Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние адгезивных факторов на сохранение эмбрионов кур при замораживании

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние адгезивных факторов на сохранение эмбрионов кур при замораживании"

РГб од

УКРАШСЬКА АКАДЕМ IЯ АГРАРИЯХ НАУК

« * <

1НСГИТУТ ТВАРИНКЩТВА УААН

На правах рукопису

БЦЕЦЬКА Ганна Васюпвна

УЛК: 636.52/58.591.3.577.1

ВПЛИВ АДГЕЗИВНЙХ ФАКТОР 1В НА ЗБЕРЕЖЕННЯ ЕМВРЮН1В КУРЕЙ ПРИ ЗАМ0Р0ШУВАНН1

03.00.13 - ф1з!0Л0г1я лодини 1 тварин

АВТОРЕФЕРАТ дисертацп на здобуття ученого ступеня кандидата б1олог1чнш< наук

Харк1в - 1993

Работа виконана у вхддШ генетики 1 селекцП птахЛв 1нституту птах!вництва Украшсько! академП аграрник наук.

Науковий кер1вник: САХАДЬКИЙ Микола 1ванович, член.кор. УААН, доктор бюлоПчних наук професор.

0ф1щйн1 опоненти: БУГРОВ 0лекс1й Дмитрович, доктор 61олог1чних наук. ЕЕГУНОВ Генад1й Федорович, доктор 61олоПчних наук.

Пров1дне гпдприемство: Харгавськш державний уШверситет, кафедра ф1з1ологП людини 1 тварин, м. Харк1в.

Захист в1дбудеться " ^ддз рсЖу 0 № годин!

зас1данн1 спещал 1зовано'1 Ради Д.020.10.02. при 1нститут1 тварин-ництва УААН

(312120, м. Харк1в, п/о Кулиша).

3 дисертащею ыожна ознайомитися в библютец! шституту. Автореферат роз1слано " '■ИИС 1993 року.

Вчений секретар спец!ал1зовано1 Ради, кандидат бшлогпчних наук

Соловйова Т. Л.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуалыпсть теми. Одним з найбмьш перспективних метод1в збе-;ення генофонду с1льсъкогосподарських птах!в е створення крюбан-eMÖpioHiß. Така форма збереження генетичних pecypciB еконсшчно 1дна i над!йна, ослйльки вдаадае необххднють в утриманн1 знач-

0 погсшв'я малопродуктивно! пттц i виключена втрата ген1в у ¡ультат! 'ix дрейфу та 1нбридингу. Використання заморожених ембр1-в дозволяв одержати необх1дне потомство в одне поншпння. KpiM о, низькотемпературний банк eMöpioHiB е джерелом генетично') iH->Maiu'i при проведенн1 досл1джень в област1 кл1тинно1 i ген.но! iH-epii. Однак, до нищшнього часу не розробленх над1йна иетоди бокого заморожування eMöpioHiB nraxiB.

Ембрюни курей - складний об'ект для крюконсервування. В не-еженгй ю.лъкост1 'ix можна одержати is св1жознесених яець на по-няно ni3Hix стадиях розвитку - к:нця бласгули-початку гаструли.

1 ембрюни складаються з 40-60 тис. кл1тин, мають складну будо-значну гетерогенн!сть кл1тин, вар1абельн1сть структури. ¡стотяе

чення при цьому мають слаби м1жк.тптинн1 зв'язки (Дькжар 1978), остальки обробка кр!опротекторами i заморожування додат-о знижують стутнь адгезивност! та ioHHoro зв'язку MiK истинами гач П.Г., Курский Н.Е. и др. ,1981), що викликае розпад eMöpioHiB при охолодженнх до -30--40°С. Це заважало створенню ефективного оду KpioKOHcepBaui'i ембркшв.

Як правило, контроль за життездатн1стю eMöpioHiB проводять ме-ом культивування in vitro. 6 щлий ряд таких ефективних метод1в w D.А.,1955, Downie J.R., 1979, Robertson A., Gingle A.K.,1977). те, Ц1 методи обмежуються використанням ембр1он1в, прикршлених власно! жовтково i оболонки. В процес1 охолодження вона руйнуеть-(Сахацкий Н.И., Михайлик А.К., 1989). Це призвело до необх1днос-розробки методу культивування eMöpioHiB на чуж1й жовтков1й обо-Ц1.

Мета i завдання досл!джень. Мета uie'i роботи - вивчити д1ю ад-ивних фактор1в на морфолог1чну ц1л1сн1сть i вгошвання 1зольова-курячих eMöpioHiB при заморожуванн1.

Для цього передбачалось вир1шити так1 завдання:

1. Розробити cnoci6 культивування курячих eMöpioHiB, який ючае в1ддыення ix в1д власноi жовтково'! оболонки, транспланта-

i приживления до чужо! жовтково!- оболонки.

2. Дослхдити можливють стабШзацП м1жкл1тинних зв'язк1в

paHHix курячих ембр!он1в i запоб1гти Ix розпаду на окрем1 кл1тин при заморожувашп-вгдтавашп.

3. Вивчити морфологiUHy UiJliCHiCTb i ф1310Л0г1чну повнощн-HiCTb курячих ембр!он1в, заморозкених в разних умовах.

Наумова новизна. Встановлена можливють мимовхльного В1дд1лен-ня ембр1он1в Bifl власно! ковтково! оболонки в середовищах з п1дви-щеним bmIctom Са2+ i приживления до чужо! жовтково! оболонки п1сл5 короткочасноЗ витримки в розчинх, який мЮтить ЕДТЛ; розробленс оригдальний метод 'ix культивування in vitro на чуж!й жовтковп оболошЦ.

Вивчена (Мзшлог^чна повноц!нн1сть курячих ембр!он1в nicjii впливу адгезивних факторхв (р1зних конпентрацш ioHiB Са2"1" i слабо-кислих значень рН розчину вщцлення); встановленз. меж1 ix викорис-тання, як! не викликають порушень розвитку курячих ембр10н!в при плюсових температурах.

Встановлена можливють регуляцП MiuHocTi м1жкл1тинних зв'яз-KiB заморожуваних eM6pioHiB шляхом зм1ни концентращй ioHiB Са2+ та водневих ioHiB в крюзахисному середовищ. Експериментально пхдт-верджена дощльнгсть застосування захиского середовища i3 слабокислим значениям рН при !х крюгаэнсервацП; вперше одержан! життездат-Hi кл!тини paHHix курячих ембр1он1в (на стад1ях к1нця бластули-по-чатку гаструли), заморожених до -196°С в слабокислому середовшц. Показано, що найкраще ix збереження теля заморожування забезпечуе сумш KpionporeKTopiB 1з пропыенпгиколю, сахарози i декстрану.

Практичне значения робота. Одержат експериментаяънi даю. мо-жуть бути викорисган1 при вдосконаленн! технолог! I консервацП емб-piOHiB або cycneH3i'i ембрюнальних кл1тин nTaxiB до -196°С, а також для з'ясування механ!зм1в крхопошкодження гетерогенних багатокл1~ тинних структур i розробки методiB 'ix захисту. Одержання життездат-них юйтин при заморожуванн! до -196°С дае можливхсть накопичувати в низькотемпературних банках генетичну iH^opMaui© про ршасн! та зникакш в иди, породи i популяцп nraxiB для наступного використан-ня П в po6oTi по створенню nraxiB з заданиями генетичними параметрами методами ембршнально!, гаптинно! i генно'1 !нженер!!.

Розроблено метод культивування eMOpioHiB, який передбачае в1д-д!лення 'ix в1д власно"1 жовтково! оболонки з наступною транспланта-ц1ею i приживлениям до чуха'! жовтково! оболонки i забезпечуе нор-мальний розвиток 85%. eM6pioHiB (а.с. СССР N 1358872). Використання даного методу дозволяв проводити пошуков1 досл1дження в галуз! Kpi-

icuiorií, eM6pio- i KJiiTHHHOí 1нженерп, експериментально! eMópio-iri'i, токсиколог i i та шших галузях знань. Щ розробки також можут ти використан1 в учбовому прonecí э курсу ембр1ологП для студен-в б1олог1чних, зоо1нженерних та ветеринарних факультет1в вищих :бових заклад1в.

Реал1защя результаг1в дскшджень. Розроблен1 hobí i вдоскона-■hí в1дом1 техн1чн1 ршення по podoTi з рашйми ембрхонами nTaxiB [ з íx окремими кл1тинами використовуються в лабораторП kkíthhhoí [женерП в!дд1лу генетики i селекцП птах1в Гкституту птах1вництва ;ра'£нсько1 академП аграрних наук при виконанн1 планових досл1д-^нь по розд1лу 02.02. "Розробити методи одержання монозиготних ¡изнкшв i клонування птиц1" державно! программ "Фундаменталън1 >сл1дження" на 1991-1995 рр.

Апробащя роботи. Ochobhí положения дисертацП були представши! на сл^дуючих наукових конференциях í нарапах: Республ1канськ1й ivkobíü конференцП "Становице i перспективи розвитку бютехноло-.1 в тваринництвГ' (XapKiB, 1988); Робоч1й нарад! кацшнального .дд1лення М1жнародного союзу охорони природи на тему: "Кр1оконсер-шдя генегичних pecypciB" (Пущино, 1989); конференцП молодих уче-tx i acnlpaHTiB Украши по пгах1вкицтву "Актуальн1 проблеми пта-[вництва" (XapKiB, 1990); Республ1канськ1й науков1й конференцП 31отехнолог1чн1 дослдаення i перспективи íx розвитку" (JIíbíb, 390); Республ1канськ1й конференцП з м1жнародною участю "Проблеми /часного птахавництва" (XapKiB, 1991).

Публ1кац1я результатов досл1джень. За матер!алами дисертаци тублжовано ? po6iT, в тому числ! 1 авторське свхдоцтво на винах 1д.

Обсяг i структура роботи. Дисергащя викладена на 105 ctopíh-ах машинописного тексту, 1люстрована 13 таблицями i 14 малюнками. эбота складаеться Í3 вступу, огляду л1тератури, розд1лу власних эсл1джень, який включае MaiepiaJi i методи досл1джень, а також ре-/льтати досл1д1в з íx обговоренням, зак1нчення, bjichobkíb 1 прак-ячних рекомендащй, списку використано! лгтерагури, до якого вхо-ять 156 джерел, у тому числ1 88 1ноземних автор1в.

МАТЕРШ I МЕТ ОМ Д0СЛ1ДЖЕНЬ

Для експеримент1В використовували ембрюни, hkí вщЦляли на тад!ях kíhiw бластули-початку гаструли 1з св1жознесених яець. Видения ембрюн1В i подготовку ix до культивування проводили вш>-им (New D.A., 1955), a по-пм розробленим нами методом.

Розвиток eMöpioHiB в культур! ощнювали по таблицях Гамбургера i Гамальтона (Рагозина М.Н., 1975) гид б!нокулярним мжроскопом МБС-9 при збШшенн! х16.

Для заморолсування ембр!он1в вжористовували лабораторну установку ориПнально'! консгрукц!1. Температуру охолодження контролюва-ли в зразку-iMiTaTopi хром-капельовою термопарою, яку исключали до самописця ЖС4-003. Враховували гак! параметр« режиму охолодження як час плато кристал1зацП зразк!в та швидк!сть заморожування. 1н1-щаадю ль од оу творения здЛйснювали частками iHeio, як1 утворювались при короткочасному вдуванн! незначно! к1лькост1 Бологого повхтря в камеру для охолодження (Новиков А.Н. и др., 1982).

Заморожування проводили в в!дкритих алюмШевих контейнерах або на пластинках з пол1стиролу. Застосовували одно- i багатосту-п!нчаг1 режим и окол одлення. Kpi-озахисне середовще готузаяи на розчюп Говарда (Howard Е., 1953) або натр1й-адетатному 6уфер1 слЬ дуючого складу (в г/л): CH3C00Nax3H20 - 16.69; KCl - 0.3?; СаС12 -

0.34; НгО до 1 л. Як кр1опрогектор використовували прошленглжоль (ПГ) в к1нцев!й концентрацП в!д 5 до 50%. До складу експеримен-тальних захисних середовищ вводили гакож сахарозу (Biß 5.5 до 40Z) i декстран (1%). Введения кр1опротектор1в зд1йснювали стугпнчаго, i три етапи загальною тривал1стю 25 хвилин. Час експозицп в захисно-му середовишД, яке м1 стило крЮпротектор в к!нцев1й концентрацп. коливався BiA 5 до 180 сек залежно в1д вир1шуваного завдання.

Результат« заморолсування оц!нювали за к1льк1стю життездатнн; eMöpioHiB або за станом кл1тшшс>1 культури шсля 24 годин iHKyöa-ци.

Ц1л1сн1сть плазматичних мембран юптин визначали за прижиттв вим забарвленням клхтин 0.1% розчином трипанового синьо-о (Stocke: F.W. et. al., 1966). Фарбування фхксоваких npenapaTiB проводили re матоксшйном 1 еозином (Волкова 0.В., Елецкий Ю.К., 19Г ).

Визначення концентращ i BiTaMiHy A i каротине д1в в жовтк яець здшемовали експрес-методами (Сурай Б.Ф., Ионов И.А., 1990).

' Статистичну обробку результатов доелгджень проводили методо Стыодента-Ф1шера (Закс Л., 1976).

РЕЗУЛЬТАТ« ДОСЛ1ДЖЕНЬ

1. Рог робка технолог! i культивування ембрюнхв на чушй жовткешй

оболошй.

Дан1 досладження були викликан1 необх1дн1стю розробити мете контролю за життездатн1стю eMCpioHiB шсля розморожування. В попе

редн1х випробовуваннях було встановлено, що крЮконсерващя ембр1о-н!в з власною жовтковою оболонкою безперспектизна в наел 1 док 1! пош-кодження в процесп охолодження.

В1докремлення ембр1он1в гид власно! жовтково! оболонки в1домим способом зд1йснюеться з допомогою щитдв специально! конструкцП (Ооигпе J.R. ,1979). Цей спосйб надзвичайно трудом1сткий, в1дзнача-еться низькою ефективн!стю 1 призводигь до травмування ембрюнхв. При пошуках альтернативних методов була встановлена можлив1сть вЬ докремлення ембр1он1в в1д власно! жовтково! оболонки шляхом змши IX адгезивних властивостей у середовишдх з р1зною концентращею Са2+. Як виявилось, ембрюни здатн! мимов1льно в1докремлюватися в1д власно! жовтково! оболонки п1сля 30-хвилинно! витримки у физиологичному розчтй, концентращя Са2+ в якому перевишуе 1.5 мМ.

Завдання наступного еталу полягало в розробц1 методу стимуля-цП прикрепления ембр10Н1В до чужо! жовтково! оболонки п1сля в1док-ремлення в1д власно! чи заморожування. Проста процедура перенесения ембр1он1в з одно! жовтково! оболонки на !ншу не давала бажаного результату. Ембр1они, як правило, не прикршлювались до не), в результат! чого втрачали здатн1сть до розвитку. В наших доелгдженнях було встановлено, що прикрХплення !зольованих ембрюн1в до чужо! жовтково! оболонки досягаеться П1сля !х витримування у розчин1 Вер-сена 1 наступного забезпечення цельного контакту ембр!он!в з жовтковою оболонкою. Оптимальний час витримування ембр1он1в у розчжп Версена перед трансплантацию становив 20 хвилин. При цьому до 601 пересаджених ембршн1в нормально розвивались в культур!. Застосу-вання штучного живильного середовща зам1сть р1дко! фракцГ! бхлка яець, найчастше використовуваного в дан1й рол1 при культивуванн! емОрюнхв в1домими методами, дозволило гпдвищиги !х життездатнхеть до 83% (група III, табл.1)

Розроблеш прийоми вид1лення ембр1он1в з яець, в1Докремлення !х в1д власно! жовтково! оболонки, пересадження 1 приживления до чужо! жовтково! оболонки, культивування лягли в основу "Способу пересадки рантх ембрюгйв птах1в на чужу жовткову оболонку", визна-ного винаходом (а.с. СРСР N 1358872). Розроблений спехпб, дозволяе П1дтримувати ф1з1олог1чну повноц1нн1сть значно! к1лькост1 ембр1он1в (до 85%) у культур! протягом 1-2 д1б. Його застосування дало можли-в!сть проводи™ оцгнку життездатностч ембр1он1в у нормальних та екстремальних умовах, у тому числ1 пгсля заморожування.

В результат! культивування 5 пор1д курей (кая1форн1йська ему-

>

Таблиця 1.

Ефективн1сть культивування ембр1он1в з використанням б1лка яець та штучного середовшца за р!зних умов тдготовки до культивування.

Група облжу, Сере- Число

(СПОС16 дови- досл1-

стимуляцП те дже-

приживления них

ембр1он1в до e\;6pi-

жовтково! OHiB,

оболонки) шт.

К1ЛЬК1СТЬ ембр1он1в, як!

почали розвиток досягли 11-12-i стадП розвитку

шт. % шт. %

I контроль 61ЛОК 25 25 100 25 100

(без в1докр. в1д

власко! обол.) штучне 16 16 100 16 100

11 контроль б 1лок 23 7 30.4 0 0

(без стимудяцП

приживления) штучне 24 8 33.3 4 16

111 (розроблений б1лок 66 46 69.7 40 60.6

спос1б-експозищя

в p-Hi Версена штучне 30 29 96.6 25 . 83.3

гаста, юрловська голосиста, плимутрок б1лш, сусекс, падуан) було встановлено, ш,о вони мають pisHV здатн1сгь до розвитку в куль-Typi. Найвища життездаттсть (82-83%) спостер1галась у ембр1он1в, вид1лених з яець в!д курей пор1д кал1форн1йська смугаста 1 шимут-рок б1лий. У жовтку яець кая1форн1йських смугастих курей виявлено виший BMicT каротшо'1д1в (на 20Х), а в жовтку яець курей породи пл1мутрок б1лий - в1там!ну А (на 28Х) пор1вняно з даними показника-ми яець 1иших пор1Д курей. Каротиновди е попередниками BiTamny А, що дозволяв зробити припущення про единий механ1зм дП цих речовин ка стан ембр1он1в. Не виключено,' що п1дв1одений вм1ст цих речовин габезпечуе вишу резистентн1сть eMopioHiB в умовах in vitro. Очевидно, розроблений нами метод культивування ембр1он1в птоля в1дпов1д-ного допрацювання може використовуватися для прогнозу виводимосri

щь залежно в!д породно! належност1, якост1 !нкубац!йних яець та япих фактор1в.

Отже, в результата проведения дослхджень було розроблено ефек-гений метод культивування курячих ем6р!он1в, який включав в1док-;млення 1х в1д влас но! ! трансплантац1ю на чужу жовткову оболонку дозволяв проводити оц!нку життездатност1 ембрюнгв П1сля заморо-'вання.

Стаб1л1зац1я м1жкл!тинних зв'язк1в курячих ембр1он1в при глибокому охолодженн1.

В1домо, що при плюсових температурах посилити адгезивтсть [!тин можна шляхом зб!льшення концентращ! !он1В Са2+" та зниження I середовшца до певного р1вня (Архипенко В.И. и др., 1975). В да-)му дослЦжешй вивчалась д1я цих фактор1в на зм1цнення м!жкл1тин-[X зв'язюв курячих ембр!он1в при !х кр!оконсервацП.

о ,

а) Заморожування ембр1он!в при р1зн1й концентрацН ¡снпв Са" в середовивд.

В умовах нормотермп куряч! ембрюни на стад1ях К1нця бласту-[-початку гаструли малочутлив! до зм!ни кондентрад!! Са^+ в сере->вищ, яке використовують для вид1лення. Проте, як показали прове-ш нами досл1дження, за тривалого збер1гання !зольованих ембр!о-в в середовищ! (б1льше 2-х годин) !х здатн!сть до розвитку в льтур! залежала В1Д використовуваних концентращй юн!в Са2+. к, к1льк1сть ембрюнхв, як! нормально розвивались, була досить лика при концентрациях цих юн!в в середовищ! 1.5, 2.1 ! 3.0 мМ 0.5", 80.0 1 78.9% в1дпов1дно). Лише при зниженн! Са2+ до 0.9 мМ льк1сть ембрютв, що розвивалися нормально, зменшилась до 27%. вно, тривала !нкубац1я ембр1он!в в такому середовищ! призводить | зм1ни стану м!жкл1тинню( зв'язк!в, оск1льки значна частина емб-он1в розпадалась при перемщенн! "!х у камеру для культивування.

Зб1льшення концентрац!! !он!в Са2+ в середовивд больше 3.0 мМ явилось недоц1льним, бо висок! концентрацП цих !он!в створювали тодичн1 складност! при робот! з ембрюнами. Зокрема, ембрюни, дд1лен1 в1д жовтково! оболонки, - у розчин1 здатн! згортатись. При силен!й адгезивност! вони залишались в такому стан1 п1сля перене-ння на жовткову оболонку ! не розпластувались на !! поверхн!. Це важало нормальному розвитку ембр1он1в в культур!.

При охолодженн! до -40°С в середовшцах з идвищеним вм!стом н1в Са2+ (до 2-3 мМ) спостерагалось зб!льшення морфолог1чно! щ-

л1сност1 кл!тин (мал. 1), що, напевно, було результатом тдвищенн? !х зчеплення. Так, в середовшц, яке м1стило 2.1 мМ Са2+ ембрЮш не розпадались- в 42.8£ випадкхв, год1 як у середовшц з 3.0 мМ Са2н - в 68.7%. Здатшсть ембр1он1в до нормального розвитку п1сля замо-рожування в середовшц з б!льш високим вм1стои 1он1в Са2+ була та-кож вщою (33.3 и 43.71 в!дпов1дно). Однак, виявлена законом1рн1ст!

Заморожування до -40°С

Доля еибр!отв. %

Заморожування до -50 С Доля еыбрютв, %

2.1 а.о

Концентрацдя Са ", иМ

морфопог!чна збережешсть

- життездагшсть

Мал.1. Морфологпчна збережешсть 1 життездаттсть ембр1ошн

при заморожувант до -40 °С та -50° С в середовищ1 ¡з

_ г+

аростаючою концентращсю Са .

1.в

не збер1галась при глибшому заморожуваннь Маше вс1 ембрюни, заморожен! до -50°С, розпадались. Де дае п!дставу для висновку, щс Шдвищення концентрацП 1он1в Са2+ в захисному середовивц позитивнс д1е лише при охолодзкенн! ембр1он1в птах1в до -40°С. Проте, для шдвищення структурно! цтсност! ембр5он1в в ^тервап плюсових температур при тдготовщ !х до крюконсервац!!, а такозк в процес1 заморожування- в!дтавання дощльно застосовувати середоЕища, як1 м1с-тять 2.1-3.0 мМ Са2+.

б) Вивчення житгездатносхч ембр1он!в в аалежност1 в1д рН середовища вид1лення 1 охолодження.

В!домо, що в1дхилення в1д оптимальних значень рН можуть 1нду-кувати зм1ни р1зного ступеня зворотност1 (Костенко М. А., 1980). То-

/, щоб зменшити юльгасть екстремальних факторов при Шдготовщ «5р1он1в до заморожування, необх!дно Оуло передус1м визначити оп-имальне значения рН розчину для видглення, в якому ембргони не грачали здатносИ до нормального розвитку п1сля тривало! витримки. ля цього пор1внювали розчини з р1зними значениями рН.

Шсля витримки ембр1он1В в середовищ вид1лення (розчин Говар-а) протягом 1.5-2 годин при рН 6.0 значна к1льк1сть !х (82.2% при =101) збер1гала здатн1сть нормально розвиватись в культур!. Цей ок?зник практично не в1др1знявся В1Д збереженост1 ембр1ок!л, пе-енесених в культуру безпосередньо гпсля вид1лення. Шсля зм1ни рН ередовища до 7.2 лише 11.8% ембр1он1в здатн1 були нормально розви-атись в культурх, а при рН 5.6 - вс1 гинули. Тому, в раз!. необх1д-ост1 витримування ембр!он1в птах1в в середовшц вщцлення протягом ривалого часу, рН- даного середовища необх1дно п1дтримувати на р!в-1'6.0.

Життездатнхсгь ембрюнгв, яких вигримували в розчит з рН 5.6, ;алежала В1Д часу експозщП. Тх витримка протягом 30-ти хвилин в ■акому розчиш практично не впливала на здатшсть до нормального юзвитку. Це давало можливютъ припустите, що короткочасна д1я сла-¡окислих рН не е згубною для курячих ембр1он1в. Однак, при цьому [еобх1дно було встановити ме.*и слабокислих значень рН, як! можна шкористовувати для стабШзацп мхжгаптинних зв'язгав при заморо-суванн1. 3 щею метою ембрюни витримували в слабокислих розчинах з )Н в1д 6.0 до 5.0. Шсля витримки в розчинах з цими 'значениями рН ;мбр1они збер!гали здатн1сть нормально розвиватись, але вона р1зко знижуваяась у випадку застосування розчин!в з рН 5.3-5.0 (табл.2).

Таблица 2.

Розвиток ембр!о.н!в курей в запежностх в1д рН середовища вщдлення.

Клльгасть ембр1он1в

РН

эредовища|

посаджених в |як! почали розвиток|з нормальним розвитком культуру, шт. I шт. %, I шт. %

.0 (контроль) ■ 5.6 5.3 5.0

101 21 18 15

91

20 15 8

89.2+2.4 95.8+4.8 83.8+6.4 53.3+8.2 *-Р<0.01

83 17 9 2

82.3+2.4 77.5+4.3 50.0+4.7* 13.8+8.2**

**-В; 0.001

Вгдомо, що рН позакл1 тинного розчину впливае на адгезивн1 власти-вост! кл1тин шляхом зкани поверхневого заряду мембран. Тривала 1Н-кубац1я в слабокислих розчинах (рН нюкче 6.0), мабуть, призводить до в нутрхшньоюи тинного зрушення рН, п!д контролем якога знаходить-ся нормальна життед1яльн1сть юптин, або до руйнування кл1тинних мембран. Очевидно, що Ц1 процеси вхдбуваються тим швидше, чим нижче значения рН позакл!тинного розчину. Це давало п1дставу для висновку про доц1льн1сть застосовування розчшпв з рН вище 5.3.

Для того, щоб визначити оптимальне значения рН середовшца охо-лодження при низько температуря 1 й консервацП ембр10н1в, його зканю-вали в межах 6.0-5.4. Замородування проводили до -40 1 -50°С. Використання середовищ 13 вказаними значениями рН дозволяло значно зб1льшити вюид морфолог14но Шлих ембр1он1в (до 50-70%), проте в шлому 1хня життездатн1сгь була на низькому р1вн1 (16-20%). I т!ль-ки у випадку застосування середовища з рН 5.6-5.7 к1льк1сть життез-датних ембр1он1в була дещо вищою (33.3+11.8%). Це св1дчило про не-обх1дн1сть оптим1зацх1 складу захисного середовшца. Експерименталь-ним шляхом було всгановлено позитивний ефект при введешп до його складу сахарози 1 декстрану. Кранц результата одержан! при викорис-танн1 середовища з таким складом компонент: 5.5% проп1ленгл!колю, 7.0% сахарози, 1% дексграну в натр!й-ацетатному буфер! (рН 5.6). Використання даного захисного середовища (Е-1) дозволяло одержати до 75% морфологгчно ц!лих ембр!он!в. Значна частина з них збер^гала життездатн1сть 1 нормально розвивалась в культур! тпсля охолодження до -40 (49.9+9.61%) 1 -50°С (55.5+7.02%). Життездатн!сть ембр^шв значною м!рою залежала в!д швидкос-п !хчжолодження. Максимально показники збереження були одержан! при охолодженн1 з швщшстю 100-120 град/хв в чемпературнш зон1 вхд -8 до -50°С.

Температурний !нтервал -50—60°С був критичним при заморожу -ванн1 курячих ембр!он!в. В цьому штервад! р1зко знижувалась 1к морфолог1чна збережек!сть, вони майже втрачали життездатнд.сть -лише поодинок! ембр!они збер!гали "¿1 при охолодженнх до -60—70°С. При цьому зм1нювалась морфолог 1чна картина заморожено-в!дтанутих ембр1он1в. Вони вграчали пружн!сть, нерако мали тр!щини. Певно, при швидкому охолодженн1 в цьому !нтервал! не вдавалось уникнути внутр1тньокл1тинно1 кристалпзацП залишково! р!дко! фази.

Використання двохегапного режиму, який включае програмне замо-рожування до -40—80°С 1 наступив занурення в азот, дозволяло одержати до 80-100% морфолоПчно вдлих ембр1он1в, як!, проте, не розви-

зались в культур!. Фарбування шитин ембр1он1в трипановим сиьпм даю можлив1сть з'ясувати, що деяка частина з них мала пошкодження щтоплазматичних мембран. Особливий Стерео викликали клатини, що ¡е забарвлювались в1тальним барвинком. В ряд1 випадкгв к1льк1сть !х )уло значною (50-?0%). В1дсутн1сть явних дефекпв мембрани не вик-почала можлив1сть пошкодження киптин внутр1шньокл1тинним льодом. 1астково, в раз1 руйнування або зм1ни агрегатного стану б1лк!в ци-юскелету, юптини втрачали здатн1сть зм!нювати свою форму. При гьому, м1жкл1тинн! зв'язки могли збер1гатись, тим самим оабезпечую-ш високу морфолог1чну ц1Л1СН1СГЬ.

100%

80% -

60% -

40% -

20%

КШЬКЛСТЬ морфоло-пчно щлих eMdpio-

HiB

кшыасть незабар-влених кл1тин в eM6pioHi

-40 -50 -во -го -ео Мнцева температура програмного заморожування, С

Мал.2. Показники збереження ewfipiomB nraxiB у за — лежност; в1д програми ix охолодження за двохетапним режимом.

Щоб запоб1гти внутр1шньокл1тинн1й кристалхзащ. "i, була вивчена фективн1сть застосування вищих швидкостей охолодження, що досяга-ося'шляхом безпосереднього занурення зразк1в у р1дкий азот. Вико-истовували нове експериментальне середовище (Е-2), склад якого був озроблений на гпдстав1 модельних досл!д1в. В ньому м1стилося 20%' Г, 40% сахарози, 1% декстрану. Крюпротектори'були введен! в нат-!й-адетатний буфер (рН 5.6). Таке середовище забезпечувало одер-ання ст1йко! склофази. При його використашй б!льше н!ж у 60% ви-адк!в вдалось уникнути внугр!шньокл1тинно1 кристал!зац1!. Показник орфолог1чного збереження ембр1он1в в кращих випадках досягав 42%

(табл.3), проте ембр1они не виявляли ознак росту в культур!.

Таблица 3.

Вплив тривалостч експозицн ембр!он1в в експерименгальному захисному середовивд Е-2 на скл1ння л збереження 1х морфо-лог1чно! ц1л1сност1 при шввдкоиу охолодженн1 до -196 °С.

:-1---1

I I К1льк1сть ембр1он1в, |

| Тривал1сть |-* I-1--1

| експозицН, | | як! досягли ¡як! зберегли ц1л1сн1сть|

| хв. | заморо- | склофази | |

I I жених, |-т-)-1-1

I | шт. | шт. | 2 | шт. | . % |

I_1_I_1_I_I__1

60 12 0 0 0 0 90 12 0 0 0 0

120 12 6 50.0 5 41.6

150 12 7 58.3 3 25.0

180 12 8 66.6 О О

Як виявилось в наступних експериментах, причина цього полягала в низьк1й к!лькост1 ембр1ональних иптин, як1 зберегли життездат-Н1сгь при заморожуванн1 до -19б°С. Для визначення життездатност1 ембр1ональних та тин застосовували метод ¡штинно! культури. В дос-л1дах використовували суспенэП кл1тин, одержаних з ембр1он1в, заморожених за одно- га багатостушнчатим режимами. ГИсля 24-х го-динно 1 1нкубацП були виявлен1 киттездагн1 д1лянки, утворен! 3-5 прикр1пленими 1 розпластаними юп тинами. Морфолог¿чно вони не в!д-р1знялись в1д контрольних. К1лькють таких дглянок варшвала залеж-но в1д режиму заморожування, але не перевщувала 10 в однш культу-ральнш камер!.. Однак, наявн!сть життездатних кл!тин п1сля заморожування до -196°С св1дчить про те, що при в1дпов1дн1й оптим1зац1Т режимв заморожування-в1дтавання идлком можливо одержати 1х в 1с-тотно 61льш1й к1лькост1. Консерващя 1 накопичення в низькотемлера-турних банках ембр1ональних юптин в1д птиц! р1дк1сних 1 зникаючих пор1д дозволить використовувати '¡х при вир!шенн1 проблеми збереження генофонду сучасними методами шпгинно! та генноТ 1нженерП.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, що в!докремлення ембр1он1в в1д власно! жовтково! оболонки необх1дно проводити в сольовому розчин1, концентрад1я

О +.

ЮН1В Са*- якого складае 1.5-2.0 мМ. Перед трансплантац!ею на чужу жовткову оболонку ембр!они необхЦко витримувати протягом 20 хв. в

ьовому розчин!, який втщуе ЕДТА. При'використанна таких при-1в 96%. ембр1он1в прикршлтаться до чужо! жовтково! оболонки 1 1'х нормально розвиваються з куль тур 1 протягом 24-48 год.

2. Для вшЦлення ембр!он!в бажано використовувати сольовий роз-Говарда. При його використанн1 1зольоват ембр!они збер!гають

1тн1сть до нормального розвитку П1сля довго! " експозицП (2-3

3. Виявлена р1зниця в життездатност1 культивованих ембр1С>н1в в 1лежност1 в1д тдодно! надежность Найб1льи;а життездатнхсть спос-;р1галась у ембр1он1в курей ' порхд кал1форН1йська смугаста 1 пмутрок б!лий (з 5 вивчених). В жовтку яець, одержаних вгд курей IX пор1д, був виявлений ¡пдвищений вм1сг в!там1ну А або каротино-цв в пор1внянн1 з шшими вкзченими породами (юрл1вська голосио-': 1, сусекс, падуан).

Г) ,

4. Шдвюдення концентргцп Са- в захисному середовищ! до 3 мМ фияе гпдаищенио морфологхчно! д!л1сност1 1 життездатност1Г| лбрюшз курей т1льки при охолодженн! !х до -40°С. Позитивний тлив цик 1сшв на агдезивн1с?ь клгтин ембр1он1в втрачаеться вже эи заморожувачн1 до -50°С.

5. Показана принципова можлив:сть застосуьання слабокислих сере-' эвищ (рН 5.5) для крюконсервацн ембр!он!в курей. !х використан- • л дозволяе проводит« охолодження ембр!он1в до -50°С !з збережеН-ям високо"! морфолог^чно! цШснсют1 (до 77.7%) 1 життездатност! до 55.5Х). Заморожування до -196°С в таких. середовищах забезпечуе исоку морфслсПчну зберехек!~ть ембр1он!в (80-100% в раз! вико-истання багатоетапного режиму охолодження 1 42% - в рзз1 одно-тапного). При цьому окрем1 кл1тини ембрюнхв збер1гають житте-датн1сть, ш,о св1дчить про до'.пльк1сть проведения дослхджень по ; досконаленню режим!в "!х охолодження.

6. Краще збереження емОрюкш ;™рей Шсля кр!оконсервацП одер-ано при влкористанн! сумж >-:р; ;>протектор1в: 5.5% проп1ленгл1ко--; ю, 7% сахарози 1 1% декстралу.

Пракгичн? рекомендацп.

1. При проведенн1 досладжень з використанням рашпх ембр1он!в [тах1в у галуз! експеримеьтально! ембрюлогН, крюбюлсгП, ток--¡икологП, кл!тинно! та генно: !нженер1!, гцо зимагають в!докрем-юння !х ъгд власно! ! культивування на чудай жовтковш оболоиц! )екомендуеться використовувати "СпосЮ пересадки рашпх' ембр!он1в

- 16 -

nTaxiB на чужу жовткову оболонку" (а.с. СРСР N 1358872).

2. Кр1оконсерващю курячих ембр1он1в на стадП к1нця бласту-ли-початку гаструли доц!льно проводити в розроблених нами захисних середовищах Е-1 та £-2. Захисне середовище Е-1 забезпечуе охолод-ження ембр1он!в багатоступ1нчатим режимом (50-60 град/хв - до початку процесу кристал1зацП; 25-35 сек - тривал1сть витримування на плато кристал!защi; noTiM - 100-120 град/хв до -80°С i зану-рення'в азот), Е-2 - одноступ1нчатим.

Материали дисертацП onyöJiiкован! в таких работах:

1. Белецкая A.B., Сахацкий Н.И. Способ пересадки ранних эмбрионов птиц.- A.c. 1358872 СССР. Опубл. в Б.И., 1987,N 46.

2. Сахацкий Н.И., Белецкая A.B. Разработка методики выделения и приживления ранних куриных эмбрионов // Научн.-гех. бюл. УНИЮ1. - 1987,- N 22. - С.7-11.

3. Сахацкий Н.И., Михаилик А.И., Белецкая A.B. Особенности трансплантации куриных эмбрионов разного возраста // Тез. докл. Респ. науч. конф. "Состояние и перспективы биотехнологии в жи-

. вотноводстве". - Харьков, 1988. - С. 103-104.

4. Новиков А.Н., Олейник С.Т., Белецкая A.B. Влияние криопротекто-ров, углеводоБ на аморфизацию модельных систем при сверхбыстром замораживании // Рукопись Деп. в ВИНИТИ, 1989. - N65-86-B89.

5. Белецкая A.B., Михайлш^ А.И. Влияние компонентов защитной среды на устойчивость куриных эмбрионов к замораживанию // Тез. докл. науч. конф. "Актуальные проблеми птицеводства Украины", - Харьков, 1990. - С.10-11.

6. Б1лецька Г.В., Новиков О.М. 0птим!защя ioHHoro складу середовища при п1Дгоговц! paHHix ewöpioHiB курей до заморожування // Тез. доп. 1 респуб. наук. конф."Бштехнологгчн! досл!дження i

' перспективи 1х розвитку",- JlbBiB, 1990.- С.48.

7. Белецкая A.B., Новиков А.Н..Сахацкий Н.И. Замораживание куриных эмбрионов в условиях низких значений pH // Тез. докл. Укр. науч. конф. с междун. участием "Актуальные проблемы современого птицеводства",- Харьков, 1991.- С.37.