Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологические свойства изолятов Listeria monocytogenes, выделенных из различных объектов и территорий

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства изолятов Listeria monocytogenes, выделенных из различных объектов и территорий"

УДК: 619:616.98:579.869.1

На правах рукописи

СУНЯЙКИН АЛЕКСАНДР ИВАНОВИЧ

Биологические свойства изолятов Listeria monocytogenes, выделенных из различных объектов и территорий

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук И. Ю. Егорова

Покров 2010

1 3 НОЯ 2010

004613125

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии).

Научный руководитель:

кандидат ветеринарных наук (ГНУ ВНИИВВИМ Россельхозакадемии)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор (ФГУ ВНИИЗЖ) доктор ветеринарных наук (ГНУ ВНИИВВИМ Россельхозакадемии)

Ведущая организация:

Егорова Ирина Юрьевна

Прунтова Ольга Вячеславовна Кушнир Анатолий Тимофеевич

ФГУ Всероссийский Государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ)

Защита диссертации состоится «25» ноября 2010 г. в «13.00 » часов на заседании диссертационного совета при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, Владимирская обл., Покров, ГНУ ВНИИВВиМ. Тел/факс: (49243)62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ. Автореферат разослан « 20 » октября 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета, ГНУ ВНИИВВИМ Россельхозакадемии кандидат биологических наук Е.А. Балашова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Проблема листериоза до настоящего времени остается актуальной. Это обусловлено широкой распространенностью листерий в природе, полиморфизмом клинических проявлений болезни, высоким уровнем летальности при генерализированных формах инфекции, а так же экономическим ущербом, наносимым сельскому хозяйству заболеваемостью и падежом животных [И. С. Тартаковский, 2000].

Существующие в настоящее время схемы осуществления надзора за листериозом рассматривают все выделенные изоляты L. monocytogenes как в равной степени патогенные, однако многочисленные наблюдения показали, что вирулентность различных штаммов варьирует [S. Roche, et al., 2004; Москаленко В. Ф., 2006; С. Buchrieser, 2004]. Как правило, снижение вирулентности возбудителя наблюдают при нахождении его в сапрофитической фазе развития. Большинство эпидемических вспышек пищевого листериоза этиологически связаны с относительно узкой филогенетической группой изолятов внутри вида Listeria monocytogenes, характеризующихся принадлежностью к серогруппам 4Ь, 1/2а, 1/2с и 1/2Ь. При этом все основные вспышки пищевого листериоза и спорадические случаи у людей вызваны штаммами серовара 4Ь. На основании этого рядом ученых высказано предположение о вероятном наличии у штаммов данного серовара уникальных вирулентных свойств. Наряду с высоковирулентными культурами в природе выявляются низковирулентные изоляты L. monocytogenes с так называемым «неинвазивным» фенотипом, роль которых в эпидемическом и эпизоотическом процессах до конца остается не ясной. Также пока остаются невыясненными особенности биологических свойств L.monocytogenes, обитающих в разных экологических условиях. Таким образом, вопрос о патогенных свойствах листерий, выделяемых из различных объектов, является актуальным.

Работы последних десятилетий показывают, что L. monocytogenes

з

претерпевает адаптационные изменения, особенно под воздействием антропогенных факторов (бесконтрольное применение антибиотиков, консервантов, дезинфицирующих средств и т.п.), которые выражаются в изменении биологических свойств. В основном они проявляются резистентностью к антибактериальным препаратам определенных групп, способностью формировать биопленки, появлением авирулентных и слабовирулентных мутантов [Т. И. Карпова, С. А. Ермолаева, 2001; С. Morvan et al., 2010; S. A. Granier et al., 2010; S. Monden et al., 2010; S. Roche etal., 2004; I. Secic, 2010].

Учитывая вышеизложенное, изучение биологических свойств изолятов L. monocytogenes, выделенных из различных источников и на разных территориях позволит отследить изменение фенотипических и генетических характеристик культур, расширить спектр тестов внутриродовой дифференциации листерий, усовершенствовать схемы индикации и идентификации данного патогена, выявить ведущие внутривидовые варианты L. monocytogenes, характерные для сапрофитической и паразитической фазы его развития.

Цель и задачи исследований

Целью данной работы являлась комплексная характеристика изолятов листерий, выделенных из различных объектов в территориально отдаленных регионах в разные временные промежутки времени, с использованием традиционных и новейших микро- и молекулярно-биологических методов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить культурально-морфологические и биохимические свойства исследуемых штаммов/изолятов L. monocytogenes.

2. Изучить фенотипические проявления признаков штаммов/изолятов L. monocytogenes, ассоциируемых с патогенными и персистентными свойствами бактерий.

3. Охарактеризовать штаммы/изоляты по вирулентности для белых

аутбредных мышей и вьивить коррелятивную зависимость между продукцией in vitro основных факторов патогенности листерий с вирулентностью культур.

4. Провести в сравнительном аспекте молекулярно-генетическое исследование штаммов/изолятов L. monocytogenes с целью получения их генетических характеристик.

Научная новизна работы

В сравнительном аспекте представлена комплексная характеристика микробиологических и молекулярно-генетических особенностей бактерий вида L. monocytogenes, выделенных из различных объектов на территории бывших СССР и ФРГ. Изучены биологические свойства впервые выделенного на территории РФ из головного мозга пятнистого оленя естественно аттенуированного изолята L. monocytogenes. Предложена схема дифференциации L. monocytogenes по показателям LD]00 и LD5() для белых аутбредных мышей. С помощью метода REA PFGE выявлены три основных пульс-электротипа (ПЭТ I, II, III), характерные для изолятов L. monocytogenes циркулировавших на территории бывшего СССР в период с 1943 по 1976 г.г.

Практическая значимость результатов исследования

Результаты экспериментальной работы использованы при разработке «Методических рекомендаций по комплексной оценке культур Listeria monocytogenes на основе изучения фенотипических и генетических характеристик», одобренных Ученым советом и утвержденных директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 07.07.10 г.

Определены генетические особенности и составлены генетические паспорта на все исследуемые штаммы/изоляты L. monocytogenes.

Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту

Фенотипическая и генетическая вариабельность штаммов/изолятов L. monocytogenes, выделенных из различных объектов и территорий.

Неоднородность вида L. monocytogenes в проявлении вирулентных

5

свойств для белых аутбредных мышей.

Апробация и публикация результатов

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2006-2009 гг.).

Материалы диссертации доложены на международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ГНУ ВНИИВВиМ: «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008); международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование: вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии, ВСЭ, биотехнологии» (Ульяновск, 2009); международной научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 70-летию со дня рождения члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И. Ф. (Покров, 2009).

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринария» и 1 статья «Журнале микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии», включенных в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Личный вклад автора в выполнении работы

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники института: к.в.н. И. Ю. Егорова (освоение микробиологических методов), д.б.н., профессор Ю. О. Селянинов (освоение молекулярно-генетических методов).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 106 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц, 14 рисунков. Список цитированной литературы включает

107 источников, из которых 50 иностранных авторов.

6

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Работа выполнена в лабораториях «Бактериологии» и «Экспериментальной микробиологии» Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии. В работе использованы 16 культур L. monocytogenes, выделенных из различных источников на территории бывшего СССР и за рубежом (ФРГ) в разные промежутки времени - с 1943 по 2006 г.г. (таблица

Таблица 1. Характеристика культур L. monocytogenes, использованных в работе____

№ п/п Условное обозначение штамма/изолята Объект выделения Дата выделения/поступления в музей бактериальных штаммов, г Место выделения

1 изолят «Х-2» Подсвинок 1943 СССР, Краснодарский край, г. Армавир

2 изолят 11 Крыса 1956 Украинская ССР, г. Киев

3 изолят 58 Мышь - полевка 1976 СССР, Читинская область, г. Чита

4 изолят 256 Обыкновенная полевка 1957 Украинская ССР, г. Киев

5 изолят156 Вода 1956/1971 СССР

6 изолят197 Клещи рода БегтаШсетег 1955/1971 Украинская ССР, г. Киев

7 штамм «А» Пастбищные клещи 1952 Казахская ССР, г. Алма-Ата

8 изолят 355 Лошадь 1965 СССР, г. Москва

9 изолят 588 Курица 1959 ФРГ

10 изолят 733 Кошка 1959 ФРГ

11 изолят 1832 Белка 1955 СССР, Новосибирская область, г. Новосибирск

12 изолят «Почва» почва прифермер-ского участка 1964 ТССР, Азиакаевский район

13 изолят 259-JI Крупный рогатый скот 1973 н/и

14 изолят 41-06 Пятнистый олень 2006 РФ, Калужская область

15 изолят 212 Шиншилла 1970 СССР, г. Москва

16 изолят 69-06 Лещ 2006 РФ, Тверская область

Примечание: н/и — не известно.

При выполнении ряда экспериментальных исследований использовали референс-штаммы L. monocytogenes I и II серогруппы №№ 766 и 634 соответственно, штаммы Staphylococcus aureus 209-Р, энтеропатогенный штамм Escherichia coli серотипа 0157:Н7, Citrobacter

freundii, Proteus mirabilis, Micrococcus luteus № 4698 ATCC.

Для культивирования и изучения биологических свойств листерий использовали ростовые и дифференциально-диагностические среды - ДТСА и ДТСБ; СМА и СМБ; агар для определения подвижности листерий; агар Мюллера-Хинтона; агар для теста на ДНК-азу с толуидиновым синим; среда Кларка; цитратный агар Симмонса; уреазный агар по Кристенсену; желатина 10%; среда Гисса с содержанием 1% углеводов, многоатомных спиртов и индикатора Андреде.

Определение патогенных свойств листерий проводили на аутбредных белых мышах, живой массой 14-16 г и морских свинках, живой массой 300-400 г. Для тестирования гемолитической активности использовали эритроциты кроликов (массой 2,5-3 кг) и баранов 2-3-х летнего возраста (массой 42-45 кг). Содержание и кормление животных проводили согласно принятым нормам. В исследованиях использовали только клинически здоровых животных. Животные контрольных и опытных групп формировались по принципу аналогов, были одного пола, возраста и получены из питомника одновременно.

Изучение культурально-морфологических, биохимических и патогенных свойств исследуемых культур проводили по общепринятым методам, а также в соответствии с «Методическими рекомендациями по лабораторной диагностике листериоза у животных и людей» (1996). Антигенные свойства культур устанавливали в пластинчатой реакции агглютинации с использованием поливалентной и серогрупповых листериозных сывороток, а также постановкой пробы фага с применением специфических листериозных бактериофагов L-2A и L-4A (ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров).

Гемолитическую активность листерий определяли на классическом кровяном однослойном и двухслойном кровяных агарах (патент на изобретение № 2318022 от 27.02.2008 г.).

Лецитиназную активность тестировали с использованием твердых

питательных сред (ALOA-arap, желточный и угольный агары) и жидкой 8

среды Дрожжевкиной. Учет результатов проводили через 24, 48, 72 часа. Полуколичественную оценку экспрессии гемолизинов и лецитиназ проводили согласно «Методическим рекомендациям по определению гемолитической активности культур рода Listeria» (Покров, 2005).

Антикомплементарную активность определяли по методике радиального гемолиза в геле [Ю. А. Брудастов, 1996]. Наличие продукции дезоксирибонуклеаз изучали на агаре для теста на ДНК-азу с толуидиновым синим. Антилизоцимную активность выявляли чашечным методом с использованием принципа «отсроченного антагонизма» [О. В. Бухарин, 1984].

Чувствительность культур к антибактериальным препаратам выявляли в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам».

Патогенность культур определяли постановкой качественного теста -кератоконъюнктивальной пробы на морских свинках. Вирулентность оценивали путем вычисления показателей LD,00 и LD50 в биопробах на беспородных белых мышах. Величину LD50 рассчитывали по формуле Кербера в модификации И. П. Ашмарина и А. А. Воробьева.

Выделение бактериальной ДНК для постановки ПЦР проводили методом нуклеосорбции с использованием коммерческого «Набора ДНК-сорб» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва). Детекцию Н1у-гена проводили с использованием коммерческой ПЦР тест-системы «Листер» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва).

Геномный полиморфизм изучали методом рестрикционного анализа и разделения фрагментов рестрикции электрофорезом в пульсирующем поле (PFGE) с использованием набора реагентов GENPATH (BIO-RAD) согласно инструкции по применению. При расщеплении ДНК исследуемых культур использовали эндонуклеазы рестрикции Smal и Ара 1. Для определения размеров рестрицированных фрагментов использовали маркер молекулярной массы - стандарт лестницы ДНК фага X (50-500 т.п.о).

Фрагменты ДНК разделяли в 1% геле агарозы электрофорезом в

9

пульсирующем поле на аппарате CHEF Mapper ТМ (BIO-RAD) в течение 1820 часов при 6 v/см. Гель окрашивали в растворе этидиума бромида, документировали изображение с помощью системы BioRad и анализировали в программе Gel-Pro 3.1. Определение степени генетического родства проводили с использованием коэффициента Дайса, а филогенетических отношений и построение дендрограмм проводили с применением пакета прикладных программ PHYLIP.

Анализ и статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами, используемыми в биологии [Лакин Г.Ф., 1980]. Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по разностному методу Стьюдента-Фишера. При обработке результатов использовали пакет прикладных программ Statgraphics, версия 2.1.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Биологические свойства штаммов/изолятов L. monocytogenes В результате изучения тинкториальных и культурально-морфологических свойств культур установлено, что все они соответствовали характеристикам типового штамма рода Listeria.

В отношении популяционной гетерогенности наиболее однородными являлись популяции культур №№ Х-2, 197, 11, 156, 733, 1832, 259-Л. В популяции этих штаммов количество колоний S-форм составляло 88,87 -99,32%, переходных SR-форм - от 0,68 до 11,13%. Популяционный состав изолята, выделенного от пятнистого оленя, и штамма «А», наоборот, были представлены преимущественно переходными RS-формами - 86,87 и 69,23%, соответственно. Остальная часть колоний приходилась на долю R-форм.

Наибольшей гетерогенностью популяционного состава обладала культура №212, выделенная от шиншиллы. В основном ее популяция была представлена колониями S-форм - 81,75%, на долю RS- и R-форм приходилось 16,79% и 1,46% колоний, соответственно.

При определении подвижности микробных клеток установлено, что

все культуры, за исключением одной, выделенной от пятнистого оленя (№4106), обладают ярко выраженной подвижностью при культивировании в условиях комнатной температуры (22±1)°С и отсутствием таковой при культивировании при (37±1)°С. Изолят №41-06 обладал подвижностью при обоих температурных режимах.

По способности продуцировать оксидазу, Н28, индол, каталазу, сбраживать глюкозу, образовывать ацетилметилкарбинол, отсутствию выраженной протеолитической активности, редукции цитратов на среде Симмонса, расщеплению мочевины на агаре Кристенсена и восстановлению нитратов до нитритов все штаммы/ изоляты между собой не отличались.

Изучение гликолитической способности штаммов показало, что все они без исключения характеризуются мономорфностью проявления ферментативной активности в отношении следующих Сахаров: в первые 24 ч ферментировали с образованием кислоты без газа глюкозу, мальтозу, рамнозу, салицин, эскулин, фруктозу и через 48 ч лактозу. В течение 10 суток (время наблюдения) все культуры не разлагали маннит, дульцит, арабинозу, инозит, галактозу, ксилозу, раффинозу и глицерин. Основное различие штаммов в гидролазной активности заключалось в их способности сбраживать сахарозу. Так, все изучаемые культуры можно подразделить на 2 группы: ферментирующие сахарозу и не ферментирующие этот углевод. Сахарозу сбраживали до образования кислоты без газа 6 культур листерий: выделенные от белки, пастбищных клещей, лошади, курицы, кошки и из воды. Остальные культуры этот углевод не ферментировали.

При серотипировании культур было установлено, что большинство из них относилось к I серологической группе, тогда как изоляты, выделенные от пятнистого оленя, шиншиллы, КРС и курицы - ко II серогруппе. Дополнительно серологическую принадлежность культур подтверждали лизисом специфическими листериозными фагами. Результаты фаготипирования совпали с результатами пластинчатой РА. Культуры, типированные в РА как представители I серогруппы, вступали в

п

специфическое взаимодействие с фагом L2A и не лизировались фагом L4A, и наоборот. Однако 2 культуры (№ 588 и Х-2), не лизировались обоими фагами, что может свидетельствовать о присутствии в их геноме профага или отсутствии рецепторов для связывания.

Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что выявленные отличия в гетероморфности популяционного состава, ферментации сахарозы были присущи изолятам/штаммам, выделенным из организма резистентных животных (шиншилла, пятнистый олень) и переносчиков листериоза (пастбищные клещи). Культуры, выделенные от естественно восприимчивых животных, листерионосителей (рыба), объектов внешней среды характеризовались типичностью проявления изученных фенотипических признаков.

Изучение фенотипических признаков, ассоциируемых с патогенностью

Известно, что листерии продуцируют ряд внеклеточных токсинов, рассматриваемых в качестве потенциальных факторов патогенности. К основным из них относят продукцию гемолизинов и лецитиназ. В настоящее время известно, как минимум, 2 экзотоксина, обладающих гемолитической активностью: тиолактивируемый цитолизин О (LLO), нарушение продукции которого приводит к потере вирулентности и листериолизин S, обнаруженный недавно у эпидемически значимых «диких» штаммов, и усиливающий вирулентность культур. Последний из гемолизинов практически невозможно получить в обычных лабораторных условиях [D. А. Portnoy et al., 1988; Р. Cossart et al„ 1989; С. Hill, 2010].

В своей работе для определения гемолитической активности использовались классический однослойный и двуслойный кровяные агары. При определении гемолитической активности на классическом однослойном кровяном агаре у всех изучаемых культур, за исключением изолята №41-06, через 48 ч инкубирования посевов, отмечали просветление среды под колонией и формирование узкой, слабо различимой, зоны гемолиза вокруг 12

колоний. Использование в работе двуслойного кровяного агара позволило выявить различия в экспрессии ферментов, обладающих гемолитической активностью (табл. 2).

Таблица 2 Экспрессия гемолизинов и фосфолипаз культурами L. monocytogenes (через 48 часов инкубирования)

п=3

№№ п/п Условное обозначение культуры 2-слойный кровяной агар ALOA-arap

Уровень экспрессии гемолизинов Соотношение Гк/WreM Уровень экспрессии фосфолипаз Соотношение Гц/Wnp

1 Х-2 средний 1,28±0,21 высокий 0,39±0,07

2 № 11 средний 1,31±0Д8 высокий 0,63±0,14

3 №58 низкий 2,38±0,26 высокий 0,51±0,15

4 №256 средний 1,62±0,44 высокий 0,48±0,12

5 № 156 средний 1,52±0,37 высокий 0,69±0,19

6 № 197 средний 1,20±0,24 высокий 0,70±0,14

7 «А» средний 1,94±0,34 высокий 0,71±0,18

8 №355 низкий 2,61±0,39 высокий 0,64±0,14

9 №588 средний 1,56±0,34 высокий 0,46±0,10

10 №733 средний 1,33±0,17 высокий 0,58±0,11

11 № 1832 низкий 2,61±0,31 высокий 0,73±0,13

12 «Почва» низкии 3,91±0,55 высокии 0,58±0,19

13 № 259-Л низкий 2,18±0,57 высокий 0,46±0,14

14 №41-06 отсутствует - отсутствует -

15 №212 средний 1,43±0,07 высокий 0,44±0,06

16 69-06 средний 1,81±0,28 высокий 0,53±0,03

Примечание: соотношение гк/Ч\'г— соотношение радиуса колонии к ширине зоны гемолиза/преципитации.

Гк^гем(пр)= 0-1 - высокий уровень продукции экзотоксинов;

г^ге„(пр)= 1-2 - средний уровень продукции экзотоксинов;

ГцЛУгсм(пр)= >2 - низкий уровень продукции экзотоксинов.

5 из 16 исследуемых культур экспрессировали гемолитически активные вещества на низком уровне, а 10 - на среднем. Все культуры синтезировали гемолизины, вызывающие распад эритроцитов по Р-типу. Изолят № 41-06 не вырабатывал экзотоксины, вызывающие деградацию красных кровяных телец.

Поскольку за синтез ЬЬО у листерий отвечает Н1у-ген, для его детекции с целью подтверждения специфического лизиса эритроцитов из всех исследуемых культур листерий была выделена тотальная ДНК и

протестирована методом ПЦР. При постановке ПЦР установлено, что на ДНК-матрицах всех без исключения, в том числе и гемнегативного in vitro изолята № 41-06, апмлифицировались специфические ПЦР-продукты, соответствующие расчетным значениям Hly-гена. Выявление нами в геноме изолята, выделенного от пятнистого оленя, «молчащего» Hly-гена возможно обусловлено нарушениями в регуляции его работы и представляет определенный научный интерес в изучении механизмов инвазивности и патогенности данного микроорганизма.

Вторым важнейшим фактором патогенности листерий является продукция ими лецитиназ, в частности, фосфолипазы С, необходимой для выживания и размножения листерий в процессе внутриклеточной инфекции. При определении лецитиназной активности изучаемых культур нами выявлены незначительные отличия. На среде Дрожжевкиной на протяжении 10 суток культивирования у 15 из 16 испытуемых культур не наблюдалось каких-либо видимых реакций, в то время как изолят Х-2, через 36-48 ч инкубирования вызывал незначительное просветление среды и формирование на поверхности пробки в виде уплотненной желтоватой творожистой массы. Через 96 ч в пробирке отмечали полное просветление среды и увеличение пробки на поверхности среды. Этот же штамм при культивировании на твердых питательных средах вырабатывал фермент лецитиназу на высоком уровне (табл. 2).

На желточно-угольном агаре все исследуемые культуры, кроме изолята №41-06, синтезировали ферменты, расщепляющие лецитин куриного желтка. Вокруг колоний наблюдали четко различимую зону преципитации желтка шириной 2-4 мм, которая через 48 ч достигала 6-10 мм. Примечательным на наш взгляд являлся тот факт, что штамм «А», выделенный от пастбищных клещей, при культивировании на угольном агаре синтезировал пигмент нежно-розового цвета по периферии колонии.

Дополнительно продукцию фосфолипазы С оценивали на коммерческой хромогенной среде - ALOA-arape. На этом агаре все

14

изучаемые культуры, за исключением изолята №41-06, продуцировали фосфолипазу на высоком уровне, что выражалось в формировании вокруг колоний зоны помутнения шириной 2-5 мм. Данные по полуколичественной оценке экспрессии фосфолипазы С представлены в табл. 1.

Определение чувствительности культур L. monocytogenes к антибактериальным препаратам

Для определения антибиотикограммы нами проведены работы по изучению чувствительности культур к антибактериальным препаратам 19 различных групп: пенициллинам, цефалоспоринам, аминогликозидам, хинолонам фторированным, макролидам, линкозамидам, тетрациклинам, гликопептидам, ингибиторам биосинтеза фолиевой кислоты, полимиксинам и бацитрацину.

Независимо от источника выделения, все тестируемые культуры L. monocytogenes показали высокую чувствительность к антибактериальным препаратам из групп фторированных хинолонов (ципрофлоксацин), макролидов (эритромицин), тетрациклинов (тетрациклин), пенициллинов (ампициллин, бензил-пенициллин). Высокую и среднюю - из группы цефалоспоринов (цефаклор, цефотаксим), аминогликозидов (стрептомицин, неомицин, гентамицин, амикацин); фторированных хинолонов (офлоксацин), гликопептидов (ванкомицин), бацитрацину и ингибиторов биосинтеза фолиевой кислоты (триметоприм). Среднюю чувствительность - к линкозамидам (клиндамицин). К препаратам из группы полимиксинов 2 культуры («А» и Х-2) были слабочувствительны, а 14 не чувствительны. Три культуры (№№ 197, 11, 256) были слабочувствительны к клиндамицину и 2 (№№ 11 и 256) - к стрептомицину.

В целом, чувствительность культур к антибактериальным препаратам не отличалась от общеизвестной, за исключением того, что все культуры были восприимчивы к воздействию препаратов цефалоспоринового ряда, что вероятно объясняется тем, что рабочая коллекция содержит изоляты, выделенные в период с 1943 по 1976 г.г. когда применение этих препаратов

15

не проводилось, и от диких животных, не подвергающихся антибактериальной терапии.

Изучение фенотипических признаков, ассоциируемых с персистенцией патогенов

К факторам, обуславливающим персистентные свойства бактерий, относят наличие у них антикомплементарной, антилизоцимной и ДНК-азной активностей. Данные о наличии этих свойств у листерий либо очень скудны, либо отсутствуют вообще.

Для определения антикомплементарной активности использовали методику радиального гемолиза в геле [Ю. А. Брудастов, А. В. Валышев, А. Н. Брудастов, 1996]. Инактивирующее воздействие супернатантов бульонных культур оценивали против комплемента морской свинки в разведениях от 1:10 до 1:200. В результате проведенных исследований установлено, что супернатанты всех испытуемых культур листерий были не способны преодолевать инактивирующие воздействие комплемента морской свинки во всех разведениях - от 1:10 до 1:200., в то время как контрольный штамм S. aureus такой активностью обладал.

Антилизоцимную активность культур выявляли чашечным методом с

использованием принципа «отстроченного антагонизма», применяемого для

выявления бактериоциногенных свойств бактерий. Предварительно

определяли оптимальную концентрацию лизоцима в среде. В качестве

контрольной тест-культуры использовали Е. coli серотипа 0157:Н7. В

результате предварительных испытаний было установлено, что при конечной

концентрации лизоцима в среде 0,5 мкг/см3 и менее наблюдается рост на

поверхности покрывного агара тест-культуры Micrococcus luteus № 4698

АТСС, поэтому в дальнейших исследованиях для тестирования

антилизоцимной активности использовали концентрацию лизоцима 1,0

мкг/см3. Интересным на наш взгляд фактом является продукция культурами

листерий бактериоциноподобных веществ при концентрации в среде

лизоцима 0,5 мкг/см3, что выражалось в подавлении роста тест-культуры 16

Micrococcus luteus вокруг колоний листерий (рис. 1).

Рисунок I Продукция бактериоцинов культурами L. monocytogenes на агаре для определения АЛЛ

Примечание: вокруг и поверх колоний испытуемых культур листерий наблюдается ингибиция роста Micrococcus luteus.

В результате проведенных экспериментов нам не удалось выявить наличие продукции ферментов, расщепляющих лизоцим, у всех 16 исследуемых культур.

При выявлении ДНК-азной активности установлено, что использование коммерческой среды не позволило выявить ее у изучаемых культур, в то время как вокруг колонии контрольной культуры St. aureus 209-Р наблюдалась прозрачная зона деградации ДНК.

Таким образом, в результате изучения фенотипических признаков, ассоциируемых с персистенцией, установлено, что все исследуемые культуры были не способны преодолевать инактивирующее действие комплемента морской свинки и вырабатывать вещества, вызывающие разрушение ДНК и лизоцима.

Определение патогенных свойств листерий

Классически патогенность листериозных культур принято определять качественным методом путем постановки кератоконъюнктивальной пробы на морских свинках. При постановке пробы Антона нами установлено, что 14 изолятов вызывали формирование гнойного кератоконъюнктивита в течение 3-5 суток после инокуляции возбудителя. Две культуры, выделенные от

пятнистого оленя и пастбищных клещей («41-06» и «А»), не вызывали изменений конъюнктивы и роговицы глаза зараженных морских свинок в течение 15 суток наблюдения.

Более объективной оценкой вирулентности является определение показателей ЬО100 и ЬВ50 для лабораторных животных. Наиболее доступной моделью для изучения степени патогенности листерий является белая мышь, поэтому в своих экспериментах вирулентность культур определяли на беспородных белых мышах по общепринятой методике.

В результате проведенных экспериментов установлено, что исследуемые культуры отличались друг от друга по показателям ЬО100 и 1ЛЭ50. На основании этого нами были предложены 2 схемы дифференциации изолятов листерий по показателям ЬЭюо и 1Л}50. С использованием показателя 1ЛЭ100 штаммы удалось распределить на 3 группы: для штаммов первой группы показатель ЬБюо составил 107 КОЕ, для второй - 108 КОЕ и третьей - свыше 109 КОЕ (табл. 2).

По показателям ЬО50 изоляты разделились на 4 группы. Условно их можно подразделить на следующие (табл. 2):

• высоковирулентные штаммы - ЬО50 в пределах от 104 до 105 КОЕ;

• вирулентные штаммы - ЬО50 составляет 106 КОЕ;

• умеренновирулентные - ЬЭ50 составляет 107 КОЕ;

• слабовирулентные - 1ЛЭ50 составляет 108 КОЕ.

• авирулентные - показатель ЬО50 не титруется (ЬБюо свыше 109 КОЕ)

Оценка степени корреляции между признаками

В связи с тем, что в Российской Федерации как таковая схема дифференциации листерий по показателям 1ЛЭюо и ЬО50 отсутствовала, то для нас представляло интерес выявление корреляционной связи между исследованными фенотипическими признаками и вирулентностью культур.

Для оценки степени взаимосвязи фенотипических признаков с

вирулентностью использовали наиболее вариабельные свойства культур:

гетерогенность популяции, гемолитическая и фосфолипазная активности. 18

Таблица 2 Дифференциация культур L. monocytogenes по степени патогенности

№ п/п Условное обозначение штамма/ изолята Дифференциация с использованием показателя ЬО((ю Дифференциация с использованием показателя 1Л350

Величина ЬОюо (кол-во КОЕ) Оценка патогенности Величина ЬБ50 (кол-во КОЕ) Оценка патогенности

1. Х-2 7,42x107 Вирулентный 7,82х105 Высоковирулентный

2. № 11 2,76х107 Вирулентный 1,24x10" Вирулентный

3. №58 1,22х108 Умеренновирулентный 1,25x10" Вирулентный

4. №256 7,0х108 Умеренновирулентный 4,76x10' Умеренновирулентный

5. № 156 6,75x10' Вирулентный 4,26x105 Высоковирулентный

6. № 197 1,60x10' Вирулентный 6,40x105 Высоковирулентный

7. «А» >10* Авирулентный Не титруется Авирулентный

8. №355 1,42x107 Вирулентный 6,67x10" Высоковирулентный

9. №588 1,41x10' Вирулентный 2,96x10" Высоковирулентный

10. №733 1,62x108 Умеренновирулентный 1,0x10" Вирулентный

11. № 1832 1,24x10* Умеренновирулентный 1,16x10" Вирулентный

12. «Почва» 4,45x10" Умеренновирулентный 9,33x105 Вирулентный

13. № 259-Л 8,94x10' Вирулентный 3,75x10" Вирулентный

14. №41-06 >10* Авирулентный Не титруется Авирулентный

15. №212 5,03x10' Вирулентный 1,01x10' Умеренновирулентный

16. 69-06 4,0x10' Вирулентный 1,0x10' Умеренновирулентный

Учитывая, что не все из исследованных нами фенотипических признаков имели количественное выражение, оценку взаимосвязи между признаками определяли с использованием коэффициента корреляции рангов Спирмена. С вероятностью 99% установлена прямая сильная (г>0,5) степень корреляции уровня продукции листериолизина О (LLO) и фосфолипазы С (Pic С), гомогенности популяции с вирулентностью L. monocytogenes (табл. 3). Чем выше уровень гемолитической и фосфолипазной активности, гомогенности популяции листерий, тем выше показатель вирулентности данного патогена. Для штаммов, популяции которых состоят на 99% из колоний S-форм, характерна повышенная продукция основных экспрессируемых факторов патогенности (листериолизина О и фосфолипазы С). Также отмечена высокая степень корреляции между гемолитической активностью L. monocytogenes и ее способностью синтезировать фосфолипазу С.

Таблица 3 Оценка степени взаимосвязи между признаками с использованием коэффициента корреляции рангов Спирмена

п=16

Hly Pic Ph LDioo

Н1у - 0,72 0,56 0,56

Р1с - 0,82 0,68

Ph - 0,62

LDioo -

Примечание: Н1у - гемолитическая активность, Р1с - фосфолипазная активность, Ph (population heterogeneity) - гетерогенность популяции, LDioo- доза, вызывающая гибель 100% взятых в опыт животных.

Исследование геномного полиморфизма культур L. monocytogenes методом рестрикционного анализа с использованием электрофореза в пульсирующем поле

Для оценки генетической вариабельности листерий применяется несколько методов, основанных на использовании различных вариантов полимеразной цепной реакции, секвенирования и рестрикционного анализа. Одним из наиболее информативных методов генотипирования

является метод рестрикционного анализа с разделением фрагментов электрофорезом в пульсирующем поле (REA PFGE), позволяющий проводить сравнение изолятов на уровне всего генома.

Для изучения генетического разнообразия культур использовали ДНК, иммобилизованную в агарозные блоки, которую в дальнейшем подвергали рестрикции ферментами Ара I и Sma I.

В результате проведенных исследований установлено, что профили рестрикции исследуемых геномных ДНК после расщепления вышеуказанными рестриктазами и дальнейшем электрофорезе в пульсирующем поле содержали от 17 до 21 фрагментов ДНК.

В целом, результаты распределения культур по пульс-электротипам для обеих рестриктаз совпадали.

Степень различия рестрикционных профилей оценивали по числу общих и различающихся фрагментов, с вычислением коэффициента Дайса (Dice's distance).

Результаты оценки генетического родства штаммов/изолятов L. monocytogenes представлены в табл. 4. Все исследуемые культуры разделились на 8 генетических групп, имеющих различающиеся между собой пульс-электротипы.

В первую группу вошли три культуры - №№ 197, «Почва», 11, выделенные на территории бывшей Украинской и Татарской ССР в период с 1955 (№№ 197 и 11) по 1964 («Почва») годы, которые имели идентичные пульс-электротипы (коэффициент Дайса 0,0). Родственными для этой группы были два изолята - №№ 256 и 1832 (коэффициент Дайса 0,03), выделенные на территории Украинской ССР и Новосибирской области. Данные изоляты имели идентичные друг с другом пульс-электротипы и отличались от первых трех отсутствием одного фрагмента.

Вторую генетическую группу формировали изоляты №№ 58, 156 и Х-2 (коэффициенты Дайса 0,05 и 0,03), выделенные на территории бывшего СССР, в Читинской области и Краснодарском крае в период с

1943 по 1976 г.г.

Третья группа представлена изолятом № 733, выделенным от кошки и штаммом «А», изолированным от пастбищных клещей на территории Казахской ССР (коэффициент Дайса 0,19). Четвертая группа была образована, возможно, родственными изолятами №№ 355 и 41-06, выделенными от лошади и пятнистого оленя в Московской и Калужской областях (коэффициент Дайса 0,19).

Остальные группы были представлены одним представителем. Уникальные пульс-электротипы формировали культуры, выделенные от рыбы, курицы, шиншиллы и крупного рогатого скота. Наиболее отличающимся по филогенетическим отношениям являлся изолят № 588, выделенный от курицы на территории бывшего ФРГ.

Филогенетические отношения изученных культур представлены на рис. 2.

- I__m .588

- L.m.212

- L.m.41 —OS

_ - L.m.355

L.m. 1 1 L.m.Soil L.m.197 r L.m. 1 S32 ' L.m.256 Г - L.m. 1 56

- L.m.X-2

--— - L.m.58

L - L.m.69 —Об

_1- L.m.733

'-—- L.rn.Ar

— L.m.259L

Рисунок 2. Дендрограмма, отражающая филогенетические отношения исследуемых культур L. monocytogenes

Таблица 4 Оценка степени генетического родства культур L. monocytogenes с использованием коэффициента Дайса

Условное обозначение культуры 197 Почва 11 355 Х-2 69-06 41-06 А 588 156 733 212 256 58 1832 259-Л

197 - 0 0 0,38 0,27 0,23 0,42 0,42 0,46 0,25 0,33 0,32 0,03 0,25 0,03 0,32

Почва - 0 0,38 0,27 0,23 0,42 0,42 0,46 0,25 0,33 0,32 0,03 0,25 0,03 0,32

11 - 0,38 0,27 0,23 0,42 0,42 0,46 0,25 0,33 0,32 0,03 0,25 0,03 0,32

355 - 0,30 0,32 0,19 0,30 0,45 0,33 0,26 0,35 0,4 0,38 0,37 0,30

Х-2 - 0,35 0,38 0,38 0,64 0,03 0,35 0,33 0,25 0,22 0,25 0,43

69-06 - 0,24 0,35 0,46 0,38 0,26 0,30 0,26 0,38 0,31 0,30

41-06 - 0,22 0,43 0,53 0,24 0,28 0,35 0,37 0,35 0,23

А - 0,37 0,47 0,19 0,33 0,30 0,37 0,30 0,33

588 - 0,51 0,39 0,29 0,39 0,51 0,39 0,32

156 - 0,38 0,37 0,28 0,05 0,33 0,46

733 - 0,35 0,32 0,33 0,32 0,35

212 - 0,35 0,37 0,35 0,24

256 - 0,33 0 0,30

58 - 0,35 0,41

1832 - 0,30

259-Л -

Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что на территории бывшего СССР в период с 1943 по 1976 г.г. циркулировали изоляты L. monocytogenes, относящиеся к 4 пульс-электротипам. Выявление идентичных ПЭТ, общих для нескольких независимых между собой изолятов свидетельствует об общности их происхождения. Установленное генетическое родство отечественных и зарубежных изолятов может являться свидетельством либо широкого распространения изолятов такого типа, либо заноса возбудителя из одной страны в другую.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что наименьшая вариабельность проявления фенотипических признаков характерна для культур, изолированных от восприимчивых животных, а наибольшая - для изолятов, выделенных из организма естественно резистентных животных (шиншилла, пятнистый олень, пастбищные клещи).

2. Штаммы/изоляты L. monocytogenes имеют различия в продукции гемолитически активных веществ (листериолизина О). Из 16 изученных культур 5 экспрессировали гемолизины на низком уровне, а 10 - на среднем. Изолят, выделенный от пятнистого оленя, не вызывал деградации красных кровяных телец.

3. Корреляционным анализом установлена прямая сильная взаимосвязь (г>0,5) показателей вирулентности культур (LDioo и LD50) для белых аутбредных мышей с однородностью популяции (форма колоний) и уровнями продукции основных экспрессируемых факторов патогенности (листериолизина О и фосфолипазы С).

4. Выделение изолятов, содержащих в популяции 95-98% клеток в S-форме, с высоким (средним) уровнем экспрессии листериолизина О и фосфолипазы С свидетельствует о принадлежности их к вирулентным культурам.

5. Штаммы/изоляты L. monocytogenes имеют различия по

вирулентности для белых аутбредных мышей. По показателю LDioo 9 культур являлись вирулентными, 5 - умеренновирулентными и 2 - авирулентными. По показателю LD50 5 культур признаны высоковирулентными, 6 -вирулентными, 3 - умеренновирулентными и 2 - авирулентными.

6. Разработана схема дифференциации листерий по показателям вирулентности, которая позволяет объективно оценивать патогенные свойства культур L. monocytogenes и распределять их на группы.

7. При изучении генетической вариабельности изолятов L. monocytogenes с помощью метода REA PFGE выявлены 8 пульс-электротипов. Три пульс-электротипа являются общими для нескольких изолятов, циркулировавших на территории бывшего СССР в период с 1943 по 1976 г., 1 пульс-электротип образован, возможно, родственными изолятами, а 4 пульс-электротипа - уникальны.

8. Выявление идентичных пульс-электротипов для изолятов, выделенных в Украинской и Татарской СССР, в Краснодарском крае и Читинской области, в Украинской СССР и Новосибирской области свидетельствует об общности их происхождения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. На основании проведенных исследований разработаны и рекомендуются в практику научно-исследовательских учреждений «Методические рекомендации по комплексной оценке культур Listeria monocytogenes на основе изучения фенотипических и генетических характеристик», которые утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 07.07.2010 г.

2. Составлены генетические паспорта на изученные культуры L. monocytogenes.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дифференциация штаммов Listeria monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части России, на основе полиморфизма

25

генов, кодирующих факторы инвазии / Е. А. Зайцева, К. Р. Беляев, И. Ю. Егорова, А. И. Суняйкин, Н. М. Пуховская, Ю. С. Мусатов, Л. И. Иванов, Д. В. Колбасов, Г. П. Сомов, A. JL Гинцбург, С. А. Ермолаева // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008.- N 6. - С. 10-14.

2. Суняйкин, А. И. Распространение листерий в природе и носительство у человека и животных / А. И. Суняйкин // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: труды Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ВНИИВВиМ,- Покров, 2008,- С. 240-245.

3. Суняйкин, А. И. Некоторые данные об изучении персистентных свойств листерий / А. И. Суняйкин, И. Ю. Егорова // Актуальные вопросы аграрной науки и образования. Вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии, ВСЭ, биотехнологии: материалы Международной научно-практической конференции,- Ульяновск, 2009.-С. 94-97.

4. Суняйкин, А. И. Фенотипическая вариабельность штаммов Listeria monocytogenes / А. И. Суняйкин, И. Ю. Егорова // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конференции молодых ученых, посвященной 70-летию со дня рождения члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И. Ф. - Покров, 2009.-С. 162-166

5. Суняйкин, А. И. Характеристика изолятов Listeria monocytogenes, выделенных из различных объектов / А. И. Суняйкин, И. Ю. Егорова, В. А. Цыбанова // Ветеринария,- 2010.- №3.- С. 30-33.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДТСА дрожжевой триптон-соевый агар

ДТСБ дрожжевой триптон-соевый бульон

СМА сердечно-мозговой агар

СМБ сердечно-мозговой бульон

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР полимеразная цепная реакция

ПЭТ пульс-электротип

ЬЭюо доза, вызывающая гибель 100% взятых в опыт животных

ЬО50 доза, вызывающая гибель 50% взятых в опыт животных

Н28 сероводород

ЯЕАРРСЕ метод рестрикционного анализа с разделением фрагментов электрофорезом в пульсирующем поле

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области Тираж 75 экз.

Содержание диссертации, кандидата ветеринарных наук, Суняйкин, Александр Иванович

Список сокращений.

1 Введение.

1.1 Актуальность темы.

1.2 Цель и задачи исследований.

1.3 Научная новизна работы.

1.4 Практическая значимость результатов исследования.

1.5 Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту.

1.6 Апробация и публикация результатов.

1.7 Личный вклад автора в выполнении работы.

1.8 Структура и объем диссертации.

2 Обзор литературы.

2.1 Распространение листерий в природе.

2.2 Экология листерий.

2.3 Таксономия листерий.

2.4 Культурально-морфологические свойства L. Monocytogenes.

2.5 Биохимические свойства листерий.

2.5.1 Гемолитическая активность.

2.5.2 Лецитиназная активность.

2.6 Антигенные свойства листерий.

2.7 Чувствительность L. Monocytogenes к воздействию специфических фагов.

2.8 Факторы патогенности листерий.

2.9 Факторы персистенции бактерий.

2.10 Патогенность листерий.

2.11 Генетическая вариабельность листерий.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Биологические свойства изолятов Listeria monocytogenes, выделенных из различных объектов и территорий"

1.1 Актуальность темы

Проблема листериоза до настоящего времени остается актуальной. Это обусловлено широкой распространенностью листерий в природе, полиморфизмом клинических проявлений болезни, высоким уровнем летальности при генерализированных формах инфекции, а так же экономическим ущербом, наносимым сельскому хозяйству заболеваемостью и падежом животных. Интерес ученых и клиницистов к этой инфекции обусловлен также и многочисленными эпидемическими вспышками пищевого листериоза у человека, связанными с употреблением в пищу продуктов, контаминированных л истерия ми в таких развитых странах, как Франция, США, Канада, Германия, Испания и т.д. [И. С. Тартаковский; 2000].

Существующие в настоящее время схемы осуществления надзора^ за листериозом рассматривают все выделенные изоляты L. monocytogenes как в равной степени патогенные, однако-многочисленные наблюдения показали, что вирулентность различных штаммов варьирует [S. Roche, et al., 2004; Москаленко В. Ф., 2006; G. Buchrieser, 2004]. Как правило, снижение вирулентности возбудителя наблюдают при нахождении его в сапрофитической фазе развития. Большинство эпидемических вспышек пищевого листериоза этиологически связаны с относительно узкой филогенетической группой изолятов внутри вида Listeria monocytogenes, характеризующихся- принадлежностью к сероварам 4Ь, 1/2а, 1/2с и 1/2Ь. При этом все основные вспышки пищевого листериоза и спорадические случаи у людей вызваны штаммами серовара 4Ь. На основании этого рядом ученых высказано предположение о вероятном наличии у штаммов данного серовара уникальных вирулентных свойств. Наряду с высоковирулентными в природе выявляются низковирулентные изоляты L. monocytogenes с так называемым «неинвазивным» фенотипом, роль которых в эпидемическом и эпизоотическом процессах до конца остается не ясной. Также пока остаются невыясненными особенности биологических свойств L. monocytogenes, обитающих в разных экологических условиях. Таким образом, вопрос о патогенных свойствах листерий, выделяемых из различных объектов, является актуальным.

Работы последних десятилетий показывают, что L. monocytogenes претерпевает адаптационные изменения, особенно под воздействием антропогенных факторов (бесконтрольное применение антибиотиков, консервантов, дезинфицирующих средств и т.п.), которые выражаются в изменении биологических свойств. В основном они проявляются резистентностью к антибактериальным препаратам определенных групп, способностью формировать биопленки, появлением авирулентных и слабовирулентных мутантов [Т. И. Карпова, С.А.Ермолаева, 2001; С. Morvan et al., 2010; S. A. Granier et al., 2010; S. Monden et al., 2010; S. Roche et al., 2004; I. Secic, 2010].

Учитывая вышеизложенное, изучение биологических свойств изолятов L. monocytogenes, выделенных из различных источников и на разных территориях позволит отследить изменение фенотипических и генетических характеристик культур, расширить спектр тестов внутриродовой дифференциации листерий, усовершенствовать схемы индикации и идентификации данного патогена, выявить ведущие внутривидовые варианты L. monocytogenes, характерные для сапрофитической и паразитической фазы его развития.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Суняйкин, Александр Иванович

5. ВЫВОДЫ

1. Установлено, что наименьшая вариабельность проявления феноти-пических признаков характерна для культур, изолированных от восприимчивых животных, а наибольшая - для изолятов, выделенных из организма естественно резистентных животных (шиншилла, пятнистый олень, пастбищные клещи).

2. Штамм ы/изоляты L. monocytogenes имеют различия в продукции гемолитически активных веществ (листериолизина О). Из 16 изученных культур 5 экспрессировали гемолизины на низком уровне, а 10 — на среднем. Изо-лят, выделенный от пятнистого оленя, не вызывал деградации красных кровяных телец.

3. Корреляционным анализом установлена прямая сильная взаимосвязь (г>0,5) показателей вирулентности культур (LDioo и LD50) для белых аут-бредных мышей с однородностью популяции (форма колоний) и уровнями продукции основных экспрессируемых факторов патогенности (листериолизина О и фосфолипазы С).

4. Выделение изолятов, содержащих в популяции 95-98% клеток в S-форме, с высоким (средним) уровнем экспрессии листериолизина О и фосфолипазы С свидетельствует о принадлежности их к вирулентным культурам.

5. Штаммы/изоляты L. monocytogenes имеют различия по вирулентности для белых аутбредных мышей. По показателю LDioo 9 культур являлись вирулентными, 5 - умеренновирулентными и 2 - авирулентными. По показателю LD50 5 культур признаны высоковирулентными, 6 - вирулентными, 3 - умеренновирулентными и 2 - авирулентными.

6. Разработана схема дифференциации листерий по показателям вирулентности, которая позволяет объективно оценивать патогенные свойства культур L. monocytogenes и распределять их на группы.

7. При изучении генетической вариабельности изолятов L. monocytogenes с помощью метода REA PFGE выявлены 8 пульс-электротипов. Три пульс-электротипа являются общими для нескольких изолятов, циркулировавших на территории бывшего СССР в период с 1943 по 1976 г., 1 пульс-электротип образован, возможно, родственными изолятами, а 4 пульс-электротипа - уникальны.

8. Выявление идентичных пульс-электротипов для изолятов, выделенных в Украинской и Татарской СССР, в Краснодарском крае и Читинской области, в Украинской СССР и Новосибирской области свидетельствует об общности их происхождения.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. На основании проведенных исследований разработаны и рекомендуются в практику научно-исследовательских учреждений «Методические рекомендации по комплексной оценке культур Listeria monocytogenes на основе изучения фенотипических и генетических характеристик», которые утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 07.07.2010 г.

2. Составлены генетические паспорта на изученные культуры L. monocytogenes.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе представлены результаты исследования биологических свойств изолятов L. monocytogenes, выделенных в пространственно отдаленных регионах в различные промежутки времени, как из объектов внешней среды, так и различных биологических объектов, относящихся к разным семействам и видам.

Предварительное изучение сформированной рабочей коллекции культур листерий показало, что большинство из них (за исключением изолята № 41 -06) являлись типичными представителями своего вида. В основном культуры принадлежали к I серологической группе, что согласовывалось с данными отечественных ученых о преимущественной изоляции на территории РФ культур L. monocytogenes I серогруппы [К.Н. Шлыгина, 1963; JI.A. Буренкова, 1962].

Известно, что вирулентные штаммы бактерий состоят на 95-100% из клеток, формирующих на твердых питательных средах колонии S-формы. В наших исследованиях также было установлено, что популяции большинства вирулентных для белых аутбредных мышей культур состояли на 88,87 - 99,32% из клеток S-форм. Популяции авирулентных культур листерий, наоборот, были представлены преимущественно RS - и R-формами, что подтвердило существующую взаимосвязь между формой колоний и вирулентностью (коэффициент корреляции 0,62). Как правило, гетероморфизм был присущ изолятам, выделенным от естественно резистентных животных (пятнистый олень, шиншилла, пастбищные клещи), которые являются лишь носителями возбудителя листе-риоза. Давление факторов неспецифического иммунитета на листерии в организме этих животных, скорее всего, приводит к изменчивости патогена, которая проявляется в расщеплении популяции на S- и R-формы и, соответственно, снижении патогенности.

Одним из косвенных доказательств естественной аттенуации штамма под прессингом иммунной1 системы может служить первый случай выделения на территории РФ авирулентной культуры листерий из головного мозга пятнистого оленя. До настоящего времени не представляется возможным проведение ее полной идентификации. С одной стороны, отсутствие у данной культуры фе-нотипического выражения in vitro продукции основных факторов патогенности (LLO и Pic С) и авирулентность для белых мышей позволяют отнести ее к виду L. innocua, с другой стороны - наличие в ее геноме «молчащего» Hly-гена и некоторых генов интерналина, присущих патогенным листериям (неопубликованные данные), свидетельствуют о принадлежности ее к виду L. monocytogenes. По крайне мере, выявленные феномены свидетельствуют о сложных филогенетических и эволюционных взаимоотношениях между этими двумя видами. О выделении негемолитичных слабо- и авирулентных культур листерий также сообщают S. Roche с соавторами (2004), Т. И. Карпова, С. А. Ермолаева (2001) и группа норвежских исследователей во главе с I. Secic (2010). Причем до настоящего времени роль таких культур в этиологии листе-риоза человека остается неясной.

За реализацию патогенных свойств листерий ответственность несут гены патогенности, локализованные как и у большинства бактерий, на, так называемых, «островках патогенности». Особый интерес для изучения у листерий представляют два основных экспрессируемых фактора патогенности — листериолизин О (LLO) и фосфатидилспецифичная фосфолипаза С (Pic С). Для тестирования этих факторов in vitro применяют однослойные среды, содержащие питательную основу и субстрат. Классически для качественной оценки гемолитической и лецитиназной активности бактерий принято использовать кровяные и желточные агары, однако, как уже отмечалось выше (разд.3.3.2.1 и 3.3.2.2) эти среды имеют ряд недостатков. В своих исследованиях мы применили разработанную ранее двухслойную среду СОГАЛ [патент на изобретение № 2318022 от 27.02.2008 г.], коммерческий ALOA-arap и предложенный нами метод полуколичественной оценки экспрессии этих факторов [И. Ю. Егорова, Ю. О. Селянинов, 2005]. Использованные нами среды и подходы позволили установить межштаммовые различия в синтезе гемолизинов и фосфолипаз у изучаемых культур и выявить взаимосвязь между уровнем продукции этих ферментов и степенью патогенности культур. Результаты показали, что чем выше уровень продукции гемолизинов и фосфолипаз, тем выше вирулентность культур листерий (г>0,6).

В современных условиях, когда воздействие антропогенных факторов на среду обитания патогенов является существенным, выживание и поддержание популяции листерий в природе достигается за счет адаптационных изменений патогена (как уже указывалось выше). Одним из таких факторов является формирование устойчивости к антимикробным препаратам. Современные данные свидетельствуют о том, что листерии приобретают резистентность ко многим современным препаратам из группы фторхинолонов, цефалоспоринов, пени-циллинов, тетрациклинов, аминогликозидов и др. Результаты наших исследований подтверждают эти данные. Ни у одного из исследуемых штам-мов/изолятов, циркулирующих на территории бывшего СССР и ФРГ в период с 1943 по 1976 г.г., когда еще эти препараты для терапии инфекционных заболеваний животных в ветеринарной практике не применялись, не обнаружено устойчивости к ним.

Одним из механизмов сохранения возбудителя в межэпизоотический период считается его способность к персистенции. Персистенция или длительное переживание патогена в экологической нише (организме хозяина) широко распространенное явление и ее следует рассматривать как одну из наиболее интересных и интенсивно разрабатываемых проблем микробиологии. Это обусловлено тем, что расшифровка механизмов бактериальной персистенции открывает перспективы для решения таких вопросов, как понимание природы бактерионосительства, выявление причинно-следственных связей дисбиозов, совершенствование диагностических препаратов и, наконец, создание основ микроэкологического мониторинга объектов внешней среды [Бухарин О. В., Усвяцов Б. Я, 1996; Прозоровский С. В. и др., 1981]. На биомолекулярном уровне персистенция характеризуется способностью микроорганизма вырабатывать специфические функционально активные вещества, так называемые факторы персистен-ции. Известно, что к ним относятся антилизоцимная, антикомплементарная, ан-тиинтерфероновая, ДНК (РНК) — азная, антикарнозиновая, антиглобулиновая, антигистонная и другие активности. Из персистентных свойств у листерий изучали антикомплементарную, антилизоцимную и ДНК-азную активности. К сожалению, выявить данный вид активностей у листерий не удалось и это может свидетельствовать либо о более сложных механизмах персистенции листерий как внутриклеточных патогенов, либо о необходимости совершенствования уже существующих методов оценки персистентных свойств патогенов, либо разработки совершенно новых подходов с учетом биологических особенностей листерий.

Существующие в настоящее время схемы осуществления надзора за листериозом рассматривают все выделенные изоляты L. monocytogenes как в равной степени патогенные. Однако наблюдения некоторых авторов показали, что вирулентность различных штаммов варьирует [S. Roche et al., 2004; С. Buchrieser, 2004; Москаленко В. Ф., 2006]. Как правило, патогенность культур листерий принято определять путем постановки кератоконъюнктивальной пробы на морских свинках. Эта качественная реакция позволяет дифференцировать листерии на патогенные и непатогенные и не позволяет объективно оценить уровень патогенности каждого из штаммов. Для объективной оценки вирулентности культур определяют показатели LDioo и LD50. Однако в России до настоящего времени не существует единой схемы дифференциации штаммов листерий внутри вида по этим показателям. Проведя анализ показателей LD10o и LD50 для белых аутбредных мышей, мы разработали схему дифференциации изолятов L. monocytogenes по вирулентности, которая позволила нам распределить их на 3-5 групп, в зависимости от того какой показатель был взят за основу. Примененный нами подход позволяет проводить межштаммовую дифференциацию изолятов патогенных листерий и может быть использован при проведении эпизоотического (эпидемиологического) анализа вспышек листериоза среди животных и человека.

Изучение фенотипических свойств изолятов листерий при помощи классических, вновь разработанных и усовершенствованных микробиологических методов позволило выявить у них различия в проявлении ряда признаков. Однако использованные методы не отражали полной картины вариабельности популяций, не выявляли степени генетического родства между исследуемыми культурами и их специфических особенностей. Поэтому для решения этих вопросов нами было проведено изучение генетической вариабельности культур сформированной рабочей коллекции.

В последние годы для типирования наиболее значимых в эпидемиологическом отношении штаммов L. monocytogenes разработаны молекулярно-генетические методы - гель - электрофорез в переменном поле (REA PFGE), мультилокусное секвенирование (мультилокусное секвенирование-типирование - MLST),

В российской литературе встречаются данные о типировании с использованием данных методов в основном клинических изолятов от человека и культур, выделенных из пищевой продукции, смывов с объектов окружающей среды в результате проведения мониторинговых исследований или эпидемиологического анализа случаев возникновения листериоза у человека. Работ посвященных изучению генетического разнообразия культур листерий, выделенных от различных животных (сельскохозяйственных, домашних, диких) практически нет. Встречаются сообщения о генотипировании штаммов L. monocytogenes, изолированных от морских гидробионтов [Е. А. Зайцева и др., 2007].

Использование двух крупнощепящих рестриктаз Smal и Apal позволило нам выявить 8 пульс-электротипов, причем некоторые из них были общими для нескольких штаммов, а другие выявляли различия между исследуемыми штам-мами/изолятами и особенности некоторых из них. Какой-либо взаимосвязи между источником выделения и пульс-электротипом мы не установили, лишь изоляты, выделенные от грызунов являлись генетически родственными. Однако мы обнаружили 100% сходство в распределении фрагментов ДНК для нескольких изолятов, циркулировавших на территории бывшего СССР в период с 1943 по 1976 г.г. Причем эти изоляты формировали 4 группы.

Итак, проведенные молекулярно-биологические исследования позволили выявить геномный полиморфизм штаммов/изолятов L. monocytogenes и установить идентичность распределения рестрицированных фрагментов ДНК для нескольких культур, выделенных в Украинской, Татарской СССР и Новосибирской области, а также Краснодарском крае и Читинской области. Последнее является свидетельством общности их происхождения.

Таким образом, в результате проведенных комплексных исследований с использованием как традиционных, так и разработанных в последнее десятилетие методик, изучены биологические свойства культур L. monocytogenes, выделенных из различных объектов в разные промежутки времени на географически отдаленных территориях.

Разработанные нами подходы и полученные данные могут быть использованы для сравнения коллекционных культур листерий со свойствами современных изолятов, циркулирующих на территории РФ и за рубежом; оценки эпизоотической значимости выделяемых изолятов листерий; разработки средств специфической профилактики и совершенствования схем лабораторной диагностики.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Суняйкин, Александр Иванович, Покров

1. A.C. № 1564191 СССР. Способ определения антиинтерфероновой активности микроорганизмов / О. В. Бухарин, В. Ю. Соколов. Открытия №18,15.05.1990.

2. Бакулов, И. А. Бактериологический контроль пищевых продуктов на наличие листерий. Методическое пособие / И. А. Бакулов. Ульяновск, 1999. -78 с.

3. Бакулов, И. А. Листериоз сельскохозяйственных животных / И. А. Бакулов. М.: Колос, 1967.- 296 с.

4. Бакулов, И. А. Листериоз как пищевая инфекция: вопросы диагностики и профилактики. Учебное пособие / И. А. Бакулов.- Ульяновск.- 1991.-С 23-29.

5. Бойко, А. В. Рибонуклеазная активность бактерий как фактор пер-систенции некоторых возбудителей сапронозных инфекций / А. В. Бойко, О. В. Бойко // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.- 1997.-№4.-С. 71-73.

6. Брудастов, Ю. А. Антикомплементарная активность бактерий: ав-тореф. дис. . канд. мед. наук / Брудастов Ю. А. — Челябинск, 1992.- 22с.

7. Бухарин, О. В. Биомедицинские аспекты персистенции бактерий / О. В. Бухарин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии-1994.-№8.- Приложение. С. 4-13.

8. Бухарин, О. В. Персистенция патогенных бактерий: теория и практика / О. В. Бухарин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.- 2000.- № 4.- Приложение.- С. 4-7.

9. Бухарин, О. В. Антилизоцимный тест как маркер персистенции микроорганизмов / О. В. Бухарин, Б. Я. Усвяцов // Теоретическая и прикладная иммунология: тез. докладов 1 Всесоюз. конф. М., 1982. - С. 58-64.

10. Гершун, В. И. Распространение и жизнеспособность листерии в объектах внешней среды и влияние температурного фактора на их морфологические свойства / В. И. Гершун // Вопросы природной очаговости болезней,-Алма-Ата, 1981.-Вып. 12.-С. 78-89.

11. Дмитренко, Н. В. Основы статистической обработки результатов микробиологических и вирусологических исследований / Н. В. Дмитренко.-Покров, 1993.-38 с.

12. Домардский, И. В. Вирулентность бактерий как функция адаптации / И. В. Домардский // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1997. - №4.-С. 16-20.

13. Егорова, И. Ю. Методические рекомендации по определению гемолитической активности культур рода Listeria / И. Ю. Егорова, Ю. О. Селянинов. -Покров, 2005.-8 с.

14. Ермолаева, С. А. Изменение уровня экспрессии факторов вирулентности Listeria monocytogenes под влиянием внешних условий / С. А Ермолаева, Ю. Ф. Белый, И. С. Тартаковский // Молекулярная генетика микробиология и вирусология.- 2000.-№1.- С. 17-19.

15. Ермолаева, С. А. Ауторегуляция экспрессии секретируемых белков у L. monocytogenes / С. А. Ермолаева, Ю. Ф. Белый, И. С. Тартаковский // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.- 2000.-№5.-С.3-6.

16. Зайцева, Е. А. Микробиологическая характеристика Listeria monocytogenes, изолированных из различных источников в Приморском крае /

17. Е. А. Зайцева, Г. П. Сомов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.- 2006.- №2.- С. 3-6.

18. Зайцева, Е. А. Распространение Listeria monocytogenes среди мышевидных грызунов на территории приморского края / Е. А Зайцева, С. А.Ермолаева, Г. П. Сомов // Тихоокеанский медицинский журнал.- 2008.- № 2.- С. 6569.

19. Зайцева, Е. А. Система анализа микробиологических и молекуляр-но-генетических маркеров для выявления высоковирулентных'штаммов Listeria monocytogenes: автореф. дис. . докт. мед. наук: 03.02.03 / Зайцева Елена Александровна.- М.- 2010.- 40 с.

20. Зарифуллина, JL А. Антилизоцимная активность менингококков, автореф. дис. . канд. мед. наук / Зарифуллина JL А. Челябинск, 1986.- 26 с.

21. Идентификация листерий с помощью метода молекулярной ДНК — ДНК гибридизации / И. А. Бакулов, В. М. Котляров, Т. П. Турова, Н. Б. Ба-калдина, Т. JT. Иванова-// Молекулярная генетика микробиология и вирусоло-гия.-1987.- №7.- С.31-35.

22. Изменение морфологии листерий в зависимости от температуры инкубирования / Л. Г. Астапович, И. А. Бакулов, В. М. Котляров, 3. Н. Меньшикова, О. Ю. Сакович//Ветеринария.- 1966.-№ 10.- С. 14-17.

23. Калишин, Н. М. Листериоз крупного рогатого скота / Н. М. Кали-шин. Л.: Колос. - Ленинградское отделение, 1981.- С. 12 .

24. Карпеев, С. А. Материалы докл. науч. конф., поев. 40-летию ТАССР / С. А Карпеев, Ф. 3. Амфитеатров. Казань, I960.- С.75.

25. Котлярова, Г. А. Биологические свойства L-форм Listeria monocytogenes: автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.096 / Котлярова Галина Александровна. — Покров, 1970. -20 с.

26. Красовский, В. В. Листериозная инфекция на Украине. Клиническая картина заболевания электронный ресурс.- Режим доступа: www.ecologylife.m/simpozium/listerioznaya-infektsiya-na-ukraine.html.- Загл. с экрана.

27. Лабораторная диагностика листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактики: методические рекомендации / Госагропром, МЗ СССР.-М., 1987.- 32 с.

28. Лабораторная диагностика листериоза животных и людей: методические рекомендации / Минздравмедпром РФ, Минсельхозпрод РФ.- М.,- 1996.28 с.

29. Лакин, Г. Ф. Биометрия. Учеб. пособие для биол. спец. вузов.- 3-е изд., перераб. и доп.- М.: Высш. школа, 1980.- 293 с.

30. Листерии и листериоз: монография / И. А. Бакулов, Д. А. Васильев, Д. В. Колбасов, Т. И. Кольпикова, Ю. О. Селянинов, И. Ю. Егорова. Ульяновск: УГСХА, 2008.- 168 с.

31. Лобан, К. М. БЖЭ. 3-е изд. / К. М. Лобан, В. П. Бисерина, И. В. То-роповцев, Г. В. Борисова. М., 1980.- С. 200-204.

32. Малеев, В. В. Опасные инфекции: листериоз / В. В. Малеев // Сестринское дело.- №4.- 2000.- 235 с.

33. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Л. Б Борисов, А. М. Смирнова, И. С. Фрейдлин и др. М.: Медицина, 1994.- 528 с.

34. Меньшикова, 3. Н. Актуальные вопросы ветеринарной медицины: электронно — микроскопическая идентификация листерий возбудителей пищевого листериоза / З.Н. Меньшикова, Е.В. Тищенко; ФГОУ ВПО Уральская ГАВМ.- 2005.- С. 68.

35. Меньшикова, 3. Н. Электронно-микроскопическое изучение морфологии листерий и эризипелотриксов: автореф. дис. . канд. биол. наук / Меньшикова Зинаида Николаевна. Покров, 1971г.- 24 с.

36. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов / О. В. Бухарин, Б. Я. Усвяцов, А. П. Малышкин, Н. В. Немцева // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.- 1984.-№2.-С. 27-28.

37. Минаева, Н. Э. Микробиологические аспекты эпидемиологии лис-териоза / Н. Э. Минаева, В. И. Ладный // Листериоз на рубеже тысячелетий: материалы Международного симпозиума.- Покров, 1999.- С. 137.

38. Москаленко, В. Ф. Биологические свойства и патогенный потенциал листерий, циркулирующих в Украине / В. Ф. Москаленко // Провизор.-1998.-№ 14,- С 58.

39. Новые методы идентификации Listeria monocytogenes / Т. И. Карпова, С. А. Ермолаева, И. В. Лопырев, Н. С. Бродинова, И. С. Тартаковский, X. А. Васкез-Боланд // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001.-Т. 3, № 3.- С. 266-273.

40. Онищенко, Г. Г. Эпидемиология и профилактика листериоза: методические указания 3.1.7.1104-02 / Г. Г. Онищенко.- М., 2002.

41. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам / методические указания 4.2.1890-04 // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.- 2004.- Т. 6, №4.- С 306-359.

42. Поздеев, О. К. Медицинская микробиология: учеб. пособие / О. К Поздеев; под ред. В. И. Покровского Изд. 4-е, испр. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006.-305 с.

43. Практическое применение листериозных фагов / И. А. Бакулов, Т. И. Кольпикова, Д. А. Васильев, А. В. Меркулов, В. М. Котляров. Ульяновск, 1998.-66 с.

44. Прозоровский, С. В. Ь-формы бактерий (механизмы образования, структура, роль в патологии) // С. В. Прозоровский, Л. Н. Кац, Г. Я. Каган.- М., 1981.- 175 с.

45. Сливко, В. В. Листереллез сельскохозяйственных животных / В. В. Сливко. Вологда, 1954.- 145с.

46. Сомов, Г. П. Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий: экологические аспекты / Сомов Г. П., В. Ю. Литвин.- Новосибирск: Наука, 1988.208 с.

47. Сухотина, В. П. Выживаемость листерий в почвах под влиянием ризосферы некоторых растений: автореф. дис. . канд. вет. наук / В. П. Сухотина.-Новосибирск, 1978. 22 с.

48. Тартаковский, И. С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика / И. С. Тартаковский, В. В. Малеев, С. А. Ермолаева М.: Медицина для всех, 2002. - 200с.

49. Тартаковский, И. С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика / И. С. Тартаковский // КМАХ. 2000.- Т 2, №2.- С 20-30.

50. Тимофеева, Л. А., Головачева Л. Я., Трофименко Н. 3. Доклад Иркутского противочумного института. Т. 4. Иркутск, 1962.- С 208-210.

51. Триполитова, А. А. Листериоз / А. А. Триполитова, Г. В. Борисова.-Томск: Изд-во ТГУ, 1965.- 260 с.

52. Чернова, О. JI. Антилизоцимная активность стафилококков, выделенных при бактерионосительстве: автореф. дис. . канд. биол. наук. Челябинск, 1989. 26 с.

53. Хоулта, Дж. Определитель бактерий Берджи: в 2-х т., Т. 2 пер. с англ; под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса. М.: Мир, 1997. - С 573-577.

54. Antimicrobal resistance of Listeria monocytogenes human strains isolated since 1926 in France / C. Morvan, A. Moubareck, M. Leclercq, S. Bremont, P. Lecuit and A. Le Monnier Courvalin. Lirvo de actas do congresso: ISOPOL XVII. -Porto, 2010. -P.108.

55. Antimicrobal susceptibilities of Listeria monocytogenes isolated in Japan / S. Monden, A. Okutani, H. Suzuki, H. Asakura, A. Nakama, S. Igimi, Y. Okada and T. Maruyama. Lirvo de actas do congresso: ISOPOL XVII. Porto, 2010.- P.73.

56. Bacterial and viral inhibitioi and modulation of host defences / H. Smith, G. Falcone, M. Campa, G. M. Scott // Academic Press Inc. London, 1984.- P. 171190.

57. Belyi, Y. F. Intracellular parasitism of microorganisms / Y. F. Belyi // Springer-Verlag Gmb H and Co. KG. - 1996. - P. 87.

58. Blakdi S. and Muhly M. J. Infect. Immun. 1985. - Vol. 47. - P. 47- 51.

59. Braude, A. I. Microbial Perturbation of Host Defences / A. I. Braude, F. О'Grady, H. Smith (ed.) // Academic Press Inc. - London, 1981. - P. 13.

60. Carbon source regulation of virulence gene expression in Listeria monocytogenes / A. A. Milenbachs, D. P. Brown, M. Moors, P. Youngman // Mol. Microbiol.- 1997.- Vol. 23.- P. 1075-1085.

61. Cossart, P. Interactions of Listeria monocytogenes with mammalian cells during entry and actin-based movement: bacterial factors, cellular ligands and signaling / P. Cossart, M. Lecuit // EMBO J. 1998. - Vol. 17. - P. 3797- 3806.

62. Czuprynski, Charles J. Interaction of rat platelets with Listeria monocytogenes / Charles J. Czuprynski, Edward Balish // Infection and Immunity. 1981. -Vol. 33. -№. l.-P. 103-108.

63. Evidence that PrfA, the pleiotropic activator of virulence genes in Listeria monocytogenes, canbe present but inactive / A. Renzoni, A. Klarsfeld, S. Dramsi, P. Cossart//Infect. Immun. 1997.-Vol. 65.-P. 1515-1518.

64. Fulco O. J., Leggiardo R .J.; N. Y. State. J. Med. 1982. - Vol. 82. -№ 12.-P. 1857-1858.

65. Gouin, E. The virulence gene cluster of Listeria monocytogenes is also present in Listeria ivanovii, an animal pathogen, and Listeria seeligeri, a nonpathogenic species / E. Gouin, J. Mengaud, P.Cossart // Infect Immun.- 1994.- Vol. 62.- P. 3550-3553.

66. Halaas O. et al. J. Immunol.- 2000.- Vol. 164, № 4.- P. 2064-2069.

67. Hamon Y, Etude du pouvoir bacteriocinogene dans le genre Listeria. 2. Individualité et classification des bacteriocines en cause / Y. Hamon, Y. Peron // Annales De L Institut Pasteur. 1963. - Vol. 104. - № 1. - P. 55.

68. Hancock, R. E. Antagonist activity medicinal chemistry-38 / R. E. Hancock // Clin Inf Dis. 1998. - Vol. 27. - S. 93-99.

69. Hill, C. Listeriolysin S a second haemolysin with a role in the virulence of Listeria monocytogenes / C. Hill. Lirvo de actas do congresso: ISOPOL XVII. - Porto, 2010. - P. 24.

70. Inl A- but not Inl B-mediated internalization of Listeria monocytogenes by non-phagocytic mammalian cells needs the support of other internalins / B. Bergmann, D. Reffelsbauer, M. Kuhn et al. // Mol. Microbiol.- 2002.- Vol. 43.- P. 557575.

71. Involvement of an active efflux system in the natural resistance of Pseudomonas aeruginosa to aminoglycosides / J. R. Aires, T. Kohler, H. Nikaido, and P. Plésiat // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol. 43. - №11. - P. 2624-2628.

72. Leimeister-Wächter, M. Detection of listeriolysin, the thiol-dependent hemolysin in Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, and Listeria seeligeri /

73. M. Leimeister-Wächter, T. Chakraborty // Infect. Immun. 1989. - Vol. 57. - P. 23502357.

74. Leimeister-Wächter, M. The expression of virulence genes in Listeria monocytogenes is thermoregulated / M. Leimeister-Wachter, E. Domann, T. Chakraborty // J.Bacteriol.-1992. Vol. 174. - P. 947-952.

75. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants / J. A. Vaz-quez-Boland, M. Kuhn, P. Berche, T. Chakraborty, G. Dominguez-Bernal, W. Goe-bel, B. Gonzalez-Zorn, J. Wehland, J. Kreft // Clin. Microbiol. 2001. - Rev. 14. - P. 584-640.

76. Listeriolysin O is essential for virulence of Listeria monocytogenes: direct evidence obtained by gene complementation / P. Cossart, M. F. Vincente, J. Mengaud, F. Baquero, J. C. Perez-Diaz, P. Berche // Infect. Immun. 1989. - V. 57.- P. 3629-3636.

77. Low-virulence field Listeria monocytogenes strains belong to four phe-notypic groups / S. M. Roche, P. Gracieux, I. Albert, P. Velge // XV International Symposium on Problems of Listeriosis.- Uppsala, Swden, 2004.

78. Non-hemolytic and hypovirulent Listeria monocytogenes became hae-molytic and virulent after passage through mice /1. Secic, T. Lindback, L. M. Rorvik.- Lirvo de actas do congresso: ISOPOL XVII. Porto, 2010. - P. 102.

79. Nucleotide sequence of the lecithinase operon of Listeria monocytogenes and possible role of lecithinase in cell-to-cell spread / J. A. Vazquez-Boland, C. Kocks, S. Dramsi, et al. // Infect Immun. 1992.- 60.- P. 219-230.

80. Paterson, J. S. Flagellar antigens of organisms of the genus Listeria / J. S. Paterson //J. Path. Bact. 1939. - 48. - P. 25-32.

81. Paterson, J. S. The antigenic structure of organisms of the genus Listeria / J. S. Paterson // J. Pathol. Bacteriol. 1940. - Vol. 51. - P. 427-436.

82. Portnoy, D. A. Innate immunity to a facultative intracellular bacterial pathogen / D. A. Portnoy // Curr. Opn. Immunol. 1992. - Vol. 4. - P. - 20-24.

83. Production and nature of Listeria monocytogenes hemolysins / Augustine N. Njoku-Obi, Edward M. Jenkins, Jessie C. Njoku-Obi, Joanne Adams and Verdell Covington // J Bacteriol. 1963. - Vol. 86, №1. - P. 1-8.

84. Rocourt J., Grimont F., Grimont P. A. D., Seeliger H. P. R // Curr. Microbiol. 1982. - Vol. 7. - P. 383 - 388.

85. Schuchat, A. Epidemiology of Human Listeriosis / A. Schuchat, B. Swaminathan, C. V. Broome // Clin. Microbiol. 1991. - Rev. - 4. - P. 169-183.

86. Seeliger, H. P. R. Listeriosis / H. P. R. Seeliger // 1961. Karger, New York. - NY.

87. Seeliger H. P. Listeria and Law in "Listeria 1992, ISOPOZ XI" / H. P Seeliger // Copenhagen. 1992. - P. 1-6.

88. Shultz, Leonard D. Cytotoxicity of rabbit blood for Listeria monocytogenes. / Leonard D. Shultz, Martin S. Wilder // Infect. Immunity. 1971. - Vol. 4. -P. 701-708.

89. Smith, C.W. Demonstration of a capsular structure on Listeria monocytogenes / C. W. Smith, G. F. Metzger 11 Pathol. Microbiol. 1962. - Vol. 25. -P. 499-506.

90. Sneath P. H. A. Bergte's manual of Systematic bacteriology / P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E. Holt J. G. Sharpe, //9th Ed.- Vol. 2.- 1986.- Williams & Wilkins.- Co. Baltimore. MD. P. 253.

91. The bvr locus of Listeria monocytogenes mediates virulence gene repression by Bglucosides / K. Brehm, M. T. Ripio, J. Kreft, J. A. Vazquez-Boland // J. Bacteriol.- 1999.- Vol. 181.- P. 5024-5032.