Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетические характеристики и объем-зависимая регуляция ионных переносчиков эритроцитов крысы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кинетические характеристики и объем-зависимая регуляция ионных переносчиков эритроцитов крысы"

РГБ Ой

2 5 СЕН

Московский Государственный Университет ин. М.В.Ломоносова , Биологический факультет

На правах рукописи

Колосова Ирина Анатольевна

КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ И ОБЪЕМ-ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ИОННЫХ ПЕРЕНОСЧИКОВ ЭРИТРОЦИТОВ КРЫСЫ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1995

Работа выполнена в лаборатории физико-химии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

биомембран

Научный руководитель: д.б.и., профессор С.Н.Орлов.

Официальные оппоненты: чл.-корр. РАМН, д.б.н., профессор

В.А.Ткачук,

д.б.н., профессор А.А.Болдырев.

Ведущая организация: НИИ.общей патологии и патофизиологии РАМН.

-¿о

Защита состоится /И g-fc/I^itV 1995 г. в часов на

заседании Специализированного биологического Совета Д.053.05.32 по присуждению ученой степени кандидата наук в Московском Государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Воробьевы горы. МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией. можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат

Ученый секретарь

Специализированного сов

кандидат биологических

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поддержание ионного гомеостаза является непременным условием существования как клетки, так и организма в целом. Ключевую роль в этом процессе играют ион-транспор-тирующие системы, осуществляющие пассивный, активный и вторично-активный транспорт. Среди вышеупомянутых систем большой интерес представляют Ыа+/Н+-обмен и Na+,К+,С1~-котранспорт, обнаруженные в плазматических мембранах многих типов клеток. Na+/H+-обмен принимает участие в трансэпителиальном движении воды и ионов, регуляции внутриклеточного рН и процессах пролиферации (Grinstein, Rothstein, 1986). Na+,К+,С1"-котранспорт вовлечен в процессы ре-абсорбции и секреции ионов з эпителиальных тканях (О'Grady et al., 1987).

Как Na+/H+-обмен, так и Na+,К*, С1~-котранспорт активируются в ответ на гиперосмотическое сжатие клеток in vitro. В ряде случаев активация этих ион-транспортирующих систем приводит к генерации нетто потоков ионов и осмотически сопряженного тока воды, направленных в клетку, следствием чего является восстановление клеточного объема (Sarkadi, Parker, 1991). In vivo уменьшение клеточного объема может происходить при изменении осмолярности внеклеточной среды или цитоплазмы. У высших животных осмолярность внеклеточной жидкости постоянна, и большинство клеток не подвергается осмотическому стрессу. Однако, в почечной ткани, эпителии дыхательного и желудочно-кишечного тракта и системе воротной вены происходят значительные изменения внеклеточной осмолярности даже при физиологических условиях. В свою очередь эритроциты, проходя через капилляры почки, кишечной стенки и печени, оказываются в гиперосмотических условиях. В настоящее время изучению объемной

регуляции ионного транспорта уделяется много внимания, так как объеи-чувствительные ионные потоки не только ответственны за поддержание клеткой постоянного объема, но также могут играть существенную роль при росте и пролиферации клеток, для которых необходимо сбалансированное увеличение содержания органических и неорганических веществ, клеточного объема и поверхности мембраны. Показано, что в некоторых типах клеток изменения клеточного объема и объем-чувствительные ионные потоки могут быть частью гормонального сигнала (Sarkadi, Parker, 1991).

Несмотря на накопленный обширный материал о системах Na+/H*-обмена и Na+,К+,С1~-котранспорта в различных типах клеток, механизм стимуляции их активности при изменении клеточного объема остается невыясненным.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования состояла в изучении кинетических характеристик Na+/H+-обмена и Na+,К+,С1~-котранспорта, выяснении механизмов их активации при гиперосмотическом сжатии клеток и возможности участия этих ион-транспортирующих систем в регуляторном восстановлении объема клеток. В качестве объекта изучения были выбраны эритроциты крысы, для которых ранее было показано наличие объем-зависимого транспорта Na+ и К+ (Duhm, Gobel, 1984; Orlov et al., 1989).

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить кинетические характеристики Na+/H+-обмена (EIPA-чувствительного транспорта Na+ и Н+) и Na+,К+,С1"-котранспорта (буметанид-чувствительного транспорта К+ и Na+) в контроле и при

еросмотическом сжатии клеток.

2. Исследовать возможность вовлечения процессов фосфорилиро-вания белков в гиперосмотическую активацию Na+/H+-обмена.

3. Оценить вклад Na^/H*-обмена и Na+ ,К+ ,С1~-котранспорта в регуляторное восстановление объема клеток в условиях гиперосмотического сжатия.

Научная новизна исследований. Впервые показано, что гиперосмотическое сжатие клеток может приводить к активации Na+/Na+-обмена, осуществляемого, по-видимому, изоформой NHE-1 Na^/H*-обмен-ника. Получены новые экспериментальные данные, свидетельствующие о влиянии реакций фосфорилирования-дефосфорилирования на Na+/Na+-обмен.

В эритроцитах крысы впервые выявлены особенности функционирования системы Na+,К+,СХ+-котранспорта и получены новые доказательства возможности функционирования этой системы в качестве вторичноактивного транспорта Na*.

Измерены нетто потоки К+ и Na+ при гипероскогическом сжатии эритроцитов крысы, что позволило объяснить отсутствие регулятор-ного увеличения объема в этих клетках in vitro.

Практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представления о функционировании обьем-активируемых систем ионного транспорта и могут внести вклад в изучение патологических процессов, связанных с изменением клеточного объема (артериальной гипертензии, серповидноклеточной анемии, отеков мозга и гипертрофии органов).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 7 Всесоюзном симпозиуме "Механизмы сенсорной рецепции" Москва, 1992), на 2 международной школе FEBS ICRO "Биохимия мембранного транспорта" (Балатон Алига, 1993), на 23 Конференции FEB5 (1995, Базель, Швейцария), на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ (Москва, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 220 наименований. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, включая 7 таблиц и 24 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали эритроциты беспородных крыс-самцов в возрасте 14-18 недель. Для выделения эритроцитов применяли метод, описанный ранее (Orlov et al., 1989).

Реципрокное изменение внутриклеточных концентраций Na+ и К+ проводили по методу с использованием нистатина, предложенному Бругнарой и соавт. (Brugnara et al., 1937).

Для фиксации мембранного потенциала при различных концентрациях С1~ в среде инкубации мы применили метод, предложенный Бругнарой и соавт. (Brugnara et al., 1989).

Для истощения ATP к эритроцитам добавляли 20-кратный объем среды, содержащей 140 мМ NaCl, 3 мМ КС1, 1 мМ СаС12, 1 мМ МдС12, 1 ММ К2НР04, 10 мМ HEPES-трис, рН 7,4, 5 мМ иодоацетамид, и инкубировали в течение 30 мин при 37°. Затем клетки осаждали, дважды промывали средой А (150 мМ хлорид холина, 10 мМ HEPES-трис, рН 7,4) и использовали для изучения транспорта Na*. В предварительных экспериментах нами было установлено, что концентрация АТР (измеренная люминисцентным методом на основе люциферин-люцифераз-ной реакции) в обработанных описанным методом клетках составляет

менее 1 мкМ.

Для изменения внутриклеточного рН использовали метод, описанный ранее (Escóbales, Canessa, 1986). Выход протонов из клеток регистрировали, как описано в работе Паркера и Кастрановы (Parker, Castranova, 1984).

Концентрацию Na+ и К+ в клетках определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре AAS-3 "Cari Zeiss" (Германия).

Для определения содержания внутриклеточной воды использовали метод, описанный ранее (Freedman, Hoffman, 1979) . Осмолярность сред инкубации эритроцитов повышали добавлением 350 мМ сахарозы.

Транспорт Na+ и К+ исследовали радиоизотопнык методом, описанным ранее (Orlov et al., 1989) с использованием 22NaCl и 86RbCl. Для идентификации отдельных ион-транспортирующих систем в среду инкубации эритроцитов добавляли следующие ингибиторы: уа-баин (1 мМ), уабаин (1 мМ) в сочетании с буметанидом (20 мкМ) , уабаин (1 кМ) в сочетании с буметанидом (20 мкМ) и SN-этилизопро-пиламилоридом (EIPA) (10 мкМ), что позволяло вычленить из суммарного потока Na+ или К+ составляющие, опосредованные Na*-насосом (уабаин-ингибируемый компонент), Na+,К+,С1"-котранспортом (уабаин-нечувствительный, буметанид-ингибируемый компонент), Na+/Н*-обменом (уабаин+буметанид-нечувствительный, EIPA-ингибиру-емый компонент) и пассивной диффузией, оцениеваемой как нечувствительный к ингибиторам компонент.

Временные задержки и стационарные скорости входа Na+ рассчитывали по уравнению, предложенному Дженнингсом и Аль-Рохилем (Jennings, Al-Rohil, 1990). На рисунках представлены среднеарифметические значения (М) н их стандартные ошибки (п), полученные в 3-4 экспериментах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. EIPA-чувствительный транспорт Na*, индуцированный гиперосмотическим сжатием клеток В отличие от большинства электрически возбудимых и эпителиальных клеток базальная (не стимулированная) , активность Na+/H+-обмена в эритроцитах крысы не регистрируется (Orlov et al., 1989). На рис. 1 показана кинетика EIPA-чувствительного транспорта Na+, индуцированного гиперосмотическим сжатием клеток. В гиперосмотической среде инкубации активация входа Na+ происходит с лаг-периодом равным 7±2 мин.

Ранее было показано, что в лимфоцитах (Grinstein, Rothstein, 1986), клетках глиомы (Dean et al., 1986), остеобластах (Dascalu et al., 1991), эритроцитах Amphiuma (Cala et al., 1991) и морской свинки (Zhao, Willis, 1993) стимулированный сжатием

амилорид-чувствительный вход Na+ сопровождается выходом протонов из клетки. В наших экспериментах нам не удалось зарегистрировать заметного закисления среды инкубации при гиперосмотическом сжатии клеток, то есть вход Na+ в эритроциты крысы не сопровождался выходом протонов в среду. Принимая во внимание тот факт, что Na* может конкурировать с Н+ за транспортный сайт на цитоплазматической стороне переносчика (Grinstein, Rothstein, 1986), можно предположить, что в гиперосмотических условиях переносчик способен функционировать в режиме Na*/На*-обмена. Действительно, в наших экспериментах гиперосмотическое сжатие стимулировало выходной поток Na+, чувствительный к EIPA (Рис. 1). Как ив случае входа Na+, активация выхода развивалась с течением времени (лаг-период равен 5±2 мин). Величины входящего и выходящего El PA-чувствительных потоков Na+ были примерно равны

Рис. 1. Кинетика Е1РА-чувствительного транспорта в эритроцитах крысы в гиперосмотической среде инкубации (690 мОсм).

10 15 20 25 30 35 40 Время, мин

и Выход а Вход N8*

друг другу и составляли 2,0 ± 0,23 ммоль/л клеток в час. На основании того, что Ыа+/Ка+-противотранспорт в эритроцитах крысы чувствителен к Е1РА и регистрируется только при клеточном сжатии, можно предположить, что Ма+/Иа+-противотранспорт является модой функционирования /Н+ -обменника.

1.2. Кинетические свойства Е1РА-чувствительного На*/Ыа*-обмена

Зависимость скорости Е1РА-ингибируемого входа от кон-

центрации Ыа+ в среде инкубации подчинялась кинетике Михаэли-са-Ментен (рис. 2). Значения Кт и Утах составляют 146 мМ и 50 ммоль/л клеток в час соответственно.

Зависимость входа Ыа+ от его концентрации в клетке имела сиг-моидный характер (рис. 3), что указывает на наличие либо на отличную от 1:1 стехиометрию Ыа+/Ыа+-обмена, либо на аллостеричес-кий эффект внутриклеточного Ыа*. Однако, принимая во внимание, что зависимость Е1РА-чувствительного входа Ыа+ от концентрации Ыа+ в инкубационной среде починяется уравнению Михаэлиса-Ментен, свидетельствуя о наличии одного транспортного сайта для Иа+

Рис. 2. Зависимость стационарной скорости Е1ГА-чувствительного входа Ыа+, индуцированного гиперосмотическим сжатием клеток, от концентрации Ыа+ в среде инкубации. Осмотичность среды (690 мОсм) поддерживалась постоянной с помощью эквимолярного замещения ЫаС1 на хлорид холина.

Рис. 3. Зависимость стационарной скорости Е1РА-чувствительного входа Ыа*, индуцированного гиперосмотическим сжатием клеток, от концентрации N3* в цитоплазме. Концентрации Ыа+ и К* в цитоплазме изменяли реципрокно с помощью нистатина.

можно сделать вывод, о том, что существует аллостерическая активация переносчика внутриклеточным натрием. Таким образом, внутриклеточный Na+ может либо повышать сродство транспортного сайта для Na+, либо увеличивать скорость транслокации переносчика через мембрану.

По нашим данным EIPA конкурирует с Na+ за транспортный сайт на внешней стороне мембраны. Закисление среды инкубации до pH 6,0 приводило к 3-кратному снижению скорости входа Na+ (по сравнению со скоростью при рН0 8,0) и ингибирование входа Na+ внешними протонами носило конкурентный характер. Повышение внутриклеточного pH с 7,2 до 8,0 увеличивало активность индуцированного сжатием EIPA-чувствительного входа Na+ в 2 раза, не влияя при этом на транспорт Na+ в изоосмотических условиях (данные представлены в диссертации), то есть внутриклеточные протоны оказывали ингибиру-ющее воздействие на переносчик.

1.3. Влияние ионного состава среды и цитоплазмы на EIPA-чувствительный транспорт Na*

Как мы обнаружили, в эритроцитах крысы гиперосмотическое сжатие активирует EIPA-чувствительный Na+/Na+-обмен (а не Na+/Н*-обмен), причем EIPA-чувствительный выход Na+ ([Na+1]=75 mM) в безнатриевую среду был даже выше, чем в среду содержащую Na+ (рис. 4). С другой стороны, мы наблюдали EIPA-чувствительный вход Na+ в клетки, полностью обедненные по Na+ (концентрация ниже 0,2 мМ) (рис. 5). Таким образом, переносчик может функционировать в несопряженной моде, генерируя нетто-поток Na*, направленный либо в клетку, либо из клетки, в зависимости от соотношения концентраций Na* по разные стороны мембраны.

к §

о со \ 14 О Н 1)

12-

10-

150 мМ КС1

75 мМ N301 75 мМ КС1

8-

и 2

Ч о

У.

со

0-

150 мМ К1Ч0з

75 мМ NaN0, 75 мМ КИ03

Рис. 4. Влияние ионного состава среды инкубации на скорость Е1РА-чувствительного выхода Ыа+, индуцированного гиперосмотическим сжатием клеток. Клетки были предварительно нагружены К+ и Ыа+ с помощью нистатина. Концентрации Иа+ и К+ в клетке после загрузки составляли примерно по 75 мМ. Концентрации Ка+, К+, С1~ и Н03~ в среде инкубации указаны на рисунке.

6

2

Рис. 5. Влияние ионного состава цитоплазмы на скорость Е1РА-чувствительного входа Ыа+, индуцированного гиперосмотическим сжатием клеток. Клетки были предварительно нагружены К+ и Ыа+ с помощью нистатина. Концентрации Ыа+, К+, С1~ и N03" после загрузки указаны на рисунке. Среда инкубации клеток с г2Ыа+ содержала [К+ 3=75 мМ, [Ыа ] = 75 мМ, [С1"] = 150 мМ.

Как видно на рис. 4 и 5, скорость EIPA-чувствительного транспорта Na+ снижается при уменьшении концентрации хлорид-аниона на противоположной стороне мембраны. Замена хлорид-аниона в инкубационной среде как на нитрат, так и на непроникающий анион глюконат полностью подавляла активацию EIPA-чувствительного входа Na+ гиперосмотическим сжатием (данные представлены в диссертации). Можно предположить, что индуцированный сжатием транспорт Na+ в эритроцитах крысы является С1~-зависимым. При этом либо хлорид-анион оказывает регуляторное влияние на преносчик, либо EIPA-чувствительный транспорт Na+ представляет собой Na+,Cl"-Ko-транспорт.

1.4. Участие процессов фосфорилирования-Эефосфорилирования в объеп-зависипой регуляции EIPA-чувствительного транспорта Na*

Наблюдения различных исследователей свидетельствуют в пользу вовлечения фосфорилирования белков в активацию Na+/H+-обмена различными стимулами, включая ростовые факторы, форболовый эфир и гиперосмотическое сжатие клеток (Grinstein, Rothstein, 1986). Рисунок 6 демонстрирует, 'что в эритроцитах крысы, истощенных по АТР, полностью отсутствует гиперосмотическая стимуляция EIPA-чувствительного входа Na+. R24571 (ингибитор

Са2*/кальмодулин-зависимых реакций) не влиял на стимулированный сжатием транспорт Na+, в то время как стауроспорин (ингибитр про-теинкиназы С) в три раза снижал скорость входа натрия. Учитывая эффект стауроспорина, следовало бы ожидать, что активатор проте-инкиназы С Р-форбол-12-мириста?-13-ацетат (ФМА) будет активировать вход Na* не только в гиперосмотической, но и в изоосмотичес-

кой среде. Однако, ФМА не оказывал никакого влияния на транспорт ни в гиперосмотической среде (рис. 6), ни в контроле. Это противоречие не позволяет нам сделать вывод об участии протеинкиназы С в гиперосмотической стимуляции транспорта Ыа+. Анализируя наши данные и особенности активации амилорид-чувствительного транспорта Ма+ форболовыми эфирами и гиперосмотическим сжатием, описанные

■ 1.5-

0.5-

ч о X

m

I I Контроль

Истощение АТР

10 мкМ стауроспорин

20 мкМ R24571 10 мкМ ФМА

Рис. 6. Влияние истощения АТР клеток, ингибиторов протеинкиназ и форболового эфира (ФМА) на EIPA-чувстви-тельный вход Na*, индуцированный гиперосмотическим сжатием клеток.

Рис. 7. Влияние ЫаГ и окадаевой кислоты (ОК) на Е1РА-чувствительный вход Ыа+, индуцированный гиперосмотическим сжатием клеток.

10 15 20 25 30 Время, мин

Контроль

10 мМ NaF

0,2 мкМ 0К

ранее, можно предположить, что гиперосмотическая стимуляция транспорта Na* опосредована протеинкиназами, отличными от С и кальмодулин-зависимой.

Ингибиторы протеинфосфатаз - окадаевая кислота и NaF - стимулировали индуцированный сжатием EIPA-чувствительный транспорт Na* (рис. 7), увеличивая время релаксации к новому равновесному состоянию (времена релаксации составляли 7±2, 15±4, 19±4 мин соответственно в контроле, при воздействии NaF и окадаевой кислоты). В условиях изоосмоса эти ингибиторы не оказывали никакого влияния на транспорт Na*. Окадаевая кислота является очень сильным и селективным ингибитором протеинфосфатазы 1 (РР1) и протеинфосфатазы 2А (РР2А) (Bialojan, Takai, 1988, Cohen 1989). Другой токсин, ка-ликулин А, также является сильным ингибитором РР1 и РР2А, причем каликулин ингибирует РР2А в тех же концентрациях, что окадаевая кислота, но в 100 раз более эффективен по отношению к РР1. Результаты наших экспериментов свидетельствуют об одинаковой активирующей способности этих токсинов (1С50=105 и 90 нм для калику-лина и окадаевой кислоты соответственно), что указывает на более вероятное участие именно РР2А в процессе стимуляции транспорта Na*.

Принимая во внимание наши данные о том, что ингибиторы фос-фатаз активируют Na*/Na*-обмен в гиперосмотических, но не в изо-осмотических условиях, можно предположить, что в изоосмосе фосфа-тазная и (или) киназная активности чрезвычайно низки, в условиях же гиперосмоса активируются как фосфатаза, так и киназа, но таким образом, что нетто фосфорилирование растет, чему сопутствует активация Na*/Na*-обмена. При этом киназа (фосфатаза) либо является трансдуктором осмотического сигнала, либо реакции фосфорилирова-

ния и дефосфорилирования оказывают лишь модулирующее влияние на функционирование преносчика.

2. Буметанид-чувствительный транспорт К* и На* (Ыа*,К*,С1~-котранспорт). Кинетические характеристики и

стимуляция гиперосмотическим сжатием клеток Ыа+,К+,С1"-котранспорт был обнаружен во многих типах клеток (см. обзор 0'Сгас1у е! а1. , 1987). Критериями существования в клетке именно этой ион-транспортирующей системы являются: 1) способность транспорта Ыа+, К+ и С1~ ингибироваться диуретиками; 2) взаимозависимость транспорта каждого из трех ионов от концентрации двух других. Практически во всех типах тканей, где был обнаружен Иа+,К+,С1~-котранспорт, он обладал свойством активироваться гиперосмотическим сжатием клеток. В таблице представлены величины скоростей буметанид-чувствительных потоков калия и натрия в на-тивных эритроцитах крысы в контроле и при гиперосмотическом сжатии клеток. Как видно, нетто потоки как К+ так и Ыа+ направлены из клетки и их скорости примерно равны. Зависимости скорости бу-метанид-чувствительного входа К* от концентраций К+ и Ыа+ в среде имели вид гиперболы (рис. 8). Гиперосмотическое сжатие не влияло на величины Кт, которые составляли приблизительно 1 мМ для калия и 15 мМ для натрия. Максимальная скорость транспорта К+ в гиперосмотической среде увеличивалась примерно вдвое по сравнению с контролем. Увеличение Ушах при неизменном значении Кт в сжатых клетках может отражать увеличение как количества молекул активного транспортера в мембране, так и скорости транслокации переносчика через мембрану.

Зависимость скорости входа К* от концентрации С1~ в среде

10

20 30 40 50 60 70 80 Концентрация иона, мМ

100

• К + ---A--- Na+-

СГ

Рис. 8. Зависимости буметанид-чувствитель-ного входа К+ в эритроциты крысы от концентраций К*, Na+ и С1' в гиперосмотической среде инкубации. Концентрации К+, Ыа+ или С1" в средах варьировали за счет экви-молярного замещения КС1 или Nací в среде на хлорид холина, а хлорид-аниона на тарт-рат-анион.

инкубации при фиксированном мембранном потенциале имела вид сиг-моиды (рис. 8), величина Кт для С1~ составляла приблизительно 75 мМ. .Полученная нами сигмоидная зависимость скорости котранспорта от концентрации С1~ согласуется с полученными ранее данными о том, что стехиометрия Na+,К+,С1~-котранспорта составляет 1:1:2. Именно такое соотношение котранспортируемых ионов было зарегистрировано ранее в клетках асцитной опухоли (Geck et al., 1980) и почечного эпителия MDCK (Saier et al., 1984). С другой стороны, подобная сигмоидная зависимость между активностью котранспорта и концентрацией С1~ может являться указанием на кооперативный характер связывания С1~ переносчиком.

Скорость выходного потока калия, чувствительного к буметани-ду, не зависела от концентрации Na+ и С1" в среде инкубации.

Полученные результаты позволяют предположить, что в эритроцитах крысы присутствует Na+,К+,С1~-котранспортирующая система. В пользу этого предположения говорят следующие факты:

1) ингибирование транспорта К+ и Ыа+ буметанидом; 2) цис-стимуля-ция буметанид-чувствительного входа калия натрием и хлоридом; 3) стимуляция буметанид-чувствительного транспорта К+ и Ма+ гиперосмотическим сжатием клеток.

На рис. 9 представлены зависимости скоростей буметанид-чувствительного транспорта калия от концентраций внутриклеточного К+ и Ыа+ (к+1 и Ыа+!) при гиперосмотическом сжатии клеток (в условиях изоосм9>са зависимости были аналогичными, отличаясь лишь меньшими скоростями транспорта). Как видно, максимальная скорость входа К+ наблюдалась при физиологических концентрациях К+ и Ма+ в клетке. Уменьшение концентрации как Ыа+1, так и К+! приводило к снижению скорости входа К+, причем в клетках, не содержащих К+, вход отсутствовал вовсе. Буметанид-чувствительный выход К+ полностью отсутствовал в клетках, обедненных по Иа+ ([Ыа+ ^] < 5 ММ), и резко увеличивался в интервале концентраций клеточного На+ от 5 до 10 мМ. Последующее постепенное снижение скорости выхода калия, очевидно, связано со снижением концентрации этого катиона в клетке. Таким образом, существует цис-стимуляция натрием бумета-нид-чувствительного транспорта калия: Ма+0 активирует вход, а Ыа+1 активирует выход калия.

Нам не удалось зарегистрировать буметанид-чувствительного входа Ыа+ в эритроциты ни при одном из указанных на рис. 9 соотношении [К+]!/[Ыа+](.

Результаты, представленные на рис. 9 демонстрируют, что Ыа+,К+,С1"-котранспортер способен функционировать в несопряженном режиме: в клетках, обедненных по Ыа+, входной буметанид-чувствительный поток К* не сопряжен ни с выходом К*, ни со входом Ыа+. Возможность работы переносчика в несопряженном режиме обсуждалась

Внутриклеточная концентрация, мМ пользуя нистатин.

ранее Канессой и соавт. (Canessa et al. , 1986).

Как видно из таблицы, в нативных эритроцитах при физиологических концентрациях Na*, К* и С1~ в инкубационной среде бумета-нид-чувствительный вход натрия отсутствует как в контроле, так и при гиперосмотическом сжатии клеток. Ранее было показано, что параллельно с нетто Na*,К+,С1"-котранспортом в эритроцитах человека (Dunham et al., 1980, Brugnara et al., 1986) и утки (Haas et al., 1982, Lytle et al., 1986) существуют Na*/Na+- и К+/К+-обмены, представляющие собой парциальные реакции Na+,К+,С1~-котранспорте-ра. Отсутствие сопряжения входных потоков Na+ и К+ в эритроцитах крысы можно объяснить, предположив, что входной поток К+ обусловлен реакцией К+/К*-обмена, в пользу этого говорят следующие экспериментальные факты: 1) вход калия абсолютно зависим от внутриклеточного калия (рис. 9); 2) преобладание входа К* над входом Ыа+ эквивалентно преобладанию выхода К* над выходом Na+ (таблица).

Ранее было показано, что в эритроцитах утки К+/К+-обмен

Таблица. Буметанид-чувствительные потоки К+ и Na+ в нативных эритроцитах крысы

т

Условия Буметанид-чувствительные потоки (ммоль/л клеток в час)

К+ Na+

Вход Выход Нетто Вход Выход Нетто

Йзоосмос 0,86 ± 0 18 1,72 ± 0,34 -0,86 0,02 ± 0,05 0,86 ± 0, 14 -0,84

(340 МОСМ)

Гиперосмос 1,91 ± 0 26 7,84 ± 1,28 -5,93 0,01 ± 0,05 3,52 ± 0, 58 -3,51

(640 МОСМ) | |

_I_I_:_

Примечание: Нетто потоки рассчитывали как разность входного и выходного потоков катиона. Данные представлены как М ± т, полученные из 3 параллельных измерений.

стимулируется внутренним Na , хотя сам Na при этом не транспортируется (Haas et al. , 1984, Lytle et al.,1986). Для объяснения этого факта Литлом и Мак Манусом была предложена модель, согласно которой реакция катионного обмена осуществляется полностью загруженным переносчиком (Lytle, McManus, 1986). Наши экспериментальные данные также говорят в пользу такого предположения: хотя буметанид-чувствительный вход Na* в эритроциты крысы отсутствует, внешний Na+ стимулирует вход К* в клетки.

Суммируя полученные нами данные, можно предположить, что бу-метанид-чувствительная система в эритроцитах крысы

(Na+,К+,С1~-котранспорт) может функционировать в 3 различных режимах: однонаправленный сопряженный транспорт Na+! и K+j из клетки; Na+0- , Na+j- и С1~0-зависимый К*0/К*х-обмен; однонаправленный несопряженный транспорт К*0 в клетку (рис. 10). Гиперосмотическое сжатие эритроцитов активирует все три режима работы переносчика.

Рис. 10. Режимы функционирования буметанид-чувствительной системы транспорта К* и N8* в эритроцитах крысы. 1) N8*0,N8*],С1~0-зависимый К+0/К*4-обмен; 2) сопряженный транспорт и N8* [ из клетки; 3) несопряженный транспорт К*0 в клетку в условиях обеднения цитоплазмы натрием ([Ыа+],<5 мМ).

Из таблицы видно, что при физиологических значениях концентраций Na+, К* и СГ в клетках и среде инкубации, переносчик генерирует нетто поток Na+, направленный против его концентрационного градиента. Т.е. Na+,К+,С1"-котранспортер осуществляет вто-ричноактивный транспорт Na+, что согласуется с представлениями о движущей силе Na+,К+,С1"-котранспорта как разности химических потенциалов транспортируемых ионов (Haas et al., 1982).

3. Нетто-потоки катионов через мембрану эритроцитов в условиях гиперосмотического сжатия Помещение эритроцитов крысы в гиперосмотическую среду (640 мОсм) вызывает быстрое уменьшение содержания клеточной воды на 25%, после чего объем клеток остается неизменным в ходе дальнейшей инкубации в течение 2 часов, т.е. восстановления объема в данном случае не регистрируется (данные представлены в диссертации) .

Рис. 11. Вклады различных ион-транс-портирующих систем в суммарные потоки К* и Ыа+ через мембрану эритроцитов крысы в условиях гиперосмоса. □

Диффузия Г" 1

Ка/Ка-оСмеп

ШЯ

Ма,К,С1—котранспорт N.1 -н;н(н

Вход К + Вход Na*

Как мы выяснили, гиперосмотическое сжатие эритроцитов крысы сопровождается активацией ион-транспортирующих систем -Na*/Na*-обмена (ЕХРА-чувствительного транспорта Na*) и Na*,К*,С1~-котранспорта (буметанид-чувствительного транспорта К* и Na+). Однако, движение ионов и воды через мембрану в данном случае не компенсирует уменьшения объема эритроцитов. На рисунке 11 представлены вклады различных ион-транспортирующих систем в величины суммарных потоков К* и Na* через мембрану эритроцитов крысы в гиперосмотических условиях. На рисунке видно, что выходные потоки ионов значительно превышают входные, т.е. нетто потоки ионов калия и натрия направлены из клетки наружу, что должно приводить к еще большему сжатию эритроцитов. Полученные данные иллюстрируют различие между объем-активируемыми и объем-регулирующими системами ионного транспорта, отмеченное ранее в других типах клеток (Parker, 1993).

ВЫВОДЫ

1. Гиперосмотическое сжатие эритроцитов крысы приводит к активации Na*/Na*-обмена, по-видимому осуществляемого изоформой NHE-1 Na*/H*-обменника и ингибируемого EIPA (5N-3TwlH3onponRnaMH-лоридом).

2. Na*/Na*-обмен осуществляется только в присутствии инов С1~ с внешней стороны мембраны и аллостерически активируется внутриклеточными ионами Na*.

3. EIPA-чувствительная система может генерировать нетто поток Na* в любом направлении в зависимости от соотношения концентраций Na* внутри и снаружи клетки.

4. Получены данные, свидетельствующие о влиянии реакций фос-

форилирования-дефосфорилирования на функционирование Na+/Na+-обмена . Подавление активности фосфопротеинфосфатазы типа РР2А приводит к дополнительной активации Na+/Na+-обмена при гиперосмотическом сжатии эритроцитов крысы.

5. Получены данные, указывающие на существование в эритроцитах крысы системы Na+ ,К+ ,С1~ -котранспорта, осуществляющей вторич-ноакивный транспорт Na* и функционирующей в 3 различных режимах: однонаправленный сопряженный транспорт Na* и К+ из клетки, К+/К+-обмен и однонаправленный несопряженный транспорт К+ в клетку.

6. Системы Na+/Na+-обмена и Na+,К+,С1~-котранспорта не способны участвовать в восстановлении объема эритроцитов крысы при гиперосмотическом сжатии, т.к. активация этих ион-транспортирую-щих систем не приводит к генерированию нетто потоков Na* и К* в клетку.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Orlov S.N., Kolosova I.A., Cragoe Е.Э., Gurlo T.G., Mongin A.A., Aksentsev S.L., Konev S.V. Kinetics and peculiarities of thermal inactivation of volume-induced Na+/H+-exchange, Na+,K+,C1~-cotransport and K+,C1~-cotransport in rat erythrocytes. Biohcim. Biophys. Acta. 1993. V.1151. P.186-192.

2. Orlov S.N., Sen C.K., Kolosova I.A., Bernhardt J., Hanninen O., Buhler F. Evidence for the involvement of G proteins in the modulation of Z2Na and 4SCa fluxes in myogenic L6 cells and aortic smooth muscle cells. Biochem. Biophys. Res. Com. 1993. V.191. No 3. P.802-810.

3. Орлов С.Н., Кузнецов С.Р., Колосова И.А., Макаров В.Л. Ка+/Н+-и №а+ /Иа""" -противотранспорт в эритроцитах человека, кролика и крысы: доказательства существования двух независимых

ион-транспортирующих систем. Биохимия. 1994. Т.59. вып.5. С.639-647.

Ц.^Г