Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние адриамицина и менадиона на агрегацию тромбоцитов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние адриамицина и менадиона на агрегацию тромбоцитов"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

На правах рукописи . УДК 612.111.7

ХУАН Боюй

ВЛИЯНИЕ АДРИАМИЦИПА И МЕНАДИОНА НА АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ •

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата-биологических наук

Минск - 1992

Работа выполнена на кафедре биофизики физического факульто Еелгосуниверситета, Минск

Научный руководитель - кандидат биологических наук

Самаль А.Б.

Официальные оппоненты - доктор биологических паук,

профессор Мажуль 13.М.,

кандидат медицинских наук Иванова II.С.

Ведущая организация - Институт биоорганической химии

Академии Наук Беларуси

Защита состоится "77" Ше^-Я 1992 г

. в У7ч

часов на

заседании специализированного СЬвета Д 006.013.01 по зашите докторских диссертаций по специальности "биофизика" при Институте фотобиологии АН Беларуси по адресу: 220733, г. Минск, ул. Скорины 27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии АН Беларуси.

Автореферат разослан

Ученный секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

Институт фотобиологии Академии наук Беларуси,11

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Адриамицин является антрациклиновым , нтибиотиком, который широко используется для лечения- опухолей, организме действию лекарственного соединения подвергаются ромбоциты - клетки крови, играющие ключевую роль в механизмах ромбообразования. Тромбоцитам отводится важная роль в ироцео-ах метастазирования. Поэтому важно знать реакцию тромбоцитов а действие адриамицина. Поскольку этот вопрос, изучен недоста-очно, то исследование, направленное на выяснение эффекта влия-ия адриамицина на функциональную активность тромбоцитов и оп-еделение механизма, посредством которого антибиотик изменяет грегацию тромбоцитов, представляется весьма важным. Изучение рирод:; взаимодействия адриамицина с тромбоцитами может дать ' .ополнительну.ч информацию о механизмах действия адриамицина на летки. Кроме тою, :» настоящее время механизмы, регулирующие [грегационную способностьостаются невыясненными. В этой связи жтуально получение дополнительных дачных, касающихся процессов [грегации и'дезагрегации тромбоцитов.. Новая точка зрения предлагает участие активных форм кислорода ./АФК/ в регуляции аг-югацйонн.ой способности тромбоцитов /Самаль и др.,1990; Del 'ricipe et ai.,1935/. В этой связи, Исследование функциональ- ; [ой активности тромбоцитов при действии адриамицина и менадиона ■ соединений, усиливающих образование свободных радикалов кис-юрода, валено как для установления роли активных форм кислорода i механизмах агрегации, тше и для понимания механизмов дейст-шя адриамицина й менадиона на клетки.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в иссле-совании агрегации тромбоцитов при действии адриамицина и мена-щона и выяснении участия АФК в регуляции агрегационной способ-юсти тромбоцитов. Для достижения поставленной цели решались :ледующие задачи:

1. Исследовать влияние адриамицина и менадиона на агрегацию тромбоцитов под действием агрегантов, запускающих различные пути жтивации. . '•

2. Изучить действие адриамицина и менадиона на агрегацию тромбоцитов в' присутствии перехватчиков АФК.

3. Установить взаимодействие адриамицина с компонентами мембранных систем тромбоцитов и определить место его локализации. '

4. Изучить редокс - системы плазматической' мембраны тромбоцитов и их активацию менадионом и адриамицином.

5.. Исследовать влияние экзогенного пероксида-водорода на агрегационную способность тромбоцитов.

6. Установить участие пероксида водорода в процессах, опосредованных действиями адриамицина и менадиона; и его роль в процессах ингибирования и агрегации тромбоцитов.

Научная новизна работы. Проведено исследование влияния адриамицина и менадиона на агрегацию тромбоцитов под действием агрегантов, запускающих различные пути активации. Установлен ингибирующий эффект адриамицина и менадиона на агрегацию тромбоцитов, вызываемую слабыми индукторами,и его отсутствие па агрегацию тромбоцитов, вызываемую сильными индукторами и любыми двумя слабыми индукторами. Показано,-что адриамицин не прони-'кает внутрь тромбоцитов,- а связывается с плазматической мембра-нбй, локализуясь преимущественно в ее липидном компоненте. Пог-казано;. что в плазматической мембране тромбоцитов имеются редокс системы, способные восстанавливать феррицианид калия и окислять НАДН. При действии адриамицина и менадиона происходит их активация; Установлена общность действия на функциональную активность тромбоцитов менадиона, адриамицина и пероксида водорода.

.' Практическая значимость работы. Диссертационная работа выполнялась в рамках Республиканской научно-технической программы по онкологии /69.01.р/. Полученные результаты вносят вклад В установление механизмов действия адриамицина и менадиолй на клетки, выявляют в их эффектах роль пероксида водорода, а таюке развивают представление об участии в РбгУЛЯ11ии йгрегацио-нной способности тромбоцитов. Результаты, свидетельствующие о снижении функциональной 'активности тромбоцитов при действии адриамицина, могут быть полезными при терапии метастазируюших опухолей.

Апробация работы.■ Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на 5-й конференции молодых ученых "Биофизика

и биохимия клеточных процессов"/Минск, 1990/-, Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение"/Москва,1992/, научных семинарах кафедры биофизики Белгооуниверситета /Минск, 1990,1991/,'совместном заседании лабораторий Института фотобиологии АН Беларуси /Минск, 1992/.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 3 печатные работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из обзора . литературы /глава 1/, методической части /глава 2/, изложения . полученных результатов и их обсуждения /главы 3,4/, выводов и списка литературы, содержащего 100 ссылок. Полный объем диссертации составляет 121 страницу, включая 37 рисунков, и 1 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы задачи исследования.

В обзоре литературы рассмотрены следующие .вопросы: 1/ биохимические механизмы регуляции структурно - функциональной активности тромбоцитов, 2/ участие пероксида водорода в регуляции функциональной активности клеток и ферментов, 3/ взаимодействие адриамицина с клетками крови, тканями, природными и искусственными мембранами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реактивы: . В работе использовали АДФ.НАДН, пероксидазу корневищ хрена /ПКХ/ - "¡ieanal"/BIIP/, каталазу, арахидоновую кислоту, трипановый синий и маннит - "Sigma''/США/,.акридиновый оранженый - "Aldrich.Chém.Com.Inc. "/Англия/, ионофор А23187 -" с albi ochem"/США/, адриамицин - "Фармиталия Карло Эрба"/Италия/, аспирин - "Bayer"/ФРГ/, 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен/ДФГГ/ -"Serva"/ФРГ/, тромбин - Каунасское объединение медпрепаратов. > Остальные используемые в работе реактивы были "Реахим"/СССР/ квалификации х.ч.

Средн. В работе использовали следующие фосфатно-сольвне Зуферы. А. Буфер Дюльбекко: 137 мМ fjaCl; 2,7 мМ KCl; 8,7 мМ UagHPO^ 1,48 мМ КН2Р04; pH 7,4. Б, Буфер Дюльбекко с Са2+:

' 137 мМ NаС1; 2,7 мМ КС1; 5 ыМ.Иа'2НГ04; 1,5 мМ КИ2Р04; 1 мМ СаС12; рН 7,35.

Объекты исследования. Объектом исследования являлись'тром боциты человека. Обогащенную тромбоцитами плазму /0Т11/ получал консервированной с раствором Тлюгицир" донорской крови центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Б 0Т11 коицен-трация тромбоцитов составляла 2-4*10® кл/мл.

Отмытые от плазмы тромбоциты получали следующим образом. ОТП закисляли ИС1 до рН 6,5, разливали в несколько силикониро-ванных пробирок вместимостью 10 мл и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин для'осаждения тромбоцитов. Еестромбо-цитарнуга плазму выливали и к осадку тромбоцитов в каждую про-, бирку добавляли 0,5-мл ФСБ без Са^+ . Содержимое перемешивали и сливали в одну пробирку. Полученную -суспензию клеток центрифугировали при. 3000 об/мин в течение 10 с для удаления эритроцитов и лейкоцитов. Затем суспезию тромбоцитов переливали в другую пробирку'и вновь центрифугировали-при 1500 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а к осадку добавляли 1 мл ФСБ без Са^+. После осторожного перемешивания получали разномерную взвесь тромбоцитов. Выделение проводили при комнатной температуре.

Методы исследования. Спектры поглощения тромбоцитов, адр мицина, ДФГТ, пирена и триптофана измерены на спектрофотометре Зресолй иУ УХЗ/ГДР/. Учет светорассеяния в спектрах логлонюни суспензии тромбоцитов проводили по методу "Двойного логарифмического масштаба" /0ксенкруг,1Э73/.

Спектры флуоресценции и возбуждения записаны на слектро-флуориметре ЭШ-4800 /США/. Ультрафиолетовые спектры флуфюсп нций тромбоцитов и райгворов триптофана исследовали при возбуж дении длиной волны 296 нм, а регистрировали'при 330 нм. Флуоресценцию ДФГГ и пиреча возбуждали светом с длинами волн 360 и и 320 нм,.а регистрировали при 430 нм и 390 нм, соответственно Концентрация тромбоцитов в исследуемых суспензиях составляли 107 кл/мл, что соответствовало 0,2 оптической плотности при 2£ нм.

Для установления в тромбоцитах явления переноса энергии с белков, связанных тромбоцитами ДФГТ и пирена на адриамицин вое

С

ользовались методическим подходом, описанном в работе /0г1ПГ1п, 986; Фролов,1989/.

Тушение флуоресценции белков тромбоцитов адриамицином с . четом эффекта экранировки определяли согласно /Добрецов,1989/.

Жизнеспособность тромбоцитов определяли с применением 0,1% рипанового синего /Адаме,1983/. ■

Для определения редокс-активности тромбоцитов измеряли в'осс-ановление непроникаюшего акцептора электронов феррициапида ка-:ия в суспензии клеток в присутствии НАДД потенциомбтрическим ¡етодом /Лукьянова,1982/.

Тушение флуоресценции адриамицина Си012 по методу /пирои-^¿аппе,1989/.

Исследование агрегации тромбоцитов проводили методом све-•орассе^ния с помощью лазерного агрегомётра, в котором источником света слулил гелий-неоновый лазер ЛГ-78 с длиной волны 632,8 !М. Приемншсом света служил ФЭУ-68. Кювета с исследуемой сус-[ензией клеток помещалась з термостатированную камеру. В провесе измерения суспензия тромбоцитов перемешивалась механиче-:кой мешалкой со скоростью вращения 300 об/мин.

Для исследования агрегации тромбоцитов непосредственно перед шытом 0,3-0,5 мл 0ТП добавляли в кювету, содержащую 1,7-1,5 мл росфатно-солевого буфера с Са2+. Количество тромбоцитов состав-шет обычно 3-4*10^ кл/мл. Агрегант добавляли в исследуемую гис'тему с помощью микропипетки. На диаграммной ленте регистрировалась кинетика изменения светопропускания клеточной суспензии в ответ на действие индуктора агрегации. Наблюдаемое после добавления агреганта.уменьшение светопропускания отражает иро-десс изменения формы тромбоцитов и образование псевдоподий, увеличение светопропускания - непосредствено процесс агрегации тромбоцитов, а последующее уменьшение светопропускания - процесс дезагрегации. Процесс агрегации характеризовали скоростью:

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ •

1. Взаимодействие адриамицина с тромбоцитами.

Для выяснения действия адриамицина на функциональную актив-

ность тромбоцитов было проведено сравнительное исследование агрегации тромбоцитов под действием АДФ, адреналина, тромбина, арахидоновой кислоты и ионофора Л23187. Такой выбор агреганто; охватывает все пути биохимической активации тромбоцитов, и позволяет рассмотреть возможное влияние адриамицина на различные, стадии процесса агрегации клеток.

Для изучения агрегации тромбоцитов в кювету, содержащую 1,5 мл ФСБ, добавляли 0,5 мл ОТП или отмытых тромбоцитов /конечная концентрация клеток 3-4*10^ в мл/, фиксировали исходный уровень светопропускания, затем вносили адриамицин, инкубировали, вводили индуктор агрегации и регистрировали изменение све-топропускания клеточной суспензии. Внесение адриамицина не изменяло исходного уровня светопропускания суспензии тромбоцитов Рис. 1 иллюстрирует действие адриамицина на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Тромбоциты, подвергнутые .действию адри; мицина изменяли форму и агрегировали друг с другом, но значительно слабее,чем' в контроле /отсутствовала вторая волна агрегац: Сходным образом адриамицин подавлял функциональную активность тромбоцитов в ответ на арахидоновую кислоту и адреналин.- Инги-бирующий эффект адриамицина зависил от концентрации антибиотик! и времени инкубирования с ним.

Однако, адриамицин в концентрациях, при которых ингибиров. ответ тромбоцитов на действие АДФ, арахидоновой кислоты и ядре^ налина/слабых индукторов агрегации/, не влиял на агрегацию трог боцитов, индуцированную тромбином и ионофором А23187 /сильных индукторов агрегации/.

Дальнейшие исследования показали, что тромбоциты, подвергнутые действию адриамицина и слабо реагирующие на введение* индуктора агрегации, при добавлении второго индуктора начинали агрегировать с такой же скоростью,как и в контроле. Было установлено, что 100$ агрегация тромбоцитов при синергическом дейс вии слабых агрегантов имела место, когда тромбоциты преинкубир! вались с антибиотиком меньше 40 минут.. При более длительном инкубировании тромбоциты слабо реагировали на введение вт.орого агреганта.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют о влияниигэдриамицина на агрегацию тромбоцитов, вызываемую слабы!

N

щукторами агрегации и об отсутствии эффекта при действии си->ных индукторов и синергизме слабых. Ипгибирование адриамици-)М агрегации тромбоцитов под действием АДФ, арахидоновой кис->ты и адреналина, запускающих разные пути активации тромбоцитов, сазывает на то, что механизмы, посредством которых инициируется 'орая волна агрегации, являются общими для слабых индукторов 'регации. Путь биохимических превращений,включаемый синерги-• ским действием агрегантов, выполняет как бы роль шунта и поз-)ляе'т обойти участок, нарушенный адриамицином. Отсутствие пикирующего эффекта адриамицина на тромбин-индуцированную агре-1цию тромбоцитов можно объяснить тем, что тромбин запускает не ¡лысо те пути, что и слабые индукторы, но и путь, который вклю-ются при синергичзжом действии агрегантов. Из совокупности шных следует, что при небольших временах инкубирования адриа-[цина с тромбоцитами наблюдаемое снижение агрегационной способ-юти тромбоцитов,скорее всего, связано с нарушением трансдукции [гнала лиганд-рецепторнсго взаимодействия. .

В литературе обсуждаются три возможных механизма действия [риамицина на клетки: изменение свойств плазматической мембраны [еток, интеркаляция молекул антибиотика ,в ДИК и повышение ин-¡нсивности образования АФК электронно-транспортными цепями. • юмбоциты - безъядерные метки. 13 этом случае . активность ад-¡амицина может быть направлена на изменение свойств плазмати-ской мембраны, мембран внутршслеточных гранул и на стимуля-:ю образования АФК.

В этой связи дальнейшие исследования были направлены па ус-шовление активации редокс-процессов в тромбоцитах при действии фиамицина, участия АФК в адриамиЦин-индуцированном ингибирова-[и процесса агрегации и определение места локализации адриами-ша в тромбоцитах. " .

Используя два непроникающих через плазматическую мембрану ¡агента - феррицианид в качестве акцептора электронов и ПАДИ • качестве донора'.электронов, были изучены редокс-свойства пластической мембраны тромбоцитов. В отсутствие клеток процесс ¡ферментативного восстановления форрицианида в присутствии НЛД11 ютекал медленно. В суспензии тромбоцитов скорость восстановил феррицианида увеличивалась, указывая на присутствие редокс-

систем в плазматической мембране тромбоцитов. При введении в суспензию тромбоцитов АДФ или тромбина каких-либо изменений в скорости восстановления феррицианида не происходило. Скорость восстановления феррицианида в присутствии 11ЛДН возрастала при добавлении к тромбоцитам адриамицина. Поскольку НАДИ и ферри-цианид не проникают через плазматическую мембрану меток, то . восстановление феррицианида свидетельствует о том, что адриами-цин активирует НАДН: феррицианид оксидopeдуктазы, принадлежащие плазматической мембране. Аналогичные результаты получены с использованием менадиона.

Таким образом, результаты данного исследования установлень что тромбоциты имеют редокс-системм в плазматической мембране, и Ьри действии адриамицина и менадиона присходит их активация.

Для того, чтобы выяснить, обусловлен ли эффект адриамициш генерацией АФК, было проведено исследование с использованием целого ряда специфических перехватчиков АФК.. В результате исследования установлено, что только каталаза и азид натрия изменяют действие адриамицина /рис.2/. Перехватчики 'ОН радикалов iià влияли на эффект антибиотика и, следовательно., их роль в ис,< ледуемом процессе не велика. Каталаза, специфический перехватчик Н2О2, защищала тромбоциты от действия адриамицина. Этот факт указывает на возможное участие пероксида водорода в инги-бировании функциональной активности тромбоцитов. . Присутствие азида натрия в инкубационной среде еще более усиливало ингиби-руиций эффект антибиотика и АДФ-индуцированпая агрегация сменялась' дезагрегацией. Азид натрия выступает в качестве ингибито каталазы и за счет этого эффект адриамицина, опосредованный пе ксидом водорода, усиливается. .Таким образом, данные полу^ешш с применением азида на?рия и каталазы свидетельствуют о том, что в адриамицин-индуцированпом ингибированйи агрегации тромбо цитов может участвовать пероксид водорода. . Адриамицин, являяс редокс-активным хинином,' активирует окислителыю-восс.тановител нне системы тромбоцитов и увеличивает образование супероксид-аниона, который при дальнейшем метаболизме приводит к образова ниюдругих активных форм кислорода. Однако, в регуляции arpera ционной способности тромбоцитов важная роль, по всей вероятное принадлежит пероксиду водорода. При длительном инкубировании

*ч

Рио.1. Влияние адриамицииа на ДДФ -индуцированное изменение све-топроиускания суспензии тромбоцитов.

1-контроль /в отсутствие ццриа-

мицина/. • 2,3-в присутствии адриамицииа в концентрациях 1,5x10"% и 3,3x10" М соответственно. Время инкубирования: 20 мин.

О 2 4 6 8 10 12 *,МШ1

Рис.2. АДФ-индуцированное изменение светопропускания суспензии тромбоцитов после 10 мин пре-инкубирования с адриамицином /1,2x10"%/ в отсутствие перехватчиков АФК /5/ и в присутст-вии:2-каталазы /0,1мг/мл/, 3-бензоата калия /1,3x10"%/, 4-ПКХ /0,1мг/мл/, 6-азида натри. /2,5x10"%/. с.

■ 1-контроль /в отсутствие адриам дана/.

:,мин

тромбоцитов с адриамицином, АФК, благодаря своей высокой химической активности, приводят к деструктивным изменениям в клетках, и они теряют способность реагировать на введение второго ■ агреганта.

Для того, чтобы определить проникает ли адриамициц внутрь тромбоцитов, были поставлены эксперименты по тушению флуоресценции адриамицина сиС12 . Тромбоциты инкубировали с адриамицином в течение часа, затем осаждали центрифугированием, надосадочную жидкость выливали, а клетки ресуспендировали в ФСБ. Регистрировали интенсивность флуоресценции, связанного тромбоцитами адриамицина, а затем в исследуемую систему добавляли порциями по 20 мкл СаО^ так, чтобы конечная концентрация изменялась в области 0-2"М. После каждой добавки наблюдалось уменьшение интенсивности флуоресценции адриамицина, которое происходило в результате образования нефлуоресцеруюшего комплекса между адриамицином и ионами Си2+ в основном состоянии. Об образовании комплекса свидетельствовало изменение спектра поглощения адриамицина в присутствии СиС1-.

7 +

Тушение ионами от флуоресценции связанного тромбоцитами адриамицина в модифицированных координатах Шторна-Фольмера показано на рис.3. При экстраполировании обо прямые пересекались с осью ординат в точке,равной 1. Из этих данных следовало, что

молекулы адриамицина полностью доступны тушителю. Поскольку 2 +

известно, что ионы схг не проходят через.липидный бислой, то полученные данные свидетельствуют о том, что адриамициц не проникает внутрь тромбоцитов. Следовательно, адриамицин находится с внешней страны клетки и связывается с плазматической мембраной, тромбоцитов.

Для установления возможного взаимодействии адриамицина с липидными и белковыми компонентами плазматической мембраны тромбоцитов использовали два флуоресцентных зонда:- ДФГТ и пиреа, а также была изучена собственная белковая флуоресценция тромбоцитов. Спектр поглощения'адриамицина в УФ области перекрывается со спектром поглощения белков. Поэтому при исследовании тушения собственной'флуоресценции белков адриамицином учитывали эффект экранировки. Основными признаками индуктивно-резонажнэго переноса энергий с ДФГТ и пирена на адриамицин были: уменьшение ин-

тенсивности флуоресценции ДФГГ и пирена при титровании ядриями-•цином, возникновение сенсибилизированной флуоресценции адриами-цина, появление в спектре возбуждения адриашцина дополнительных полос доноров в области 300-400 им.

Зависимость тушения флуоресценции ДФГГ, пирена и белков от концентрации адриамиЦина показана на рис. 4. Практически нулевое значение тушения! флуоресценции тромбоцитарных белкой свидетельствует о том, что переноса энергии с триитофанилов балков на адриамицин не происходит. Но всей вероятности, адриамицин не связывается с белками плазматической мембраны тромбоцитов. Данные по тушению флуоресценции ДФГТ и пирена свидетельствуют ■ о том, что адриамицин взаимодействует с липидннм компонентом. Таким образом, данные, полученные методами переноса энергии и тушения флуоресценции, свидетельствуют о том, что адриамицин не проникает внутри тромбоцитов, а связывается с поверхностной мембраной, локализуясь в липидном компоненте.

Представление в настоящей главе результаты свидетельствуют о том, что адриамицин связывается с плазматической мембраной тромбоцитов, активирует редокс-системы плазматической мембраны, стимулирует образование АФК и адриамшшн-индуцированноо ингиби-рование агрегации тромбоцитов опосредовано действием Н,^. Следовательно, активность адриашцина в тромбоцитах связана с его способностью усиливать образование АФК электронно- транспортными системами.

2. Влияние менадиона на агрегацию тромбоцитов.

Для установления участия АФК в регуляции агрегационпой способности тромбоцитов исследовали влияние менадиона на агрегацию тромбоцитов при таких же экспериментальных условиях, как и в опытах с адриамицином. Результаты исследования показали, что преинкубирование тромбоцитов с менадионом приводит к ипгибиро-ванию агрегации тромбоцитов, вызываемой слабыми индукторами агрегации. Эффект ингибирования зависел от концентрации и времени инкубирования и с увеличением времени инкубирования клеток с менадионом усиливался. При этом наблюдался такой инкубационный период, когда тромбоциты, показывающие низкую агрегацию к действию вводимого агрегаита, на добавление второго агреганта

Го

8

7

6

5

4

3 2

1

О 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 *10б 1/1Си2+1, м"1

Рис.3.

.2+

Тушение ионами Си, флуоресценции связанного тромбоцитами адриа-мицина /в модифицированных координатах Штерна-Фольмера/. Тромбоциты инкубировали с адриамицином в концентрации 2'10~^М в течение часа при комнатной температуре /2/ и при 37°С /1/.

1.4 1,2

1,0

0,8

0,6 0,4

0,2

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 «10'6 С, М Рис.4.

Тушение флуоресценции громбоцитарных белков /1/, связанных тромбоцитами пирена /2/ и ДФГГ /3/ молекулами адриамицина.

отвечали полной arpe идеей. При более длительном инкубировании тромбоцитов с менадионом тромбоциты переставали реагировать на введение и второго агреганта. Ииглбиругаиий эффект менадиона на тромбоциты исследовали в присутствии перехватчиков АФК /рис.5/. Перехватчики 'ОН радикалов практически не влияли на эффект менадиона.. Защитное действие оказывали каталаза и диэтилдитиокар-бамат - ингибитор СОД. Азид' натрия, как и в случае с адриами-цином, усиливал эффект менадиона. Снижение ингибируюшей активности менадиона в присутствии каталазы и'ингибитора СОД и усиление в присутствии азида натрия указывают на то, что в мена-дион-индуцированном ингибироваяии ответной реакции тромбоцитов на слабые агреганты немаловажная роль принадлежит пероксиду водорода.

3. Ингибирование агрегации тромбоцитов пероксидом водорода.

В настоящем параграфе ставилась, задача выяснить эффект экзогенного пероксида водорода на функциональную активность тром-бицотов при действии слабых и сильных индукторов агрегации при их синергизме, а также в присутствии перехатчиков АФК. В результате исследования было установлено, что пероксид водорода, добавленный, к суспензии тромбоцитов за несколько секунд до введения агреганта или одновременно с ним индуцировал дезагрегацию . тромбоцитарных агрегатов , образовавшихся в ответ на действие АДФ, арахидоновой кислоты /рис.6/, адреналина и NaF. С увеличением времени инкубирования суспензии тромбоцитов c'HgOg ичги-бирующий эффект пероксида водорода усиливался. В отличие от слабых агонистов тромбин и иоиофор кальция одинаково индуцировали агрегацию тромбоцитов как в присутствии, так и в отсутствие пероксида водорода, Ингибируюший и дезагрегирующий эффекты пероксида на агрегационную способность тромбоцитов не проявляются при синергическом действии АФК и адреналина.

При исследовании агрегирующего эффекта пероксида иаСагре-гацию тромбоцитов в присутствии перехватчиков АФК были получены следующие результаты ; Бензоат калия, маннит, тиомочевина, пероксидаза и этанол не влияли на Н^Ог, - индуцированную arpe-... гацию тромбоцитов при действии арахидоновой кислоты,Nа, адреналина и ДЦФ. Во всех опытах усиление эффекта fígOg имело место

Рис.5. АДФ-индуцироваяное изменение светонропускания суспензии тромбоцитов после 8 мин инкубирования с менадионом/БЧО-^М/ е отсутствие перехватчиков ЛФК/5/ и в присутствии: 2-диэтшщитио-карбамата/3*10"^м/. 3-каталазы /ОДмг/мл/, 4-бензоата калия /10~3М/, 6-азида натрия/10~3М/. 1-контроль/в отсутствие менадио

О 2 4 6 8 10 12 14 1;. мин

I'

Рис,6. Влияние Нг^ на арахидопат-

индуцированную'агрогаци тромбоцитов.

Концентрации:арахидоновой- кисло -0,01 мг/мл, Н202-2,5-10~4М.

в присутствии азида-натрия - ингибитора каталазы.

Таким образом, представленные в настоящей работе данные показывают, что менадион, адриамицин и пероксид водорода сходным образом изменяют агрегациоиную способность тромбоцитов, Адриамицин и менадион, являясь редокс-активными соединениями, активируют окислительно - восстановительные процессы в тромбоцитах. При активации редокс -' систем образуются АФК, в том.... числе и пероксид водорода. ИнгибирующиЙ эффэкт менадиона и ад-риамицина опосредован, действием пероксида водорода. HgOg участвует в регуляции активности тромбоцитов.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что адриамицин, менадион и пероксид водорода ингибируют агрегацию тромбоцитов, вызываемую слабыми индукторами агрегации, и не влияют на агрегацию тромбоцитов, вызываемую сильными индукторами /тромбином и ионофором А23187/. .

2. Антиагрегационный эффект адриамицина, менадиона и пероксида водорода отсутствует при синергйческом действии двух любых слабых индукторов.

3. Установлено, что адриамицин не проникает внутрь тромбо- . цитов, а связывается с плазматической мембраной, локализуясь преимущественно в ее липидном компоненте.

4. Показано, что в плазматической мембране тромбоцитов имеются редокс - системы, способные восстановливать феррицианид ■ калия и окислять НАДН. При действии адриамицина и менадиона происходит их активация.

5. ИнгибирующиЙ эффект адриамицина и менадиона опосредован действием пероксида водорода,

6. Пероксид водорода можно рассматривать в качестве эндогенного медиатора, участвующего в регуляции агрегационной активности тромбоцитов. .• G

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хуан Б., Самаль А.Б. Влияние адриамицина на агрегацию тромбоцитов in vitro // Тез.докл.-Республиканская конференция молодых ученых по биохимии и биофизике клеточных процессов. -1990. - с. 8.

2. Самаль А.Б., Хуан , Черенкевич С.II. Ингибировапие агрегации тромбоцитов адрйамициаом // Фармакология и токсикология /в печати/.

3. Самаль А.Б., Фролов A.A., Хуан Б. Определение локализации адриамицина в тромбоцитах методами переноса энергии и тушения (Ушуоресценции // Тез.докл. Всесоюзного совещания "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение", Москва, 1992.

Подписано к печати ¿6".Формат 60x84 1/16 Усл.п.л. 1,0. . Тираж 100 экз. Заказ №Ц05 Бесплатно

220080, Минск, ул. Бобруйская. 7. Отпечатано на ротапринте БГУ.