Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические особенности Listeria Monocytogenes и совершенствование методов их выделения

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические особенности Listeria Monocytogenes и совершенствование методов их выделения"

РГ Б ОД

На правах рукописи

БОЙКО Оксана Витальевна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ LISTERIA MONOCYTOGENES И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИХ ВЫДЕЛЕНИЯ

JJ* ' 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Оренбург -1997

Работа выполнена в Астраханском филиале Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Ибрагимов Ф.Х. Официальные оппоненты :

доктор медицинских наук, профессор Усвяцов Б.Я. доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Дерябин Д.Г.

Ведущая организация - Челябинская государственная медицинская академия

Защита состоится "_"_1998 года в_часов на заседании диссертационного совета К 084.51.02 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу : 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6 Телефон (3532) 77-61-03 Факс (3532) 77-94-08

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургской государственной медицинской академии

Автореферат разослан "_"_1997 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук, доцент ЮЛ.Семченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время мнение о роли Listeria monocytogenes в инфекционной патологии человека значительно изменилось. Наблюдается расширение как удельного веса этой инфекции, так и спектра ее клинических проявлений (Покровский В.И., 1993; Тартаковский И.С. с соавт., 1994).

В последние годы в США листериоз по числу смертельных неходов лидирует среди других пищевых инфекций, а L.monocytogenes внесены в список четырех типов микроорганизмов, являющихся основной проблемой для обеспечения эпидемической безопасности пищевых продуктов в "Системе анализа факторов риска и критических контрольных точек" (Speber Willian Н., 1991).

Наибольшей опасности подвергаются беременные женщины, их плод и новорожденные, а также лица с ослабленной иммунной системой, хотя возможны случаи заболеваний у людей, не имеющих предрасполагающих факторов к данной инфекции. Смертность при некоторых формах листериоза, несмотря на активную антибиотикотерапию, достигает 90-100% (Хеприч Пол Д., 1983).

Сложившаяся ситуация во многом связана с имевшейся ранее недооценкой экологической гибкости и потенциала изменчивости микроорганизмов в природе, а также экологической детерминированности факторов их патогенности и персистенции. Сегодня вполне ясно, что понятие "патогенность микроорганизмов" включает и патогенность потенциальную. Сапрофиты, к которым относятся и листерии, способны проявлять патогенные свойства в организме человека и животных (Бухарин О.В., Литвин В.Ю., 1997).

Обладая значительными экологическими возможностями,

листерии имеют широкий круг хозяев, существенно отличающихся друг от друга как филогенетически, так и экологически. Все это дает основание рассматривать вопрос о биологических особенно-

I

стях L.monocytogenes, позволяющих им успешно переживать в различных эконишах. В первую очередь это касается специализации листерии к паразитическому существованию, обязательными атрибутами которого являются факторы персистенции. При этом пер-систентные потенции таких микроорганизмов экологически многопрофильны (Бухарин О.В., Литвин В.Ю., 1997).

Хотя в литературе имеется достаточно сведений о путях внедрения возбудителя в потенциального хозяина, метаболических изменениях, с помощью которых он вызывает повреждение тканей, влиянии специфического иммунитета и "неспецифической" резистентности, тем не менее еще не всегда можно преломить всю накопленную информацию в целях объяснения специфических функций, позволяющих листериям успешно переживать в организме хозяина. Поэтому обнаружение факторов персистенции у листерии актуально не только в целях эпидемиологического прогноза, но и для знания того, какой из защитных механизмов поврежден, что важно для разработки эффективной клинической стратегии, прогнозирования исхода инфекции, а также оптимального плана терапевтических и профилактических мер. Рабочей группой ВОЗ по проблемам листериоза рекомендовано проведение исследований по изучению патогенности и вирулентности L.monocytogenes, что зафиксировано включением в список рекомендаций (Бюллетень ВОЗ, 1988).

Не менее актуальным представляется и определение некоторых биохимических свойств L.monocytogenes, так как листерии

представляют собой относительно малоизученный род. Необходимо учитывать, что окружающая среда (местообитание) оказывает

на паразита сильное воздействие, в силу чего он приобретает каче-

«

ства, позволяющие ему успешно адаптироваться в новых условиях (Бухарин О.В., Литвин В.Ю., 1997). В настоящее время при выделении и идентификации этих микроорганизмов возникают сложности, обусловленные недостаточностью критериев их дифференцирования в смешанной культуре, что связано с несовершенством существующих сред. Несмотря на значительное количество исследовании, посвященных оиологии листерии и различным методам их выделения и идентификации, "многоликий" листериоз остается во многом малоизученным и редко диагностируемым заболеванием в России (Тартаковский И.С. с соавт., 1994).

В связи с вышеперечисленными данными возникает научно-практический интерес в изучении вопроса метаболических возможностей L.monocytogenes, определении неизвестных ранее перси-стентных и биохимических свойств листерий, которые могут служить в качестве маркеров при диагностике заболеваний, расшифровке эпидемиологических ситуаций, проведении микробиологического мониторинга и экологических исследований.

Цель исследования. Оценка биологических особенностей L.monocytogenes, факторов их патогенности и персистенции, совершенствование методов выделения из различных биосубстратов.

Достижение этой цели планировалось путем решения следующих задач:

1. Провести выявление факторов патогенности и персистенции у L.monocytogenes, выделенных из различных объектов окружающей среды и из материала от больных.

2. Определить качественные и количественные различия в распределении факторов патогенности и персистенции у листерий различной экотопической принадлежности.

3. Выявить значимость отдельных тестов для идентификации листерий и эпидемиологического анализа.

4. Изучить влияние различных факторов на рост Ь.шопосуЮ-genes и на этой основе сконструировать питательную среду для их выделения.

5. Провести сравнительную оценку эффективности новой и общепринятой сред для выделения листерий.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. С помощью ряда тестов установлено наличие у Ь.шопосу-и^епеэ свойств, обеспечивающих им персистенцию в макроорганизме и способствующих широкому распространению в природе данного вида бактерий.

2. На основании изучения биохимических особенностей Ь.топосуи^епез разработана новая питательная среда для их выделения из различных объектов.

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование активности ряда факторов патогенности и персистенции у Ь.топосуК^епез (лизоцимная, антилизоцимная, РНК-азная, липаз-ная, антинтерфероновая, антикомплементарная активность), выделенных из различных субстратов. Определена диагностическая значимость этих факторов, что позволит более полно охарактеризовать эпидемическую опасность обнаруженных штаммов. Разработана новая питательная среда для выделения листерий из различных субстратов, отличающаяся более высокой чувствительностью.

Практическая значимость работы. Сконструированная среда может быть рекомендована для использования в бактериологических лабораториях санитарно-эпидемиологического и ветеринарного надзора, больниц и в научно-исследовательских учреждениях как для целей диагностики инфекционных заболеваний у человека и животных, так и для целей сертификации продуктов питания.

Предложен ряд дополнительных тестов для идентификации листерий и эпидемиологического анализа.

Внедрение п практику. Новая среда была апробирована и использовалась в лаборатории микробиологической диагностики инфекций Астраханского филиала ЦНИИ эпидемиологии для выделения Ь-топосу^епея от людей и животных, а также из продуктов питания. Биологические характеристики вновь выделенных и полученных из других учреждений штаммов были оценены и с учетом их персистентных свойств.

По результатам разработки среды подана заявка, признанная изобретением, и получена приоритетная справка № 95109695X13(016875).

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации доложены на конференции "Эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика важнейших инфекционных болезней" гг. Тамбов - Астрахань 1994 г., Международном симпозиуме, посвященном году Пастера "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями". 6-10 июня 1995 г. Институт Пастера, Санкт-Петербург, Россия., 11 Всероссийской научной конференции "Персистенция микроорганизмов". 7 - 9 октября 1997 г., Оренбург.

По теме диссертации опубликовано 9 работ в различных из-

даниях.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 45 отечественных и 131 иностранный источник. Диссертация изложена на 146 страницах компьютерного текста, содержит 15 таблиц и 8 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В экспериментальной части работы были использованы 93 штамма различных микроорганизмов:

- L.monocytogenes - 31 штамм;

- Aeromonas, Proteus, Salmonella, E.coli - no 10 штаммов

- Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aerugenosa, Yersinia entero-colitica, Staphylococcus aureus - no 5 штаммов

- Corinebacterium xerosis и Micrococcus lisodeicticus - no 1 штамму.

Все используемые штаммы были типичны по своим культу-ральным, морфологическим и биохимическим свойствам.

При оценке персистентных характеристик L.monocytogenes все имеющиеся в нашем распоряжении штаммы были разделены на гостальную и внеорганизменную части популяции.

Определение у микроорганизмов факторов персистенции проводилось по следующим методикам:

- продукция листериями лизоцима определялась методом от-

сроченного антагонизма;

- наличие антилизоцимной активности и способности к инактивации антибактериальной составляющей препарата человеческого лейкоцитарного интерферона выявлялись с помощью методик, предложенных О.В.Бухариным с соавт. (1984,1990);

- тактические подходы, послужившие основой доя разработанной нами модификации методики определения антикомплементарной активности также описаны О.В.Бухариным с соавт. (1992). Реакция проводилась на плашках для ИФА. Результаты учитывались на аппарате для чтения планшет при постановке иммунофер-ментных реакций Мультискан Reader Microelisa system (Organen tex-nica, Finland) при длине волны 492 нм;

- способность листерий к гидролизу крахмала определяли путем посева на чашки с крахмальным агаром с последующим за-лнтием их после инкубации раствором йода;

- наличие лецитиназы определяли на желточном агаре. Для обнаружения глицеролэстергидролаз (липаз) использовали агар с твинами 20, 60 и 80. В качестве индикатора использовали фенолрот в концентрации 0,5%;

- влияние мочевины на рост L.monocytogenes устанавливали путем ведения в питательный агар различных ее концентраций и последующим сравнением активности роста с контролем.

На этапе конструирования питательной среды при подборе индикаторной системы и ингибиторов также одновременно проводился посев и на обычный питательный агар, не содержавший испытуемых компонентов.

Разработанную среду оценивали по дифференциальным и селективным свойствам и чувствительности. Дифференциальные

качества среды устанавливали, исходя их цвета, размера и формы колоний, формируемых листериями и другими микроорганизмами. Селективные качества определяли, исходя из частоты выделения Ь.топосуК^епез как в чистой культуре, так и при посеве на среду их смесей с эшерихиями, протеями и сальмонеллами.

Для экспериментальной оценки преимущества использования новой среды по сравнению с рекомендуемой в "Инструкции о мероприятиях по профилактике и борьбе с листериозом животных и человека" (1987) проводили параллельный высев на обе среды из искусственно зараженных субстратов и материала от больных. Обсеменяемые образцы предварительно исследовали на наличие лис-терий (контроль).

Результаты исследований были обработаны методами вариационной статистики с использованием параметрических и непараметрических критериев. Все расчеты проводились с использованием коммерческих программных продуктов на вычислительной технике.

Результаты исследования

Была проведена серия опытов, направленных на выявление у Ь.топосуго»епез лизоцимной активности.

Обследование групп листерий, одна из которых включала в себя штаммы, полученные из теплокровных объектов, а другая - из объектов окружающей среды, показало, что действительно существует различие между лизоцимной активностью среди микроорганизмов этих двух совокупностей, что продемонстрировано на рисунке 1.

80

£ 70

к с 60

с О 50

сг ,__

в ~ 40

ПЗ 17" 30

т 20

с о 10

с£ 0

И"

¡¿£71

От теплокр.

Из окруж. среды

ПЛигоцимпоз1тги8Ные

□ Лизоцимнегэтивные

Рисунок 1. Лизоцимная активность листерий, выделенных из

объектов окружающей среды и теплокровных организмов

Статистическая обработка подтвердила, что полученные различия являются достоверными ( Р < 0,05) и, следовательно, есть основания полагать о более частой лизоцимной активности у штаммов, полученных от человека и животных, в сравнении с микроорганизмами из объектов окружающей среды.

Антилизоцимная активность у Ь.топос}1^епе5 не была обнаружена.

Для обнаружения способности листерий инактивировать антибактериальную составляющую препарата человеческого лейкоцитарного интерферона использовались следующие его разведения: 1X160, 1\140, 1\120, 1\100, 1\80, 1\60, !\40. В результате были получены данные о наличии той или иной степени активности у 70,8% штаммов. По нашему мнению, представляются существенными результаты анализа распределения антиинтерфероновой активности среди листерий, выделенных из окружающей среды и от теплокровных животных, а также определение оптимальных гра-

ниц, попадание в которые испытуемых штаммов с большей вероятностью позволит говорить об их патогенности или ее отсутствии.

Полученные данные можно оценивать следующим образом: при разведении 1\160 антиинтерфероновая активность имеет место у микроорганизмов, выделенных как из объектов внешней среды (50%), так и из макроорганизмов (81,25%). Принципиальной разницы, могущей быть зафиксированной математически, здесь нет Оф < tst). Такое количество интерферона вполне могут инактиви-ровать многие штаммы листерий - независимо от меры их патоген-ности. Напротив, разведение интерферона 1\40 не может быть разрушено большинством L.monocytogenes из обеих групп, ибо такое количество антибактериальной составляющей слишком велико для многих из них. Различия и в этом случае недостоверны. Анализ антиинтерфероновой активности листерий при остальных пяти концентрациях позволяет с уверенностью говорить о более частом обнаружении антиинтерфероновой активности среди штаммов, выделенных из теплокровных макроорганизмов. Четкие отличия, подтвержденные статистически, можно получить при анализе любой из этих концентраций, так как 1ф у них лежат выше установленного значения t st во всех случаях и равен 2,32 при разведениях 1\100, 1 \120 и 1\140 и 1,94 в разведениях 1\60и 1\80.

Полагаем, что наиболее целесообразно в качестве дифференцирующего критерия использовать разведение интерферона 1 \100, поскольку оно является наименьшим, которое позволяет выявить наибольшие различия между листериями из окружающей среды и от теплокровных хозяев.

Заканчивая анализ антиинтерфероновой активности L.mono-

суЮ^елеэ, хотелось бы отметить постепенное уменьшение числа активных штаммов при повышении концентрации интерферона в агаре. Падение данного свойства постепенно происходит в обеих группах, что отображено на рисунке 2.

Рисунок 2. Доля антиинтерфероноактивных штаммов листе-рий при различных разведениях интерферона

Переходя к рассмотрению антикоплементарной активности Ь.топосуи^епез, необходимо отметить примерно одинаковое соотношение комплементинактивирующих бактерий в той и другой совокупности : 75% от общего числа листерий каждой группы обладали антикомплементарными свойствами, исходя из результатов падения оптической плотности в каждой опытной лунке и параллельного учета контрольных данных. Статистически достоверных различий между этими двумя совокупностями не было. Микроорганизмы, представляющие их, обладали одинаковой выраженностью признака. Для наглядности на рисунке 3 показан процент активных штаммов, разлагающих комплемент как среди листерий,

выделенных из объектов окружающей среды, так и от теплокровных хозяев в несколько произвольно выбранных коридорах. Ввиду того, что 0,01 мл каждой лунки содержит максимально 4 СШо комплемента, были выбраны пять коридоров: до 1 СШо, до 2 СШо, до 3 СШо и непосредственно 4 СШо, то-есть в ситуации, когда бактерии полностью разлагают весь комплемент в лунке.

Факт широкого распространения антнкомплементарных свойств среди листерий в обеих группах свидетельствует о принадлежности этого признака к типичным для Ь.топосу^епеБ характеристикам. Большинство из общего числа штаммов практически полностью разлагали имеющийся комплемент в лунке, то-есть наблюдалось количественное преимущество высокоактивных штаммов, нараставшее в каждом следующем коридоре. Так, если в параметрах до 1 СШо, до 2 СШо и до 3 СШо процент антикомплементарных штаммов сравнительно невысок, то уж-е в коридоре до 4 СШо их количество по сравнению с предыдущим значением удваивается в обеих группах. В дальнейшем среди штаммов, выделенных из окружающей среды, происходит последующее увеличение антикомплементарных бактерий на 25%, а от теплокровных животных -на 43,75%.

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Положительных 1лтаммов в %

; □ Из скруж. среды О От теплокр. хозяев

Рисунок 3. Распределение антикомплементарной активности

среди листерий, изолированных из различных источников

Представляют интерес данные по РНК-азной активности листерий. У штаммов, полученных от людей и животных, РНК-азная активность была в 2,3 раза выше (средняя ширина зоны деградации РНК М=6,0 мм), чем у листерий, выделенных из различных объектов окружающей среды (М=2,6 мм), что статистически достоверно (Р<0,05).

Анализ полученных результатов свидетельствует о существовании корреляционной зависимости между активностью ферментов и местом выделения листерий. Коэффициент корреляции между двумя этими признаками равен 0,84. Коэффициент детерминации, по величине которого можно определить, какая доля признака зависит от варьирования другого, равен 0,71. Таким образом, активность РНК-аз у Ь.топосу^епез на 71% зависит от их местообитания.

Это же касается биохимических особенностей листерий, а именно ряда автономных признаков, которые теоретически должны иметь место у листерий в связи с их убиквитарным распространением во внешней среде и в соответствии с принципом экологической детерминированности свойств способствовать их переживанию в различных биосубстратах.

При обследовании имеющихся в нашем распоряжении штаммов 9,68% из них обладали амилазой. Это кажется нам существенным, учитывая дискутируемость наличия данного свойства у Ь.топосу1о£епе5. Таким образом, обнаружение амилолитической активности у микроорганизмов, потенциально относимых к листе-риям, не может служить поводом для прекращения их дальнейшей идентификации со ссылкой на распространенное мнение о неспособности их к этому.

Лецитиназная активность у L.monocytogenes не была обнаружена.

Рассматривая липазную активность, необходимо отметить, что у испытуемых штаммов наблюдается четкая закономерность наличия липазы у части L.monocytogenes, полученных из объектов окружающей среды и ее отсутствие у штаммов, выделенных из организма человека и больных животных. В первой из указанных групп 50% штаммов обладали липолитической активностью, во второй - только 5,3%. Данные различия высоко достоверны - Р < 0,001. Кроме того, наблюдается известная корреляция липазной активности в зависимости от источника выделения: все липазопо-зитивные листерии получены либо из различных видов молока, либо из молочных продуктов - например, сыра. Штаммы же, полученные из рыбы, прудовой воды и почвы, липазу не образовыва-

ли. Эти различия также подтверждены статистически (Р < 0,001).

Нами установлено, что мочевина в концентрации 4% оказывает стимулирующее влияние на рост L.monocytogenes. При посеве на питательный агар взвеси микроорганизмов, содержащей 100 теоретически рассчитанных клеток в 0,1 мл, получали значение КОЕ, равное 86,83+8,13, в то время как при посеве той же дозы, но на питательный агар с 4% мочевины, число КОЕ равнялось 112,76+7,72. t,j> в данном случае равен 2,213, Р < 0,05. Концентрация мочевины 4% в агаре, оказывая стимулирующее влияние на клетки L.monocytogenes и способствуя, по-видимому, их выживанию и размножению, существенно не влияла на форму и размер колоний.

Обобщая полученные результаты, было решено провести своего рода конвергенцию установленных факторов персистенции [..monocytogenes между собой и местом выделения. Представляется достаточно обоснованным подключение к этой категории также липазной активности в связи с достоверно установленной зависимостью между ее наличием и принадлежностью бактерий к определенной части популяции.

Значение множественного коэффициента корреляции стремится к 1. Исходя из этого, можно сделать вывод о сильной степени связи места выделения ¡..monocytogenes с совокупностью таких признаков как РНК-азная, лизоцимная, липазная активности и способности к инактивации антибактериальной составляющей интерферона.

Естественным развитием работы явилось конструирование новой питательной среды для выделения L.monocytogenes. В качестве ингибиторов посторонней флоры была предпринята попытка использовать красители в соответствии с рекомендациями Daniell

У.С. (1973). Использовались следующие концентрации: акридиновый желтый - 0,01%; кристаллвиолет - 0,01%; основной фуксин -1%; бромфеноловый синий - 0,001%; нейтральный красный -0,001%; крезоловый красный - 0,001%; бриллиантовый зеленый -0,0001%, 0,0002%, 0,0003%, 0,0005%; сафранин - 0,001%, 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,1%, 0,2%. В качестве индикатора пробовался бромтимоловый синий в концентрациях 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,5%, 0,7%, 1%, 2%. Обе эти попытки нельзя признать удачными в связи с тем, что либо подавление роста листерий начиналось раньше, чем наступало ингибирование роста остальных испытуемых микроорганизмов, либо это ингибирование было недостаточным для наших целей. Бромтимоловый синий также не годился в качестве индикатора точки перехода рН, так как его дифференцирующие свойства в варианте отдельных колоний недостаточны.

Вышеперечисленные недостатки не позволили нам использовать в рецептуре среды такие вещества как хлорид натрия (концентрация 5%, 6%, 7%, 7,5%, 8%), сахарозу и лактозу (концентрации 10%, 20%, 25%), нитрат калия (концентрации 1,5%, 2%, 2,5%, 3%).

С целью повышения дифференциальных свойств среды в рецептуру был введен теллурит калия. Были опробованы концентрации 0,004%, 0,02%, 0,03%, 0,04%. Оптимальной оказалась концентрация 0,004% теллурита з агаре, так как именно в этом случае листерии, благодаря своей восстанавливающей способности, формируют черные колонии с металлическим блеском и подавление их роста не наблюдается. Дальнейшие попытки увеличения селективных качеств среды путем снижения ее окислительно-восстановительного потенциала с помощью сульфата железа закисного привели

к потере черного цвета колониями, в связи с чем от его использования решено было отказаться. Представители родов Aeromonas, Pseudomonas, а также K.pneumonia^E.coli и Y.enterocolitica на среде с теллуритом калия в концентрации 0,004% демонстрировали худшую, чем L.monocytogenes, выживаемость; на бактерии рода Proteus влияние не оказывалось. Однако, было установлено, что мочевина в концентрации 4% не только стимулирует рост листерий, но и подавляет роение протея и снижает количество КОЕ до 25%. Новая среда имеет следующий состав: Гидролизат казеина - 8 г Сухой питательный бульон - 8 г Мочевина - 4 г

Теллурит калия - 2 мл 2% р-ра Агар - агар - 12г Дистиллированная вода - до 1 л. Окончательный pH был равен 7,3.

Высокий уровень селективных и дифференциальных качеств среды был подтвержден путем определения чувствительности испытуемой среды и среды прототипа. Так, при посевной дозе (по стандарту мутности) 10 клеток, число колоний на предлагаемой среде равнялось 12, а на общепринятой - 9; при посеве 100 клеток -130 и 110 колоний соответственно. Более убедительные результаты получены при высеве смесей листерий с протеями и кишечными палочками, причем листерии были взяты в концентрациях на порядок меньше, чем сопутствующие микроорганизмы. Если на испытуемой среде повсеместно отмечался рост листерий в виде мелких черных колоний диаметром 0,2мм, а колонии протея были темно-серыми с фестончатым краем и более темным центром в ко-

личестве много, меньше, чем листерии, то на общепринятой среде при высеве из смесей, содержащих L.monocytogenes в концентрациях 5х105, 5х106, 5x107, а представителей рода Proteus - в концентрациях 5х106, 5х107 и 5х108, рост листерий визуально не определялся. При посеве последней смеси некоторые чашки с общепринятой средой полностью заросли протеем.

При высеве из обсемененных биосубстратов установлено, что сконструированная и общепринятые среды статистически одинаково эффективны относительно выделения листерий из молока, куриного мяса, зельца и говяжьего фарша. Что же касается воды, то в этом случае испытуемая среда достоверно превосходит общепринятую: Р= 0,05, t = 2,17, а в отношении вареных колбас результат был обратным.

Однако, при обработке сводных данных по обеим средам было установлено, что испытуемая среда на 0,83% чувствительнее общепринятой. Это важно потому, что для врачей практического здравоохранения и ветеринаров представляет интерес возможно более высокая потенциальная универсальность среды, учитывая невозможность проведения испытаний на всех предполагаемых субстратах, которые теоретически могут быть инфицированы лис-териями.

При высеве из испражнений больных получены еще более убедительные данные, представленные на рисунке 4.

Доза обсеменения (кл/г).

| □ Испытуемая среда О Общепринятая среда |

Рисунок 4. Частота выделения листерий при посеве искусственно обсемененных испражнений на испытуемую и общепринятую среды

Таким образом, используя в работе как уже апробированные и широко практикуемые методики, а также собственные новые разработки, нам удалось с позиции биологической целесообразности, обуславливающей экологическую детерминацию свойств, оценить ряд факторов персистенции, а также некоторые биохимические характеристики Ь.топосч^епеБ. Показано, что разные части популяции возбудителя, приуроченные к различным средам обитания, характеризуются заметными отличиями. В первую очередь это относится к персистентным характеристикам листерий. Наряду с этим возможности Ь.топосу^епез к ферментации ряда субстратов позволяет им осваивать те или иные экониши. Показана тесная взаимосвязь между лизоцимной, РНК-азной, липазной активностями, а также способностью к инактивации антибактериальной составляющей интерферона и экотопической принадлежностью штаммов.

В заключение хотелось бы еще раз подчеркнуть биологическую целесообразность, обуславливающую экологическую детерминацию как персистентного потенциала бактериальных патогенов, так и других фенотипических признаков микроорганизмов при переходе из одной экосистемы в другую. Популяционный биопрофиль "отражает адаптационные сдвиги микроорганизмов с учетом специфики экониши.... В наибольшей степени это относится к потенциально патогенным микроорганизмам... (Бухарин О.В., Литвин В.Ю., 1997). Именно к этой категории и принадлежит Ь.топосуи^епез.

ВЫВОДЫ

1. В ходе выполнения данной работы установлено наличие у Ь.топосуи^епеБ следующих факторов персистенции: лизоцимной, РНК-азной, антикомплементарной и антиинтерфероновой активности.

2. Применительно к Ь.шопос>1о§епез выяснена двоякая функция мочевины как стимулятора роста и ингибитора посторонней флоры одновременно.

3. Выявлено наличие амилазы у 9,68% листерий, а также преобладание липазоположительных штаммов среди внеорганизмен-ной части популяции (50%) против 5,3% в гостальной ее части.

4. Статистический анализ распределения ряда биологических свойств Ь.топосуи^епез (лизоцимной, РНК-азной, антиинтерфероновой и липазной активности) позволяет использовать их в качестве маркеров при решении вопросов диагностики заболеваний, расшифровке эпидемиологических ситуаций, проведении микробиологического мониторинга и экологических исследований.

5. На основании данных, полученных при изучении биологических свойств Ь.топосу^епез, сконструирована питательная среда для выделения л истерий из объектов окружающей среды и материала от больных. С помощью этой среды на территории Астраханской области выявлены листерии в 9,7% всех исследованных проб, что, с одной стороны, свидетельствует о ее достаточно высоких элективных свойствах, а с другой - подтверждает повсеместное распространение данного микроорганизма, в том числе и в указанном регионе.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Актуальность и некоторые аспекты эпидемиологии листе-

риоза //Эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика важнейших инфекционных болезней. - Материалы конференции, гг. Тамбов - Астрахань, 1994, С.156-157 (соавт.: А.В.Бойко).

2. Резистентность листерий к различным химическим веществам // Эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика важнейших инфекционных болезней. - Материалы конференции, гг.Тамбов - Астрахань, 1994, С.157-158.

3. Бактерицидная активность иловых грязей озер Астраханской области по отношению к некоторым патогенным и потенциально патогенным микроорганизмам //Эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика важнейших инфекционных болезней. - Материалы конференции, гг.Тамбов - Астрахань. -1994. - С.175-177 (соавт.: Ю.Д.Чиркин, А.Г.Давыдов, Т.С.Гненюк, Р.В.Измайлова, С.А.Ильязова, Ю.Ю.Черникова, Г.Н.Киселева, Л.А.Журавлева, О.С.Унгарбаев.

4. Антилизоцимная активность шигелл и листерий //Идеи

Пастера в борьбе с инфекциями. - Международный симпозиум, посвященный году Пастера, Институт Пастера,6 - 10 июня 1995, Санкт-Петербург, Россия, С.61 (соавт. В.А.Колоколов).

5. Устойчивость листерий к веществам, используемым в пищевой промышленности // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. -Международный симпозиум, посвященный году Пастера, Институт Пастера, 6-10 июня 1995, Санкт-Петербург, Россия, С.125.

6. Сравнение двух сред для выделения листерий из воды и пищевых продуктов // Актуальные вопросы современной микробиологии, вирусологии и иммунологии. - Астрахань. - 1995. - С.78 (соавт. А.В.Бойко, Ф.Х.Ибрагимов).

7. Пищевые продукты как важнейший фактор передачи возбудителя листериоза // Труды Астраханской государственной медицинской академии. - Астрахань. - 1996. - Т.5, - С.73-74.

8. Дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий // Эпидемиологические и клинико-иммунологические аспекты профилактики важнейших инфекционных заболеваний. -Материалы конференции к 25-летию Астраханского филиала ЦНИИЭ ГК СЭН РФ, Астрахань. - 1996. - С. 136 - 137 (соавт. А.В.Буркин, Ф.Х.Ибрагимов, А.В.Бойко).

9. Рибонуклеазная активность бактерий как фактор перси-стенции некоторых возбудителей сапронозных инфекций //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1997. - № 4. -С. 71 - 73 (соавт. А.В.Бойко).