Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Листерии в фауне Центрального региона России

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Листерии в фауне Центрального региона России"

На правах рукописи

Егорова Ирина Юрьевна

Листерии в фауне Центрального региона России (распространение, биологические и филогенетические особенности)

06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

17 окг т

Покров-2013

005534963

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии).

Научный консультант:

заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

заведующий лабораторией ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, доктор ветеринарных наук, профессор

заведующий лабораторией ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир,

доктор биологических наук, профессор Прунтова Ольга Владиславовна

профессор на кафедре РГАЗУ, г. Балашиха, доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Новиков Борис Владимирович

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт санитарии, гигиены и экологии (ГНУ ВНИИВСГЭ, г. Москва)

Защита диссертации состоится «19» декабря 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, Владимирская обл., Покров, Тел/факс: (09243) 62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан 18 сентября 2013 г. Размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniiwim.ru и на сайте ВАК России www.vak2.ed.gov.ru.

Балашова Елена Алексеевна

Фертиков Владимир Иванович

Балышев Владимир Михайлович

Ученый секретарь диссертационного совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, кандидат биологических наук

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

С момента открытия возбудителя листериоза (1891-1892 г.г.) интерес к болезни не уменьшился, а, наоборот, возрос. Об этом свидетельствует большое количество публикаций по этой проблеме специалистов, занимающихся изучением указанной болезни. В связи с выявлением в конце XX века контаминации пищевой продукции листериями и связанных с этим крупных вспышек пищевых инфекций человека, нередко заканчивающихся летальным исходом, листериоз с 1992 года в нашей стране причислен к группе эпидемически значимых эмерджентных болезней. В 2008 году начата официальная регистрация листериоза как особо опасной болезни животных, относящейся к сапрозооонозным инфекциям.

Как и для большинства возбудителей сапрозоонозов, характерной особенностью листериоза является его стационарность, которая обусловлена следующими факторами: уникальной экологической пластичностью листерий, наличием в стадах сельскохозяйственных животных-листерионосителей и существование природных очагов листериоза, в которых основным биологическим резервуаром, помимо грызунов, могут выступать и дикие животные. Об этом свидетельствуют многочисленные данные отечественных и зарубежных исследователей, установивших листерионосительство и восприимчивость к листериозу диких птиц, насекомоядных, зайцеобразных, некоторых парнокопытных, приматов и др. Однако в настоящее время до конца не определено какие виды диких животных могут выступать в качестве резервентов листериозной инфекции. Отсутствует единое мнение о роли рыб в поддержании стационарности листериоза.

Считается, что эколого-географические особенности территории являются важным фактором в развитии эпизоотического процесса [A.A. Конопаткин и др., 1984; C.B. Кашапова, 2007; А.Ю. Бондарев, 2010].

Для изучения экологии и эпизоотологии листериоза особый интерес представляет густо заселенный людьми Центральный регион России с его умеренно-континентальным климатом, многообразием флоры и фауны.

Проведенный в этом регионе в период с 1933 по 1972 г. комплекс работ по восстановлению и увеличению численности охотничьих видов животных с

учетом их интродукции, привел к значительному скоплению диких животных разных видов на ограниченных территориях [М.П. Павлов, 1974; В.И. Фертиков, 1998]. По данным учета «Центрохотконтроля» Минсельхоза России в 2007 г. в ЦФО РФ обитало лосей - 66,5 тыс., кабанов - 94,9 тыс., косуль - 41,6 тыс., благородных оленей - 8,4 тыс., пятнистых оленей - 21,4 тыс.

Многообразие и плотность населения популяций обитаемых видов холоднокровных животных наблюдается и в Иваньковском водохранилище -основном питьевом резервате г. Москвы, расположенном на территории трех областей Центрального региона России. В настоящее время в нем регистрируется 34 вида рыб, из них 7 - интродуценты.

Акклиматизация в регионе животных-интродуцентов, совместное использование водных и околоводных территорий, лесов, болот, пастбищ домашними и дикими копытными животными, а также попадание неочищенных стоков животноводческой индустрии в воды бассейна реки Волги способствуют заносу и распространению многих инфекционных агентов, патогенных для животных и человека, в том числе и листериоза. Длительное использование солонцов, мест подкормки животных также может служить одним из факторов поддержания и передачи листериоза у диких животных и эстафетного вовлечения их в эпизоотии [В.М. Фомушкин, 1988]. Поэтому многие вопросы инфекционной патологии, эпизоотологии, профилактики листериоза диких животных остаются неизученными, и в случае возникновения эпизоотий ветеринарная служба испытывает трудности в проведении действенных защитных мероприятий, что создает реальную угрозу биологической безопасности на территории Российской Федерации.

Перечисленные выше обстоятельства явились основополагающими в выборе темы диссертационной работы.

Степень разработанности проблемы

Целенаправленно работ по изучению вопросов естественного носительства листерий в природных популяциях холодно- и теплокровных животных, обитающих на территории РФ, не проводилось. Как правило, единичные данные об обнаружении листерий у представителей дикой фауны являются сопутствующим результатом мониторинговых исследований других заболеваний животных и человека, при которых дикие животные могут являться природным резервуаром.

Из 50 видов диких животных, установленных в качестве естественных листерионосителей, обитавших на территории бывшего СССР, лишь 4 вида животных представлены дикими парнокопытными - кабан, джейран (Азербайджан), косуля (Белоруссия) и сайга (Эстония) [А. М. Ханкишиев, 1959; В.А. Адамович, И. Ойцось, 1963; В.В. Тилга, 1964]. Наибольших результатов в изучении этого вопроса добились зарубежные ученые, показавшие носительство и заболевание листериозом таких диких парнокопытных животных как американский лось A Ices alces, косуля Capreolus capreolus, лань Dama dama, белохвостый олень Odocoileus virginianus, жираф Giraffa camelopardalis, лама Ьама glama и др. [R. Archibald, 1960; D.O. Trainer, J.B. Hale, 1964; F. Lemenes et al., 1983; L. Eriksen et al„ 1988].

Относительно недавно появились сведения о том, что различные виды гидробионтов, обитающие в акваториях водоемов РФ, также являются резервуарами листерий [Е.А. Зайцева и др., 2002; И.А. Беленева, Э.Ф. Масленникова, 2002; Г.Л. Сомов и др., 2002; Л.Б. Мухина, 2002; В.Е. Терехова и др., 2006; Е.А. Зайцева, 2010 и др.]. Проводимые на территории РФ работы, в основном, посвящены изучению вопросов естественной зараженности морских гидробионтов и искусственно культивируемых моллюсков.

Также отсутствуют сведения о распространении листерий в пресных водоемах у представителей ихтиофауны и популяционных группировках диких парнокопытных, обитающих на территории Центрального региона РФ, их биологических характеристиках и роли в поддержании стационарных очагов листериоза.

Цель и задачи исследований

Целью данной работы является изучение природно-антропогенных предпосылок формирования очагов листериоза на территории Центрального региона России с участием представителей наземной и пресноводной фауны; биологических и генетических особенностей изолятов L. monocytogenes, выделенных от диких животных и из объектов внешней среды; разработка на основе полученных данных мероприятий по профилактике листериоза и предупреждению распространения листерий среди диких животных.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ природно-географических характеристик Московской, Тверской, Калужской и Владимирской областей.

2. Изучить особенности природных очагов листериоза, их гостальность, ландшафтно-географическую приуроченность, влияние социально-экономических факторов на формирование аутохтонных и антропургических очагов в различных административных областях Центрального региона России.

3. Выявить экологические связи листерий патогенных и непатогенных видов с представителями наземной и водной фауны.

4. Установить источники и пути передачи листерий в фауне Тверской, Московской, Калужской, Владимирской областей и определить факторы риска их распространения.

5. Изучить биологические и молекулярно-генетические особенности изолятов Listeria monocytogenes, выделенных у представителей дикой фауны и из объектов внешней среды с целью установления их экотиповой принадлежности.

6. Определить патогенный потенциал изолятов Listeria monocytogenes, выделенных из различных объектов наземной и водной экосистем.

7. Разработать классификацию Listeria monocytogenes по степени патогенности и на ее основе дать оценку эпидемической и эпизоотической значимости изолятов листерий, выделенных в дикой фауне.

8. Обосновать и разработать на основании полученных данных мероприятия по профилактике листериоза в природных популяционных группировках холодно- и теплокровных животных.

Научная новизна работы

Впервые установлено, что популяционные группировки 3 видов диких парнокопытных и 8 видов гидробионтов, обитающих на территории Центрального региона России, являются резервентами листерий непатогенных и патогенных видов. Последние участвуют в поддержании стационарных очагов листериоза. Показано, что на распространение листерий в популяциях диких парнокопытных и в водных экосистемах оказывает влияние хозяйственная деятельность человека.

Впервые в РФ разработаны:

- классификация L. monocytogenes по вирулентности для аутбредных белых мышей, позволяющая оценивать патогенный потенциал листерий и прогнозировать их эпидемическую и эпизоотическую значимость;

- двухфазная дифференциально-диагностическая питательная среда, позволяющая не только выявлять гемолитическую активность патогена, но и дифференцировать штаммы/изоляты листерий по уровню экспрессии основного фактора их патогенности - LLO (патент на изобретение № 2318022 от 27.02.08

г.);

- мероприятия по профилактике листериоза среди диких животных, позволяющие обеспечить повышение уровня биологической безопасности в различных субъектах Центрального региона России.

Выявлено, что пребывание листерий в организме диких холодно- и теплокровных животных не приводит к изменению их биологических свойств -биологические характеристики и патогенный потенциал выделенных изолятов L. monocytogenes соответствуют свойствам эпидемически и эпизоотически значимых штаммов листерий.

На основании сравнительного изучения антибиотикограмм штаммов/изолятов L. monocytogenes установлена связь природных и антропургических очагов листериоза.

Молекулярно-генетическими исследованиями установлено генетическое разнообразие циркулирующих вариантов L. monocytogenes в популяциях наземных и водных диких животных, что свидетельствует о различных источниках поступления листерий в фауну Центрального региона РФ.

Анализ результатов изучения фенотипических свойств и генетических характеристик, выделенных изолятов листерий, позволил установить циркуляцию одних и тех же клональных вариантов в популяционных группировках холодно- и теплокровных животных и их филогенетические отношения, свидетельствующие об обмене изолятами между ними.

Теоретическая и практическая значимость результатов исследований

В результате проведенных исследований выявлена роль отдельных видов диких животных, обитающих на территории Центрального региона России, в поддержании стационарных очагов и полигостальности листериоза, влияние хозяйственной деятельности человека на распространение листерий в

s

популяциях наземных и водных животных. Научно обоснована необходимость проведения мониторинга и разработка мероприятий по профилактике листериоза среди диких животных, способствующие обеспечению биологической безопасности в Центральном регионе РФ. Оценен потенциал патогенности изолятов L. monocytogenes, циркулирующих в популяциях холодно- и теплокровных диких животных и их эпидемическая и эпизоотическая значимость.

Разработан способ дезинфекции подкормочных площадок для диких животных с применением безопасного биоцида из класса третичных амминов, позволяющий обеззараживать поверхностные слои грунта подкормочных площадок от возбудителей инфекционных болезней животных, относящихся к 1-2 группам устойчивости к дезинфекционным средствам.

На основании полученных данных разработаны и одобрены Ученым советом ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии и Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 4 методических рекомендации, одно методическое наставление и «Мероприятия по профилактике листериоза среди диких животных в Государственных комплексах «Завидово» и «Таруса» Федеральной службы охраны Российской Федерации.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту

Формирование природных очагов листериоза в условиях Центрального региона России происходит под действием природно-географических и социально-экономических факторов с участием популяционных группировок диких парнокопытных и пресноводных гидробионтов.

Дезинфекция поверхностных слоев грунта подкормочных площадок для диких животных с применением современного безопасного бесхлорного биоцида из класса третичных аминов как основа профилактики распространения листериоза в дикой фауне.

Биологические характеристики (культурально-морфологические, биохимические, генетические, антигенные и патогенные) изолятов L. monocytogenes, выделенных в дикой фауне Центрального региона России, свидетельствующие об отсутствии экотиповой принадлежности культур.

Неоднородность вида L. monocytogenes в проявлении вирулентных

свойств в отношении аутбредных белых мышей и патогенный потенциал выделенных изолятов листерий как критерий оценки их эпидемической и эпизоотической опасности.

Генетическое разнообразие изолятов L. monocytogenes, циркулирующих в природных популяциях наземных и водных животных, - результат множественности источников поступления листерий в фауну Центрального региона России.

Филогенетические отношения изолятов L. monocytogenes, циркулировавших в популяциях домашних, диких, полудиких животных и объектах внешней среды на территории бывшего СССР и России в период с 1943 по 2009 г.г.

Пути реализации

Результаты исследований могут быть использованы при планировании и проведении научно-исследовательских и санитарно-профилактических работ в природно-охранных территориях, охотничьих хозяйствах, пресноводных водоемах других регионов РФ, в учебно-педагогическом процессе при подготовке специалистов биологических, медицинских и ветеринарных профессий, а также курсах повышения квалификации ветеринарных специалистов.

«Мероприятия по профилактике листериоза среди диких животных в Государственных комплексах «Завидово» и «Таруса» Федеральной службы охраны Российской Федерации внедрены приказами ФСО России (№№ 282 и 134 от 15.08.2011 и 01.09.2011 г.) в практику этих природно-охранных территорий.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов подтверждена статистической обработкой данных, корреляционным анализом, актами комиссионных испытаний и патентом.

Основные положения диссертационной работы и методическая основа ее выполнения доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, Научно-технического совета Национального парка «Завидово» ФСО РФ, секции Инфекционная патология Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (2007-2012 гг.), представлены на

международных и региональных научно-практических конференциях: XVI Московский Международный Конгресс по болезням мелких домашних животных (Москва, 2008); Международная научно-практическая конференция «Проблемы аграрной науки и образования» (Тверь, 2008); 29-й Международный конгресс биологов и охотоведов (Москва, 2009); Международная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы аграрной науки и образования» (Ульяновск, 2009); II, III и IV Ежегодный Всероссийский конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2010, 2011, 2012); Меэедународная научно-практическая конференция, посвященная 60-летию факультета охотоведения им. В.Н. Скалона «Охрана и рациональное использование животных и растительных ресурсов» (Иркутск, 2010); Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных» (Ставрополь, 2012); Международный симпозиум по проблемам листериоза IZOPOL XVII и XVIII (Португалия, 2010 и Индия, 2013).

В рамках выполнения диссертационной работы опубликовано 28 печатных работ, из них 13 в журналах рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций, 5 тезисов в зарубежных изданиях, 2 монографии, изданные отечественными и зарубежными издательствами. Приоритетность результатов исследований подтверждена 1 патентом РФ на изобретение.

В 2010 году работа по мониторингу листерий в дикой фауне и разработке мероприятий по профилактике листериоза среди диких животных удостоена диплома и медали «Золотой микроскоп» X Сибирской ветеринарной конференции (г. Новосибирск), в 2012 году - премии ФСО России «Золотой мерлон» в номинации наука.

Личный вклад автора в выполнение работы

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных публикациях и монографиях. При выполнении отдельных этапов работы оказывали научно-методическую и практическую помощь: сотрудники ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии д.б.н., профессор Ю. О. Селянинов, д.в.н., профессор Е.М. Хрипунов; сотрудники «Государственного комплекса «Завидово» ФСО РФ

д.б.н., профессор В. И. Фертиков, к.б.н. Н. А. Полякова, к.в.н. М.С. Воронин; сотрудники «Государственного комплекса «Таруса» ФСО РФ к.в.н. А.Н. Воличев и В.М. Шевцов, за что автор выражает свою искреннюю признательность и благодарность.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Работа изложена на 244 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 таблицами, 8 диаграммами и 10 рисунками. Список цитированной литературы включает 327 источников, из которых 116 иностранных авторов.

2 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2.1 МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Для изучения распространения листерий в фауне Центрального региона России исследовали 2127 проб биологического материала и объектов внешней среды, отобранных на территориях Калужской, Тверской, Московской и Владимирской областей в период с 2006 по 2013 г.г. (таблица 1).

Таблица 1 - Перечень исследуемых объектов

Наименование объекта Тип объекта Количество проб

Дикая перелетная птица Биологический материал 12

Рыба пресноводная Биологический материал 866

Моллюски, членистоногие, полуводные млекопитающие отряда грызунов Биологический материал 16

Материал от трупов затонувших оленей Биологический материал 34

Материал от отстрелянных диких парнокопытных (пятнистый олень, лось, марал,кабан) Биологический материал 212

Половозрелые формы гельминтов Биологический материал 68

Сыворотки крови от диких парнокопытных Биологический материал 120

Поверхностные слои речной воды Объект внешней среды 20

Донные отложения рек О&ьект внешней среды 14

Водная растительность Объект внешней среды 11

Фекалии диких животных Объект внешней среды 610

Грунт подкормочных площадок Объект внешней среды 127

Гниющие растительные остатки и корма Объект внешней среды 17

Отбор проб воды, водной растительности, гидробионтов, донных отложений проводили в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000. Определение рода и вида отловленной рыбы проводили по атласам-определителям [Н.А. Мягков, 1994; Е.Д. Васильева, 2004]. Возраст рыбы определяли по методике, описанной И.Ф. Правдиным (1966).

Отлов полуводных млекопитающих проводили расстановкой капканов типа КПН 140. Для исследования отбирали пробы паренхиматозных органов и сердце с кровью.

Сбор трупов затонувших диких животных и отбор от них материала (кусочки печени, селезенки, ножки диафрагмы) проводили в весенний период после освобождения водоема от льда.

Диких парнокопытных и дикую птицу отстреливали при проведении мониторинговых исследований на вирусные и бактериальные болезни. Для исследования от животных отбирали пробы паренхиматозных органов, сердца, мышечной ткани, головного мозга, от птиц - паренхиматозные органы, сердце с кровью. Биологический и патологический материалы от диких животных, пробы объектов внешней среды и кормов отбирали согласно «Правил взятия патологического материала и кормов и пересылки их в лабораторию» (Москва, 1987).

Серологический мониторинг осуществляли с использованием реакции связывания комплемента (РСК) согласно инструкции по применению «Набора диагностического для постановки РСК при листериозе».

Исследование проб на наличие листерий, идентификацию выделенных культур, изучение культурально-морфологических, биохимических, серологических свойств проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по лабораторной диагностике листериоза животных и людей» (Москва, 1996) и МУК 4.2.1122-02.

При сравнительном изучении биологических и генетических характеристик выделенных изолятов, разработке среды для определения гемолитической активности использовали 19 штаммов и изолятов листерий, хранящихся в музее бактериальных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Для изоляции, культивирования и изучения биологических свойств

листерий использовали следующие селективные, дифференциально-диагностические и ростовые среды: забуференная пептонная вода, рН 7,2±0,2; среда Фрезера первичного обогащения; среда Фрезера вторичного обогащения; РАЬСАМ-агар; дифференциальный агар для листерий (АЬОА-агар) с селективными и обогатительными добавками; мясо-пептонный агар и бульон (МПА, МПБ); дрожжевой триптонсоевый агар и бульон (ДТСА, ДТСБ); агар и бульон с сердечно - мозговой вытяжкой (СМА, СМБ); полужидкий питательный агар для определения подвижности листерий; среда Кларка; среда Кристенсена с мочевиной; среда Симмонса; нитратный агар; однослойный кровяной агар с содержанием 5% дефибринированной крови барана; среда Гисса с содержанием 1% углеводов, многоатомных спиртов и индикатора Андраде; агар Мюллера-Хинтона для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.

Патогенные свойства изолятов тестировали на аутбредных белых мышах, живой массой 14-16 г и морских свинках, массой 300-400 г. Вирулентность оценивали путем вычисления показателей ЬО100 и 1Л350 в биопробах на аутбредных белых мышах. Величину ЬО50 рассчитывали по формуле Кербера в модификации И. П. Ашмарина и А. А. Воробьева (1962). Содержание и кормление животных проводили согласно принятым нормам. Животных получали из сектора подготовки подопытных животных ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Чувствительность культур листерий к АБП определяли диско-диффузионным методом, определение антимикробной (бактерицидной и бактериостатической) активности биоцидов проводили методом серийных разведений согласно МУК 4.2.1890-04. Для изучения влияния высокомолекулярного белка на антимикробную активность биоцидов проводили аналогичные испытания с добавлением в жидкую питательную среду инактивированной нормальной сыворотки крови лошади в конечной концентрации 40 %.

При разработке способа дезинфекции подкормочных площадок использовали препараты из разных химических классов (комбинированные препараты на основе ЧАС, третичные амины и окислители). Подбор безопасных биоцидов из различных химических классов и оценку их местно-

раздражающего действия проводили согласно методам, описанным в руководстве Р 4.2.2643-10 и «Методических указаниях о порядке испытания новых дезинфицирующих средств для ветеринарной практики», утвержденных ГУВ Госагропрома СССР в 1987 г. В качестве лабораторной модели при определении местно-раздражающего действия использовали кроликов породы «шиншилла». Контроль эффективности проведенных дезинфекционных мероприятий осуществляли согласно «Правил проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора» и «Методических указаний по контролю качества ветеринарной дезинфекции объектов животноводства», утвержденных МСХ РФ 15.07.2002 №13-5-2/0525.

Геномный полиморфизм штаммов/изолятов изучали методом рестрикционного анализа и разделения фрагментов рестрикции электрофорезом в пульсирующем поле (REA PFGE) с использованием набора реагентов GENPATH (BIO-RAD). При расщеплении ДНК исследуемых культур использовали эндонуклеазы рестрикции Sma I (фирмы BioRad) и Apa I (фирмы Promega), входящие в состав коммерческих тест-систем фирмы BioRad (США). Фрагменты ДНК разделяли в 1% геле агарозы на аппарате CHEF Mapper TM (BIO-RAD) в течение 18-20 часов при 6 В/см. Гель окрашивали в растворе этидиума бромида, документировали изображение с помощью системы BioRad и анализировали в программе Gel-Pro 3.1. Степень различия рестрикционных профилей оценивали по числу общих и различающихся фрагментов с вычислением коэффициента Дайса (Dice's distance):

Dij=l-2C/(Ni+Nj)

где С — число полос, общих для культур I и J; N — общее число полос в культурах I и J, соответственно.

Определение филогенетических отношений и построение дендрограмм проводили с применением пакета прикладных программ PHYLIP.

Анализ и статистическую обработку полученных результатов, корреляционный анализ проводили общепринятыми методами, используемыми в биологии [И.П. Ашмарин, A.A. Воробьев, 1962; Г.Ф. Лакин, 1980]. Эпизоотологический анализ проводили, используя описательный, статистический и картографический методы согласно «Рекомендациям по методике эпизоотологического исследования» [И.А. Бакулов, Г.Г. Юрков, А.П.

Песковацков, 1975]. При обработке результатов использовали пакет прикладных программ 81а1£гарЫсБ, версия 2.1.

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Природно-географические характеристики Владимирской, Калужской, Московской и Тверской областей

По географическому местоположению все изучаемые области расположены в центре густо населенной Европейской части России (ВосточноЕвропейская равнина), имеют большой промышленный потенциал с развитой дорожной сетью и характеризуются сходными климато-географическими условиями. Климат на территории всех областей умеренно континентальный, с тёплым летом, умеренно холодной зимой и ярко выраженными переходными сезонами. В областях созданы крупные водохранилища, протекают сотни больших и малых рек. Леса занимают от 44 до 55 % площади. В растительном покрове преобладают смешанные, мелко- и широколиственные леса (Тверская, Московская и Калужская области), сосновые сообщества (Владимирская область). Для региона характерен мелкохолмистый равнинный рельеф с отдельными грядово-холмистыми возвышениями.

Почвы представлены следующими типами: плодородные темноцветные карбонатные и серые лесные (Владимирская область); дерновые аллювиальные почвы (поймы рек Оки и Клязьмы); дерново-подзолистые почвы (Тверская и Калужская области); средне- и тяжелосуглинистого типа (Владимирская, Калужская, Московская области); супесчаного и песчаного типов (Тверская область); подзолисто-болотные и болотные (Калужская и Тверская области). Современная фауна областей насчитывает более 50 видов млекопитающих.

Для проведения исследований в качестве территориальных единиц были выбраны НП «Завидово» (Тверская и Московская области, далее по тексту Тверская/Московская), ГПЗФЗ «Таруса» (Калужская область) и Суздальское ГООХ (Владимирская область) богатые разнообразием флоры и фауны, характерной для рассматриваемого региона.

Социально-экономические (хозяйственные) факторы изучаемых субъектов

В период Великой отечественной войны фауна Центрального региона претерпела значительные изменения в численности диких животных и

нуждалась в их восстановлении, в связи с чем в регионе был проведен большой объем биологических работ. Анализ данных по акклиматизации диких парнокопытных показал, что в период с 1950 по 1970 г.г. в охотничьи угодья Тверской, Московской Калужской и Владимирской областей пятнистые олени завозились из хозяйств Дальнего Востока (таблица 2) [М.П. Павлов 1974, 1999; В.И. Фертиков, 2009]. На территорию изучаемых областей завезено 246 пятнистых оленей.

Таблица 2 - Интродукция пятнистых оленей в охотничьи хозяйства

Тверской, Московской, Калужской и Владимирской областей

Наименование хозяйства, область Год(а) интродукции Место отлова Количество выпущенных животных

Скнятинское охотничье хозяйство, Тверская область 1957-1961 Дальний Восток 59

Завидовское заповедно-охотничье хозяйство (ныне НП «Завидово», Тверская и Московская области 1957-1961 Дальний Восток, Иманская дальневосточная база «Зооцентр» 66

Суздальское государственное лесо-охотничье хозяйство, Владимирская область 1977 Дальний Восток, оленеводческий совхоз «Туманово» Владивостокского района 100

Охотничье хозяйство «Барсуки» (ныне «Таруса»), Калужская область 1972-1974 Скнятинское охотничье хозяйство, Тверская область 21

В природные угодья НП «Завидово» из этой же географической территории с целью акклиматизации завозился и кабан — за период с 1966 по 1970 г.г. завезено и выпущено в природу 102 кабана [В.И. Фертиков, 1998]. Кроме того, между НП «Завидово» и ПГЗФЗ «Таруса» в 90-х годах прошлого столетия существовали тесные хозяйственные связи по обмену дикими животными. Так, на территорию НП «Завидово» в период с 1997 по 1999 г.г. было выпущено 158 пятнистых оленей, отловленных в охотничьих угодьях ПГЗФЗ «Таруса». Данные пятнистые олени были обменяны на 192

кабана, отловленных на территории парка и выпущенных в угодья ПГЗ ФЗ «Таруса».

Таким образом, результаты анализа вторичных движущих сил эпизоотического процесса свидетельствуют о возможности заноса листерий в популяции диких парнокопытных на территорию Центрального региона с Дальнего Востока, а природно-географические и социально-экономические факторы, наблюдаемые на территориях Тверской/Московской, Калужской и Владимирской областей, как и во всем регионе благоприятны для возникновения аутохтонных очагов листериоза.

Мониторинг листерий в популяциях тепло- и холоднокровных животных, обитающих на территории Центрального региона РФ

Изучение распространения листерий в популяциях диких парнокопытных и объектах внешней среды

В период с 2006 по 2012 г.г. с целью изучения распространения листерий в дикой фауне Московской, Тверской, Калужской и Владимирской областей, плотно населенных популяциями диких парнокопытных, произведен отбор 1098 проб различных объектов. География и структура исследованных проб представлены в таблице 3.

Таблица 3 - География исследованных проб

Место отбора проб Административные районы Вид материала Количество отобранных проб

ГПЗФЗ «Таруса», Калужская область Жуковский объекты внешней среды 286

биологический материал 151

НП «Завидово», Московская и Тверская области Калиниский Конаковский Клинский Лотошинский Волоколамский объекты внешней среды 382

биологический материал 193

Суздальское ГООХ, Владимирская область Камешковский Суздальский объекты внешней среды 86

биологический материал 0

В результате исследований фекалий животных установлено, что дикие парнокопытные, обитающие на территориях Тверской/Московской, Калужской и Владимирской областей являются носителями в желудочно-кишечном тракте

листерий 2-х из 8-ми известных в настоящее время видов - Listeria monocytogenes и Listeria innocua.

При этом уровень носительства листерий в популяциях диких парнокопытных, обитающих на различных территориях, зависит от формы хозяйственной деятельности субъекта и уровня развития ветеринарной службы. Так, на территориях ГПЗФЗ «Таруса» и НП «Завидово», расположенных в Калужской, Тверской/Московской областях, где выполняются все необходимые профилактические мероприятия, листерионосительство пятнистым оленем составило 5,5 и 8,7 %, кабаном - 6,6 и 7,8 %, а маралом - 0 и 6,0 %, соответственно. Аналогичные показатели для пятнистого оленя и кабана, обитающих на территории Суздальского ГООХ Владимирской области, где не имеется возможности проведения в полном объеме ветеринарно-санитарных и охото-устроительных мероприятий, составили 34,5 и 24,0 %, соответственно.

Инфицированность L. monocytogenes в популяциях диких парнокопытных охотохозяйств Тверской/Московской, Калужской и Владимирской областей составила 2,1%, 3,2% и 7,3%, L. innocua - 4,98%, 2,43% и 23,2% соответственно (от числа исследованных проб).

Выявление листерионосителей в популяциях парнокопытных, средой обитания которых являются различные лесные сообщества, свидетельствует о приуроченности природных очагов листериоза к лесным ландшафтам - от 23 до 44% территорий изучаемых субъектов занято лесными массивами.

При составлении нозогеографических карт для каждого изучаемого хозяйства (НП, ГПЗФЗ, ГООХ) и последующем их анализе было установлено следующее:

— в 5 административных районах (Калининский, Конаковский Клинский Лотошинский и Волоколамский), на территории которых расположен НП «Завидово», листерионосители среди диких парнокопытных обнаружены лишь в 2-х - Конаковском районе Тверской области и Лотошинском районе Московской области. Причем максимальное количество листерионосителей выявлено на 5 подкормочных площадках Сокольского лесничества (Конаковский район) и по одному случаю в Ошейкинском и Грибановском лесничествах (Лотошинский район);

- в 2 исследованных административных районах Суздальского ГООХ дикие парнокопытные-листерионосители обнаружены на территории обоих районов. 83% парнокопытных, инфицированных L. monocytogenes, выявлены на территории Суздальского района, остальные 17% - на территории Камешковского района;

- в ГПЗФЗ «Таруса» листерионосители обнаружены на территории всех трех лесничеств, в частности, 4-х подкормочных площадках, расположенных на юге, севере, востоке и западе, что свидетельствовало о наличии диффузного очага листериоза на этой природоохранной территории.

Анализ причинно-следственных связей показал, что из всех природно-климатических условий (количество выпадаемых осадков, климат, типы растительных сообществ и почвы) основные различия изучаемых административных районов заключаются в типах почв и плотности населения популяционных группировок диких парнокопытных, посещающих подкормочные площадки.

Корреляционным анализом выявлена связь между типом почв, плотностью населения животных в популяционных группировках и вероятностью обнаружения листерионосителей: прямая слабая (г=0,26) и прямая сильная (г=0,81) связи между плотностью населения животных и плодородием почвы, т.е. с увеличением плотности населения популяционных группировок дикими парнокопытными и содержанием органических веществ в почвах ареала обитания увеличивается вероятность обнаружения листерионосителей (р<0,05).

Для выявления закономерностей эпизоотического процесса на территории различных областей определяли степень распространения листерионосителей в пределах того или иного нозоареала. В качестве единицы нозоареала рассматривали территорию одной подкормочной площадки (квартала). Установлено, что в НП «Завидово» и ГПЗФЗ «Таруса» коэффициент распространения листерионосителей практически идентичен (0,11 и 0,13), в то время как в Суздальском ГООХ он выше более чем в 2,5 раза.

По результатам лабораторных исследований установлено, что листерионосители среди диких парнокопытных выявляются во все сезоны года. По нашему мнению, это является свидетельством хронического носительства листерий дикими животными в желудочно-кишечном тракте. Эти данные

согласуются с мнением Ю.Г. Чернуха (1988) о том, что у диких животных зоонозы протекают, как правило, хронически, способствуя сохранению возбудителя в природе неограниченно длительное время.

Из 212 исследованных проб биологического/патологического материала от диких парнокопытных лишь в трех случаях удалось выделить культуры листерий. В одном случае культуру L. monocytogenes выделили из легких и печени павшего кабана, обитающего на территории Национального парка «Завидово». Две культуры L. innocua выделены из содержимого желудка, затонувшего в акватории Шошинского плеса, пятнистого оленя и печени пятнистого оленя, отстрелянного с диагностической целью. По данным наблюдения егерских и ветеринарных служб, у диких животных клинических симптомов проявления листериоза не регистрировали. Подтверждением тому служат отрицательные результаты исследований 120 проб сывороток крови диких животных на присутствие в них противолистериозных антител.

Для выявления природных резервуаров листерий дополнительно исследованию подвергали грунт подкормочных площадок, гниющие растительные остатки, сочные и сухие корма, загрязненные экскрементами грызунов. Установлено, что все исследованные объекты являются природными резервуарами и источниками листерий обоих видов для диких парнокопытных.

Всего из объектов внешней среды (без учета фекалий диких парнокопытных) изолировано 34 культуры листерий, из которых 6 принадлежало к виду L. monocytogenes, а остальные 28 - к виду L. innocua. При этом максимальное количество культур (3 изолята) L. monocytogenes было выделено из сочных кормов и зернофуражной смеси, отобранных на территории ГПЗФЗ «Таруса».

Изучение распространения листерий в акватории Шошинского плеса Иваньковского водохранилища

Для выяснения роли пресноводных рыб, обитающих в водоемах Центрального региона, в эпизоотологии листериоза в период с 2006 по 2010 г.г. проведены мониторинговые работы в акватории Иваньковского водохранилища, входящего в систему Волжских водохранилищ и обеспечивающих г. Москву питьевой водой. В качестве объекта исследований был выбран один из самых мелководных, хорошо прогреваемых и зарыбленных плесов - Шошинский, в

прибрежной зоне которого расположены очистные сооружения п. Козлово и Национального парка «Завидово» (река Котевля), подкормочные площадки с выходом диких животных к береговой полосе (реки Лама и Шоша), что, по нашему мнению, могло являться источниками попадания листерий в акваторию плеса. Подтверждением необходимости проведения исследований послужило то, что в 2006 году из 7 исследованных экземпляров рыб, выловленной в водах Шошинского плеса, 2 оказались зараженными L. monocytogenes.

За весь период наблюдений было отобрано 866 образцов пресноводной рыбы, относящихся к 19 видам из них: 8 видов являлись хищниками, 2 вида растительноядными и 9 видов представлены особями со смешанным типом питания.

Структура исследованной рыбы представлена на диаграмме 1.

И лещ

■ окунь обыкновенный

® красноперка

■ карась и дикие гибриды

Диаграмма 1 - Виды рыб биоценоза Иваньковского водохранилища, исследованных на листерионосительство (%)

В 2006 году процент особей, инфицированных L. monocytogenes, от общего числа исследованных проб составил 28,6. Однако в последующем, при более массовом исследовании проб, уровень выявляемых листерионосителей среди популяции рыбы не превышал 1%. В 2009 и 2010 г.г. среди отловленных экземпляров рыбы носителей L. monocytogenes не обнаруживали.

Всего от различных видов рыб за весь период наблюдений изолировали 52 культуры листерий, из которых 7 принадлежало к виду L. monocytogenes, а 45 — к виду L. innocua. Частота выделения листерий от общего числа проб составила 6,0 %, из которых на долю L. monocytogenes пришлось 0,8% всех случаев. Какой-либо зависимости частоты обнаружения листериносителей от возраста рыбы, половой принадлежности и типа ее питания не выявлено.

Частота выделения листерий патогенных и непатогенных видов от рыб

8%_

представлена на диаграмме 2.

■ окунь

Listeria Listeria innocua

monocytogenes

Диаграмма 2 - Частота выделения (%) листерий от рыб различных видов

С одинаковой частой листерии обоих видов выделяли от карася и его диких гибридов (2,3% случаев). Различия в частоте выявления листерий патогенных и непатогенных видов обнаружены для леща, густеры и окуня обыкновенного. Ни в одном из случаев не удалось изолировать культуры L. monocytogenes от красноперки, щуки обыкновенной, толстолобика пестрого и карпа.

При анализе географии обнаружения листерионосителей установлено, что L. innocua выявляли в рыбе, выловленной в трех из 4-х рек (Лама, Шоша, Котевля) бассейна Шошинского плеса, в то время как L. monocytogenes изолировали от рыб, обитающих в реках Шоша и Котевля.

При этом 56% культур были изолированы от рыбы, выловленной в реке Котевля вблизи места расположения очистных сооружений (п. Козлово).

Дополнительное изучение возможных источников поступления листерий в аквафауну показало, что таковыми может выступать и вселяемая молодь рыб. Так, у вселяемой молоди толстолобика пестрого и карпа обнаружено носительство листерий непатогенных видов.

При изучении тропизма листерий к тканям и органам рыб установлено, что наиболее часто культуры листерий патогенных и непатогенных видов изолируют из поверхностных покровов кожи рыб (в 50% случаев - L. monocytogenes и в 47,5% случаев L. innocua), затем в 37,5 - 39% случаев из жаберных лепестков и в 12,5 - 13,5% случаев - из органов кровотока и кишечника, соответственно.

Анализ данных выделения культур от гидробионтов показал, что в

отличие от диких парнокопытных сезонные изменения погодных условий, в частности, повышение температуры воды, оказывают влияние на показатели естественного инфицирования рыбы листериями - пик носительства приходится на летний период (40%). В осенний и зимний периоды частота обнаружения листерионосителей находится на одном уровне и составляет 28%, весной этот показатель снижается до 4%.

Изучение распространения листерий в объектах внешней среды, среди представителей водной и полуводной фауны, трупах затонувших животных, гельминтах

Для получения более полной информации о возможных источниках поступления листерий в аквафауну Шошинского плеса и их резервуаров было отобрано и подвергнуто исследованию 172 различных пробы биологического материала от дикой перелетной птицы, полуводных млекопитающих отряда грызунов (ондатра), моллюсков (беззубка речная, улитки), членистоногих (рак), трупов затонувших пятнистых оленей, гельминтов, а также донные отложения рек, водная растительность, поверхностные слои речной воды.

Из всех исследованных образцов, листерии или их генетический материал были обнаружены только в пробах биологического материала от затонувших трупов пятнистого оленя.

Разработка мероприятий по дезинфекции подкормочных площадок для диких животных

Дезинфекция является важным звеном в системе охранных профилактических мероприятий, обеспечивающих в целом безопасность объектов государственной охраны в отношении зоо(антропо-)нозов. Ранее указывалось, что одним из природных резервуаров листерий является грунт подкормочных площадок, в поверхностных слоях которого патоген может сохраняться продолжительное время, тем самым способствуя инфицированию новых особей и распространению листерий в популяциях диких парнокопытных.

Проведение дезинфекционных мероприятий в дикой фауне осложняется активной реакцией животных на запахи и присутствие человека. Поэтому к дезинфицирующим средствам (ДС) предъявляются повышенные требования, в частности, отсутствие выраженной токсичности для животных и человека и

резкого отпугивающего запаха.

На основании сведений о безопасности ДС различных химических классов, механизмах и спектрах их инактивирующего действия для исследований были отобраны 3 «неагрессивных» дезинфектанта, относящихся к таким химическим классам как окислители (Экоцид С), четвертичные (Эффект-Форте) и третичные (Теотропин) амины.

Известно, что штаммы одного и того же вида бактерий могут иметь различия в устойчивости к физическим и химическим факторам, в том числе и к дезинфицирующим средствам. Для получения объективных данных об устойчивости выделенных изолятов L. monocytogenes к ДС в рабочую коллекцию отобрали по несколько изолятов, выделенных на территории различных административных областей (Тверской, Владимирской, Калужской). Антимикробную активность отобранных ДС тестировали в отношении 9 изолятов L. monocytogenes и 2 референс-штаммов I и II серогруппы (№№766 и 634, соответственно). Результаты изучения антимикробного действия биоцидов в отношении листерий представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Антимикробная активность отобранных биоцидов в отношении листерий

п=11

Наименование препарата Концентрация препарата, вызывающая бактериостатическое действие, % Концентрация препарата, вызывающая бактерицидное действие, %

Теотропин 0,025±0,002 0,065±0,007

Экоцид С 0,113±0,008 0,301±0,04

Эффект-Форте 0,0037±0,002 0,022±0,005

При тестировании биоцидов установлено, что наибольшей активностью в проявлении бактериостатического и бактерицидного действия в отношении листерий обладали препараты на основе третичных и четвертичных аминов. У перекисного препарата Экоцид С антимикробная активность была в 4,5 раза ниже чем у Теотропина и в 13-30 раз ниже, чем у Эффект-Форте. При этом препарат Эффект-Форте обладал наиболее выраженной бактериостатической активностью. Значимых различий в устойчивости различных изолятов L. monocytogenes к ДС не выявлено.

Известно, что наличие в почве и на поверхности объектов ветеринарно-

санитарного надзора высокомолекулярного белка оказывает существенное влияние на эффективность дезинфекции, в связи с чем, нами изучено влияние белков сыворотки крови лошади на антимикробную активность ДС (таблица 5).

Таблица 5 - Антимикробная активность биоцидов в отношении листерий в присутствии высокомолекулярного белка

п=6

Наименование препарата Концентрация препарата, вызывающая бактериостатическое действие, % Концентрация препарата, вызывающая бактерицидное действие, %

Теотропин 0,023±0,003 0,0465±0,003

Экоцид С 1,75±0,25 2,0±0

Эффект-Форте 0,014±0,003 0,06±0,02

Установлено, что присутствие органического белка не оказывает влияния на антимикробную активность Теотропина, тогда как эффективные концентрации препаратов Экоцид С и Эффект-Форте, вызывающие бактериостатическое и бактерицидное действие в отношении листерий, возросли более чем в 6,5 и 2,5 раз соответственно.

Также, отмечена более широкая вариабельность устойчивости испытуемых культур L. monocytogenes к действию препарата Эффект Форте (0,0078 - 0,031% статическое действие и 0,015-0,125% цидное действие).

При выборе дезсредства для проведения дальнейших испытаний за основополагающие были использованы следующие критерии: высокая антимикробная активность; слабое влияние высокомолекулярного белка на статическое и цидное действие препаратов в отношении листерий; стабильность рабочих растворов дезсредства; отсутствие местно-раздражающего действия; отсутствие в составе препаратов отдушек, красителей и т.п.

Из испытанных ДС предъявленным требованиям отвечал Теотропин — высокая бактерицидная активность в отношении листерий как в присутствии, так и в отсутствии органического белка, отсутствие постороннего запаха, способного отпугнуть животных, высокая стабильность рабочих растворов (до 120 суток в сравнении с 7 сутками для Эффект Форте), 4-5 класс опасности по выраженности местно-раздражающего действия на слизистые оболочки глаз и кожу.

Учитывая данные литературы о биологии листерий, особенностях

питания диких парнокопытных, антимикробной и дезинфицирующей активности Теотропина, типа почвы и сосредоточении микробных клеток бактерий в поверхностных горизонтах почвы было решено, что для достижения необходимого профилактического эффекта достаточна обработка почвы на глубину до 5 см.

Подбор режимов обеззараживания поверхностных слоев грунта проводили в лабораторных и полевых условиях. Определяли рабочие концентрации ДС, нормы его расхода и необходимость дискования почвы после внесения ДС. Пробы для контроля эффективности обеззараживания отбирали через 24 ч после нанесения ДС, эффективность оценивали по выявлению санитарно-показательных микроорганизмов и Listeria monocytogenes. Данные по эффективности обеззараживания ДС поверхностного слоя фунта на глубину 5 см представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Результаты оценки эффективности дезинфекции, проведенной с использованием 2%-ного водного раствора Теотропина

Норма расхода препарата Наличие в пробе грунта санитарно-показательных микроорганизмов

БГКП* Staphylococcus sp. L. monocytogenes

1 дм'/М* обнаружены обнаружены обнаружены

2 дм^м7 обнаружены не обнаружены не обнаружены

3 ш'/м1 не обнаружены не обнаружены не обнаружены

Контроль обнаружены обнаружены обнаружены

Примечание: БГКП* - бактерии группы кишечной палочки.

В полевых испытаниях установлено, что оптимальная норма расхода 2% раствора Теотропина, обеспечивающая инактивацию санитарно-показательных микроорганизмов, относящихся к 1 и 2 группам по устойчивости к химическим ДС, на глубину 5 см в поверхностном слое из намытого речного песка, составляет 3 дм3/м2 при экспозиции 24 ч.

Изучение биологических свойств и паспортизация изолятов L. monocytogenes, выделенных в дикой фауне

Характер проявления и широта распространения большинства инфекционных болезней, прежде всего, связаны с биологическими особенностями возбудителя и его вирулентностью [А.А. Конопаткин и др., 1984]. При этом отмечается, что для возбудителей некоторых природно-очаговых инфекций характерна неоднородность спектра микробиологических

свойств для изолятов, выделяемых на различных географических территориях. Так, например, на основе отклонений в проявлении фенотипических признаков у возбудителя чумы (Yersinia pestis) выделены несколько био(эко)типов, связанных с их территориальной принадлежностью [Л.Н. Величко, A.M. Кокушкин, 1997; O.K. Поздеев, 2006]. Кроме того, биологические и генетические характеристики патогенов могут изменяться под влиянием иммунно-биологических свойств макроорганизма животного-носителя [О.В. Горшков, 2000]. Учитывая, что исследуемые изоляты листерий были выделены в различных административных областях ЦФО РФ и от разных сочленов популяций холодно- и теплокровных диких животных, для нас представляло интерес изучение их биологических характеристик.

В результате проведенных исследований рабочей коллекции, состоящей из 25 изолятов L. monocytogenes, какие-либо существенные отличия в проявлении тех или иных фенотипических признаков не выявлены. Для всех изолятов были характерны типичные для этого вида культурально-морфологические и некоторые биохимические свойства. Незначительные отличия выявлены в способности изолятами ферментировать сахара и многоатомные спирты. 7 из 25 изолятов обладали способностью сбраживать сахарозу, 6 - сорбит (на 10 сутки инкубирования посевов), а два изолята, выделенные из объектов внешней среды и фекалий кабана на одной и той же подкормочной площадке Калужской области, - дополнительно сбраживали галактозу и раффинозу. При этом установлено, что эта способность не связана с источником выделения изолята.

Исследованием антигенной структуры выделенных изолятов установлено, что все они без исключения агглютинировались поливалетной сывороткой и сывороткой I серологической группы. По способности лизироваться специфическими листериозными фагами L2A и L4A культуры листерий распределились на две группы. Первую группу формировали 22 изолята L. monocytogenes чувствительных к воздействию фага L2A и не лизирующиеся фагом L4A, вторую - 3 изолята резистентные к обоим бактериофагам.

Основными дифференциально-диагностическими признаками, позволяющими отличать патогенные виды листерий от непатогенных, являются способность первых вызывать лизис эритроцитов животных и ферментировать

определенные фракции куриного желтка. Если для детекции второго признака современной ветеринарной и медицинской практике предложено несколько различающихся по чувствительности питательных сред, то выявление гемолитической активности L. monocytogenes до сих пор принято определять на классическом кровяном агаре, имеющем ряд недостатков, в частности, низкую чувствительность.

Для повышения эффективности выявления признака гемолитической активности у листерий нами проведены исследования по разработке более чувствительной тест-системы. За основу избран двухслойный агар широко применяющийся в микробиологической практике для изучения энзиматической активности микробов и имеющий ряд преимуществ перед однослойными средами. С учетом биологии листерий произведен подбор оптимального состава покрывного слоя агара, включающий 0,85% хлористого натрия, 100% МПБ (бульон Хоттингера), 1% дрожжевого экстракта, 0,7% агара «Дифко», 2 тМ дитиотрейтола и 3% дефибринированной крови кролика.

После завершения конструирования двухслойной тест-системы проведены сравнительные испытания классического кровяного агара с предложенной новой средой. В результате исследований установлено, что двухслойный кровяной агар превосходит по наглядности, чувствительности и эффективности выявления гемолитической активности листерий однослойную среду (рисунок 1).

С использованием разработанной среды изучены гемолитические свойства 16 культур L. monocytogenes, выделенных из различных источников Установлено, что штаммы/изоляты L. monocytogenes неоднородны в проявлении гемолитических свойств в отношении эритроцитов кролика. Из 16 изученных культур 5 экспрессировали гемолизины на низком уровне, а 10 - на среднем. Один изолят не вызывал деградации красных кровяных телец.

Рисунок 1 - Классический (А) и двухслойный (Б) кровяной агары через 48 часов инкубирования при 37°С культур штаммов следующих видов листерий: 1 - L. monocytogenes №766; 2 - L. monocytogenes №9-72; 3-1. monocytogenes №9-127; 4 - L. monocytogenes №634; 5 - L. seeligery; 6 - L. welshimeri; 1 - L. innocua

Тестирование гемолитической и фосфолипазной активностей изолятов, выделенных в дикой фауне, с использованием разработанного нами двухслойного кровяного агара и хромогенного агара для дифференциации листерий по признаку фосфолипазной активности (ALOA-arap), установило, что все они без исключения экспрессировали in vitro основные факторы патогенности L. monocytogenes. При постановке пробы Антона на морских свинках все изоляты без исключения вызывали формирование гнойного кератоконъюнктивита на 2-4 сутки после инокуляции патогена на конъюнктиву глаза.

Таким образом, изучение фенотипических характеристик изолятов листерий, выделенных в период с 2006 по 2009 г.г. на территориях Тверской, Московской, Калужской и Владимирской областей показало, что большинство их биологических характеристик соответствовало свойствам культур, выделенных в ходе эпизоотических и эпидемических вспышек от животных и человека, и хранящихся в музее бактериальных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Каких-либо фенотипических маркеров, указывающих на принадлежность штамма к определенному хозяину, нами не выявлено.

В последнее время в качестве маркера, позволяющего определять источник выделения или заноса, принято использовать устойчивость культур к антибиотикам. Так, например, энрофлоксацин- и тетрациклин устойчивые

варианты листерий, как правило, выделяют от животных, а эритромицинрезистентные изоляты - преимущественно из клинического материала от человека [S. Monden et al., 2010; J. Barbosa et al., 2010]. В сравнительном аспекте изучены антибиотикограммы 17 изолятов L. monocytogenes, вьщеленных от холодно- и теплокровных диких животных, 16 изолятов, вьщеленных в период с 1943 по 2012 г.г. на территории бывшего СССР, РФ (14 изолятов) и за рубежом (2 изолята), а также референс-штаммы первой и второй серогруппы №№766 и 634, соответственно.

Чувствительность исследуемых культур L. monocytogenes определяли в отношении 18 антимикробных препаратов, принадлежащих к 11 группам.

Независимо от источника выделения, все тестируемые культуры L. monocytogenes показали высокую и среднюю чувствительность к антибактериальным препаратам из групп фторированных хинолонов, макролидов, тетрациклинов, пенициллинов, цефалоспоринов, ингибиторов биосинтеза фолиевой кислоты и гликопептидов. Подобная чувствительность культур также отмечена и для двух препаратов из группы аминогликозидов, за исключением одного изолята, выделенного из фекалий кабана на территории Тверской области, - он оказался малочувствителен к этим АБП. Все без исключения изоляты проявляли природную резистентность к воздействию полимиксина Б.

Чувствительность культур L. monocytogenes к таким препаратам как цефаклор, стрептомицин, неомицин, олеандомицин, клиндамицин и бацитрацин варьировала. Максимальную устойчивость к воздействию АБП наблюдали у изолята, выделенного из фекалий кабана на территории Тверской области, который был резистентен к воздействию стрептомицина (Str-), клиндамицина (Cd-), высокоустойчив к воздействию неомицина, амикоцина и олеандомицина (N+, Ak+, 01+). При проведении в последующем эпизоотологического исследования установлено, что в НП «Завидово» имеются пастбищные территории, которые активно используются как дикими, так и сельскохозяйственными животными. Таким образом, обнаружение подобного изолята свидетельствует в пользу гипотезы о возможности обмена изолятами листерий между дикими и домашними животными, подвергаемыми антибактериальной терапии.

Разработка классификации L. monocytogenes по вирулентности для лабораторных животных

Как известно, в возникновении любого инфекционного заболевания, большую роль играет вирулентность возбудителя, которую следует рассматривать как фенотипический признак, проявляющийся в способности патогена вызывать поражение клеток человека или животного. Она является показателем индивидуального качественного признака патогенного микроорганизма и может изменяться как под влиянием экологических факторов, так и естественных условий состояния внутренней среды организма хозяина. В настоящее время отсутствуют данные о влиянии неспецифических факторов иммунитета диких животных на патогенные свойства изолятов, оценке их эпизоотической и эпидемической значимости. Кроме того, не разработана классификация патогенных листерий по их вирулентности для лабораторных животных, без которой невозможно решить данные вопросы.

При разработке классификации в качестве лабораторной модели использовали аутбредных белых мышей живой массой 14-16 г. Предварительно устанавливали влияние состава питательных сред и различных сезонов года на показатели вирулентности для белых аутбредных мышей. Установлено, что состав питательной среды и сезоны года не оказывают существенного влияния на показатели вирулентности для аутбредных белых мышей. В связи с тем, что в некоторых случаях при определении показателя LDioo наблюдали выживание по 1-2 головы в группах животных, зараженных максимальными дозами возбудителя, при гибели 100% животных, инфицированных меньшими дозами, в качестве объективного показателя использовали LD50. Для получения достоверной информации проводили определение верхних и нижних границ доверительного интервала, в котором с вероятностью 95% находится действительное значение LD50 Результаты определения показателей LDso/max и LD5o/min некоторых штаммов и полевых изолятов L. monocytogenes представлены в таблице 7.

Установлено, что показатели LD50 для белых мышей у изучаемых культур варьируют, хотя для большинства ИЗ НИХ LDso/min И LDso/max НАХОДИЛИСЬ В пределах Ю6- 107м.т./гол.

Таблица 7 - Показатели LDS0 некоторых штаммов/изолятов L.

monocytogenes для аутбредных белых мышей

Условное обозначение Источник и год выделения Показатель LDj0, м.т./гол

LDso/max LDJ0/min

1 2 3 4

«А» пастбищный клещ, 1952 не титруется* не титруется

61-06 фекалии кабана, 2006 3,59x10" 5,198x10s

69-06 лещ, 2006 2,32x10' 4,63x10'

71-06 густера, 2006 2,82x10' 5,51x10'

76-06 головной мозг овцы, 2006 1,82x10' 3,64x10'

134-08 грунт подкормочных площадок, 2008 2,52x10' 4,30x10'

139-08 фекалии кабана, 2008 2,18x10' 4,35x10'

243-09 фекалии пятнистого оленя, 2009 2,67 х106 5,34x10s

311-07 окунь, 2007 6,14x10' 1,23x10'

431-09 фекалии пятнистого оленя, 2009 2,16x10' 2,67x10'

434-09 фекалии кабана, 2009 1,23x10" 1,78х105

488-09 фекалии пятнистого оленя, 2009 5,0x10' 8,52x10'

633-09 фекалии кабана, 2006 3,0x10' 4,35x10'

699-09 фекалии пятнистого оленя, 2009 9,48x10' 1,37x10'

39-12 кровь сердца аборт-плода КРС, 2012 2,32x10' 2,32x10'

референс-штамм II серогруппы №634 свинья, 1955 1,35x10" 2,69x10'

референс-штамм I серогруппы №766 овца, 1976 6,64x10' 1,33x10'

12** человек 2,3x10' 2,0x10'

138** человек 3,2x10' 2,95x105

Коспоченко** человек 23x10s 2,0х105

Нелюбова** человек 5,6x10' 5,35x10'

Примечание: * - показатель ЫЭюо свыше 10 м.т. гол; 12** - изоляты, выделенные от больных людей, показатели ЬЭзо определены Б.И. Маракуша, К. Дарвиш и И.С. Тартаковским, 1996 (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи).

На основе анализа результатов определения показателей LD50 43 культур L. monocytogenes разработана следующая схема дифференциации изолятов листерий по их вирулентности для белых аутбредных мышей:

— высоковирулентные штаммы - LD5o/min и LD50/max в пределах 104 - 106 м.т./гол;

- вирулентные штаммы - LDso/mm и LD50/max в пределах 106 - 107 м.т./гол;

- умеренновирулентные - LD50/mm и LDso/maxB пределах 107 - 108м.т./гол;

- слабовирулентные - LD5o/mm и LD50/max в пределах 108 - 109м.т./гол;

- авирулентные - показатель LDso не титруется (LDioo свыше 10® м.т./гол).

Оценка вирулентных свойств 22 изолятов L. monocytogenes, выделенных в дикой фауне показала, что среди «диких» изолятов L. monocytogenes 4 принадлежало к группе высоковирулентных культур и 18 - к группе вирулентных культур. Минимальный показатель LD50 для изолятов первой группы составил 1,78х105 КОЕ/гол, а максимальный - 4,54х106 КОЕ/гол. Для второй группы эти показатели составили 1,03х10б и 5,0х107 КОЕ/гол соответственно. Показатели вирулентности изолятов, выделенных от диких животных и объектов внешней среды, были сопоставимы с таковыми показателями для изолятов, выделяемых при различных патологиях человека, вызванных листериями, т.е. при наличии или стечении неблагоприятных факторов (холодные и голодные зимы, беременность, молодые и старые животные, контаминация патогенными листериями продукции, изготовленной на основе продуктов убоя диких животных и т.п.) они способны вызвать заболевание не только у животных, но и у человека.

Генетическая характеристика изолятов L. monocytogenes

Определение генетического разнообразия различных изолятов L. monocytogenes является необходимым аспектом в изучении молекулярной эпизоотологии возбудителя. Выяснение филогенетических различий среди изолятов одной и той же серогруппы позволит установить происхождение отдельно взятого штамма, более детально следить за его распространением среди восприимчивых животных и выявлять источники инфицирования. В своих исследованиях для генотипирования выделенных изолятов L. monocytogenes мы применили метод гель-электрофореза рестрицированной ДНК в пульсирующем поле - REA PFGE с применением рестриктаз Smal и Apal. Наиболее информативными являлись результаты рестрикции с использованием

Таблица 8 - Оценка степени генетического родства изолятов L. monocytogenes, выделенных от диких холодно- и теплокровных животных, объектов внешней среды с использованием коэффициента Дайса (Sma I)

Условное обозначение изолята 61-06 69-06/71-06 134-08 139-08 164-09 191-09 276в/о-07/ 277ж-07 311-07 361-09 403-09 434-09 438-09 633-09 699-09

61-06 - 0,28 0,22 0,24 0,26 0,26 0,21 0,16 0,26 0,16 0,30 0,27 0,18 0,09

69-06/71-06 - 0,23 0,30 0,17 0,17 0,22 0,22 0,12 0,25 0,27 0,28 0,14 0,27

134-08 - 0,28 0,24 0,24 0,24 0,25 0,24 0,11 0,11 0,17 0,13 0,24

139-08 - 0,27 0,27 0,27 0,23 0,27 0,26 0,32 0,29 0,24 0,23

164-08 - 0 0,24 0,19 0 0,24 0,29 0,25 0,21 0,09

191-09 - 0,24 0,19 0 0,27 0,29 0,25 0,21 0,14

276в/о-07/277ж-07 - 0,09 0,24 0,23 0,33 0,25 0,25 0,09

311-07 - 0,19 0,18 0,33 0,30 0,14 0,05

361-09 - 0,27 0,29 0,25 0,21 0,14

403-09 - 0,18 0,19 0,16 0,18

434-09 - 0,3 0,26 0,33

438-09 - 0,15 0,25

633-09 - 0,21

экзонуклеазы Smal. Оценку степени генетического родства проводили комбинированным методом: вычислением коэффициента подобия Дайса (Dsc -Dice's similarity coefficient, таблица 8) и сопоставлением фрагментов рестрикции ДНК-матриц изолятов [М.А. Davis et al., 2003]. Идентичными считали штаммы, не отличающиеся по набору фрагментов рестрикции и имеющие Dsc 0,0; родственными - отличающиеся по 2-3 фрагментам и имеющие Dso от 0,03 до 0,08; возможно родственными - по 4-6 фрагментам, Dsc от 0,09 до 0,15 и неродственными - по 7 и более фрагментам, Dsc>0,16.

Рестрикционный анализ 15 изученных изолятов, выделенных от диких холодно- и теплокровных животных, объектов внешней среды, позволил разделить их на 12 пульс-электротипов (ПЭТ, таблица 9).

Таблица 9 - Пульс-электротипы изолятов L. monocytogenes, выделенных в дикой фауне

Номер ПЭТ Количество изолятов в группе с идентичными ПЭТ Условное обозначение изолята, № Источник выделения изолятов

I 2 69-06,71-06 густера, лещ

II 2 277в/о-07,277ж-07 карась

III 1 311-07 окунь

IV 1 699-09 пятнистый олень

V 1 61-06 кабан

VI 1 191-09 грунт подкормочных площадок

VII 1 139-08 кабан

VIII 3 164-09 191-08 361-09 пятнистый олень, марал, гниющие растительные остатки

IX 1 403-09 пятнистый олень

X 1 434-09 кабан

XI 1 438-09 кабан

XII 1 633-09 кабан

Как видно из данных таблицы 9 девять ПЭТ представлены единичными изолятами, два ПЭТ - двумя и один ПЭТ - тремя изолятами. При этом ПЭТ одного изолята, выделенного на территории Калужской области (№№139-08), уникален, тогда как остальные 11 обладают генетическим родством в различной

степени: от идентичных до возможно родственных. Три клональных варианта L. monocytogenes, формирующие ПЭТ I, II и III, были выделены от сочленов ихтиофауны, обитающих в акватории Иваньковского водохранилища. Причем изоляты от карася и окуня (II и III ПЭТ) имеют относительно высокую степень родства (Dsc= 0,09, рисунок 2) и входят в группу возможно родственных изолятов.

436,5

388,0 339,5 291,0

242,5

194,0

145,5 -►

97.0 -►

48,5

т.п.о.

I

а

9

к

ш

Ф Щ *» ~ "* •

Я ' »

■ W '

Рисунок 2 - Электрофореграмма разделения в пульсирующем поле Sma I -фрагментов ДНК изолятов L. monocytogenes

Треки: 1,11- маркер; 2 - изолят №311; 3 - изолят №699; 4 - изолят №276в.о.-07; 5 - изолят №69-06; 6 - изолят №139-08; 7 - изолят №71-06 (лещ); 8 - изолят №134-08; 9 - изолят №277ж-07; 10-S. aureus.

В целом, изоляты L. monocytogenes, выделенные от диких парнокопытных на одной и той же географической территории формируют обособленные группы. Однако анализ филогенетических отношений позволил выявить идентичность изолятов, выделенных из фекалий пятнистого оленя, обитающего в охотничьих угодьях Калужской области, и культур, изолированных из растительных остатков и фекалий марала, отобранных на территории Тверской области (№№164, 191 и 361). Кроме того, к группе возможно родственных изолятов можно отнести культуры, выделенные из фекалий пятнистого оленя и кабана (№№403-09 и 434-09), обитающих на территории Суздальского ГООХ, и грунта подкормочной площадки (№134-08), расположенной на территории

ГПЗФЗ «Таруса» (Dsc= 0,09). Эти данные в целом подтверждают участие торгово-хозяйственных отношений между указанными охотхозяйствами в распространении листерий на территории РФ.

На основании анализа данных построения дендрограмм и филогенетических отношений изолятов L. monocytogenes также установлено:

- наличие филогенетического родства между некоторыми изолятами, выделенными на территории различных административных районов и областей ЦФО РФ, косвенно подтверждает состоятельность гипотезы об их едином географическом источнике происхождения - Дальнем Востоке и подтверждается документально сведениями об интродукции животных;

- обнаружение генетически идентичных изолятов, выделенных в 2008 году из гниющих растительных остатков (изолят №191-08) и в 2009 году из фекалий марала (изолят №361-09) в одном и том же охотничьем хозяйстве (НП «Завидово») свидетельствует о длительной циркуляции одного и того же клонального варианта L. monocytogenes в дикой фауне;

- в дикой фауне Центрального региона России циркулируют 2 ведущих клональных варианта L. monocytogenes, группообразующими которых являются неродственные по отношению друг к другу (Dsc= 0,21) изоляты №№633-09 и 699-09, выделенные на территории НП «Завидово» (Тверская область) из фекалий кабана и пятнистого оленя. Первый клональный вариант включал 5 возможно родственных изолятов (Dsc 0,13-0,15), а второй - 9 культур (Dsc 0,05-0,14). Причем первый клональный вариант встречался на территории всех изучаемых охотохозяйств, тогда как второй - только на территориях Тверской/Московской и Калужской областей;

- филогенетическое родство (Dsc 0,05-0,09) между изолятами, выделенными от гидробионтов (окунь и карась) и диких парнокопытных (пятнистый олень и кабан), обитающих на территории Конаковского района Тверской области свидетельствует об обмене культурами L. monocytogenes между холодно- и теплокровными животными.

Филогенетические взаимоотношения культур L. monocytogenes, изолированных от представителей дикой фауны и из объектов внешней среды, представлены на рисунке 3.

■ L.m.134-08

- L.m.434-09

- L.m.403-09

L.m.311-07

- L.m.438-09

- L.m.277-07

f- L.m.164-09

L L.m.1 „

L.m.1

L.m.361-03

L.m.184-09

Рисунок 3 - Филогенетические отношения изолятов L. monocytogenes, выделенных в дикой фауне (рестриктаза Smal)

Изучение филогенетических отношений изолятов, выделенных от диких животных, и других эпизоотически значимых штаммов L. monocytogenes показало, что возможно родственными для «диких» изолятов также являются штаммы, выделенные от диких, синантропных и полусинантропных грызунов, членистоногих и объектов внешней среды (рисунок 4). Так, изоляты №№61-06, 164-09/191-09/361-09, 311-07 и 699, выделенные на территории Тверской/Московской и Калужской областей имели высокую степень родства со штаммами, изолированными в 1955 и 1964 г.г. от клещей (№197) и из почвы

Рисунок 4 - Филогенетические отношения изолятов L. monocytogenes, выделенных на территории бывшего СССР, РФ и за рубежом в период с 1943 по 2009 г.г.

Примечание: Области: Tv - Тверская, Ка - Калужская, VI - Владимирская, No - Новосибирская, ChR - Читинская, Mos - Московская, KT - Краснодарский край; Ru - Россия; Kaz - Казахстан; Tat - Татарстан; Uk - Украина; G - Германия.

Объекты выделения: Soil - почва; Deer - пятнистый олень; Maral - марал; WBoar - кабан; Carp - карась; Bream - лещ; Perch - окунь; Plant - гниющие растительные остатки; Squir - белка; Chinch - шиншилла; Rat - крыса; Mouse - мышь; Swine - свинья; Cow - КРС.

на территориях Украинской ССР и Татарской ССР, а также состояли в родстве со штаммами, выделенными от крысы (№11), обыкновенной полевки (№256) и белки (№1832) на территориях Украинской ССР и Новосибирской области в период с 1955 по 1957 г.г.

Таким образом, выявленное филогенетическое родство «диких» изолятов со штаммами отечественного происхождения свидетельствует об их географической приуроченности к территории бывшего СССР и РФ (рисунок 4), доминирующего распространения II клонального варианта L. monocytogenes в популяциях животных и о различных источниках поступления листерий в наземную и водную фауну Центрального региона РФ.

3 ВЫВОДЫ

1. Изучены природно-антропогенные предпосылки формирования очагов листериоза в фауне Московской, Тверской, Калужской и Владимирской областях Центрального региона России. Установлено, что сложившиеся в этом регионе природно-географические и ландшафтные условия способствуют формированию аутохтонных очагов листериоза.

2. Резервентами листерий патогенных и непатогенных видов в фауне выступают эволюционно отдаленные различные виды диких животных (3 вида парнокопытных и 8 видов гидробионтов), обусловливая полигостальность листериоза в Центральном регионе РФ. Инфицированность L. monocytogenes в популяциях диких парнокопытных в НП «Завидово», ГПЗФЗ «Таруса» и Суздальского ГООХ составляет 2,1%, 3,2% и 7,3%, соответственно, а в популяции ихтиофауны Иваньковского водохранилища - 0,8%. Коэффициент распространения листерионосителей в популяциях диких парнокопытных на этих территориях составил 0,13; 0,11 и 0,29, соответственно.

3. Корреляционным анализом установлена прямая сильная зависимость (г=0,81) инфицированности L. monocytogenes популяции диких парнокопытных от типа почв ареала обитания. Наибольшее количество листерионосителей выявлено на территориях с почвами высокой (светло- и темно-серые лесные) и средней (торфяно-подзолистые) плодородности, наименьшее — с низкой плодородностью (супесчаные и песчаные, супесчаные и глинистые). Листерионосителей среди диких парнокопытных, обитающих на

территориях с комбинацией среднетяжелых и тяжелосуглинистых почв, не выявляли.

4. Иррадиация L. monocytogenes из антропогенной среды в природную и переход аутохтонных очагов листериоза в антропургические является результатом хозяйственной деятельности человека (сброс в реки неочищенных стоков индустрии, интродукция животных и гидробионтов, подкормка диких животных кормами, контаминированными листериями, и т.п.).

5. Выделение от кабана, обитающего в охотничьих угодьях Тверской области, мультирезистентного к воздействию АБП изолята L. monocytogenes указывает на то, что в перекрывающихся ареалах обитания домашних и диких животных происходит обмен изолятами L. monocytogenes.

6. Способ дезинфекции подкормочных площадок на основе современного бесхлорного безопасного биоцида из класса третичных аминов позволяет проводить обеззараживание грунта в присутствии животных от возбудителей инфекционных болезней, относящихся к 1-2 группе устойчивости к химическим дезинфекционным средствам. Применение 2% водного раствора Теотропина с нормой расхода препарата 3 дм3/м2 и экспозиции 24 ч обеспечивает инактивацию L. monocytogenes и санитарно-показательных микроорганизмов (БГКП, Staphylococcus sp.) в поверхностном слое грунта из намытого речного песка на глубину до 5 см.

7. Изучением биологических свойств рабочей коллекции изолятов L. monocytogenes по 37 критериям показана незначительная вариабельность некоторых фенотипических признаков (гликолитическая активность, способность лизироваться специфическими бактериофагами, чувствительность к антибактериальным препаратам, проба Антона на морских свинках и др.), не связанная с источником выделения патогена.

8. Разработанные двухслойный кровяной агар (СОГАЛ) и классификация изолятов L. monocytogenes по вирулентности для белых аутбредных мышей позволяют проводить внутривидовое типирование патогена и оценку эпизоотической/эпидемической значимости исследуемых изолятов. По способности эксперессировать гемолитически активные вещества изоляты L. monocytogenes подразделяются на три группы (продуцирующие LLO на высоком, среднем и низком уровнях), а по показателю LD50 для аутбредных

белых мышей - на 5 (высоковирулентные, вирулентные, умеренно-, слабовирулентные и авирулентные). Выделенные, от диких холодно- и теплокровных животных изоляты L. monocytogenes, продуцируют основные факторы патогенности и относятся к группам высоковирулентных и вирулентных культур, что обусловливает их опасность для животных и человека.

9. Методом REA-PFGE установлено разнообразие генетических вариантов L. monocytogenes, циркулирующих на территории Центрального региона РФ в популяциях наземных диких животных и рыб. Изученные культуры L. monocytogenes распределяются на 12 пульс-электротипов, каждый из которых включает от одного до трех идентичных изолятов. Один пульс-электротип, характерный для изолята, выделенного на территории Калужской области, является уникальным, остальные - имеют различную степень родства (идентичные, родственные, возможно родственные). Выявление в популяциях диких парнокопытных, обитающих на территориях Тверской/Московской, Калужской и Владимирской областей, родственных изолятов свидетельствует о едином географическом источнике их происхождения.

10. Установленное филогенетическое родство (Dsc 0,05-0,09) между изолятами, выделенными от гидробионтов (окунь и карась) и диких парнокопытных (пятнистый олень и кабан), идентичность изолятов от пятнистого оленя и марала (Dsc 0,0), обитающих на территории Конаковского района Тверской области, доказывают наличие обмена культурами L. monocytogenes не только между различными видами диких парнокопытных, но и между холодно- и теплокровными животными.

11. Сравнительным анализом PFGE-патгернов изолятов, выделенных от диких и домашних животных, обитаю(-в)ших на территории РФ и бывшего СССР в период с 1943 по 2009 г.г., установлена циркуляция двух ведущих клональных вариантов L. monocytogenes. При этом, первый клональный вариант встречался только в популяциях диких животных, обитающих в настоящее время на территории Центрального региона РФ, тогда как генетически родственные второму клональному варианту штаммы L. monocytogenes ранее выделялись на территории бывшего СССР от диких и полудиких животных

(белка, обыкновенная полевка, крыса), насекомых (клещи) и объектов внешней среды (почва) в период с 1955 по 1964 г.г.

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. На основании проведенных исследований разработаны, утверждены и рекомендованы для использования в практике диагностических учреждений и специализированных НИИ следующие разработки:

- Среда для определения гемолитической активности культур рода Listeria (Патент на изобретение №2318022);

- Методические рекомендации по определению гемолитической активности культур рода Listeria (Покров, 2005);

- Методические рекомендации по комплексной оценке культур Listeria monocytogenes на основе изучения фенотипических и генетических характеристик (Покров, 2010);

- Схема-модель классификации изолятов L. monocytogenes по вирулентности для лабораторных животных;

- Методические рекомендации по исследованию проб при мониторинге листерий в природе (почва, растительность, дикие копытные животные) (Покров, 2008);

2. При планировании и разработке комплекса противоэпизоотических мероприятий на особо охраняемых природных территориях, охотничьих хозяйствах, отдельных пресноводных водоемах и т.п. целесообразно использовать следующие сборники методик:

- Методические положения по отбору проб и предупреждению распространения листерий в аквафауне пресноводных водоемов (на примере Шошинского плеса Иваньковского водохранилища) (Покров, 2010);

- Методические наставления по дезинфекции мест подкормки диких животных на территории «Государственных комплексов «Завидово» и «Таруса» Федеральной службы охраны Российской Федерации (Покров, 2011);

- Мероприятия по профилактике листериоза среди диких животных в Государственных комплексах «Завидово» и «Таруса» Федеральной службы охраны Российской Федерации (Покров, 2011).

3. Изоляты L. monocytogenes депонированные в музей бактериальных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии целесообразно использовать

для изучения молекулярной эпидемиологии/эпизоотологии листериоза на территории РФ.

5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Егорова, И.Ю. Среда для определения гемолитической активности культур рода Listeria /И.Ю. Егорова, Ю.О. Селянинов //Патент на изобретение № 2318022 от 27.02.08 г. Приоритет от 07.02.2006 г.

2. Зайцева, Е.А. Дифференциация штаммов Listeria monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части России, на основе полиморфизма генов кодирующих факторы инвазии /Е.А. Зайцева, K.P. Беляев, И.Ю. Егорова, А.И. Суняйкин, Н.М. Пуховская, Ю.С. Мусатов, Л.И. Иванов, Д.В. Колбасов //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -2008,-№6.-С. 10-14.

3. Егорова, И.Ю. Мониторинг листерий в водной фауне Иваньковского водохранилища /И.Ю. Егорова, Ю.О. Селянинов, М.С. Воронин //Ветеринария. - 2009. - № 8.- С. 29-31.

4. Юров, Д.С.Влияние мутации в гене, кодирующем L,D -карбоксипептидазу на динамику листериозной инфекции /Д.С.Юров, И.Ю. Егорова, А.Ф. Варфоломеева, Д.В. Колбасов //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2009. - №4. - С. 55-59.

5. Фертиков, В.И. К формированию бактерий рода Listeria в эпоху позднего плейстоцена; факты и гипотезы /В.И. Фертиков, А.Н.Тихонов, Е.М. Хрипунов, И.Ю. Егорова //Сельскохозяйственная биология. - 2009. - №6. - С. 18-26.

6. Бакулов, И.А. Распространение листерий в фауне Центрального региона России /И.А. Бакулов, И.Ю. Егорова, В.И. Фертиков, М.С. Воронин //Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук - 2010. - №1. -С.48-50.

7. Bakulov, I.A. Spread of Listeria in Fauna of the Central Region of Russia /I.A. Bakulov, I.Yu. Egorova, V.I Fertikov, M.S. Voronin //Russian Agricultural Science. - 2010. - Vol. 36. -No.l. - P. 58-68.

8. Егорова И.Ю. Характеристика изолятов L. monocytogenes, выделенных из различных объектов /И.Ю. Егорова, Ю.О. Селянинов, А.И. Суняйкин, В.А. Цыбанова //Ветеринария. - 2010. - №3. - С. 30-33.

9. Егорова И.Ю. Дикие животные как источник пищевых токсикоинфекций человека /И.Ю. Егорова, В.А. Цыбанова //Ветеринарная патология. - 2011. - Т.38, №4. - С. 45-48.

10. Адгамов, P.P. Эколого-генетические механизмы формирования эпидемически значимых вариантов возбудителей сапронозных инфекций /P.P. Адгамов, Н.Ф. Тимченко, Е.А. Зайцева, В.И. Пушкарева, Д.В. Колбасов, И.Ю. Егорова, Н.М. Пуховская, Ю.С. Мусатов, Л.И. Иванов, С.А. Ермолаева //Успехи современной биологии. - 2012. - Т. 132, №6. - С. 551-567.

11. Егорова, И.Ю. Разработка подходов к классификации изолятов Listeria monocytogenes по их вирулентности для лабораторных животных /И.Ю. Егорова //Сельскохозяйственная биология. - 2013. - №4. - С. 70-75.

12. Егорова, И.Ю. Мониторинг листерий в популяциях холодно- и теплокровных животных, обитающих на территории ЦФО РФ /И.Ю. Егорова //Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. - 2013. - №07 (54). -Часть 1.-С. 90-94.

13. Егорова, И.Ю. Новый способ определения гемолитической активности у листерий /И.Ю. Егорова, Ю.О. Селянинов //Ветеринария. - 2013. -№7. - С. 62-64.

Монографии

Листерии и листериоз /И.А. Бакулов, Д.А. Васильев, Ю.О. Селянинов, Д.В. Колбасов, Т.И. Кольпикова, И.Ю. Егорова. - Ульяновск: Color-Принт. -2008.- 166 с.

Yegorova, I. Listeria in the Wildlife of Russia /I. Yegorova, Yu. Selyaninov, V. Ferticov //Listeria Infections: epidemiology, pathogenesis and treatment. - Nova Biomedical.-2012.-P. 167-176.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АБП антибактериальные препараты

ГООХ Государственное опытно-охотничье хозяйство

ГПЗФЗ Государственный природный заказник Федерального

значения

ДС дезинфицирующее средство

нп Национальный парк

РФ Российская Федерация

ФСО РФ Федеральная служба охраны Российской Федерации

ЦФО РФ Центральный Федеральный округ Российской Федерации

ЧАС четвертичные аммониевые соединения

LDioo доза, вызывающая гибель 100% взятых в опыт животных

LD50 доза, вызывающая гибель 50% взятых в опыт животных

LLO листериолизин О

REA PFGE restriction enzyme analysis and pulse field gel electrophoresis -

рестрикционный анализ с разделением фрагментов

электрофорезом в пульсирующем поле

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области Тираж 80 экз.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, доктор ветеринарных наук, Егорова, Ирина Юрьевна, Покров

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО- ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

Егорова Ирина Юрьевна

Листерии в фауне Центрального региона России (распространение, биологические и филогенетические особенности)

ч

06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Диссертация

на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

В.И. Фертиков

ч

Покров-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

1 Введение

1.1 Актуальность темы 8

1.2 Степень разработанности проблемы 10

1.3 Цель и задачи исследований 11

1.4 Научная новизна работы 12

1.5 Теоретическая и практическая значимость результатов исследований

1.6 Основные положения диссертационной работы, 14 выносимые на защиту

1.7 Пути реализации 15

1.8 Степень достоверности и апробация результатов 16

1.9 Личный вклад автора в выполнение работы 17

1.10 Структура и объем диссертации 18

2 Обзор литературы 19

2.1 Листерии, таксономия, их значение в инфекционной 19 патологии животных и человека

2.2 Современная эпизоотическая ситуация по листериозу в 22 РФ

2.3 Биологические свойства L. monocytogenes 25

2.3.1 Культурально-морфологические свойства листерий 25

2.3.2 Биохимические свойства листерий 29

2.3.3 Антигенные свойства листерий и их чувствительность к 35 специфическим бактериофагам

2.3.4 Факторы патогенности и персистенции листерий 38

2.3.5 Патогенность листерий 43

2.3.6 Внутривидовая вариабельность L. monocytogenes 47

2.4 Адаптационные свойства листерий 53

2.5 Распространение листерий в природе 57

2.6 Распространение листерий среди гидробионтов 61

2.7 Листериоз человека 63

2.8 Дикие и домашние животные как источник возбудителей

65

различных инфекций человека

2.9 Состояние рыбных запасов пресноводных водоемов 70 России

2.10 Современное состояние популяции диких 74 парнокопытных в ЦФО РФ

2.11 Биологические особенности диких парнокопытных 77

2.12 Заключение по литературному обзору 80 3 Собственные исследования 83

3.1 Материалы 83

3.1.1 Объекты исследования 83

3.1.2 Штаммы микроорганизмов 83

3.1.3 Питательные среды 86

3.1.4 Ферменты 86

3.1.5 Реактивы 87

3.1.6 Дезинфицирующие средства 88

3.1.7 Растворы 88

3.1.8 Диагностические тест-системы 88

3.1.9 Лабораторное оборудование 89

3.1.10 Расходные материалы 90

3.1.11 Животные 90

3.2 Методология и методы исследований 91

3.2.1 Отбор проб воды, водной растительности, гидробионтов, 91 донных отложений

3.2.2 Отбор проб полуводных млекопитающих отряда 91 грызунов, дикой птицы, затонувших трупов диких животных

3.2.3 Отбор проб объектов внешней среды, биологического 92 материала от животных, кормов

3.2.4 Выявление специфических противолистериозных 92 антител в сыворотках крови животных

3.2.5 Изоляция листерий и изучение их биологических свойств 92

3.2.6 Получение бактериальной массы 93

3.2.7 Определение концентрации жизнеспособных клеток 93

3.2.8 Определение патогенности и вирулентности 94 штаммов/изолятов L. monocytogenes

3.2.9 Определение чувствительности к антибактериальным 95

_препаратам

3.2.10 Выделение бактериальной ДНК 96

3.2.11 Выявление Н1у-гена методом ПЦР 96

3.2.12 Изучение геномного полиморфизма штаммов/изолятов 96

3.2.13 Программное обеспечение 97

3.2.14 Определение антимикробной (бактерицидной и 97 бактериостатической) активности биоцидов методом серийных разведений

3.2.15 Определение и оценка местно-раздражающего действия 98 дезсредств

3.2.16 Дезинфекция подкормочных площадок и контроль 102 эффективности проведенных дезинфекционных мероприятий

3.2.17 Статистическая обработка результатов 102

3.3 Результаты исследований и их обсуждение 103

3.3.1 Обоснование выбора Центрального Федерального 103

округа (ЦФО) в качестве объекта исследований

3.3.1.1 Природно-географические характеристики 104

Владимирской, Калужской, Московской и Тверской областей

3.3.1.1.1 Природно-географическая характеристика 104 Владимирской области

3.3.1.1.2 Природно-географическая характеристика Московской и 107 Тверской областей на примере Национального парка «Завидово»

3.3.1.1.3 Природно-географическая характеристика Калужской 110 области

3.3.1.2 Социально-экономические (хозяйственные) факторы

изучаемых субъектов

3.3.1.2.1 Интродукция диких парнокопытных на территории 112 охотничьих хозяйств Владимирской, Калужской, Московской и Тверской областей

3.3.2 Мониторинг листерий в популяциях тепло- и 116 холоднокровных животных, обитающих на территории Центрального региона РФ

3.3.2.1 Изучение распространения листерий в популяциях 116 диких парнокопытных и объектах внешней среды

3.3.2.2 Изучение распространения листерий в акватории 125 Шошинского плеса Иваньковского водохранилища

3.3.2.2.1 Изучение распространения листерий в популяциях рыбы 126

3.3.2.2.2 Изучение распространения листерий в объектах 134 внешней среды, среди представителей водной и полуводной фауны, трупах затонувших животных, гельминтах

3.3.3 Разработка мероприятий по дезинфекции подкормочных 136 площадок для диких животных

3.3.3.1 Подбор безопасного для животных дезинфицирующего 136 средства

3.3.3.2 Изучение местно-раздражающего действия биоцидов 141 ^ ^ Подбор режимов обеззараживания подкормочных 142

площадок

3.3.4 Изучение биологических свойств и паспортизация 146 изолятов L. monocytogenes, выделенных в дикой фауне Фенотипическая характеристика изолятов L. 147

3.3.4.1

monocytogenes

3.3.4.1.1 Разработка способа определения гемолитической 151 активности у листерий

3.3.4.1.2 Определение чувствительности изолятов L. 157 monocytogenes, выделенных в дикой фауне, к антибактериальным препаратам

3.3.4.1.3 Разработка классификации L. monocytogenes по 162 вирулентности для лабораторных животных

3.3.5 Генетическая характеристика изолятов L. monocytogenes 171

3.3.5.1 Изучение генетического разнообразия изолятов L. 171

monocytogenes с использованием REA PFGE

4 Заключение 184

5 Выводы 198

6 Практические предложения 202

7 Список литературы 204 Список сокращений и условных обозначений 241 Список терминов 244 Приложения 245

Приложение 1 Письмо-ответ на запрос №01/15098-8-31 от 16.12.2008 г.

Приложение 2 Письмо-ответ на запрос №7315-01 от 22.11.2010 г.

Приложение 3 Письмо-ответ на запрос №02/7615 от

19.11.2010 г.

Приложение 4 Письмо-ответ на запрос №1183-04-07 от

13.07.2011 г.

Приложение 5 Нозогеографическая карта обнаружения листерионосителей в НП «Завидово» Приложение 6 Нозогеографическая карта обнаружения листерионосителей в ГПЗФЗ «Таруса» Приложение 7 Титульный лист «Методические наставления по дезинфекции мест подкормки диких животных на территории Государственных комплексов «Завидово» и «Таруса» Федеральной службы охраны Российской Федерации»

Приложение 8 Титульный лист «Мероприятия по профилактике листериоза среди диких животных в Государственных комплексах «Завидово» и «Таруса» Федеральной службы охраны Российской Федерации» Приложение 9 Приказ № 282 от 05.08.2011 г «Об усилении ветеринарно-санитарного надзора на территории НП «Завидово»

Приложение 10 Приказ № 282 от 05.08.2011 г «Об усилении ветеринарно-санитарного надзора на территории ГПЗФЗ «Государственный комплекс «Таруса» ФСО РФ

Приложение 11 Патент на изобретение № 2318022 Среда для определения гемолитической активности культур рода Listeria

Приложение 12 Титульный лист «Методические рекомендации по определению гемолитической активности культур рода Listeria»

Приложение 13 Титульный лист «Методические рекомендации по комплексной оценке культур Listeria monocytogenes на основе изучения фенотипических и генетических характеристик»

Приложение 14 Титульный лист «Методические рекомендации по отбору проб и предупреждению распространения листерий в аквафауне пресноводных водоемов (на примере Шошинского плеса Иваньковского водохранилища)»

Приложение 15 Титульный лист «Методические рекомендации по исследованию проб при мониторинге листерий в природе (почва, растительность, дикие копытные животные)»

Приложение 16 Паспорта на изоляты L. monocytogenes

1. Введение

1.1 Актуальность темы

С момента открытия возбудителя листериоза (1891-1892 г.г.) интерес к болезни не уменьшился, а, наоборот, возрос. Об этом свидетельствует большое количество публикаций по этой проблеме и специалистов, занимающихся изучением указанной болезни. В связи с выявлением в конце XX века контаминации пищевой продукции листериями и наличием крупных вспышек пищевых инфекций человека, нередко заканчивающихся летальным исходом, листериоз с 1992 года в нашей стране причислен к группе эпидемически значимых эмерджентных болезней [И.А. Бакулов, 2008]. В 2008 году начата официальная регистрация листериоза как особо опасной болезни животных, относящейся к сапрозооонозным инфекциям.

Как и для большинства возбудителей сапрозоонозов, характерной особенностью листериоза является его стационарность, которая обусловлена следующими факторами: уникальной экологической пластичностью листерий, позволяющей им длительно сохраняться во внешней среде, наличием в стадах сельскохозяйственных животных-листерионосителей и существование природных очагов листериоза, в которых основным биологическим резервуаром, помимо грызунов, могут выступать и дикие животные. Об этом свидетельствуют многочисленные данные зарубежных и отечественных исследователей, установивших листерионосительство и восприимчивость к листериозу диких птиц, насекомоядных, зайцеобразных, некоторых парнокопытных, приматов и др. Однако в настоящее время до конца не определено какие виды диких животных могут выступать в качестве резервентов листериозной инфекции. Отсутствует единое мнение о роли рыб в поддержании стационарности листериоза [J1.A. Ряпис, 2006].

Считается, что эколого-географические особенности территории являются важным фактором в развитии эпизоотического процесса [A.A. Конопаткин и др., 1984; C.B. Кашапова, 2007; А.Ю. Бондарев, 2010]. В этой

связи для изучения экологии и эпизоотологии листериоза особый интерес представляет Центральный регион России с его умеренно-континентальным климатом, многообразием флоры и фауны.

Проведенный в этом регионе России в период с 1933 по 1972 г. комплекс работ по восстановлению и увеличению численности охотничьих видов животных с учетом их интродукции, привел к значительному скоплению диких животных разных видов на ограниченных территориях [М.П. Павлов, 1974; В.И. Фертиков, 1998]. По данным учета «Центрохотконтроля» Минсельхоза России в 2007 г. в ЦФО РФ обитало лосей - 66,5 тыс., кабанов - 94,9 тыс., косуль - 41,6 тыс., благородных оленей - 8,4 тыс., пятнистых оленей - 21,4 тыс.

Многообразие и плотность населения популяций обитаемых видов холоднокровных животных наблюдается и в Иваньковском водохранилище -основном питьевом резервате г. Москвы, расположенном на территории трех областей Центрального региона России. В настоящее время в нем регистрируется 34 вида рыб, из них 7 интродуценты.

Акклиматизация в регионе животных-интродуцентов, совместное использование водных и околоводных территорий, лесов, болот, пастбищ домашними и дикими копытными животными, а также попадание неочищенных стоков животноводческой индустрии в воды бассейна реки Волги способствуют заносу и распространению многих инфекционных агентов, патогенных для животных и человека, в том числе и листериоза. Длительное использование солонцов, мест подкормки животных также может служить одним из факторов поддержания и передачи листериоза у диких животных и эстафетного вовлечения их в эпизоотии [В.М. Фомушкин, 1988]. Поэтому многие вопросы инфекционной патологии, эпизоотологии, профилактики листериоза диких животных остаются неизученными, и в случае возникновения эпизоотий ветеринарная служба испытывает большие трудности в проведении действенных защитных мероприятий, что создает

реальную угрозу биологической безопасности на территории Российской Федерации.

Перечисленные выше обстоятельства явились основополагающими в выборе темы диссертационной работы.

1.2 Степень разработанности проблемы

Целенаправленно работ по изучению вопросов естественного носительства листерий в природных популяциях холодно- и теплокровных животных, обитающих на территории РФ, не проводилось. Как правило, единичные данные об обнаружении листерий у представителей дикой фауны являются сопутствующим результатом мониторинговых исследований других заболеваний животных и человека, при которых дикие животные могут являться природным резервуаром.

Из 50 видов диких животных, установленных в качестве естественных листерионосителей, обитавших на территории бывшего СССР, лишь 4 вида животных представлены дикими парнокопытными - кабан, джейран (Азербайджан), косуля (Белоруссия) и сайга (Эстония) [А. М. Ханкишиев, 1959; В.А. Адамович, И. Ойцось, 1963; В.В. Тилга, 1964]. Наибольших результатов в изучении этого вопроса добились зарубежные ученые, показавшие носительство и заболевание листериозом таких диких парнокопытных животных как американский лось Alces alces, косуля Capreolus capreolus, лань Dama dama, белохвостый олень Odocoileus virginianus, жираф Giraffa camelopardalis, лама Ьама glama и др. [R. Archibald, 1960; D.O. Trainer, J.B. Hale, 1964; F. Lemenes et al., 1983; M. G. Evans, G.L. Watson, 1987; T L. Eriksen et al., 1988].

Относительно недавно появились сведения о том, что различные виды гидробионтов, обитающие в акваториях водоемов РФ, также являются резервуарами листерий [Е.А. Зайцева и др., 2002; И.А. Беленева, Э.Ф. Масленникова, 2002; Г.Л. Сомов и др., 2002; Л.Б. Мухина, 2002; В.Е. Терехова и др., 2006; Е.А. Зайцева, 2010 и др.]. Проводимые на территории

РФ работы, посвящены изучению вопросов естественной зараженности морских гидробионтов и искусственно культивируемых моллюсков.

Также отсутствуют сведения о распространении листерий в пресных водоемах у представителей ихтиофауны и популяционных группировках диких парнокопытных, обитающих на территории Центрального региона РФ, их биологических характеристиках и роли в поддержании стационарных очагов листериоза.

1.3 Цель и задачи исследований

Целью данной работы является изучение природно-антропогенных предпосылок формирования очагов листериоза на территории Центрального региона России с участием представителей наземной и пресноводной фауны; биологических и генетических особенностей изолятов L. monocytogenes, выделенных от диких животных и из объектов внешней среды; разработка на основе полученных данных мероприятий по профилактике листериоза и предупреждению распространения листерий среди диких животных.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ природно-географических характеристик Московской, Тверской, Калужской и Владимирской областей.

2. Изучить особенности природных очагов листериоза, их гостальность, ландшафтно-географическую приуроченность, влияние социально-экономических факторов на формирование аутохтонных и антропургических очагов в различных административных областях Центрального региона России.

3. Выявить экологические связи листерий патогенных и непатогенных видов с представителями наземной и водной фауны.

4. Установить источники и пути передачи листерий в фауне Тверской, Московской, Калужской, Владимирской областей и определить факторы риска их распространения.

5. Изучить биологические и молекулярно-генетические особенности изолятов Listeria monocytogenes, выделенных у представителей дикой фауны и из объектов внешней среды с целью установления их экотиповой принадлежности.

6. Определить патогенный потенциал изолятов Listeria monocytogenes, выделенных из различных объектов наземной и водной экосистем.

7. Разработать классификацию Listeria monocytogenes по степени патогенности и на ее основе дать оценку эпидемической и эпизоотической значимости изолятов листерий, выделенных в дикой фауне.

8. Обосновать и разработать на основании полученных данных мероприятия по профилактике листериоза в природных популяционных группировках холодно- и теплокровных животных.

1.4 Научная новизна работы

Впервые установлено, что популяционные группировки 3 видов диких парнокопытных и 8 видов гидробионтов, обитающих на территории Центрального региона России, являются резервентами листерий непатогенных и патогенных видов. Последние участвуют в поддержании стационарных очагов листериоза. Показано, что на распространение листерий в популяциях диких парнокопытных и в водных экосистемах оказывает влияние хозяйственная деятельность человека.

Впервые в РФ разработаны:

- классификация изолятов L. monocytogenes по их вирулентности для аутбредных белых мышей, позволяющая оценивать патогенный потенциал листерий и прогнозировать их эпидемическую и эпизоотическую значимость;

- двухфазная дифференциально-диагностическая питательная среда, позволяющая не только выявлять гемолитическую активность патогена, но и дифференцировать штаммы/изоляты листерий по уровню

экспрессии основного фактора их патогенности - LLO (патент на изобретение №2318022 от 27.02.08 г.);

- мероприятия по профилактике л