Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Влияние абиотических и биотических факторов на выживаемость и морфологию популяций листерий в объектах ветеринарно-санитарного надзора

ВАК РФ 06.02.05, Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

Автореферат диссертации по теме "Влияние абиотических и биотических факторов на выживаемость и морфологию популяций листерий в объектах ветеринарно-санитарного надзора"

На правах рукописи

ВЛАСОВ АРТЕМ АРКАДЬЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ АБИОТИЧЕСКИХ И БИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ И МОРФОЛОГИЮ ПОПУЛЯЦИЙ ЛИСТЕРИЙ В ОБЪЕКТАХ ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНОГО НАДЗОРА

06.02.05 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

~ 2 ЛЕИ 2070

Москва-2010

004615705

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Павлова Инна Борисовна

(ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Тартаковский Игорь Семенович (ФГБУ ИЭМ им. Гамалеи Мин. Здрав. Соц. Развития РФ)

доктор биологических наук, профессор

Светлнчкин Вячеслав Владимирович (ГНУ ВНИИВСГЭ РАСХН)

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский Государственный университет прикладной биотехнологии (МГУПБ).

Защита диссертации состоится ¿К- 2010 г. в «. » часов на заседании диссертационного совета Д 006.008.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, г. Москва, Звенигородское ш., д. 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.

Автореферат разослан

2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Юдина А.А.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время одним из современных направлений микробиологии является экология микроорганизмов, которая включает в себя раздел популяционной микробиологии, требующий глубокого понимания структурно-функциональных особенностей существования популяций различных микроорганизмов.

Изучению биологии, экологии, индикации и идентификации листерий посвящен целый ряд работ таких исследователей как Бакулов И.А. 1967, Меньшикова 1971, Бутко М.П. 1977, Шевелева С.А. 1999, Котлярова Г.А. 1989, Котляров В.М. 1999, Тартаковский И.С. 2002, Нитяга И.М. 2004 и другие.

В связи с участившимися случаями выявления возбудителя листериоза в объектах ветеринарно-санитарного надзора, в частности, в водоемах, кормах, продуктах питания, возникает необходимость детального исследования выживаемости и морфологических особенностей популяций листерий в указанных выше объектах.

В последнее время, наряду с психрофильными бактериями вида L. monocytogenes, свою экологическую нишу начинают занимать L. innocua. Как показывают последние исследования при выделении листерий из объектов окружающей среды, патологических и биологических материалов доля Listeria innocua часто составляет больше половины от общего числа видов листерий (Бакулов И.А., Егорова И.Ю. и др. 2009). Так, в период с 2006 по 2009 годы из пресноводной рыбы Иваньковского водохранилища листерии были выделены в 5,53 % проб, из них на долю L. monocytogenes приходилось 48 %, а на L.innocua - 52 % проб (Егорова И.Ю., Селянинов Ю.О. и др. 2009).

Особый интерес представляют данные о проявлении патогенных свойств L.innocua. Так, при постановке конъюнктивальной пробы на морских свинках со штаммами L.innocua, выделенными из свинины, говядины, сливочного

3

масла, была отмечена положительная реакция и зафиксирована гибель нескольких животных, во внутренних органах которых при микробиологических исследованиях обнаруживались L. innocua (Кольпикова Т.И., Котляров В.М. и др. 1998). Таким образом, авторы полагают, что штаммы L.innocua не могут относиться к непатогенным видам листерий, а наличие их в кормах и продуктах питания представляет опасность для животных и людей.

Учитывая вышеизложенное, исследования экологии популяций L.ínnocua, как одного из наименее изученных представителей рода Listeria, являются новыми и актуальными. Такого рода исследования будут способствовать изысканию способов предотвращения контаминации листериями продуктов питания, кормов для животных и распространению опасного патогена в окружающей среде.

Цель работы. Целью настоящей работы является изучение выживаемости и морфологии популяций L.innocua при воздействии абиотических и биотических факторов окружающей среды.

Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методические подходы к исследованию влияния абиотических и биотических факторов на выживаемость и морфологию популяций Listeria innocua.

2. Изучить выживаемость и морфологию популяций Listeria innocua в водной среде при различных температурных режимах (in vitro).

3. Изучить выживаемость и морфологию популяций Listeria innocua в молочных продуктах (in vitro).

4. Изучить выживаемость и морфологию популяций листерий в тканях листовых пластинок кормовой культуры овса.

5. Изучить процессы адгезии и колонизации Listeria innocua комбикормов.

6. Изучить влияние растворов кластерного серебра на выживаемость и

морфологию популяций Listeria innocua.

4

Научные положения, выносимые на защиту.

- выживаемость и морфология L. innocua при различных режимах температур в водной среде и молочных продуктах.

- методика исследования выживаемости и морфологии популяции L. innocua в тканях листовых пластинок растений с использованием метода сканирующей электронной микроскопии.

-морфология популяций L. innocua при существовании в тканях листовых пластинок овса и на поверхностях частиц комбикорма.

- механизм действия растворов кластерного серебра на морфологию популяций L. innocua методом сканирующей электронной микроскопии.

Научная новизна. С использованием метода сканирующей электронной микроскопии изучено влияние абиотических и биотических факторов на морфологию популяций Listeria innocua.

Экспериментальными исследованиями показано, что в водной среде при низких и отрицательных температурах существование популяций бактерии Listeria innocua обеспечивается образованием колоний и микроколоний, в которых бактерии погружены в межклеточный матрикс, формирующий на поверхностях покровы - биопленки различной толщины. Стратегия выживания листерий при различных температурах обеспечивается гетероморфизмом популяций с различными проявлениями L-трансформации, что расширяет возможности их персистенции в объектах окружающей среды. Показано, что в биокефирах, контаминированных Listeria innocua (in vitro), молочнокислые бактерии оказывают бактериостатическое действие.

Впервые разработана методика исследования выживаемости и морфологии популяции L. innocua в тканях листовых пластинок растений с использованием метода сканирующей электронной микроскопии. Показана способность Listeria innocua проникать через корневую систему в листовые пластинки кормовой культуры овса и персистировать в тканях растений. Установлена способность клеток листерий адгезироваться и колонизировать частицы комбикорма при различных температурных режимах.

5

Впервые методом сканирующей электронной микроскопии изучен механизм действия растворов кластерного серебра, ведущим фактором которого является повреждение клеточной стенки листерий. Установлено, что растворы кластерного серебра оказывают бактериостатическое действие на популяции листерий пока существует контакт между бактериями и растворами кластерного серебра, что подтверждено данными изучения реверсии клеток в исходное состояние.

Практическая значимость работы. На основании результатов экспериментальных исследований разработано «Методическое пособие по изучению влияния растворов различных химических агентов на морфологию популяций бактерий методом отпечатков с последующим исследованием в сканирующем электронном микроскопе», утвержденное отделением ветеринарной медицины РАСХН 11.05.2010, рекомендованное для специалистов биологических, ветеринарных и медицинских научно-исследовательских институтов.

Результаты исследований влияния абиотических и биотических факторов на выживаемость и морфологию популяций Listeria innocua показали необходимость проведения микробиологического мониторинга и контроля в таких объектах как вода, молоко, молочные продукты, зеленые корма и комбикорма для предотвращения распространения листерий в окружающей среде.

Апробация работы. Материалы научных исследований, представленные в диссертации, доложены на VII международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва 2008г.), на VIII международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва 2009г.), годовых отчетах аспирантов на Ученом совете ВНИИВСГЭ (2009, 2010), межлабораторном совещании научных сотрудников ВНИИВСГЭ 19.10.2010.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 6 работ, из них четыре в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 105 страницах машинописного текста, содержит два графика, таблицу и 33 рисунка. Список литературы включает 126 источников, включая 50 источников иностранной литературы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследования

Экспериментальная работа по теме диссертации проводилась в период 2007-2010 г.г. в лаборатории санитарной микробиологии ГНУ ВНИИВСГЭ. Работа являлась частью темы в программе фундаментальных исследований, направленных на изучение влияния экологических факторов на популяции листерий в некоторых продуктах животноводства (08.05.02.04.8.3).

В опытах использовали 48-часовую культуру Listeria innocua в S-форме из коллекции НИРГУНИИ питания РАМН, типичной по культурально-биохимическим свойствам. Для получения культур листерий в S-форме оптимальными являются мясопептонный бульон и мясопептонный агар с добавлением 1% глюкозы. В экспериментах использовали селективную среду PALCAM-arap и селективный агар для листерий фирмы «Merck». Для получения культуры в S-форме листерии культивировали при комнатной температуре (18-22°С) 48 ч. Для ускорения роста и развития популяций после экспериментов проводили подращивание культур при 37°С.

Для изучения морфологических особенностей популяций бактерий использовали метод сканирующей электронной микроскопии, дающий возможность изучать культуру не нарушая естественной архитектоники. С этой целью исследуемые пробы наносили на мембранные фильтры «Владипор» №№ 2-4, фиксировали парами 25%-го глутарового альдегида с последующим обезвоживанием в парах пропиленоксида или в восходящих концентрациях этилового спирта. Полученные таким способом препараты

7

помещали на медные подложки и напыляли ионами золота на установке «Hitachi Е-102». Электронно-микроскопические исследования проводили на микроскопе «Hitachi-800» со сканирующей приставкой «Hitachi-8010» при ускоряющем напряжении 75 кВ и инструментальном увеличении 1-15000.

Для изучения антибактериальной активности растворов кластерного серебра использовали метод последовательных десятикратных разведений взвеси листерий, содержащей 2x109 кл/мл. Исследуемый препарат кластерного серебра с концентрацией 50 мг/л в количестве 1 мл вносили в выбранные разведения бактериальной суспензии на фосфатном буфере и через 40мин., 1,5ч. и 3 ч. производили высевы на мембранные фильтры, помещенные на поверхность плотной питательной среды (МПА с 1% глюкозы) и инкубировали при 37°С в течение 48 часов.

Для экспериментального изучения взаимодействия листерий с растениями была разработана методика исследования возможности проникновения листерий через корневую систему в вегетативные органы злаковой культуры овса с применением метода сканирующей электронной микроскопии и параллельным исследованием выживаемости бактерий в процессе эксперимента. За основу взята методика изучения листерий в растениях, описанная в монографии В.Ю.Литвина с соавторами (1998).

Семена овса деконтаминировали антибиотиками: линкомицин 100

мкг/мл, рифампицин 100 мкг/мл, гентамицин 20 мкг/мл с экспозицией 2 часа

и с последующей обработкой фунгицидным препаратом (нистатин) в дозе 10

мкг/мл в течение 2-х часов. Отмывали трижды стерильным буферным

раствором. После обработки всхожесть семян составляла 60-70%. Далее

семена проращивались при комнатной температуре в течение 4-6 суток в

стерильных чашках Петри на подложке из ваты, смоченной стерильной

водопроводной водой. Затем каждый проросток помещали в стерильный

стакан высотой 15 см и объемом 200 мл таким образом, чтобы в почве

находились только корни проростков. Растения закрывали стерильным

стеклянным колпаком и выращивали при температуре 18-20°С в течении

8

двух недель. Взвесь клеток в концентрации 2x109 кл/мл (1 мл) вносили в стерильную почву (рН 7,0-7,2) стерильным шприцом строго в околокорневую зону не касаясь корневых волосков растений. В сроки, определенные для эксперимента, производили отбор проб для изучения выживаемости и морфологии популяций листерий.

2.2. Результаты исследований 2.2.1. Выживаемость и морфология популяций Listeria innocua в водной среде при различных температурах

На первом этапе диссертационной работы была изучена выживаемость и морфология популяций Listeria innocua в стерильной водопроводной воде при температурах 22°С, 4°С и -18°С, срок наблюдения составил 3 месяца.

На протяжении всего срока эксперимента выживаемость листерий в воде определяли путем высева на питательные среды. Так, при 4 и -18°С через 3 месяца КОЕ снижалось на 3 и 2 порядка соответственно. В то время как при 22°С через 3 месяца эксперимента при высеве на питательные среды не выявлялось видимого роста культуры даже после подращивания на среде обогащения (бульон Фразера) (рис. 1).

Э Í А в в 10 М

Время эксперимента (недели)

Рис. I. Выживаемость L. Innocua при различных режимах температур.

Согласно данным литературы, способность листерий не только выживать, но и размножаться при пониженных температурах, обусловлена адаптационными механизмами, присущими психрофилам. К таким механизмам относится гомеовязкостная адаптация липидов мембран, что проявляется повышением содержания непредельных жирных кислот, повышающих эластичность мембран (Коронелли Т.В. 1984 г.), а так же способность листерий при низких температурах компенсировать малую эффективность рибосом их дополнительным синтезом (Бузолева JI.C. и др. 2000 г.).

Исследование морфологии популяций листерий при температуре 4°С показало, что через 2 недели эксперимента были выявлены микроколонии, представляющие собой популяции листерий, погруженных в межклеточный матрикс, формирующий на поверхности покровы (биопленки) (рис. 2а).

Интересно отметить, что через две недели в пробе размороженной воды (-18°С) была обнаружена пленка, исследование которой показало, что популяция представлена листериями типичной морфологии в виде палочек с закругленными концами, погруженными в толстый слой покрова, в отдельных участках которого бактерии хорошо просматривались (рис. 26). Через 2 месяца в пробах размороженной воды были выявлены популяции листерий, имеющие типичную морфологию и погруженные в межклеточный матрикс (рис. За). Через 3 месяца в пробах размороженной воды выявлены популяции L.innocua, с поверхности закрытые плотным покровом, через которые видны очертания отдельных бактерий (рис. 36).

Рис. 2. (а) Фрагмент микроколонии L. innocua в водной среде. 4°С, 2 недели. Клетки закрыты плотным покровом - биопленкой, (б) Фрагмент популяции L.innocua в водной среде (после размораживания) -18°С, 2 недели. Бактерии объединены межклеточным матриксом. Популяция представлена бактериальными клетками нормальной морфологии. СЭМ.

Рис. 3. (а) Фрагмент микроколонии иппосиа в водной среде. - 18°С, 2 месяца. Бактериии погружены в межклеточный матрикс. Популяция листерий имеет нормальную морфологию, (б) Через 3 месяца листерии в микроколонии объединены межклеточным матриксом, с поверхности закрыты плотным покровом. СЭМ.

Изучение морфологии популяций листерий показало, что при температуре 22°С через 2 недели листерии образуют микроколонии и колонии, погруженные в межклеточный матрикс, формирующий на поверхности покровы (рис. 4а). Через 3 месяца эксперимента выявлен гетероморфизм клеток на разных стадиях Ь-трансформации с образованием клеток протопластного типа (рис. 46). Для изучения процессов реверсии нами были произведены высевы листерий на двойные мембранные фильтры

11

(№№ 2 и 4) с последующей электронной микроскопией препаратов из нижних мембранных фильтров (№2). Выявлен переход клеток в исходное состояние, что проявлялось образованием тонкой пленки, под которой просматривались отдельные бактерии.

Рис. 4. (я) Микроколонии L.innocua в водной среде. 22°С, 2 недели. Листерии погружены в межклеточный матрикс, на поверхности клеток сформирован тонкий покров, (б) Через 3 месяца популяция листерий представлена гетероморфными клетками протопластного типа. СЭМ.

Таким образом, было показано, что в водной среде при низких и отрицательных температурах в отсутствии питательных веществ существование популяций листерий обеспечивается образованием колоний и микроколоний, в которых бактерии погружены в межклеточный матрикс, формирующий на поверхности покровы (биопленки). Стратегия выживания обеспечивается процессами гетероморфизма, что расширяет возможности популяций листерий персистировать в некультивируемом состоянии. Явление гетероморфизма вызывает трудности индикации листерий, так как видимого роста при культивировании на питательных средах не наблюдается.

2.2.2. Исследование морфологии популяций и выживаемости Listeria innocua в молоке и молочных продуктах

Проблема контаминации молока и молочных продуктов является в настоящее время актуальной. Данные литературы свидетельствуют о том, что

широкие адаптационные возможности листерий способствуют активному размножению популяций на всём протяжении технологических цепочек изготовления и хранения молока и молочных продуктов. В этой связи нами были проведены исследования существования листерий в этих объектах с использованием микробиологических и электронно-микроскопических методов.

Так как молочные продукты хранятся в холодильных камерах, эксперименты проводили при температуре 4°С.

Изучение выживаемости листерий в молоке и молочных продуктах показало, что после инкубации в течение 7 суток концентрация листерий увеличилась в молоке на 4 порядка (с 108 до 1012), кисломолочных продуктах на три (до 101'), а на поверхности твёрдого сыра на два (до Ю10).

Параллельно с исследованиями выживаемости листерий в молоке и молочных продуктах проводилось изучение морфологии популяций листерий с применением метода сканирующей электронной микроскопии. Необходимо отметить, что такие исследования были связаны с определенными сложностями, объясняемыми высоким содержанием жира и белков в исследуемых продуктах.

Изучение проб стерилизованного молока в сканирующем электронном микроскопе показало отсутствие сторонней микрофлоры. Поверхность молочной пленки гладкая, складчатая (рис. 5а). При исследовании проб контаминированного молока было выявлено наличие большого количества микроколоний, закрытых покровами, под которыми просматривались бактерии типичной для листерий морфологии (рис. 56). Подтверждением наличия листерий в контаминированном молоке явился характерный рост на дифференциально-диагностической среде РАЬСАМ, окраска по Граму и положительная проба на каталазу.

Отсутствие в стерилизованюм молоке мезофильной микрофлоры, типичной для данного продукта, способствует активному размножению

популяций Listeria innocua при пониженных температурах, что создает возможность их персистенции и накопления до опасного уровня.

Рис. 5. (а) Фрагмент капли стерильного питьевого молока (контроль). Бактериальных клеток и микроколоний не выявлено. (6) Фрагменты капли молока, контаминированного культурой листерий. В поле зрения - участки микроколоний листерий. Видны бактерии овоидной формы, закрытые с поверхности покровом. СЭМ.

Следующим объектом исследования были кисломолочные продукты. В это понятие были объединены пастеризованный йогуртный продукт с длительным сроком хранения (3 месяца) и биокефир - детский кисломолочный продукт, содержащий живые закваски бифидобактерий и лактобактерий, сроком хранения не более 72 ч. Оба продукта представляют особый интерес, так как используются в качестве детского питания.

Исследования показали, что выживаемость листерий в обоих продуктах была одинаковой, однако электронно-микроскопическая картина не контаминированных образцов йогуртного продукта и биокефира, а также морфология популяций листерий в этих продуктах имели существенные отличия.

Так, в контрольных образцах пастеризованного йогуртного продукта микрофлоры не выявлено. На поверхности мембранного фильтра выявлена тонкая бесструктурная плёнка (рис. 6а), при этом в контрольных образцах биокефира выявлялись множественные микроколонии бактериальных клеток, закрытых покровами, под которыми видны очертания отдельных

бактерий. Выявленные микроколонии являются составной частью молочнокислой закваски, входящей в биокефир (рис. 66).

Рис. 6. (я) Фрагмент капли йогуртного продукта (контроль). Бактериальных клеток и микроколоний не выявлено. (6) Фрагмент капли биокефира (контроль). В поле зрения - микроколония бактерий под покровом. На повепхности видны отдельные бактепиальные клетки. СЭМ.

В контаминированных листериями образцах йогуртного продукта выявлено формирование микроколоний и колоний, закрытых покровами, под которыми видны очертания овальных клеток - листерий (рис. 7а), что подтверждено высевами на дифференциально-диагностическую среду РАЬСАМ. Гетероморфизма в популяции листерий в данном продукте не выявлено, в то время как в пробах биокефира, контаминированного листериями, выявлен гетероморфизм с различными проявлениями Ь-трансформации и образованием Ь-форм (рис. 7а), которые возникают в результате нарушения целостности клеточных стенок. Мы полагаем, что это связано с антагонистической активностью бактерий, входящих в состав молочнокислой закваски. По данным литературы, молочнокислые бактерии синтезируют биологически-активные вещества - молочную кислоту, перекись водорода, лизоцим и другие биоцины (Рыбалченко О.В., Бондоренко В.М., Добрица В.П. 2009 г.). В конечном итоге, бактерии входящие в состав молочнокислой закваски, обладают бактериостатическим эффектом по отношению к листериям, что подтверждается их ростом на

дифференциально-диагностической среде с полным восстановлением типичных для листерий морфологических и биологических свойств.

Рис.7, (а) Фрагмент капли йогурта, контаминированного культурой листерий. В центре видна популяция листерий под покровами и очертания отдельных клеток, (б) Фрагмент капли биокефира, контаминированного культурой листерий. Видны гетероморфные клетки протопластного типа и мелкие L-формы (фрагменты микроколоний). СЭМ.

Таким образом, нами было показано, что листерии способны активно размножаться в молоке и молочных продуктах при температуре холодильных камер. Микроорганизмы, входящие в состав биокефиров, и их метаболиты оказывают на популяцию клеток листерий бактериостатическое действие, о чем свидетельствует образование клеток протопластного типа, способных персистировать в молочных продуктах длительное время.

2.2.3. Экспериментальное исследование взаимодействия кормовой культуры овса с Listeria innocua.

Несомненный интерес представляет изучение экологических аспектов существования условно-патогенных и патогенных бактерий в окружающей среде, а также пути их циркуляции, при которой может происходить контаминация кормов для животных. В этой связи нами было изучено взаимодействие кормовой культуры овса с Listeria innocua с помощью метода сканирующей электронной микроскопии и параллельным исследованием выживаемости популяций листерий в тканях растений.

16

Для этих целей была модифицирована методика изучения существования листерий в растениях, предложенная В.Ю. Литвиным с соавторами (1998). Усовершенствование метода заключается в возможности проведения исследований выживаемости листерий с параллельным изучением морфологии популяций листерий в тканях растений с помощью метода сканирующей электронной микроскопии.

Изучение выживаемости показало, что при внесении в стерильную почву листерий в концентрации 109 КОЕ/мл на третьи сутки в корне она составляла 108 КОЕ/мл, а в стебле была на уровне 107 КОЕ/мл. Через 7 суток эксперимента указанные концентрации листерий в листовых пластинках и корне овса сохранялись. Через 14 суток в листовых пластинках овса концентрация листерий снизилась до 106 КОЕ/мл, в то время как в корневой части сохранялась на исходном уровне - 108 КОЕ/мл.

Перед изучением морфологии листерий в тканях листовых пластинок овса с использованием сканирующей электронной микроскопии, были исследованы образцы листовых пластинок кормового овса, проращенного из деконтаминированных семян - контроль (рис. 8а). На участке препарата листовой пластинки после снятия оболочки листа (эпидермы) были выявлены контурированные оболочкой края и внутренняя часть листа, представленная гранулированной тканью - хлоренхимой. Сторонней микрофлоры выявлено не было.

При исследовании препаратов, полученных из листьев контаминированного листериями кормового овса, на 3-й день эксперимента было обнаружено большое количество гетероморфных клеток листерий в виде округлых образований и продолговатых, палочковидных, неправильной формы клеток протопластного типа, локализованных в большом количестве в хлоренхиме листовой пластинки (рис. 86).

Рис. 8. (я) Контроль. Фрагмент листовой пластинки овса. Эпидерма удалена, видна рыхлая хлоренхима. (б) Фрагмент листовой пластинки овса. Эпидерма удалена. Выявлены гетероморфные бактериальные клетки листерий округлой и палочковидной формы, находящиеся на разных стадиях ^трансформации. 3-е суток эксперимента. СЭМ.

При исследовании препаратов листовой пластинки овса в хлоренхиме через 7 и 14 суток также наблюдали скопления популяций клеток листерий, находящихся на различных стадиях гетероморфизма (рис. 9а, б). Подтверждением наличия листерий служили высевы на дифференциально-диагностическую среду Мерк, окраска по Граму, определение каталазной активности.

Рис. 9. (а) 7-е сутки эксперимента. Фрагмент листовой пластинки овса. Эпидерма удалена. Видны бактериальные клетки листерий в состоянии гетероморфизма, находящихся на разных стадиях Ь-трансформации. (б) 14-е сутки эксперимента. Видны гетероморфные клетки листерий. СЭМ.

Таким образом, нашими исследованиями показано, что на всех сроках эксперимента внутри листовых пластинок овса был выявлен гетероморфизм клеток листерий, что обусловлено дефектностью клеточных стенок. Гетероморфизм реализуется образованием различных морфологических вариантов: изменением формы клеток, механизма деления, потерей способности к адгезии, что, как известно, ведёт к потере бактериями патогенных свойств. Однако нами установлено, что при высеве гомогенатов вегетативных органов овса на дифференциально-диагностическую среду листерии восстанавливали свои морфологические и физиологические свойства.

Как известно, угнетение роста и развития патогенных и условно-патогенных бактерий при существовании в тканях растений обусловлено воздействием таких факторов фитоиммунитета, как биологически активные и физиологически активные вещества (аналоги витаминов, гормоны), вырабатываемые в ответ на внедрение патогенов (Крючкова J1.0. и др. 2000г., Стехова и др. С.И. 2006 г.).

Наши исследования показали, что стратегия выживания популяций листерий в тканях растений определяется процессами гетероморфизма, что расширяет возможности возбудителя к поддержанию численности и накоплению в зеленых кормах, а, следовательно, создает угрозу заражения животных листериозом.

2.2.4. Экспериментальное исследование процессов адгезии и колонизации Listeria innocua комбикормов.

Помимо способности клеток листерий к существованию в тканях растений, другим возможнымспособом контаминации кормов является адгезия и колонизация листерий на поверхностях частиц комбикормов. В этой связи нами проведено экспериментальное изучение процессов адгезии и колонизации листериями частиц комбикорма при температурах 4°С, 22°С, 37°С.

При исследовании в сканирующем электронном микроскопе контрольных стерильных (не контаминированных листериями) препаратов на поверхностях частиц комбикорма сторонней микрофлоры не выявлено (рис. 10а). Исследование частиц комбикорма, контаминированных при температуре 4°С, выявило колонизацию листериями поверхностей частиц комбикорма с формированием микроколоний, с поверхности закрытых массивными покровами (рис. 106).

Рис. 10. (а) Контроль, Фрагмент частицы комбикорма. Посторонняя микрофлора не выявлена.

(б) Фрагмент дробленого зерна. Температура 4°С, срок экспозиции 24 ч. На поверхностях частиц

комбикорма микроколония листерий, закрытая массивными покровами СЭМ.

При температуре 22°С на поверхности частиц комбикорма выявлены отдельные адгезированные бактериальные клетки, а также формирование микроколоний листерий под покровами (рис. 11а). Исследование препаратов частиц комбикорма, контаминированных листериями, показало, что при 37°С и экспозиции 24 часа были выявлены популяции клеток листерий палочковидной и округлой формы, единичные адгезированные листерии (рис. 11 б). Нашими исследованиями показано, что через 24 часа наибольшая адгезия и колонизация частиц комбикорма листериями наблюдалась при 4°С, в то время как при 37°С процессы адгезии и колонизации менее интенсивны.

Рис.11, (а) Фрагмент дроблёного зерна. Температура 22°С, срок экспозиции 24 ч. На поверхностях частиц комбикорма видна микроколония листерий, под покровами которой видны отдельные бактериальные клетки. (б) 37°С, срок экспозиции 24 ч. На поверхностях частиц комбикорма видна популяция палочковидных и шаБовидных клеток. СЭМ.

2.2.5. Исследование влияния раствора кластерного серебра на выживаемость и морфологию Listeria innocua

В настоящее время ведется поиск новых, безопасных препаратов для санации объектов ветеринарно-санитарного надзора. В этой связи интерес представляют растворы кластерного серебра, полученные импульсно-дуговым методом. Работа проводилась совместно с сотрудниками РГТУ имени К.Э. Циолковского к.т.н. Голубевым В.Н. и д.т.н. Слепцовым В.В.

Проведено изучение воздействия растворов кластерного серебра на выживаемость и морфологию популяций L.innocua с использованием метода сканирующей электронной микроскопии.

Согласно данным исследования выживаемости листерий при воздействии растворов кластерного серебра (50 мг/л) на взвесь листерий, содержащей 2х 102 кл/мл, количество колониеобразующих единиц в 1 мл уменьшалось с увеличением срока экспозиции. Так, при экспозиции 40 минут концентрация листерий составляла 60 КОЕ/мл, через 1,5 часа - 10 КОЕ/мл, через 3 часа видимого роста листерий на плотной питательной среде не наблюдали.

Параллельно с исследованием выживаемости, проводилось изучение морфологии популяций листерий при взаимодействии с растворами кластерного серебра в сканирующем электронном микроскопе. Исследование опытных образцов показало значительные изменения морфологии популяций листерий в пробах, обработанных раствором кластерного серебра, по сравнению с контролем.

В контрольных препаратах популяция L.innocua представлена однородными, короткими палочковидными бактериями с закругленными концами. Клетки в популяции плотно упакованы, продольно ориентированны, погружены в межклеточный матрикс, формирующий на поверхностях бактерий тонкий покров (биопленку) (рис. 12а). Взаимодействие растворов кластерного серебра с популяцией листерий через 1 час вызывало адсорбцию и налипание частиц серебра на поверхностях клеточных стенок листерий, что четко определялось благодаря возникшему при этом дополнительному контрастированию (рис. 126).

Рис. 12. (а) Фрагмент популяции L.innocua. Контроль. Бактерии имеют типичную морфологию для листерий. (б) Эффект воздействия растворов кластерного серебра на популяции L innocua, 1 час. Морфология бактерий не изменена, отсутствуют межклеточный матрикс и покровы, края четко контурированы, видно налипание класеров серебра на поверхностях листерий СЭМ

При этом в отличие от контроля отмечено нарушение пространственной ориентации клеток, разрушение видимых связей (межклеточного матрикса) между отдельными бактериальными клетками в популяции. Кроме того, на

поверхности популяций L. innocua, подвергшихся воздействию растворов кластерного серебра в течение 1 часа, покровы отсутствовали.

Через 3 часа наблюдали частичное или полное разрушение структуры клеточной стенки, в результате чего популяция переходила в состояние гетероморфизма с образованием L-форм, размером 0,3 - 0,5 мкм (рис. 13а). Подращивание такой популяции на мембранных фильтрах, помещенных на поверхность плотной питательной среды (МПА с 1% глюкозы), показало, что через 3-4 суток большая часть популяции листерий реверсировала в исходное состояние, что можно объяснить отсутствием нарушений в геноме бактериальных клеток листерий (рис. 136).

Рис. 13. (а) Эффект воздействия растворов кластерного серебра на популяции L. innocua, 3 часа. Бактериальные клетки листерий находятся в гетероморфизме на разных стадиях L-трансформации. (б) L. innocua после подращивания. Выявлена реверсия клеток в исходное состояние. СЭМ.

На основании проведенных нами исследований можно констатировать, что растворы кластерного серебра оказывают бактериостатическое действие на популяции листерий в течение времени, пока существует контакт между бактериальной клеткой и раствором кластерного серебра. При прекращении такого взаимодействия большая часть популяции бактерий способна к реверсии в исходное состояние.

На основании полученных нами данных об антибактериальной

активности растворов кластерного серебра можно сделать вывод о

возможности их использования для обработки упаковочных материалов,

23

поверхностей производственного оборудования, а также в качестве пролонгаторов стерильности некоторых лекарственных средств.

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментальными исследованиями показано, что листерии при обитании в таких объектах как вода, молоко, молочные продукты, ткани растений, комбикорма в диапазоне температур от -18°С до 37°С способны к размножению и накоплению при существовании популяций в микроколониях и колониях закрытых покровами (биопленками). Другим механизмом адаптации листерий является гетероморфизм, обеспечивающий длительную персистенцию измененных гетероморфных клеток со сниженным метаболизмом. Эти явления вызывают трудности индикации и идентификации листерий, так как видимого роста при культивировании не наблюдается. В этой связи особое значение приобретает разработка и внедрение в практику современных методов выделения, идентификации, типирования листерий, основанных на научном подходе к их биологическим и морфологическим особенностям.

4. ВЫВОДЫ

1. Популяции Listeria innocua способны выживать в течение трех месяцев (время эксперимента) в воде в условиях пониженных и низких температур при минимальном содержании питательных веществ. Данными сканирующей электронной микроскопии установлено, что в этих условиях популяции листерий существуют в микроколониях и колониях, в которых бактерии погружены в межклеточный матрикс, формирующий на поверхностях покровы (биопленки) различной толщины.

2. Популяции Listeria innocua способны активно размножаться в стерилизованном молоке в условиях пониженных температур (4°С), при которых они существуют в микроколониях и колониях, закрытых покровами.

3. В образцах биокефира популяции кисломолочных бактерий существуют в колониях и микроколониях закрытых покровами, в то время как в образцах стерилизованного йогуртного продукта микрофлоры не выявлено. В контаминированных пробах биокефира и йогуртного продукта листерии способны размножаться в условиях пониженных температур (4°С). Методом сканирующей электронной микроскопии показано, что популяции листерий в образцах биокефира находятся в гетероморфизме с проявлениями L-трансформации, что обусловлено действием биологически активных веществ, синтезируемых молочнокислыми бактериями. В йогуртном продукте, лишенном молочнокислых бактерий, популяции листерий существуют в микроколониях и колониях, плотно закрытых покровами.

4. Разработана методика изучения морфологии популяций патогенных бактерий в тканях растений с использованием метода сканирующей электронной микроскопии. Этот метод позволил выявить в тканях листовых пластинок кормового овса, контаминированного Listeria innocua, гетероморфизм популяций листерий, что свидетельствует об их способности к персистенции в тканях растений с возможностью реверсии в исходное состояние при благоприятных условиях окружающей среды.

5. Методом сканирующей электронной микроскопии показано, что Listeria innocua при благоприятных условиях (питательный субстрат, влажность 80%, рН 6,8 - 7) способна адгезироваться и колонизировать на поверхности частиц комбикорма в диапазоне температур от 4°С до 37°С.

6. Методом сканирующей электронной микроскопии показано, что растворы

кластерного серебра (50 мг/л) нарушают целостность клеточной стенки

листерий, вызывая гетероморфизм с различными стадиями L-

трансформации. Установлено, что растворы кластерного серебра оказывают

25

бактериостатическое действие на популяции листерий в течение времени, пока существует контакт между бактериальной клеткой и раствором кластерного серебра. При прекращении такого взаимодействия большая часть популяции бактерий способна к реверсии в исходное состояние.

4. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. A.A. Власов. Выживаемость Listeria innocua в водной среде // Ветеринария. 2009, № 10, с. 26 - 28.

2. A.A. Власов, И.Б. Павлова. Выживаемость и морфология листерий в тканях растений кормового овса // Сельскохозяйственная биология. 2009, №4, с. 89-92.

3. И.Б. Павлова A.M. Смирнов, A.A. Власов, В.Н. Голубев, В.В. Слепцов. Влияние растворов кластерного серебра на выживаемость и морфологию патогенных бактерий // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2010, №5.

4. Д.А. Банникова, И.Б. Павлова, А.А.Власов. Выживаемость и морфология популяций листерий в молочных продуктах (сканирующая электронная микроскопия) // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. 2010, № 2.

5. A.A. Власов. Выживаемость и морфология популяций листерий при низких температурах // VII международная конференция студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» Москва 2008г. Материалы конференции. МГУПБ. 2008. с. 226 - 227.

6. A.A. Власов. Экспериментальное исследование контаминации листериями комбикорма // VIII международная конференция студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» Москва 2008г. Материалы конференции. МГУПБ. 2009. с. 292-294.

Заказ № 130-А/11/2010 Подписано в печать 16.11.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495)649-83-30 www.cfr.ru; е-тай:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Власов, Артем Аркадьевич

f . ' ' - . « • . • ■ Стр ' ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.J.

5 ■ ■ ■ ' ■

ГЛАВА 1. Сапрофитическое существование патогенных и условно

I патогенных бактерий в различных экосистемах.

1.1. Сапрофитическое существование бактерий рода Listeria в водной ■■■ ' ' ' ' среде.

1.2. Контаминация бактериями рода Listeria продуктов питания:. i ■ ' ' ' ' ' ' •. '

1.3. Сапрофитическое существование листерий в почве и растениях. i 1.4. Влияние абиотических факторов на выживаемость листерий.

I ГЛАВА 2. Биология листерий:.

Г '. ■ ■

2.1, Виды eaicrepHfi-pOflaiListeria;. 2.2. Идентификация листерий-.

ГЛАВА 3. Способы существования листерий в среде обиганпя.

3.1. Адгезия и колонизация листерий на объектах окружающей среды 3.2! Гетероморфизм как форма существования;листерий;.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ;.

ГЛАВА 4. Материалы и методы.

I 4.1. Методы изучения влияния абиотических факторов; на 32 j выживаемость и морфологию популяций Listeria innocua.

4.1.1. Методы изучения влияния; температуры на выживаемость и 32 морфологию популяций Listeria innocua.

4.1.2. Методы изучения влияния; растворов кластерного серебра на; 32 выживаемость и морфологию популяций Listeria innocua.

Г 4.2. Методы изучения влияния биотических фак торов на выживаемость и морфологию популяций Listeria innocua.—.

4.2.1. Методы, изучения взаимодействия популяций Listeria innocua с

J вегетативными органами растений:и комбикормами.

4.2.2. Методы изучения выживаемости и морфологии Listeria innocua в молоке и молочных продуктах.

I . ■ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ.

ГЛАВА 5. Выживаемость и морфология популяций Listeria innocua в 38 водной среде при различных температурах.

ГЛАВА 6. Исследование морфологии популяций и выживаемости

Listeria innocua в молоке и молочных продуктах.

ГЛАВА 7. Экспериментальное исследование взаимодействия кормовой культуры овса с Listeria innocua.

ГЛАВА 8. Экспериментальное исследование процессов атгезии и 60 колонизации Listeria innocua комбикормов.

ГЛАВА 9. Исследование влияния растворов кластерного серебра на 64 выживаемость и морфологию популяций Listeria innocua.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Влияние абиотических и биотических факторов на выживаемость и морфологию популяций листерий в объектах ветеринарно-санитарного надзора"

Актуальность проблемы. В настоящее время одним из современных направлений микробиологии является экология микроорганизмов, которая включает в себя раздел популяционной микробиологии, требующий глубокого понимания структурно-функциональных особенностей существования популяций различных микроорганизмов.

Изучению биологии, экологии, индикации и идентификации листерий посвящен целый ряд работ таких исследователей как Бакулов И.А. 1967, Меньшикова 1971, Бутко М.П. 1977, Шевелева С.А. 1999, Котлярова Г.А. 1989, Котляров В.М. 1999, Тартаковский И.С. 2002, Нитяга И.М. 2004 и другие.

В связи с участившимися случаями выявления возбудителя листериоза в объектах ветеринарно-санитарного надзора, в частности, в водоемах, кормах, продуктах питания, возникает необходимость детального исследования выживаемости и морфологических особенностей популяций листерий в указанных выше объектах.

В последнее время, наряду с психрофильными бактериями вида L. monocytogenes, свою экологическую нишу начинают занимать L. innocua. Как показывают последние исследования при выделении листерий из объектов окружающей среды, патологических и биологических материалов доля Listeria innocua часто составляет больше половины от общего числа видов листерий (Бакулов И.А., Егорова И.Ю. и др. 2009). Так, в период с 2006 по 2009 годы из пресноводной рыбы Иваньковского водохранилища листерии были выделены в 5,53 % проб, из них на долю L. monocytogenes приходилось 48 %, а на L.innocua - 52 % проб (Егорова И.Ю., Селянинов Ю.О. и др. 2009).

Особый интерес представляют данные о проявлении патогенных свойств L.innocua. Так, при постановке конъюнктивальной пробы на морских свинках со штаммами L.innocua, выделенными из свинины, говядины, сливочного масла, была отмечена положительная реакция и зафиксирована гибель нескольких животных, во внутренних органах которых при микробиологических исследованиях обнаруживались L.innocua (Кольпикова Т.И:, Котляров В.М. и др. 1998). Таким образом, авторы полагают, что штаммы L.innocua не могут относиться* к непатогенным видам листерий, а наличие их в кормах и продуктах питания представляет опасность для животных и людей.

Учитывая вышеизложенное, исследования экологии популяций L.innocua, как одного из наименее изученных представителей рода Listeria, являются новыми и актуальными. Такого рода исследования будут способствовать изысканию способов предотвращения контаминации листериями продуктов питания, кормов для животных и распространению опасного патогена в окружающей среде.

Цель работы. Целью настоящей работы является изучение выживаемости и морфологии популяций L.innocua при воздействии абиотических и биотических факторов окружающей среды.

Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методические подходы к исследованию влияния абиотических и биотических факторов на выживаемость и морфологию популяций Listeria innocua.

21 Изучить выживаемость и морфологию популяций Listeria innocua в водной среде при различных температурных режимах (in vitro).

3. Изучить выживаемость и морфологию популяций-Listeria innocua в молочных продуктах (in vitro).

4. Изучить выживаемость и морфологию популяций листерий в тканях листовых пластинок кормовой культуры овса.

5. Изучить- процессы адгезии и колонизации Listeria innocua комбикормов.

6. Изучить влияние растворов кластерного серебра на выживаемость и морфологию популяций Listeria innocua.

Научная новизна. С использованием метода сканирующей электронной микроскопии изучено влияние абиотических и биотических факторов на морфологию популяций Listeria innocua.

Экспериментальными исследованиями показано, что в водной среде при низких и отрицательных температурах существование популяций бактерии Listeria innocua обеспечивается образованием колоний и микроколоний, в которых бактерии погружены в межклеточный матрикс, формирующий на поверхностях покровы — биопленки различной толщины. Стратегия выживания листерий при различных температурах также обусловлена гетероморфизмом популяций с различными проявлениями L-трансформации, что расширяет возможности их персистенции в объектах окружающей среды. Показано, что в биокефирах, контаминированных Listeria innocua (in vitro), молочнокислые бактерии оказывают бактериостатическое действие.

Впервые разработана методика исследования выживаемости и морфологии популяции L. innocua в тканях листовых пластинок растений с использованием метода сканирующей электронной микроскопии. Показана способность Listeria innocua проникать через корневую систему в листовые пластинки кормовой культуры овса и персистировать в тканях растений. Установлена способность клеток листерий адгезироваться и колонизировать частицы комбикорма при различных температурных режимах.

Впервые методом сканирующей электронной микроскопии изучен механизм действия растворов кластерного серебра, ведущим фактором которого является повреждение клеточной стенки листерий. Установлено, что растворы кластерного серебра оказывают бактериостатическое действие на популяции листерий пока существует контакт между бактериями и растворами кластерного серебра, что подтверждено данными изучения реверсии клеток в исходное состояние.

Практическая значимость работы. На основании результатов экспериментальных исследований разработано «Методическое пособие по изучению влияния растворов различных химических агентов на морфологию популяций бактерий методом отпечатков с последующим исследованием в сканирующем электронном микроскопе», утвержденное отделением ветеринарной медицины РАСХН 11.05.2010, рекомендованное для специалистов биологических, ветеринарных и медицинских научно-исследовательских институтов.

Результаты исследований влияния абиотических и биотических факторов на выживаемость и морфологию популяций Listeria innocua показали необходимость проведения микробиологического мониторинга и контроля в таких объектах как вода, молоко, молочные продукты, зеленые корма и комбикорма для предотвращения распространения листерий в окружающей среде.

Апробация работы. Материалы научных исследований, представленные в диссертации, доложены на VII международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва 2008г.), на VIII международной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва 2009г.), годовых отчетах аспирантов на Ученом совете ВНИИВСГЭ (2009, 2010), межлабораторном совещании научных сотрудников ВНИИВСГЭ 19.10.2010.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза", Власов, Артем Аркадьевич

ВЫВОДЫ

1. Популяции Listeria innocua способны выживать в течение трех месяцев (время эксперимента) в воде в условиях пониженных и низких температур при минимальном содержании питательных веществ. Данными сканирующей электронной микроскопии установлено, что в этих условиях популяции листерий существуют в микроколониях и колониях, в которых бактерии погружены в межклеточный матрикс, формирующий на поверхностях покровы (биопленки) различной толщины.

2. Популяции Listeria innocua способны активно размножаться в стерилизованном молоке в условиях пониженных температур (4°С), при которых они существуют в микроколониях и колониях, закрытых покровами.

3. В образцах биокефира популяции кисломолочных бактерий существуют в колониях и микроколониях закрытых покровами, в то время как в образцах стерилизованного йогуртного продукта микрофлоры не выявлено. В контаминированных пробах биокефира и йогуртного продукта листерии способны размножаться в условиях пониженных температур (4°С). Методом сканирующей электронной микроскопии показано, что популяции листерий в образцах биокефира находятся в гетероморфизме с проявлениями L-трансформации, что обусловлено действием биологически активных веществ, синтезируемых молочнокислыми бактериями. В йогуртном продукте, лишенном молочнокислых бактерий, популяции листерий существуют в микроколониях и колониях, плотно закрытых покровами.

4. Разработана методика изучения морфологии популяций патогенных бактерий в тканях растений с использованием метода сканирующей электронной микроскопии. Этот метод позволил выявить в тканях листовых пластинок кормового овса, контаминированного Listeria innocua, гетероморфизм популяций листерий, что свидетельствует об их способности к персистенции в тканях растений с возможностью реверсии в исходное состояние при благоприятных условиях окружающей среды.

5. Методом сканирующей электронной микроскопии показано, что Listeria innocua при благоприятных условиях (питательный субстрат, влажность 80%, рН 6,8 — 7) способна адгезироваться и колонизировать на поверхности частиц комбикорма в диапазоне температур от 4°С до 37°С.

6. Методом сканирующей электронной микроскопии показано, что растворы кластерного серебра (50 мг/л) нарушают целостность клеточной стенки листерий, вызывая гетероморфизм с различными стадиями L-трансформации. Установлено, что растворы кластерного серебра оказывают бактериостатическое действие на популяции листерий в течение времени, пока существует контакт между бактериальной клеткой и раствором кластерного серебра. При прекращении такого взаимодействия большая часть популяции бактерий способна к реверсии в исходное состояние.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Власов, Артем Аркадьевич, Москва

1. Авдиенко И.Д., Исмаилов З.Ф., Рябченко Н.Ф. и др. Консорциум шаммов-антагонистов для борьбы с бактериальными и грибковыми болезнями растений. // Патент РФ № 2149552. Опубл. 27.05.2000.

2. Адамовская В.Г., Молодченкова О.О., Цисельская Л.И. и др. Изменение протеиназно-ингибиторной системы пшеницы и ячменя в связи с устойчивостью к фузариозу. // Физиология и биохимия культ, растений. 1999. — 31, №5. С. 366 -371.

3. Банникова Д.А., Павлова И.Б., Кононенко А.Б. и др. Морфология популяций листерий при различных условиях культивирования (сканирующая электронная микроскопия). // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. 2009, № 2, с.50-59.

4. Бакулов И.А. Листериоз сельскохозяйственных животных. // Москва, Колос, 1967.

5. Бакулов И.А., Васильева Д.А. Листериоз как пищевая инфекция. // Вопросы диагностики и профилактики, Ульяновск, 1991.

6. Баранова Е.К., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н. и др. Взаимодействие ионов и кластеров серебра в водных и водно-органических растворах с клетками Candida utilis и Saccaromyces cerevisia. //

7. Ботвинко И.В. Экзополисахариды бактерий. // Успехи микробиологии., 1985, Т. 20, с. 79-122.

8. Васильев Д.А. Батраков В.В. Факторы, способствующие распространению пищевого листериоза. // Тез. Док. Науч. Прак. Конференции «Актуал. проб, вет сан. Контроля с.-х. продукции». М. 1997, ч. 2. с. 165.

9. Волкова Т.Г., Калачева Г.С., Пузырева А.П. Влияние внутриклеточного пула полиоксибутирата на рост водородных бактерий в неоптимальных условиях. // Микробиология. 200, 69 (6). С. 770

10. Гершун В.И., Туякова Р.К., Кауменов Н.С. Жизнеспособность листерий в комбикормах. // Вестник науки Казахский государственный агротехнический университет имени С. Сейфулина, 2007 г., № 4, с. 72 75.

11. Гершун В.И., Туякова Р.К., Батырбеков А.Н. Динамика популяции листерий в ассоциации с инфузориями и гуппи. // Ветеринарные науки, 2007 г., с.100 102.16 (29). Гершун В.И. Листериоз сельскохозяйственных животных. // Алма-Ата, 1981.

12. Гершун В.И. Экология листерий и пути их циркуляции в природном очаге. // Экология возбудителей сапронозов, М., 1988, с. 80 85.

13. Гершун В.И., Туякова Р.К., Кауменов Н.С. Жизнеспособность листерий в комбикормах. // Вестник науки Казахского гос. акгротех. универ.-та им. Сейфулина, № 4, 2007, с. 72-75.

14. Гершун В.И. Влияние температурного режима на популяцию листерий в объектах внешней среды. // Ветеринария. 1983, 8, с. 29 30.

15. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий. // Издательство Ленинградского университета, 1989.

16. Дмитриев AM. Сигнальные системы иммунитета растений. // Цитология и генетика. 2002. 36, № 3. С 38 68.-773.

17. Егоров Н.С. Микробы-антаганисты и биологические методы определения антибиотической активности. // М. Высш. Школа. 1965. с. 221.

18. Егоров Н.С., Милько Е.С., Степанова Р.А. и др. Влияние факторов внешней среды на рост и изменчивость R- S- и М-вариантов Micobacterium lacticolum. // Биологические науки, 1986, № 8, с. 87 92.

19. Егорова И.Ю., Селянонов Ю.О., Воронин М.С. Мониторинг листерий в водной фауне иваньковского водохранилища. // Ветеринария, № 8, 2009, с. 29 -31.

20. Ермолаева С.А. Генетические механизмы вирулентности Listeria monocytogenes. //Генетика. 2001, 37. с. 286 293.

21. Ермолаева С.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С. Свидетельства ауторегуляции экспрессии секретируемых белков Listeria monocytogenes. // Журн. микробиол. 2000. 5. с.З 6.

22. Ермолаева С.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С. Изменение уровня экспрессии факторов вирулентности Listeria monocytogenes под влиянием внешних условий. //Мол. ген. микробиол. вирусол. 2000, I.e. 17 19.

23. Ермолаева С.А., Карпова Т.И., ТартаковскийИ.С., и др. Способ дифференциации культуры L.monocytogenes. // Патент на изобретение. Решение о выдаче на заявку № 200111 1636/13(012462) от 03.05.2001.

24. Ефимочкина Н.Р., Карликанова С.Н. Выделение L. monocytogenes из молока и молочных продуктов. // Молочная промышленность, № 5, 2004, с. 36-38.

25. Зайцева Е.А., Влияние температуры на адгезивные свойства листерий. // НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Журн. Микробиологии Эпидемиологии и иммунологии, 2006, №3.

26. Звягинцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями //. Москва, 1973.

27. Ищенко Л.А., Чеснокова И.Н. Роль прокариот в устойчивости плодовых растений к неблагоприятным абиотическим и биотическим факторам среды.

28. Карликанова Н.Р., Куваева И.Б., Карликанова С.Н. Листерии в молоке и молочных продуктах. // Москва-Углич; 1999.

29. Карпова Л.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С., Прозоровский С.В. Отчистка и характеристика листериолизина О L. monocytogenes. // Микробиология, № 3, 1994, с. 3 4.

30. Карпова Т.И., Ермолаева С.А., Лопырев И.В. и др. Новые методы идентификации Listeria monocytogenes. // Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. 2001, 3. с. 266 273.

31. Киселева И.С. Влияние некоторых психрофильных бактерий на качество и безопасность продуктов животноводства. // Саратовский гос. универ.-т им. Вавилова Н.И.; Саратов.

32. Козак С.С., Догадова H.JL, Хан Л.Г. Устойчивость листерий к физическим и химическим факторам окружающей среды. // ГУ птицеперерабатывающей промышленности, Мясная индустрия, № 7, 2009, с. 18-21.

33. Козак С.С. Профилактика контаминации листериями продуктов из мяса птицы. // ВНИИ птицеперерабатывающей промышленности, Архив ветеринарных наук т. 9 (56) часть 2, 2008, с. 43-46.

34. Козак С.С., Догадова Н.Л., Иванова A.C. и др. Листерии в яичных продуктах. // ГУ птицеперерабатывающей промышленности, Птица и птицепродукты, № 3, 2008, с. 13-15.

35. Колбасов Д.В., Цыбанова В.А., Фирсова Т.Е. Выявление патогенных листерий в рыбной продукции. // ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, г. Покров; Ветеринарная патология, № 2; 2007, с. 111-113.

36. Кольпикова Т.И., Котляров В.М., Фирсова Т.Е. Опасна ли Listeria innocua? / ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, г. Покров, с. 237-234.

37. Кондратьева E.H., Красильникова E.H. Фототрофные бактерии как продуценты поли-Ь-гидроксибутирата. // Прикл. Биохимия и микробиология . 1989. XXV (6). с. 786 789.

38. Костюкова H.H. Начальный этап инфекционного процесса — колонизация и пути ее предотвращения. // ЖМЭИ, 1989, № 9, с. 103 109.

39. Кореневский A.A., Сорокин В.В., Каравайко Г.И. Взаимодействие ионов серебра с клетками Candida utilis. // Микробиология, Вып. 6, 1993, Т. 62, с.1085-1092.

40. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов.// Издательство Московского Университета 1984г., с. 8183.

41. Костенко Ю.Г., Шагова Т.С., Янковский К.С. Рекомендации по профилактике листериоза при производстве мясных продуктов. // ВНИИ мясной промышленности, 1999г.

42. B.JL Котков. В.Е., Курочкин, Л.К., Панина и др. Пролонгированная микробная устойчивость воды, обработанной импульсными электрическими разрядами. // Журнал технической физики, Институт электрофизики и электроэнергетики РАН, Санкт-Петербург, 2007 г.

43. Красильников H.A. Антагонизм микробов и антибиотические вещества. М. Сов. Наука. 19856. С. 339.

44. Крючкова JI.O. Гриби роду Fusarium — збудники кореневих гнилей озимой пшеници. // Захист i карантин рослин. 2000. Вил. 46. С. 86-91.

45. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева А.Л., Романова Ю.М. и др. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. // Москва 1998г.

46. Меньшикова З.Н., Тищенко Е.В. Электронно-микроскопическая идентификация листерий возбудителя пищевого листериоза. // Актуальные вопросы ветеринарной медицины, Материалы конференции, Новосибирск, 2005, с. 37-38.

47. МУ 3.1.7.1104-02. Эпидемиология и профилактика листериоза.

48. Никитин Д. И. Роль микроорганизмов в образовании и удалении этилена. // Роль микроорганизмов в круговороте газов в природе. М. Наука. 1979. с. 241-254.

49. И.Б. Павлова A.M. Смирнов, A.A. Власов, В.Н. Голубев, В.В. Слепцов. Влияние растворов кластерного серебра на выживаемость и морфологию патогенных бактерий // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2010, №5.

50. Павлова И.Б., Ленченко Е.М., Банникова Д.А. Морфология популяций патогенных бактерий. // Монография, Москва, 2007 г.

51. Пешков М.А. Цитология бактерий. // Москва, Ленинград 1955.

52. Пушкарева В.И., Ермолаева С.А., Литвин В.Ю. Патогенные листерии и почвенные простейшие: сопряженность жизненных циклов. // Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва, № 3, 2008, С. 245 251.

53. Рабинович М.Л., Черноглазов В.М., Клесов A.A. Классификация целлюлаз, их распространенность, множественные формы и механизм действия. // ИНТ АН СССР. Сер. Биотехнология. 1988. Т. 11. с. 224.

54. Ревина A.A., Баранова Е.К. Некоторые особенности воздействия кластерного серебра на дрожжевые клетки Candida utilis. // Электронный научный журнал, 2005 г.

55. Рыбалченко О.В., Бондоренко В.М., Добрица В.П. Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека // Москва, 2009 г.

56. Светличкин В.В. Индикация иерсиний в зеленых кормах методом ДНК диагностики. // Сборник трудов ВИИВС Проблемы вет. сан. гигиены и экологии, Москва, 2003, т. 115, с. 184 188.

57. Семенихина В.Ф., Гуськова Л.Д., Рожкова И.В. Влияние молочнокислых бактерий на развитие листерий при совместном культивировании в молоке. // Научное обеспечение молочной пром-ти (ВНИМИ-75 лет) / Всерос. науч -исслед. ин-т молоч.пром-ти.- Москва, 2004.

58. Семенова A.M., Ганзликова A.B., Тенова H.A. Накопление поли-2-оксимасляной кислоты некоторыми олигофторными полипростековыми бактериями. // Микробиология. 1989, 58 (6). С. 923 925.

59. Сидоренко М.Л. Размножение патогенной микрофлоры под влиянием микробного сообщества почвенной экосистемы.

60. Сидоренко М.Л., Бузолева Л.С., Костенков Н.М. Влияние свойств почв на сохранение и размножение листерий и иерсиний. // Почвоведение, № 2, 2006 г., с. 237-243.

61. Сомов Г.П., Бузолева Л.С. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды. // Владивосток, Приморский полиграфкомбинат, 2004.

62. Сомов Г.П., Варвашевич Т.Н., Тимченко Н.Ф. Психрофильность патогенных бактерий. // Новосибирск, Наука, 1991.

63. Сомов Г.П., Тимченко Н.Ф. Основные итоги изучения психрофильности патогенных бактерий. // Журнал микробиология 1997, 5, с. 12-16.

64. Сомов Г.П., Литвин В.Ю. Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий (экологические аспекты). // Новосибирск. 1988.

65. Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. // Москва, Медицина для всех, 2002.

66. Тартаковский И.С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. // Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. 2000, 2(2). С. 20 — 30.

67. Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева СА. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. // М. Медицина для всех. 2002.

68. Тимченко Н.Ф., Недашковская Е.П., Долматова Л.С., Сомова-Исачкова Л.М. Токсины Yersinia pseudotuberculosis. // Владивосток 2004 г.

69. Туякова Р.К. Жизнеспособность листерий в подсолнечном силосе. // Вестник науки Казахского гос. акгротех. универ.-та им. Сейфулина, № 4, 2007, с. 1526.

70. Anderson A.J., Dawes E.A. Occurence, metabolism, metabolic role and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. // Microbiol. Rev. 1990.54 (4). p. 450-472.,

71. Bateman G. Pseudocercosporella anquoides, a weakly pathogenic rungus associated with eyespot in winter wheat at site in England. // Plant Pathol. 1988. 37. P. 291-296.

72. Behari J., Youngman P. Regulation of hly expression in Listeria monocytogenes by carbon sources and pH occurs through separate mechanisms mediated by PrfA. // Infect. Immun. 1998. 66. p. 3635 3642.

73. Belyi Y.F. Intracellular parasitism of microorganisms. // Springer-Verlag, Gmb&Co, KG, 1996.

74. Berestctsky O. A., Knvchenko L.Y. Volatile products of plant residue decomposition and ther effect on soil micriflora. // Soil. BioL Conserv. Biosphere. 1984. v. 1. p. 419-425.

75. Brisson L.F., Tehaken R., Lamb C. Function of oxidative cross-linking of cell wall structural proteins in plant disease resistance. // Plant Cell. 1994. 6, N 12. P. 1703 1712.

76. Braunegg G., Sonnleitner В., Lafferty R.M. A rapid gas chromatographic method for the determination of poly-p-hydroxybutyric acid in microbial biomass. // J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1978. 6. p. 29-33.

77. Bubert A., Socotovic Z., ChunS.K. et al. Dif-ferential expression of Listeria monocytogenes virulence fines in mammalian cells. // Mol. Gen. Genet 1999. 261. p. 323-336.

78. Crawford D.I., Suh H.W. Use of Streptomyces wyec 108 for the protection against to the plant pathogenes. // Patent USA N 5403584. 04.04.95.

79. Cossart P., Kocks C. The actin-based motilityof the facultative intracellular pathogen Little-ria monocytogenea. // Mol. Microbiol. 1994. 13. p. 395-402

80. Dawes E.A. Growth and survival. // Bacteria in nature. New York, Plenum Publishing Corp. 1989.

81. Dickneite C., Bockmann R. Spory A. et al. Differential interaction of the transcription fac-tor PifA and the PrfA-activating factor of Lis-Ioid monocytogenea with targets sequences. // Ibid. 1998. 27. p.915-928.

82. Dibrov P., Dzioba J., Gosink K.K. and al. Chemiosmotic Mecnanism of Antimicrobial Activity of Ag in Vibrio chalerac. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, Vol. 46, № 8, p. 2668-2670.

83. Durand M.L., Calderwood S.B., Weber D.J. at al. Acute bacterial meningitis in adults: a reviev of 493 episodes. // 1993, N., Engl. J., Med, 328, 21-28.

84. Elliot T.R., Elmer H.M. Listeria, listeriosis, and food safety. // 2nd Edition, 1998.

85. Ermolaeva S., Varfolomeeva N., Belyi Y., Tar-takovskii I. Isolation and characterization of a- Listeria monocytogenes mutant strain hyper-producing virulence factors. //FEMS Microbiol. Lett. 1997. 150. p. 189-195.

86. Farber J.M. et al. Growth of Listeria monocytogenes in naturally-contaminated raw milk. // Lebensmittel-Wissenchaft und Technlogie, 23, 3, 1990, 252 254.

87. Fleming D.W., Cjchi M./ N. England J. Medicin, 1985, 312, p/ 404 407.

88. Freitag N.E., Rong L., Portnoy D. Regulation of prfA transcriptional activator of Listeria monocytogenea: multiple promotor elements contribute of intracellular growth and cell-to-cell spread. // Infect. Immun. 1993. 61. p. 2337 2544.

89. Freeman L.P., Silverman G.J., Angelina et al. Volatile produced by microorganisms isolated from refrigerated chicken at spoilage. // Appl. Enviromo Microbiol. 1976.V. 32. № 2. p. 222-231.

90. FrouinA. Listeria ecologia et epidemiologie. // Cah. Nutr. Et. Diet. 1989. V. 24. №4. p. 302-305/

91. Gaillard J.L., Alouf J.E., Berche P. J. gen. //Microbiology, 1989, Vol. 135, p. 481-487.

92. Gaillard J.L., Jaubert F., Berchc P. The inlAB locus mediates the entry of Listeria monocytogenes into hepatocytes in vivo. // J. Exp. Med. 1996. 183. p. 359 -369.

93. Goebel W., Kreft J. Cytolysins and the intracellular life of bacteria. // Trends Microbiol. 1997. 5. p. 86 88.

94. Gouin E., Mengaud J., Cossart P. The virulence gene cluster of Listeria monocytogenes is also present in Listeria ivanovii, an animal pathogen, and Listeria seeligeri, a nonpathogenic species. // Infect, Immun. 1994. 62. 3550 -3553.

95. Gray M.L. et al. A new technique for isolation listerellae from the bovine brain. // J. Bacteriol, 1948,55, 471 476.

96. Hess J.A., Dreher A., Gentschev D., et al. Protein p60 participates in intestinal host invasion by Listeria monocytogenes. Zentralbl. // Bacteriol. 1996. 284. p. 263 -272.

97. Ito S. ,KarnovskyM J. Formaldehyde-glutaral-dehyde fixative containing trinitro compounds. //J. Cell Biology. 1968. 39. p. 168a 168b.

98. Klaus T. ;Joerger R., Olson E., Grangvist C-G. Silver-based crystalline nanoparticles, rnicfobially fabricates. // PNAS, 1999, V. 96, № 24, p. 1361113614.

99. Kuhn M., Goebel W. Host cell signaling during Listeria monocytogenes infection. // Trends. Microbiol. 1998. 6. p. 11-15.

100. Kuhn M., Goebel W. Internalization of Listeria monocytogenes by nonprofessional and pro fessional phagocytes. // Subcell. Biochem. 2000. 33. p.411 -436.

101. Leimeister-Wächter M., Domann E., Chakra-botary T. The expression of virulence genes in Listeria monocytogenes lathermoregulated. // J. Bactcrioi, 1992.174. p. 947-952.

102. Mollaret H.H. Le bacile de Malassez et Vignal (Caracteres Culturaux et biochimugues) // Appl. Microbiol. 1962. V. 30 № 1. p. 29 32.

103. Moors M.A., Levitt B., Youngman P., Portnoy DA. Expression of Listeriosin 0 and ActA by intracellular and extracellular Listeria monocytogenes. // Infect. Immun. 1999. 67. p. 131 139.

104. Paterson I.S., Cook K. A method for the recovery of Pasteurella pseudotuberculosis from faeses. // J. Path. Bact. 1963. 85 (1). P. 241 242.

105. Portnoy D.A., Chakraborty T., Goebel W., Cossart P. Molecular determinants of Listeria monocytogenes pathogenesis. //Ibid. 1992. 60. p. 1263 1267.

106. Rensoni A., Klarsfeld A., Dramsi S., Gossart P. Evidence that PrfA, the pleiotropic activator of virulence genes in Listeria monocytogenes, can be present but inactive. // Ibid. 1997. 65. p. 1515- 1518.

107. Seeliger ILP.R. Listeriosen: II 1958. Springer-Verlag, KG, Berlin.

108. Seeliger H.P.R. Listeriosis history and actual development., II 1988, Infection, 16, S. 80-84.

109. Schlutter D., Domann E., Buck C. et al. Phos-phatidiylcholine-specifie phospholipase G fi*om Listeria monocytogenes in an important virulence factor in murine cerebral listeriosis. // Ibid. 1998. 66. p. 5930 5938.

110. Schuchat A., Deaver K.A., Wenger LD. et al. Role of foods in sporadic listeriosis // I. Case-control study of dietary risk factors.-1992.- JAMA.- N 267.-P: 2041-2045

111. Smith G., Marquis H., Jones N. et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread.//Ibid. 1995. 63. p.423l'-4237.

112. Shaegani M., De Forge J., McGlinn D. et al. Caracteristics of Yersinia; enterocolitica- and related; species isolated: from human, animal and environmental sources//J. Clin. Microbiol. 1981. V. 14.№3.p. 304-312.

113. Swift S., Throup J. By croft B. et al. Quorum sensing: bacterial; cell-cell: signaling from bio-luminescence to pathogenicity. // In: Molecular Microbiology., S. Busby, G. Thomas, N.Brown (ed.), Springer-Verlag, Berlin. 1998. p. 185 208.

114. Tilney L.G., Portnoy D.A. Actin filaments and; the growth; movement1 and spread Of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. // J: Gell. Biol: 1989.109. p. 1597 1608.

115. Vazquez-Boland JlA., Kuhn M:, Berche P. et al. Listeria Pathogenesis and molecular virulence Determinants. // Clin. Microbiol. Rev. 2001. 14 (3). P. 584640.

116. Zhang S. and Grow S.A. Jr. Toxic Effects of Ag(I) and Hg(II) on Candida albicans and C. maliosa: a Flow Cytometric Evaluation;. // Applied and Environmental Microbiology, 2001, Vol 67, № 9, p. 4030-4035.

117. Российская академия сельскохозяйственных наук (РАСХН)

118. Государственное научное учреждение

119. ВСЕРОСИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ САНИТАРИИ, ГИГИЕНЫ И ЭКОЛОГИИ

120. ГНУ ВНИИВСГЭ) РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

121. ИМЕНИ К.Э.ЦИОЛКОВСКОГО (МАТИ)

122. УТВЕРЖДАЮ Академик-секретарь отделения ветеринарной медицины РАСХН1. Смирнов A.M.» 2010 г.1. МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ

123. ПО ИЗУЧЕНИЮ ВЛИЯНИЯ ХИМИЧЕСКИХ АГЕНТОВ НА МОРФОЛОГИЮ ПОПУЛЯЦИЙ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ МЕТОДОМ ОТПЕЧЕТКОВ С ПОСЛЕДУЮЩИМ ИССЛЕДОВАНИЕМ В СКАНИРУЮЩЕМ ЭЛЕКТРОННОМ МИКРОСКОПЕ1. Москва-2010

124. Методическое пособие предназначено для специалистов научно-исследовательских и производственных лабораторий, занимающихся разработкой антибактериальных препаратов.

125. Рецензент: доктор ветеринарных наук Рубченков П.Н.

126. Материалы рассмотрены и одобрены ученым советом ГНУ ВНИИВСГЭ и секцией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН.

127. Ответственный за выпуск: зав. сектором Отделения ветеринарной медицины РАСХН, кандидат биологических наук Бабышова JI.B.971. Содержаниестр.

128. Введение -------------------------------------------------------------- 3

129. Сущность метода ---------------------------------------------------- 4

130. Лабораторное оборудование реактивы и материалы -------- 4

131. Проведение испытаний -------------------------------------------- 6

132. Обобщение и оценка результатов эксперимента ------------- 7

133. Заключение ----------------------------------------------------------- 9

134. Список литературы ------------------------------------------------- 10981. Введение

135. Освещая проблему механизма действия растворов кластерного серебра на условно-патогенные и патогенные микроорганизмы, можно объективно оценить его воздействие на популяционном уровне.2. Сущность метода

136. Сущность метода заключается в исследовании непосредственного влияния растворов различных химических агентов на морфологию популяций бактерий с использованием сканирующей электронной микроскопии.