ГЛАВА I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОВРЕЖДЕНИЯ РАСТЕНИЙ СТРЕССОРНЫМИ ФАКТОРАМИ И СПОСОБОВ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ..................................................................................10

1.1 Физиолого-биохимические основы повреждения растений неблагоприятными воздействиями среды..............................................................10

1.2 Общие представления об устойчивости растений к абиотическим и антропогенным стрессорным факторам..................................................17

1.3 Регуляторы роста как факторы, индуцирующие повышение устойчивости культурных растений к стрессорам....................................................21

1.4 Использование синтетических и природных регуляторов роста для защиты сельскохозяйственных растений от стрессорных воздействий...............26

ГЛАВА II. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............................33

2.1 Объекты исследования...............................................................33

2.2 Постановка эксперимента...........................................................33

2.3 Методы исследования...............................................................34

ГЛАВА III. ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ГИПО- И ГИПЕРТЕРМИИ НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В РАСТЕНИЯХ..40 3.1 Прорастание семян и рост кукурузы при действии неблагоприятных температур.......................................................................................40

3.2. Проницаемость клеточных мембран в листьях кукурузы после температурного стресса..................................................................43

3.3 Изменения прооксидантной системы растений кукурузы при действии неблагоприятных температур............................................................46

3.4 Влияние температурного стресса на антиоксидантную активность

проростков кукурузы.....................................................................49

ГЛАВА IV. ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ КУКУРУЗЫ К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ ТЕМПЕРАТУР AM.... 5 7

4.1 Изучение влияния синтетических цитокининовых препаратов на устойчивость кукурузы к гипо- и гипертермии................................................57

4.2 Влияние эпибрассинолида на устойчивость растений кукурузы к неблагоприятным температурам.................................................................76

4.3 Влияние Рибав-Экстра на устойчивость растений кукурузы к неблагоприятным температурам.....................................................................84

4.4 Влияние иммуноцитофита на устойчивость растений кукурузы к различным температурным режимам..........................................................90

ГЛАВА V. МЕХАНИЗМЫ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ПОВЫШЕННУЮ СТРЕС-

СОУСТОЙЧИВОСТЬ ДЕЙСТВИЯ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА....................95

5.1. Влияние регуляторов роста на возникновение и интенсивность окислительного стресса при действии гипо- и гипертермии.............................95

5.2 Влияние регуляторов роста на антиоксидантную активность растительных клеток после воздействия неблагоприятных температур................102

5.3 Влияние регуляторов роста на активность антиоксидантных ферментов

в условиях стрессорных температурных воздействий..........................107

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................113

ВЫВОДЫ.................................................................................117

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ..............................119

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. В настоящее время растения подвергаются нарастающему воздействию абиотических и антропогенных факторов среды [Лукаткин, 2005; Кошкин, 2010]. Влияние на растения неблагоприятных температур является одним из наиболее распространенных абиотических стрессоров, определяющим географическое распространение растений и их продуктивность. На 40% территорий умеренного климата Земли растения испытывают влияние повышенных или пониженных стрессовых температур [Усманов и др., 2001]. Согласно прогнозам, повышение средней температуры на 1°С может привести к сокращению видового разнообразия растений в Европе на треть [Дроздов, Курец, 2003].

Гипотермия является ведущим стрессовым фактором при возделывании теплолюбивых культурных растений [Генкель, Кушниренко, 1966; Wang, 1982; Лукаткин, 2002; Кошкин, 2010]. Действие пониженных положительных температур в умеренном климате приводит к снижению или полной потере урожая, вследствие прямого повреждения либо замедленного созревания; даже небольшие понижения температуры, не вызывающие видимых повреждений теплолюбивых растений, приводят к снижению продуктивности до 50% [Коровин, 1984; Лукаткин, 2002].

Высокотемпературный стресс - один из наиболее значимых абиотических факторов, определяющих урожайность сельскохозяйственных культур. Гипертермия (превышение температуры воздуха 40°С) наблюдается на более чем 23% территории [Кошкин, 2010], и сельскохозяйственные культуры по устойчивости к высоким температурам относятся к группе нежаростойких.

Для успешного выращивания растений в неблагоприятных условиях необходимо знание физиологических механизмов повреждения и адаптации растений и их клеток к неблагоприятным условиям среды. Поскольку основные ответные реакции растений на воздействия неблагоприятных абиотических

факторов связаны со сверхпродукцией активированных форм кислорода (АФК) и возникновением окислительного стресса [Лукаткин, 2002], то главная задача растения состоит в том, чтобы управлять реакциями, индуцированными активированным кислородом [Минибаева, Гордон, 2003]. Активность антиок-сидантной системы является одним из основных механизмов защиты растений от неблагоприятных факторов среды [Деви, Прасад, 2003; 8^аг й а1., 2013]. Действие ферментативных и неферментативных компонентов системы анти-оксидантной защиты сводится к подавлению образования свободных радикалов, поддержанию нормального уровня свободнорадикальных процессов и пе-рекисного окисления липидов в тканях [Мерзляк, 1989; Лукаткин, 2002].

Реализация максимальной продуктивности культурных растений при попадании в условия абиотического стресса может быть осуществлена посредством использования биологически активных веществ (БАВ), в т.ч. регуляторов роста (РР) [Гамбург и др., 1979; Оешзе1 е1 а1., 2013; Капшаг е1 а1., 2013]. В настоящее время созданы новые БАВ и синтетические РР, которые можно использовать для повышения устойчивости растений к стрессорным факторам. Особенностью действия новых РР является то, что они интенсифицируют фи-зиолого-биохимические процессы в растениях и одновременно повышают устойчивость к стрессам и болезням [Прусакова и др., 2005]. Показана возможность антиоксидантного действия некоторых синтетических регуляторов роста, особенно при стрессорных воздействиях [Лукаткин, 1999; А1-Накпш, 2007; КатакпБЬпа, Яао, 2013]. Однако плохо выяснены закономерности направленного повышения резистентности растений к различным стрессорам синтетическими и природными РР, а также механизмы их действия, особенно в плане воздействия на про/антиоксидантную активность растительных клеток.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение эффективности и механизмов повышения резистентности растений кукурузы к неблагоприятным температурам посредством обработки семян экзогенными регуляторами роста.

Для решения цели поставлены следующие задачи:

- изучить физиологические и биохимические процессы, лежащие в основе повреждения растений кукурузы стрессирующими факторами (гипо- и гипертермией) и направленного повышения резистентности растений экзогенными регуляторами роста различной природы;

- проанализировать влияние предпосевной обработки семян кукурузы регуляторами роста различной природы на прорастание семян, рост и проницаемость мембран растений при действии неблагоприятных температур;

- исследовать влияние обработки семян регуляторами роста на проок-сидантную активность в растениях кукурузы;

- изучить влияние экзогенных регуляторов роста на антиоксидантную способность растений (общую и ферментативную);

- провести отбор концентраций регуляторов роста, индуцирующих повышенную термоустойчивость растений.

Научная новизна. Проведено комплексное исследование физиологических и биохимических процессов в растениях кукурузы при действии гипо-и гипертермии. Показано возникновение окислительного стресса при действии неблагоприятных температур на растения, характеризующееся усилением генерации потенциально опасных АФК и снижением антиоксидантной активности.

Доказано, что синтетические регуляторы роста цитокининовой природы (цитодеф, тидиазурон, 6-бензиламинопурин), а также эпибрассинолид и природные регуляторы - Рибав-Экстра и иммуноцитофит - способствовали улучшению физиологических и биохимических характеристик культурных растений как в оптимальных условиях, так и при действии стрессоров - неблагоприятных (пониженной и повышенной) температур. Впервые показано повышение антиоксидантной активности вследствие обработки регуляторами роста. Выявлено, что эффективность РР, как в нормальных, так и в стрессовых

условиях, зависит от особенностей растений, условий их выращивания, а также от стрессора и его дозы (интенсивности и длительности).

Научно-практическая значимость работы. Разработаны методологические подходы к оценке действия стрессорных температур на растения по изменениям физиологических и биохимических параметров, а также способов повышения стрессоустойчивости растительных объектов. Степень повреждения растений, определяемая величиной коэффициента повреждаемости (по выходу электролитов из высечек листьев), может быть использована как критерий сравнительной стрессоустойчивости сортов и гибридов кукурузы.

Выявлены оптимальные концентрации синтетических и природных регуляторов роста, максимально снижающие стрессовые ответы растительных клеток. Использование РР в целях повышения стрессоустойчивости растительных организмов может быть перспективным на территориях с высокой вероятностью возникновения температурных стрессов.

Полученные результаты могут быть использованы при разработке технологий повышения стрессоустойчивости и продуктивности культурных растений, в адаптивных системах растениеводства; в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторных занятий по курсам «Физиология растений», «Растение и стресс», «Экологическая физиология растений», «Регуляция роста и развития растений» и др.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Неблагоприятные воздействия как гипотермии, так и гипертермии вызывают в клетках растений кукурузы сходные ответные реакции, характеризующиеся торможением роста, нарушением физиологических процессов, возникновением окислительного стресса.

2. Синтетические и природные РР могут ослаблять тяжесть стрессорных воздействий, главным образом через изменение про/антиоксидантного состояния клетки.

3. Концентрационные эффекты регуляторов роста сильно зависят от физиологических (сортовых и возрастных) особенностей и условий выращивания растений, и варьируют на фоне различных доз стрессора.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на научных конференциях: VII Международной конференции молодых ученых «Бюлопя: вщ молекули до бюсфери» (Харков, Украина, 2012); XII международной конференции «Научные, прикладные и образовательные аспекты физиологии, генетики, биотехнологии растений и микроорганизмов» (Киев, 2012); международной научной конференции «Регионы в условиях неустойчивого развития» (Кострома - Шарья, 2012); X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Биодиагностика состояния природных и природно-техногенных систем» (Киров, 2012); научной конференции Х1Л Огаревские чтения (Саранск, 2012); международной научно-практической конференции «Клеточная биология и биотехнология растений» (Минск, Беларусь, 2013); Всероссийской научно-практической конференции - выставки экологических проектов с международным участием «Бизнес. Наука. Экология родного края: проблемы и пути их решения» (Киров, 2013); Всероссийской (с международным участием) научной конференции «Актуальные проблемы экологии и физиологии живых организмов» (Саранск, 2013); Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновацинные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013); I международном симпозиуме «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Казань, 2013).

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано _15 печатных работ, в числе которых 5 статей в рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложены на 146 страницах печатного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертационная работа включает 27

рисунков и 34 таблицы. Список литературы содержит 237 источников, 99 из них на иностранных языках.

Обозначения и сокращения

АБК - абсцизовая кислота

АК - аскорбиновая кислота;

АО - антиоксид анты;

АОА - антиоксидантная активность;

АПО - аскорбатпероксидаза;

АФК - активные формы кислорода;

6-БАП - 6-бензиламинопурин;

ГК - гибберелловая кислота

ИУК - индолил-3 -уксусная кислота

КП - коэффициент повреждаемости

МДА - малоновый диальдегид;

НУК - нафтилуксусная кислота;

ПОЛ - перекисное окисление липидов;

РР - регулятор роста

СОД - супероксиддисмутаза;

СР - свободные радикалы;

ТБК - тиобарбитуровая кислота;

ТМ - тяжелые металлы;

ФГ - фитогормоны

БРРН -1,1 -дифенил-2-пикрилгидразил; С8Н - восстановленный глутатион; в88С - окисленный глутатион.

ГЛАВА I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОВРЕЖДЕНИЯ РАСТЕНИЙ СТРЕССОРНЫМИ ФАКТОРАМИ И СПОСОБОВ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ

1.1 Физиолого-биохимические основы повреждения растений неблагоприятными воздействиями среды

Условия внешней среды претерпевают периодические и случайные колебания, причем отклонения от благоприятных для жизни растения норм часто достигают опасных амплитуд [Лукаткин, 2002; Кошкин, 2010]. Реакция растений на неблагоприятные факторы внешней среды (стрессоры) - стресс [Алехина и др., 2005]. Учение о стрессе, разработанное Г. Селье, предполагает существование единого алгоритма в реакциях на различные неблагоприятные (стрессовые) факторы [Селье, 1979]. П. А. Генкель впервые применил термин «фитостресс» в качестве определения реакции растительного организма на неблагоприятные условия существования [Генкель, 1982].

Концепция стресса позволяет оценить любой неблагоприятный фактор как стрессор опосредованно, через интенсивность реакции растения на него. В то же время всю совокупность ответных реакций растения на стрессор по характеру и направленности изменений метаболических процессов можно разделить на адаптивные (направленные на выживание, поддержание роста и создание урожая в условиях стресса), вредные (губительные для жизни), а также сопровождающие стресс и нейтральные по своему действию. Действие самых разных стрессоров вызывает у растения многочисленные неспецифические реакции [Лукаткин, 2002].

При фитострессе происходит гидролитический распад запасных веществ (фаза реакции). Если действие стресса не достигает пороговых значений, могут возникнуть обратимые процессы и формируется устойчивость организма к стрессу (фаза адаптации). После прекращения действия отрицательного фактора возможно восстановление функций организма (фаза рести-

туции или восстановления). При усилении стрессового воздействия до летальных пределов наступает фаза повреждения и гибели. Характерно, что вся последовательность реакций сводится к одному - поддержанию гомеостаза растительного организма в экстремальных условиях [Шматько, Григорюк, 1992]; основную роль в этом играют системы антиоксидантной защиты и противодействия окислительному стрессу [Кошкин, 2010; Zhang et al., 2012; O'Brien et al., 2012; Saruhan et al., 2012; Asthir et al., 2012; Bocova et al., 2012].

Температура как ведущий экологический фактор в жизни растений. Температура является одним из наиболее значительных лимитирующих факторов среды, определяющих географическое распространение и продуктивность растений [Коровин, 1984; Theocharis et al., 2012]. Тепловой режим среды обитания оказывает существенное влияние на интенсивность и направленность физиологических и биохимических процессов, рост и продуктивность растений [Усманов и др., 2001; Кошкин, 2010]. Растения принадлежат к пойкилотермным организмам, температура тела которых в результате энергообмена с окружающей средой несколько отличается от температуры воздуха [Лукаткин, 2005]; они вынуждены посто�