Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка питательных сред и микротест-системы для накопления, выделения и идентификации листерий
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Разработка питательных сред и микротест-системы для накопления, выделения и идентификации листерий"
На правах рукописи
ОМАРОВА Салидат Магомедовна
РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И МИКРОТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ, ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИСТЕРИЙ
03.00.07 ■ микробиология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
□ □ЗОВО~?78
Махачкала - 2007
003060778
Работа выполнена в ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ НПО «Питательные среды» и ГОУ ВПО Дагестанская Государственная Медицинская Академия
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор
Игорь Семенович Тартаковский
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Лариса Петровна Блинкова
Доктор медицинских наук, профессор Виктор Михайлович Бондаренко
Доктор медицинских наук, профессор Борис Аркадьевич Шендеров
Ведущая организация: ФГУН ГосНИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им Л А Тарасевича Роспотребнадзора
Защита диссертации состоится " 21 "июня 2007г в 12 00 ч на заседании диссертационного совета Д001 035 01 при ГУ НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН по адресу 105064, Москва, Малый Казенный переулок, д 5А
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН
Автореферат разослан " .. ".................2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук
И.В.Яковлева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Значимость инфекционного фактора в патологии человека в начале XXI столетия не только не снижается, но и проявляет тенденцию к нарастанию, несмотря на несомненные успехи, достигнутые в борьбе с инфекционными болезнями, (Опочин-ский Э Ф ,2001, Покровский В И , Черкасский Б J1, Онищенко Г Г , 2002).
В связи с этим существенно расширились представления о роли инфекционных агентов в возникновении и развитии патологических процессов у человека К числу инфекций с доказанной нозологической самостоятельностью относят листериоз, возбудитель которого широко распространен в природе и вызывает острое инфекционное заболевание людей и животных (Бакулов И А, Васильев ДА, 1991; Тартаковский И С., Малеев В В , Ермолаева С.А ,2002, Зайцева Е А , Сомов Г П ,2006, ЧеркасскийБ Л, 1995)
Наибольшую опасность листериозная инфекция представляет для беременных и новорожденных, вызывая выкидыши, мертворож-дение, пороки развития плода, а также менингоэнцефалиты, сепсис и пневмонии у новорожденных Несмотря на своевременную антибио-тикотерапию, смертность при перинатальном и неонатальном листе-риозе достигает 30-50%, в том числе при внутрибольничных вспышках в роддомах (Тартаковский И С ,2002, Kaufmann SHE ,1993, Lor-ber В.,1997)
Согласно данным медицинской статистики в последние годы крупные вспышки листериоза с высоким процентом летальных исходов обусловлены потреблением пищевых продуктов, прежде всего, сыра и других молочных продуктов, салатов, мясных, куриных и рыбных изделий (Linnan М G et al, 1998 г , Schwartz В et al, 1989)
Заболеваемость листериозом в России регистрируется с 1992 г , однако количество положительных находок невелико (до 100 случаев ежегодно), что вероятно связано с отсутствием эффективной системы санитарно-эпидемиологического надзора и неудовлетворительным качеством лабораторной диагностики
Анализ различных методических подходов к диагностике листериоза позволил определить ведущую роль бактериологических методов выделения и идентификации Listeria monocytogenes, для проведения которых необходимы новые селективные среды и микротест-системы
В 2002 году утверждены методические указания по организации контроля пищевых продуктов на наличие в них L monocytogenes Введение обязательных регламентированных требований санитарно-бактериологического контроля пищевых продуктов за обсемененно-стью патогенными листериями способствует получению объективных данных в целом по России
Увеличение случаев листериоза у людей диктует настоятельную необходимость создания эффективных методов и схем диагностики листериоза с применением селективных питательных сред
Зарубежные фирмы - производители питательных сред («Oxoid», «BBL», «Merck», «Ью Мепеих», «Himedia» и др) выпускают коммерческие селективные среды для накопления, выделения, и идентификации листерий Однако использование этих сред в практических лабораториях нашей страны крайне ограничено в связи с их высокой стоимостью
В настоящее время в арсенале лабораторной службы не имеется отечественных коммерческих питательных сред для культивирования, выделения и идентификации патогенных листерий Кроме того, не менее важно применение для экспресс-диагностики и биохимической идентификации листерий современных тест-систем, промышленное производство которых также отсутствует в нашей стране
В связи с этим диссертационная работа посвящена решению ключевых вопросов микробиологической диагностики листериоза
Цель работы. Разработка питательных сред и микротест-системы для накопления, выделения и идентификации листерий Задачи исследования:
1 Экспериментально обосновать рецептуру питательной среды для накопления L monocytogenes при выделении из клинического материала и состав селективного питательного бульона для предварительного обогащения культур Listeria при контроле пищевых продуктов
2 Сконструировать агаризованные питательные среды для выделения, культивирования и идентификации листерий
3 Разработать и апробировать в эксперименте и на клиническом материале микротест-систему для ускоренной биохимической идентификации листерий
4 Отработать технологию производства питательных сред и микротест-системы для накопления, выделения и идентификации листерий
5 Определить диагностическую ценность разработанных препаратов при бактериологическом исследовании клинического материала и контроле пищевых продуктов
6 Предложить рациональную схему исследования клинического материала на листериоз.
Научная новизна. Впервые с учетом питательных потребностей возбудителя научно обоснованы рецептуры, экспериментально и клинически апробированы созданные на их основе отечественные питательные среды для накопления, выделения и идентификации листе-рий Сконструированные среды обеспечивают высокий уровень накопления Listeria при их минимальных количествах в исследуемом клиническом материале, что позволяет существенно сократить сроки выявления возбудителя, а также провести идентификацию патогена по биохимическим тестам Установлена диагностическая ценность созданных питательных сред для лабораторной диагностики листериоз-ной инфекции Научный приоритет разработанных питательных сред для накопления и первичной идентификации листерий подтвержден патентами РФ (№ 2158758 от 10 11 ООг и № 2201957 от 04 05 01г)
Впервые разработана отечественная микротест-система для ускоренной биохимической идентификации листерий (MTC-J1), позволяющая провести идентификацию листерий через 6 ч инкубации вместо 18 ч при использовании традиционных сред Гисса
Экспериментально доказана стабильность сохранения биологических свойств листерий при культивировании на разработанных питательных средах с использованием расширенного набора музейных штаммов и свежевыделенных культур листерий из исследуемого материала различного происхождения
Практическая значимость работы. Впервые в России разработаны и освоены на производстве филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ и CP РФ НПО «Питательные среды» коммерческие питательные среды и микротест-система для накопления, выделения и идентификации листерий
Питательная среда для накопления листерий, помимо, использования с целью выделения патогена из клинического материала, может применяться при получении биомассы листерий в экспериментальных исследованиях и на биотехнологических производствах
Использование питательной среды для предварительного обогащения листерий при микробиологическом контроле пищевых продуктов позволит обеспечить эффективный эпидемиологический над-
зор за распространением листериоза, обусловленного инфицированными продуктами питания
Применение разработанной среды для выделения листерий при определении чувствительности к антибактериальным препаратам сократит количество питательных сред, используемых в процессе диагностики
Созданная микротест-система для биохимической идентификации листерий существенно ускорит сроки получения результатов бактериологических исследований в клинико-диагностических лабораториях
Предложенная рациональная схема бактериологического исследования клинического материала на листериоз позволяет сократить сроки выделения и идентификации возбудителя с использованием сконструированных сред и микротест-системы
На основании проведенных исследований разработана нормативная документация (НД) для промышленного выпуска питательных сред и микротест-системы для накопления, выделения и идентификации листерий По результатам исследований утверждены НД ФСП 42-0504-7919-06 и ПР №1241-02 «Сухая питательная среда для накопления листерий», ФСП 42-0504-7918-06 и ПР №1309-03 «Сухая питательная среда для выделения и культивирования листерий».
Разработанные питательные среды и микротест-система апробированы в специализированных лабораториях ГУ НИИЭМ им НФ. Гамалея (Москва), РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов), ВГНИИ контроля и стандартизации ветеринарных препаратов (Москва), а также в клинических лабораториях ДНЦ РАМН (Махачкала), родильных домов №1 и №2 (Махачкала) По результатам испытаний питательных сред и микротест-системы получены положительные заключения от этих учреждений о целесообразности их применения в диагностических целях
Внедрение разработанных сред и микротест-системы в практику позволит обеспечить лабораторную службу страны стандартными препаратами для бактериологического исследования клинического материала на листериоз и контроля пищевых продуктов на обсеме-ненность листериями
Методические приемы по биохимической идентификации листерий, разработанные в ходе исследований, вошли в учебное пособие для студентов медицинских вузов «Микротест-системы в лабораторной диагностике инфекционных болезней» (М «Медицина»,2006),
рекомендованное Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России
Основные положения, выносимые на защиту
1 Экспериментально обоснован состав и разработана технология получения сухих питательных сред для накопления, выделения и идентификации листерий
2 Сконструирована и апробирована микротест-система МТС-Л для биохимической экспресс-идентификации листерий
3 При бактериологическом исследовании клинического материала на листериоз и контроле пищевых продуктов на обсемененность культурами листерий доказана диагностическая эффективность разработанных препаратов
4 Предложена рациональная схема бактериологического исследования на листериоз, позволяющая сократить сроки выделения и идентификации возбудителя
Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции, посвященной 75-летию государственной санитарно-эпидемиологической службы «Региональные проблемы охраны окружающей среды и здоровья населения» (Махачкала, 1997г), на VI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1999г ), на 3-й научно-практической конференции НПО «Питательные среды» МЗ РФ «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических сухих питательных сред и микротест-систем» (Махачкала, 2001г), на VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002г), на научно-практической конференции, посвященной 50-летию НПО «Питательные среды» МЗ РФ «Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем» (Махачкала, 2003г), на XI11 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006г),
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 работ
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 315 страницах и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 338 источников, и приложения Материалы исследований иллюстрированы 88 таблицами и 36 рисунками
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.
В работе использован 671 штамм бактерий рода Listeria, из них 45 типовых музейных и 626 свежевыделенных штаммов, полученных из коллекций лаборатории легионеллеза ГУ НИИЭМ им Н Ф Гамалея (Москва), Ростовского НИПЧИ, Российского НИПЧИ «Микроб» (Саратов) и лаборатории клинической микробиологии НПО «Питательные среды» (ФГУП НПО «Микроген») (табл 1)
Таблица 1
Перечень использованных в работе культур рода Listeria
Культуры Музейные Свежевыделенные
1 L monocytogenes 38 558
2 L ivanovn 1 21
3 L innocua 2 18
4 L seeligeri 1 2
5 L Welshmen 1 13
6 L grayi 2 14
Итого 45 626
В работе также использовали штаммы - Proteus mirabilis «Сиднее» 71/2, Proteus vulgaris НХ19 222, Staphylococcus aureus Wood 46, Staphylococcus aureus FDA P-209, Staphylococcus aureus «Виотко», Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coh Su 3912/41(0 55 К 59), Escherichia coli 124 К 72227, Escherichia coll 168/59, Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli 18, Escherichia coli 06P16, Enterococ-cusfaecalis 775, полученные из коллекции ФГУН ГИСК им JIА Тара-севича
В качестве сред сравнения применяли среды лабораторного приготовления, рекомендованные действующими Методическими рекомендациями (Москва, 1987 г, Ульяновск, 1992; МУК 4 2 1122-02 и ГОСТом Р51921-2002 ), для выделения, накопления и идентификации листерий, а также среды зарубежных фирм «HiMedia» триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA), триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB), «Ью Мепеих» бульон Фразера «Fraser Broth», «Difco» жидкая и плотная среды на основе триптического соевого перевара (TSB, TSA)
Для высева из среды накопления и контроля чистоты выросшей культуры использовали сухой питательный агар, приготовленный по ФСП 42-0504-5807-04, питательный агар с 10% инактивированной сыво-
ротки и 5% кровяной агар для изучения гемолитических свойств патогенных штаммов листерий
Всего изучено 520 образцов жидких сред для накопления и обогащения листерий, 590 образцов плотных питательных сред для выделения и идентификации, а также 36 образцов среды для определения подвижности листерий с использованием тест-штаммов Проведено 1820 экспериментальных исследований, на клиническом материале -1236 исследований.
Физико-химические методы Контроль качества белковых основ и образцов питательных сред по физико-химическим показателям осуществляли в соответствии с Методическими указаниями МУК 4 1/4 2 588-96 (содержание хлоридов, аминного азота) и требованиями Государственной фармакопеи, XI изд (рН, содержание остаточной влаги) Качество химреактивов и индикаторов изучали по методикам, изложенным в ГОСТах на соответствующий препарат
Биологические методы in vitro Оценку качества разработанных сред по биологическим показателям осуществляли посредством определения количества колониеобразующих единиц (КОЕ), показателей чувствительности, сроков появления роста (скорости роста), эффективности и ингибиции в соответствии с «Методическими рекомендациями к контролю питательных сред по биологическим показателям» (М, 1980 г), а также по параметрам кинетики роста культуры в соответствии с «Методическими рекомендациями по параметрам роста микроорганизмов в процессе их культивирования» (М, 1980г)
Реакцию агглютинации на стекле, РНГА, ПЦР выполняли по общепринятым методикам
Гемолитическую активность выделенных культур листерий исследовали на кровяном агаре с 5% эритроцитов человека, барана или кролика Гемолиз с диапазоном размера зон более 5мм оценивали как выраженный Кроме того, проводили количественную оценку гемолитической активности по методу Barolay R.et al., (1989)
Лецитиназную и липазную активность листерий определяли на средах с добавлением яичного желтка (1%) Количественный учет ле-цитиназной и фосфолипазной активности проводили по гидролизу яичного желтка и фосфатидилхолина, соответственно, как описано Barolay Retal (1989)
Определение срока годности препаратов проводили в соответствии с Методическими рекомендациями «Определение сроков годности сухих микробиологических сред и питательных основ методом «ускоренного старения» при повышенной температуре» (1986г)
Биологические тесты in vivo Внутрибрюшинное заражение мышей проводили путем инфицирования животных различными дозами 18-часовой агаровой культуры в изотоническом растворе натрия хлорида Результаты учитывали через 21±1 день с последующим определением ЬДзо
Конъюнктивальную пробу проводили нанесением на конъюнктиву глаза морской свинки 2 капель исследуемой бульонной культуры Вирулентность штаммов листерий оценивали на 2-4 день по наличию у животного гнойного кератоконъюнктивита
Статистическую обработку материала осуществляли с помощью программы Microsoft Excel, определяя достоверность различий между средними величинами по критерию Стьюдента (Лакин Г Ф, 1990) Результаты исследований и их обсуждение При изучении различных белковых основ (рыбные и казеиновые панкреатические гидролизаты, пептоны и др ), используемых при конструировании питательных сред и имеющих промышленный выпуск, было установлено, что по физико-химическим и биологическим свойствам оптимальным является сухой питательный бульон (СПБ), обеспечивающий физиологические потребности листерий Известно, что для роста и размножения большинства микроорганизмов необходимы триптофан, цистин, тиамин, метионин, аспарагиновая кислота (Лабинская А С, Блинкова Л П, Ещина А П, 2004) Показано, что оптимальной концентрацией триптофана в среде является 50-100мг% Такое количество свободного триптофана содержат панкреатические гидролизаты каспийской кильки Концентрация свободного триптофана в пептических гидроли-затах кильки и казеина намного меньше (Плоскирев H В , 1964, Лихварь H А, Веденяпина 3 С с соавт ,1974, Биргер M О, А К. Варгина с соавт, 1975, Степанова Э Д ,1979, Телишевская Л Я, 2000) Это объясняет, на наш взгляд, преимущество панкреатических гидролизатов кильки перед другими основами, наиболее часто используемыми в производстве сухих питательных сред В то же время СПБ несколько уступал контрольной среде - триптиказо-соевому бульону с дрожжевым экстрактом (TSB) по показателям оптической плотности (рис 1)
Известно, что за исключением спинномозговой жидкости и крови, клинический материал, как правило, контаминирован сопутствующей микрофлорой На общем микробном фоне количество листерий невелико, а скорость роста листерий уступает многим условно патогенным бактериям, поэтому для успешного выделения листерий из клинического материала, существенное значение имеет процедура накопления микроорганизмов, которая во многом зависит от оптимального подбора стимуляторов роста.
Следующим этапом исследований был поиск дополнительных факторов и стимуляторов роста л истерий, которые могли бы способствовать максимальному накоплению микробных клеток и сокращению сроков появления роста.
РИС, 1. Изменение оптической плотности 100 Е( (ось ординат)/., пюпосую-gen.es 56 па этапах периодического куяьтивйршВйиз I. ч (оев абсцисс) при использовании различных Основ:I- триптиказо-саешЙ бульон (Т5В); 2- питательный бульон (СПБ}, 3 - казеиновый панкреатический гидролизах, 4 - пептон семипалатинский
В качестве стимуляторов роста микроорганизмов широкое применение находит экстракт кормовых дрожжей (ЭКД), что объясняется наличием н нем комплекса водорастворимых витаминов группы «В», а также стандартностью и возможностью длительного хранения (ЭКД выпускается в сухом виде). В качестве энергетического источника использовали глюкозу.
Несмотря на то, что в ЭКД содержится комплекс водорастворимых витаминов группы В, содержание тиамин-бромида, на наш взгляд, недостаточно для обеспечения максимального накопления листерий, а дополнительное внесение этого витамина обеспечило повышение чувствительности среды до МУ .
Проведенные исследования показали, что сочетанийе использование рост стимулиру[ощих факторов - ЭКД (2,0 г/л), тиамин-бромида (0,003 г/л) и глюкозы (1,0 г/л), значительно повышало стимулирующий эффект среды в отношении листерий и физиологическую актив-
ность популяции Среда обеспечивала за (18±2) ч инкубации четкий рост листерий при посеве в среду 0,1 мл микробной взвеси из 10"7 разведения, что соответствует расчетной концентрации возбудителя в среде - 10м к. в 1 мл среды, в то время как на контрольной среде при этих же условиях в течение (18±2) ч инкубации рост тест-штаммов не обнаруживался (табл 2,3)
Таблица 2.
Определение оптимального количества стимуляторов роста
в рецептуре среды для накопления листерий
Состав образца среды, г/л L monocytogenes 56 L monocytogenes NCTC 10527 (4в)
СПБ Глюкоза экд Тиамин-бромид 10"5 10 6 10-' 10"8 10"5 10 6 101 10
1,5 1,0 2,0 - +++ +++ - - +++ +++ - -
1,5 1,0 2,0 0,002 +++ +++ - - +++ +++ - -
1,5 1,0 2,0 0,0025 +++ +++ + ± +++ +++ + ±
1,5 1,0 2,0 0,003 +++ +++ ++ ± +++ +++ ++ ±
1,5 1,0 2,0 0,0035 +++ +++ ++ + +++ +++ ++ ±
1,5 1,0 2,0 0,004 +++ +++ ++ ± +++ +++ ++ +
Обозначения здесь и далее ± сомнительный рост, + слабый рост, ++ умеренный рост, +++ обильный рост,- отсутствие роста
Таблица 3
Рост тест-штаммов в среде накопления при различной посевной дозе
Тест-штаммы Разработанная среда Контрольная среда (TSB)
разведение культуры разведение культуры
106 10 10"6 10 10'
L monocytogenes NCTC 10527 (4в) +++ ++ ++ - +
L monocytogenes NCTC 5214 (4а) +++ ++ ++ - +
L monocytogenes NCTC 7973 +++ ++ ++ - +
L monocytogenes 21 +++ ++ ++ - +
L monocytogenes 213 +++ ++ ++ - +
L monocytogenes 56 +++ ++ ++ - +
L monocytogenes NCTC 55143 +++ ++ ++ - +
L monocytogenes NCTC 5348 +++ ++ ++ - +
L monocytogenes NCTC 19117 +++ ++ ++ - +
Время культивирования 18+2 ч 18±2 ч 18±2 ч 18±2ч 36±2 ч
Оптимальный экспериментальный образец показал высокую эффективность накопления листерий за (18±2) ч инкубации, количест-
во которых увеличивалось более чем в 1000 раз по сравнению с исходной посевной дозой (табл 4)
Таблица 4
Эффективность накопления штаммов листерий в разработанной среде
Тест-штаммы Количество микроорганизмов (КОЕ/мл) Показатель эффективности (накопительный эффект) Рэ М±т
исходная посевная доза (п0) М±т через (18±2) ч инкубации в среде накопления с учетом разведения (nt) M+m
L. monocytogenes 4а 55+8,0 (58±4) 105 5454+109
L monocytogenes 4в 48+4,0 (52±6) 105 8333+166
L monocytogenes 21 40+3,0 (45+4) 105 12500+250
L monocytogenes 56 41+3,0 (44±3) 105 7310±146
L monocytogenes 213 49±4,0 (51 ±4) 105 4081±81
L. monocytogenes NCTC 7973 23±3,0 (30+3) 105 3448±68
L monocytogenes NCTC 55/43 57±6,0 (60±6) 105 5263+105
L monocytogenes NCTC 53/48 32±5,0 (34+5) 105 6250+125
L monocytogenes NCTC 105/27 34,0+7,0 (36±7) 105 5882+117
После определения базовой рецептуры предлагаемой среды для накопления и изучения ее по биологическим показателям роста и в периодических процессах культивирования, получили лабораторно-экспериментальные серии сухого препарата с целью масштабирования и отработки требований к качеству и технологии получения препарата в производственных условиях
Экспериментальные серии среды для накопления изучали по биологическим показателями параметрам роста в периодических процессах культивирования листерий (табл 5, рис 2)
Параметры роста тест-штамма L. monocytogenes NCTC 10527 (4в) в лабораторно-экспериментальных сериях среды накопления
Лабораторно-экспериментальные серии среды накопления Значения параметров роста Биологические показатели серий среды
t- лаг, ч t- эксп, ч М-тах» ч 1 gmin, Ч Lg 100 Et чувствительность сроки появления роста, ч
серия №1 2,0 3,8 1,38 0,50 1,90 10"7 18+2
серия №2 3,0 3,4 1,42 0,49 1,44 10"7 18+2
серия №3 0 6,5 0,84 0,80 2,35 10"7 18+2
серия №4 0 6,0 0,39 1,70 1,20 10"7 18+2
Обозначения (t,jiar) - логарифмическая фаза,
(t, эксп) - экспоненциальная фаза,
(Umax) - максимальная удельная скорость роста
(gmin) - минимальное время генерации,
( Lg 100 Et) - оптическая плотность
Изучение параметров роста тест-штамма L monocytogenes NCTC 10527 (4в) показало, что экспериментальные серии среды накопления обеспечивают высокие значения оптической плотности культуры, максимальной удельной скорости роста и длительности фазы экспоненциального роста
Анализируя результаты экспериментов, пришли к выводу, что разработанная среда может быть использована для выращивания тест-штаммов листерий в длительных процессах культивирования с целью накопления большого количества биомассы Это особенно важно в связи с развитием исследований в области медицинской биотехнологии и необходимостью создания широкого спектра иммунобиологических препаратов для диагностики и профилактики листериоза
1дЮ0Ё1 2,5
2 4
В 8
10 12
6 10 12 14
)д 100 Е|
1,4 1,2 1.0 0,6 0,6 0,4 0,2
1,ч
8 10 12
1'ИС. ¡4. Изменение оптической шюЩгасти Lg 100 [-1 (оси ординат) 1... топасу1о^е>шз 4н на этапах периодического культивирования, I, ч (оси абсцисс) и лаборатории-экспериментальных сериях среды накопления (1-1V]
Таким образом, высокие ростовые показатели предлагаемой среды достигнуты за счет сочетанного использования оптимальных концентраций питательной основы и компонентов, стимулирующих рост листерий Ферментативный гидролизат из свежезамороженной кильки, являющийся основой используемого рыбного бульона, содержит полный набор аминокислот, в том числе незаменимых, не уступая по этому показателю классическому мясопептонному бульону Кроме того, он содержит микроэлементы такие, как натрий, калий, кальций, магний, цинк, которые переходят в гидролизат кильки в процессе технологической обработки и оказывают стимулирующее действие на рост микроорганизмов, что в совокупности обеспечивает в минимальные сроки высокий накопительный эффект при культивировании листерий
Дня подавления сопутствующей микрофлоры в исследуемом клиническом материале в состав среды в качестве селективных агентов введены налидиксовая кислота и акрифлавина гидрохлорид в количестве 0,04 и 0,0125 г/л, соответственно Образцы селективной среды накопления полностью ингибировали рост микробов-ассоциантов тест-штаммов Е coh Su 3912/41 (055 К59) и Е coli 168/59 из разведения 10"2, Р vulgaris НХ19 222 из разведения 10"6, S aureus «Виотко» и S. aureus FDA 209-Р из разведения 10"1, не подавляя при этом рост листерий
Изучение чувствительности селективной и контрольной сред накопления показало, что среды независимо от используемого тест-штамма листерий, обеспечивали в опытных пробирках через (18±2) ч равномерное помутнение при их засеве 1 мл культуры листерий из разведения 10"6. Инокуляция листерий из разведения 10~7 в экспериментальных средах также приводила к помутнению разработанной нами среды, тогда как пробирки с контрольной средой сравнения через (18±2) ч инкубации оставались прозрачными Высев бульонной культуры из контрольной среды подтвердил отсутствие роста тест-штаммов
В результате проведенных исследований определены биологические свойства среды накопления, характеризующие качество разработанного препарата, показатели которых представлены в таблице 6.
Следующий этап исследований посвящен созданию селективного варианта питательного бульона для предварительного обогащения культур рода Listeria при исследовании пищевых продуктов Схемы выявления и выделения листерий из клинического материала отличаются от методов выделения листерий из пищевых продуктов, так как последние значительно больше обсеменены контаминантами, в частности, энтерококками, являющимися одним из санитарных показателей загрязнения пищевых продуктов
Таблица 6
Показатели качества питательной среды для накопления листерий
Показатели качества среды L monocytogenes 56 L monocytogenes NCTC 10527 (4в) L monocytogenes NCTC 5214 (4а) Е coli Su 3912/41 (055.-К59) S aureus FDA 209-Р Р vulgaris НХ19 222
Чувствительность среды 107 10 7 107
Сроки появления роста, (скорость роста), ч 18±2 18±2 18+2
Показатель эффективности в 1000 раз в 1000 раз в 1000 раз - - -
Ингибиция ассоциантов отсутствие роста при посеве 0,1 мл из разведения 102 отсутствие роста при посеве 0,1 мл из разведения 101 отсутствие роста при посеве 0,1 мл из разведения 106
В связи с этим, для подавления роста энтерококков в среду обогащения в качестве дополнительного селективного агента ввели хлорид лития в концентрации 3,0 г/л, который полностью подавлял рост энтерококка Однако введение в состав среды дополнительного селективного агента несколько угнетало рост листерий, что могло отрицательно сказаться на процедуре выделения листерий при контроле пищевых продуктов, поэтому для стимуляции роста листерий в составе базового образца среды увеличили концентрацию ЭКД до 5,0 г/л
Для обеспечения дифференциации патогенных листерий от ас-социантов в среду ввели эскулин в количестве 1,0 г/л в соответствии с рекомендациями МУК 4 2 1122-02, а также определили оптимальное количество цитрата железа аммонийного - 0,5 г/л, сочетанное использование которых позволяет с высокой степенью надежности идентифицировать L monocytogenes При этом исходили из того, что, как известно, в результате гидролиза эскулина до глюкозы и эскулитина, реагирующего с ионами железа, образуется комплекс черного или оливкового цвета, что дает возможность по изменению цвета среды визуально четко регистрировать рост патогенных листерий при исследовании пищевых продуктов (рис 3)
1
РИС. 3. Гост тест-штамма Д. топосую^епщ 7973 (1/2а) в среде для обогащения лиетерий. |
Образцы бульона испытывали в сериях опытов при различной микробной концентрации, с целью определения чувствительности и эффективности среды. Результаты представлены в таблицах 7, 8.
Таблица 7
Чувствительность бульона для обогащения лиетерий при различных чосеиных дозах тест-штат мое_
Исследуемые штаммы Время инкуба-ЦИИ.Ч Экспериментальная среда Контр оj tьная срела (бульон Фразера)
разведение культу ры развеле11 ие ку j 11 »ту рьi
10 ИГ 10 ■ 10* to to" 10"' 10*
L. monocytogenes ¡vox: Щ527 Т&±2 +++ ++ ++ ± +++ ++ + -
monocytogenes NCTC52U 1К±2 +++ ++ ++ ± +++ ++ + -
L. monocxtogt'nes 213 18 ±2 +++ +++ ++ ± +++ ++ + -
L monocytogenes 2/ 18±2 +++ +++ ++ ± +++ ++ + -
L. monocytogenes NCTC 7973 18±2 +++ +++ ++ ± +++ ++ + -
L morWcvrogetWS 56 18±2 +++ +++ ++ ± +++ ++ + -
I., ivanovii 19119 18+2 +++ ++ + +++ ++ +
L. innocua Sl.CC 3379 18+2 +++ ++ + ± +++ ++ + -
L seeligen SLCV 18/100 18+2 +++ ++ + ± +++ ++ + -
L. welshitneri 3587 1й±2 +-V+ ++ - - +++ ++ - -
I. gravi 437 18+2 ++ + - - ++ + -
Таблица 8
Сравнительные данные испытания экспериментальной и контрольной сред по тесту эффективности
Тест- Исходная Количество Количество колоний, сформировавшихся
штаммы посевная жизнеспо- на сывороточном агаре
доза, м к собных экспериментальная среда контрольная среда-бульон
клеток (по) (через 7±1 ч) Фразера (через 18±2 ч)
М±т количе- при- эффек- количе- прирост, эффек-
ство рост, тивность, ство крат- тив-
колонии кратность % колоний ность ность,
(nt) M±m (П.) М±т %
L mono- 100 22+4 120±10 5,4 81 89+8 4,0 75
cytogenes NCTC 7973 (*.l/2a) 10 6±2 46±6 7,6 86 0 0 0
L mono- 100 25+6 132+15 5,3 81 101+9 4,0 76
cytogenes 21 (l/2a) 10 7+2 41+5 5,8 83 0 0 0
Из таблиц 7 и 8 видно, что экспериментальный селективный бульон для предварительного обогащения листерий, обладал высокими показателями чувствительности (107) и эффективности в отношении наиболее часто выделяемых штаммов листерий и не уступал по этому показателю контрольной cpefle(Fraser broth, "bio Meneux")
Экспериментально-производственные образцы разработанного бульона для предварительного обогащения испытаны при микробиологическом контроле продуктов питания на обсемененность культурами L monocytogenes.
Для исследования были отобраны 1320 проб пищевых продуктов с рынка № 2 г Махачкалы в период с 2003 по 2005 гг
В результате исследований выделено 319 культур рода Listeria Из 319 положительных находок 31 (9,7%) штамм серотипирован и идентифицирован по существующим тестам, как L monocytogenes, они отнесены к серогруппе I, сероварам 1/2а и 1/2с (по результатам реакции агглютинации с групповыми сыворотками) (табл 9)
Таблица 9
Характеристика выделенных культур L. monocytogenes
Выделен- Проис- Серовар Морфол, Подвиж- Чувствитель- Показатель роста
ные штам- хождение тинктор, ность ность к фагам на бульоне обо-
мы штамма физиол -биохим при 23±1°С гащения
свойства Л-2а Л-2с
L mono- сыр Ша типичные (++)- + - изменение цвета
cytogenes по морфо- 12шт (10шт) среды от светло-
п=14 лог-ким, тинктор и физиол -биохим свойствам (±)-2 шт желтого до черного или темно-оливкового
L mono- сыр 1/2с (++)- - + изменение цвета
cytogenes то же 8 шт (6 шт) среды от светло-
п=9 (-)-1 шт желтого до черного или темно-оливкового
L mono- мясо 1/2а (++)- + - изменение цвета
cytogenes то же 7шт (6 шт) среды от светло-
п=8 (±)~ 1шт желтого до черного или темно-оливкового
Дальнейшие исследования были направлены на создание селективной среды для выделения листерий Лабораторно-экспериментальные образцы среды испытывали с целью определения чувствительности среды к минимальным посевным дозам В связи с этим, испытания экспериментальных образцов среды проводили путем посева тест-штаммов в количестве 0,1 мл из разведения 10"6 и по 0,1 и 0,5 мл из 10~7, что соответствует 100, 50 и 10м к Результаты исследования представлены в таблице 10
Как видно из данных таблицы 10, экспериментальная среда не уступала контрольной, не содержащей селективных компонентов, по количеству колоний, сформированных на чашке через (18+2) ч инкубации посевов, а также обладала высокой чувствительностью(10"7), поскольку позволяла обнаружить рост колоний при посеве единичных микробных клеток Через (18+2) ч инкубации при температуре (37+1)°С из 10м к. вырастало <5±2 колоний, из 100 посеянных микробных клеток вырастало в среднем 42±6 бесцветных, прозрачных, круглых колоний, диаметром 0,8±0,2мм При определении морфологии листерий в мазках отмечались типичные характерные мелкие грамположительные палочки Жизнеспособность выращенных на среде выделения культур листерий составила 41,9+0,8 %
Определение чувствительности селективной среды для выделения листерий
Наименование тест-штаммов Экспериментальная среда Контрольная среда (TSA)
разведение культуры разведение культуры
106 107 10 6 107
количество микроорганизмов, (КОЕ) количество микроорганизмов, (КОЕ)
0,1 мл 0,5 мл 0,1 мл 0,1 мл 0,5 мл 0,1 мл
100 м к 50 м к 10 м к 100 м к 50 м к 10 м к
М±т М±т М±т М±т М±т М±т
L monocytogenes 56 40±4 18+3 3±1 38±5 19+3 4+2
L monocytogenes NCTC 5214 (4а) 38+3 16±2 3±1 45±5 17+3 4±2
L monocytogenes NCTC 10527 (4в) 44+2 20±3 4±2 37±3 15±4 5±2
L monocytogenes 21 41+4 18±2 3±1 42±3 15±3 3±1
L monocytogenes EGD 45±2 15±4 5+2 41+3 13+1 4±2
L monocytogenes NCTC5348 44±4 17±3 5+2 37+4 17+3 5±2
L monocytogenes NCTC 55143 46±2 18+3 4±1 43±4 15±4 5±2
L monocytogenes 12 41±2 16+3 4±2 41±4 12±2 3+1
L monocytogenes 138 37±4 19±3 5±1 37±3 21±5 4±2
L monocytogenes Костюченко 43±5 18±4 3±1 43±4 14±3 4+2
L monocytogenes 616 42+2 15+3 4±1 36±3 18±4 3+1
L monocytogenes Нелюбова 39±2 19+3 4±1 35+5 12+2 3±1
L monocytogenes УСХИ-1 37±2 18+5 3±1 41±2 20±3 4±2
L monocytogenes УСХИ-1 45±2 16+3 3±1 43±4 19±4 3+1
В работе установлено, что экспериментальная среда позволяла обнаружить рост всех видов листерий через (18±2) ч инкубации и полностью подавляла рост сопутствующей флоры, в то время как на контрольной среде (ТБА) ассоцианты вырастали сплошным газоном, что не позволяло выделить искомый микроорганизм в случае посева контаминированного материала (табл 11)
Характеристика селективных свойств среды для выделения листерий
Тест-штаммы Посевная доза 1 мл Экспериментальная среда Контрольная среда (TSA)
время инкубации, ч размер колоний, (d) мм количество колоний (КОЕ), М±т время инкубации, ч размер колоний, (<1) мм кол-во колоний (КОЕ), М±т
L monocytogenes NCTC10527 (4в) 106 18±2 0,6±0,2 34±2 18+2 0,9±0,2 32±4
L monocytogenes NCTC 5214 (4а) 10б 18+2 0,7±0,2 38+2 18±2 1,0±0,2 21±3
L. monocytogenes 56 106 18±2 0,7±0,2 31+4 18+2 1,0±0,2 31±4
L monocytogenes 21 106 18±2 0,7+0,2 33±2 18+2 0,8±0,2 31±6
L innocua SLCC 3723 106 18+2 0,5±0,1 36±3 18+2 1,1+0,2 27+4
L seeligeri SLCC 18/100 106 18±2 0,6±0,2 29±1 18±2 0,9±0,1 20+3
L ivanovu 19119 106 18±2 0,7±0,2 35±3 18+2 0,8+0,1 25+3
L welshimeri 3587 106 18+2 0,5±0,2 38±2 18+2 1,0±0,2 19±2
L grayi 437 106 18±2 0,6+0,1 30±2 18+2 1,2±0,2 23±3
S aureus «Виотко» 10' 18±2 нет роста нет роста 18+2 сплошной газон сплошной газон
S aureus FDA 209-P 101 18+2 -II- -II- 18+2 сплошной газон сплошной газон
E coh Su 3912/41 (OSS K59) 102 18±2 -II- -II- 18±2 сплошной газон сплошной газон
E coh ATCC 25922 102 18+2 -II- -II- 18±2 сплошной газон сплошной газон
E coh 168/59 102 18±2 -II- 18±2 сплошной газон сплошной газон
P vulgaris HX19222 106 18±2 -II- -II- 18±2 сплошной газон сплошной газон
P mirabilis «Сиднее» 71/2 106 18±2 -II- -II- 18±2 сплошной газон сплошной газон
Изучение показателя эффективности экспериментальной среды для выделения проводили на расширенном наборе штаммов L monocytogenes (табл 12)
Как видно из данных таблицы 12, количество листерий, выросших на питательной среде для выделения, составил в среднем (1,9±0,1)х109 мк/мл Отдельные штаммы росли лучше (максимум 3,1х109 м к /мл), другие хуже (1,4х109 м к /мл)
Ростовые свойства разработанной среды для выделения и культивирования листерий
Название штаммов Посевная Количество листерий,
доза, м к /мл выросших через (18±2) ч инкубации в мл
Listeria monocytogenes 1196 50 млн 1,8 млрд
Listeria monocytogenes АИФ 1,7 млрд
Listeria monocytogenes A-ucx -11- 1,7 млрд
Listeria monocytogenes 546 -II- 1,5 млрд
Listeria monocytogenes сер 34 -II- 1,7 млрд
Listeria monocytogenes 61/18 -II- 2,1 млрд
Listeria monocytogenes 77 -11- 3,1 млрд
Listeria monocytogenes сер I -II- 2,3 млрд
Listeria monocytogenes 56 -II- 1,9 млрд
Listeria monocytogenes 4a -II- 1,5 млрд
Listeria monocytogenes УСХИ-52 -II- 1,6 млрд
Listeria monocytogenes сер III -II- 1,6 млрд
Listeria monocytogenes сер II -II- 1,4 млрд
Listeria monocytogenes Тернополь -II- 2,4 млрд
Listeria monocytogenes УСХИ-19 -II- 1,5 млрд
Listeria monocytogenes произв -II- 1,7 млрд
Listeria monocytogenes x2 2,4 млрд
Listeria monocytogenes Бурынь 2,1 млрд
Listeria monocytogenes 944 -II- 2,5 млрд
Listeria monocytogenes 4e -II- 1,8 млрд
M±m 1,9±0,1 млрд /мл
Задачей следующего этапа исследований явилась разработка питательной среды с теллуритом калия для первичной идентификации листерий, позволяющая по цвету колоний отличить рост листерий от микробов-ассоциантов На разработанной среде Listeria spp редуцируют теллурит калия до металлического теллура и образуют мелкие колонии черного цвета
Известно, что теллурит калия, подавляя рост микробов ассоци-антов, частично угнетает рост листерий, ингибируя восстановление поврежденных теплом клеток L monocytogenes,
Это выражается в уменьшении размеров колоний до точечных и появлении атипичных форм (до 25%) В связи с этим возникла необходимость изменения количества питательной основы (СПА до 40,0
г/л), ростовых факторов (ЭКД до 5,0 г/л) и селективных агентов, в том числе теллурита калия из расчета 10 мл на 1л готовой среды
Таким образом, питательная среда для первичной идентификации листерий (теллурит-агар), обеспечивает четкую индикацию роста листерий через (18±2) ч роста из разведения 10~б при полной ингиби-ции микробов ассоциантов, в то время как на традиционно используемой для этих целей среде лабораторного приготовления результаты можно учитывать только через 46±2 ч (табл 13)
Таблица 13
Изучение ростовых и ингибирующих свойств образцов сред для первичной идентификации листерий
Тест-штаммы Посевная доза Экспериментальный образец Контрольная среда Бакулова И А лабораторного приготовления
размер, с! мм, цвет колоний время инкубации ч размер, с1 мм, цвет колоний время инкуб,ч
L. monocytogenes 56 ОД мл КГ6 0,8±0,2 черный 18±2 0,5+0,2 черный 46±2
L monocytogenes NCTC 5214 (4а) ОД мл 10"6 0,8±0,2 черный 18+2 0,5±0,2 черный 46+2
L. innocua SLCC 3379 ОД мл 10"6 0,8±0,2 черный 18+2 0,5+0,2 черный 46+2
L ivanovn 19119 ОД мл Ю-6 0,8+0,2 черный 18+2 0,5±0,2 черный 46+2
E coli 3912/41 (055-.K59) ОД мл ю-2 нет роста 18+2 газон 46±2
S aureus №25923 ОД мл Ю-1 нет роста 18+2 газон 46±2
Известно, что для идентификации листерий используют дополнительные методы, в частности, тесты определения подвижности и лецитиназной активности листерий
Разработанные нами для этих целей сухие дифференциально-диагностические питательные среды для определения подвижности и лецитиназной активности листерий были испытаны на широком наборе музейных штаммов в сравнении с известными препаратами отечественных и зарубежных фирм (табл 14)
Таблица 14
Определение подвижности свежевыделенных штаммов L. monocytogenes на экспериментальной среде и среде сравнения
Клинические штаммы L monocytogenes Визуальная характеристика роста Экспериментальная среда (18±2) ч Контрольная среда (HiMedia Motility medium)
(18±2) ч (36±2) ч
температура инкубации температура инкубации температура инкубации
(23±1)°С (37±1)°С (23±1)°С (37±1)иС (23±1)иС (37±1)°С
401JI рост по ходу укола в виде зонтика ++ ± ++
402Л -II- ++ - ± - ++ -
403JI -II- ++ - + - ++ -
404JI -II- ++ - ± - ++ -
405Л -II- ++ - ± - ++ -
2Э -II- ++ - ± - ++ -
5Э -II- ++ - ± - ++ -
1109 -II- ++ - ± - ++ -
1113 -II- ++ - + - ++ -
121У -II- ++ - + - ++ -
1183 -II- ++ - ± - ++ -
322JI -II- ++ - ± - ++ -
323JI -II- ++ - ± - ++ -
324Л -II- ++ - ± - ++ -
325Л -II- ++ - ± - ++ -
326Л -II- ++ - ± - ++ -
327Л -II- ++ - ± - ++ -
328Л -II- ++ - ± - ++ -
329Л -II- ++ - ± - ++ -
ЗЗОЛ -II- ++ - ± - ++ -
331Л -II- ++ - ± - ++ -
332Л -II- ++ - ± - ++ -
ЗЗЗЛ -II- ++ - ± - ++ -
334Л -II- ++ - ± - ++ -
335Л -II- ++ - ± - ++ -
Обозначения
(++) - наличие четко выраженного роста по уколу в виде зонтика,
(-) - отсутствие роста,
(±) - рост по уколу сомнительный
Как видно из таблицы 14, все испытанные штаммы обладали подвижностью при росте на разработанной среде при температуре (23+1 ) С черс1 (18±2) ч культивирования, тогда как на контрольной среде ¡визуальная регистрация подвижности листерий отмечалась только через (36±2) ч культивирования.
Испытания среды для определения лецитиназной активности L. monocytogenes в сравнении с отечественной средой Г I'M-1 (ГИЦ г. Оболенск) показали преимущество предлагаемого препарата но времени Проявления лецитиназной активности (появления зон помутнения среды вокруг роста колоний). Па испытуемой среде учет результатов был возможен через (18±2) ч, в то время как на среде сравнения не ранее, чем 36-48ч. Па наш взгляд, преимущество разработанной нами среды для определения лецитиназной активности перед аналогичной отечественной средой объясняется тем, что используемое нами сырье (каспийская килька) превосходит по ростовым свойствам рыбную муку, применяемую при изготовлении среды ГРМ-1 (рис.5, табл. 15),
Зоны проявления Экспертной I ал i, на я Контрольная
активности, мги 18-20 ч 36-48 ч
РИС. 5. Лйдатиназная активность тсст-штамма L, monocytogenes 4я я процессе культивирования и разработанной и контрольной средах с различным содержанием акти-пиронаииого угля: 0%, 0,4%, 0,_<i%. 0.6%.
Таблица 15
Сравнительное изучение лецитиназной активности L. monocytogenes на различных питательных средах
Исследованные штаммы Предлагаемая среда Среда ГРМ №1
с активиро- без активи- с активиро- без активи-
ванным рованного ванным рованного
углем 0,6% угля углем 0,5% угля
L monocytogenes NCTC 5214 +++ - ++ -
L monocytogenes NCTC 10527 +++ - ++ -
L monocytogenes213 +++ - ++ -
L monocytogenes 7973 +++ - ++ -
L monocytogenes 21 +++ - ++ -
L monocytogenes 56 +++ - ++ -
L monocytogenes 138 +++ - ++ -
L monocytogenes 5348 +++ - ++ -
L monocytogenes 55143 +++ - ++ -
L monocytogenes 5214 +++ - ++ -
L monocytogenes 10527 +++ - ++ -
L monocytogenes 616 +++ - ++ -
L monocytogenes EGD +++ - ++ -
L monocytogenes 61/18 +++ - ++ -
L monocytogenes 77 +++ - ++ -
L monocytogenes сер I +++ - ++ -
L monocytogenes УСХИ-52 +++ - ++ -
L monocytogenes сер III +++ - ++ -
L monocytogenes сер II +++ - ++ -
L monocytogenes Тернополь +++ - ++ -
L monocytogenes УСХИ-19 +++ - ++ -
L monocytogenes Бурынь +++ - ++ -
L monocytogenes 944 +++ - ++ -
L. monocytogenes УСХИ-1 +++ - ++ -
L monocytogenes УСХИ-7 +++ - ++ -
Время инкубации 18±2 ч 18±2ч 36-48 ч 36-48 ч
Обозначения (+) - зона помутнения среды шириной 1-2 мм (++) - зона помутнения среды шириной 2-4 мм (+++) - зона помутнения среды шириной 5-7 мм (-) - отсутствие зоны помутнения на среде
Известно, что наиболее трудоемким этапом бактериологической диагностики является идентификация микроорганизмов до вида, предусматривающая изучение биохимических свойств выделенной культуры с помощью набора дифференцирующих сред и реактивов Традиционно для этой цели используют среды Гисса
Отечественные микротест-системы для ускоренного определения биохимических свойств листерий до последнего времени отсутствуют, а зарубежные тест-системы, выпускаемые различными фирмами, малодоступны для практического здравоохранения
Предпринятые в этой связи разработки микротест-системы для ускоренной идентификации листерий по 5 и 12-ти основным биохимическим тестам определили оптимальный состав субстратно-индикаторной среды для ячейки микроконтейнера и необходимую микробную дозу (200 млн м к ), вносимую в ячейку Это в совокупности позволило создать микротест-систему для листерий (варианты МТС-5Л, МТС-12Л), превосходящую традиционные среды Гисса по срокам проявления ферментации субстратов — 6 часов против 24 часов
В течение этого времени в случае утилизации субстрата исследуемой культурой накапливаются продукты, сдвигающие рН к кислотным значениям, что проявлялось изменением цвета среды (положительная реакция) Если субстрат не утилизировался, цвет среды оставался первоначальным (отрицательная реакция). Состав и ферментация субстратов в МТС-Л приведены в таблицах 16,17
Состав сред с различными субстратами для биохимической идентификации листерий
Ингредиенты сред в ячейке микроконтейнера (в г из расчета на 30 мл среды) Субстраты среды
Глюкоза Маннит Рамноза Ксилоза Манноза Рибоза Галактоза Лактоза Арабиноза Сорбит Крахмал Эскулин
Среда для накопления листерий 1,2 1,2 1,2 1.2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2
Феноловый красный 0,0035 0,0035 0,0035 0,0035 0,0035 0,0035 0,0035 0,0035 0,0035 0,0035 0,0035 0,0035
Трис-буфер 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14
Поливиниловый спирт 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35
Глюкоза 1,4 - - - - - - - - - - -
Маннит - 1,4 - - - - - - - - - -
Рамноза - - 1,4 - - - - - - - - -
Ксилоза - - - 1,4 - - - - - - - -
Манноза - - - - 1,4 - - - - - - -
Рибоза - - - - - 1,4 - - - - - -
Галактоза - - - - - - 1,4 - - - - -
Лактоза - - - - - - - 1,4 - - - -
Арабиноза - - - - - - - - 1,4 - - -
Сорбит - - - - - - - - - 1,4 - -
Крахмал - - - - - - - - - - 1,4 -
Эскулин - - - - - - - - - - - 1,4
Ферментация субстратов листериями разных видов при посевной дозе 200 млн м кл.
Субстрат Тест-штаммы листерий
Ь топосуШ^епев 56 | Ь «ее1щеп 18/100 | Ь гапоуи 19119 | Ь тпосиа3379 | Ь «»екИнпеп 3587 | Ь йгау1473
Время инкубации при температу] ре(37±1)°С,ч
3 6 18 3 6 18 3 6 18 3 6 18 3 6 18 3 6 18
Маннит ± + +
Манноза - + + - - - - - - + + + + + + - - -
Ксилоза - - - - + + - + + - - - - + + - - -
Рамноза - + +
Рибоза - - - - - - - + + - - - - - - - + +
Галактоза + +
Лактоза + +
Крахмал + +
Глюкоза - + + - + + - + + ± + + + + + ± + +
Арабиноза - - - - + + - + + - - - - + + - - -
Сорбит
Эскулин - + + - + + - + + - + + - + + - + +
Обозначения
(+, ±, ±) - наличие ферментации (-) - отсутствие ферментации Вероятность достоверности [Р] [+, -] - 0 исключений Р > 98% [±] -1 исключение Р > 95%
Для ускорения учета результатов биохимической идентификации листерий, предложен «Цветовой указатель» (табл 18), а с целью автоматизированного учета предложена компьютерная программа «Микротест-система» Дискета с этой программой входит в состав инструкции по практическому применению MTC-12JI
Разработанная микротест-система апробирована на широком наборе музейных (26) и свежевыделенных штаммов (320) Процент совпадений определения биохимических свойств листерий с помощью MTC-5JI и средами Гисса составил 98±2% (табл 19)
МТС-Л имеет преимущество перед средами Гисса не только по срокам выявления ферментативных свойств листерий, но и по простоте проведения опыта
На разработанные питательные среды и микротест-систему подготовлена нормативная документация Экспериментальные серии сухих питательных сред приготовлены по традиционной технологической схеме, включающей процесс смешивания в шаровой мельнице-смесителе в оптимальных концентрациях питательных основ и ингредиентов (рис 6) В отличие от зарубежных аналогов селективные агенты, входящие в состав разработанных сред, вносятся в мельницу- смеситель одновременно со всеми компонентами среды Это позволит получить готовый к применению препарат, исключающий необходимость внесения этих ингредиентов ex tempore
На этапе бактериологического контроля готовых сухих препаратов нами внесены некоторые изменения, касающиеся используемых штаммов Рекомендовано при контроле производственных серий использовать штаммы, наиболее часто циркулирующие на территории России
Биохимическая идентификация листерий (МТС-12Л) -цветовой указатель-
№ пп Тесты утилизации Ь.топо- су(^епе8 Ь.$ее%еп Ьлуапоун Ьлппосиа ЬлуекЫ-теп
1 Маннита • • • • • + ©
2 Маннозы + © • • + © + © •
3 Ксилозы • + ® + © • + © •
4 Рамнозы ® • • • • •
5 Рибозы • • © • • ©
6 Галактозы • • • • • + О
7 Лактозы • • • • • + ©
8 Крахмала • • • • • + ®
9 Глюкозы + © + © + © + ® + ® + ©
10 Арабинозы • + © + ® • + © •
11 Сорбита • • • • • •
12 Гидролиз эскулина + © + © + ® + ® + О + ©
Примечание (+)- положительная реакция (изменение цвета субстрата из красного в желтый) (-) - отрицательная реакция (цвет - красный)
Разработанные питательные среды и микротест-система апробированы на клиническом материале при акушерско-гинекологической патологии, так как наибольшую опасность листериозная инфекция представляет для беременных женщин и новорожденных Мазки и со-скобы из цервикального канала изучали бактериологическим и серологическим методами, а также проводили ПЦР-диагностику
Частота совпадения результатов определения биохимических свойств листерий при помощи МТС- 5 Л и сред Гисса
Кол-во штаммов Совпаде-ния.% Маннит Манноза Ксилоза Рамноза А рабиноза
6ч 18ч К (18 ч) 6ч 18 ч К (18 ч) 6ч 18ч к (18 ч) 6ч 18ч К (18 ч) 6ч 18 ч К 08 ч)
Ь топосуи^епев 258 число, % 258 100 258 100 258 100 258 100 258 100 258 100 249 97 249 97 259 99 258 100 258 100 258 100 258 100 258 100 258 100
Ь 1Уапо\'11 21 число, % 21 100 21 100 21 100 21 100 21 100 21 100 21 100 21 100 21 100 21 100 21 100 21 100 21 100 21 100 21 100
Ь $ее1щеп 2 число, % 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
1 тпосиа 18 число, % 18 100 18 100 18 100 18 100 18 100 18 100 17 95 17 95 18 100 18 100 18 100 18 100 18 100 18 100 18 100
Ь welshlmeп 13 число, % 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100 13 100
1 ягау! 14 число, % 14 100 14 100 14 100 14 100 14 100 14 100 14 100 14 100 14 100 14 100 14 100 14 100 14 100 14 100 14 100
К - контрольная среда (жидкая среда с феноловым красным и соответствующим углеводом среды Гисса)
РИС.6.Технологическая схема производства сухих питательных сред для накопления, выделения и идентификации листерий
Обозначения ПР-подготовительные работы
СТП-стадии технологического процесса ТП-технологический процесс
Обследованы (152 беременные женщины, активного репродуктивного возраста (20-35 лет). Из них у 60% диагностировано вторичное бесплодие с привычными выкидышами (58 %) и мертиорождаемо-стьго (42%). У 40% женщин установлены диагнозы: эрозия шейки матки (46%), кольпиты (19%), эндометриты (15 %), вагиниты (7%) и вагинальный кандидоз (13%), У всех женщин данной группы в акушерском анамнезе отмечено невынашивание беременности.
При наличии в исследуемом материале искомого возбудителя па селективной среде для накопления лиетсрий наблюдали помутнение бульона, па среде для выделен ля листерий отмечали рост мелких бесцветных колоний, блестящих, голубоватых при исследовании в косо-проходящем светс (рис.7). На среде для первичной идентификации через (18±2)ч выявлен рост колоний черного цвета, блестящих, влажных в Э-форме, (!=1,0±0,2мм (рис.8).
РИС.7, Рост штамма пюпскуго$епех на среде для выделения листерий.
РИС.8, ['ост штамма /,. monocytogenes на среде для первичной идентификации листерий,
От обследованного контингента женщин выделено 112 культур рода Listeria (17,2%). Из них идентифицированы до вида L,monocytogenes - 24 (21,4^) штамма, остальные культуры отнесены к: Lseeligeri-28 (25%), Livanovii-П (0,9%), Listeria spp.- 49 (43,7%) (рис,9). Среди 24 положительных находок в 14 случаях установлен диагноз «мертворождасмос! ь», а в 10 случаях диагноз «невынашивание», lice женщины имели в анамнезе 2 и более выкидыша при большом сроке беременности (21-25 недель).
Выделенные культуры были типированы л РА на стекле с м о по-специфически ми агглютинирующими сыворотками. Выделенные штаммы ¡^monocytogenes (24 культуры) были отнесены к сероварам: 4в, I/2а и 1/2с. Наиболее часто выявлены штаммы серовара 4в (5йЗ%), в меньшей степени встречались культуры серовара 1/2а (33,3%), реже всего о б наружи в ал и штаммы серовара 1/2с (8,3%).
Сыворотки крови 112 женщин с осложненным акушсрско-гинекологическим анамнезом, от которых выделены культуры рода Listeria, исследовали в РИГА с листериозным эритроцитарным диагностику мом на наличие антител к L.monocytogenes. Серопозитивпо (титр 1:320 и выше) реагировала 21 сыворотка (18,7 %); сомнительные результаты (титр !:80 и 1:160) получены при исследовании 3-х сывороток (2,7 %); в 31 образце (21.1%) выявлены титры ниже диагностических (ниже 1:80), в 57 сыворотках (50,9%), реакция была отрицательной.
лнстерии
17,20%
бактерии 82,80%
L. ivanovii 0,90%
L. monocytogenes 21,4%
«в
L. seeligeri 25%
РИС. Распределение бактерий рола Listeria и патогенного вида ^monocytogenes среди аыдеденных микроорганизмов.
Принадлежность 24 изолятов к виду L. monocytogenes подтверждена в поли мер аз ной ценной реакции (ПЦР) с вндоспециф и ч ее ким и праймерами, направляющими амплификацию консервативного фрагмента ДНК L. monocytogenes гена fufA в амнлификаторе Терцик (ДНК-технология). Все штаммы L monocytogenes давали положительный результат в ПЦР. Лнстерии, принадлежащие другим видам, в ПЦР давали отрицательный результат (рис. 10),
Listeria spp. 43.70%
+ - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1» 11 12 U 14 15 1617
РИС. 10. Фотоснимок агарозного геля с результатами III [!' НО амплификации специфических фрагментов ДНК Ьтопосу^епех -КПОЛожительный контрольный образец; -отрицательный конт рольный образец; 1.23.4,5,6,8,9,10,11.12,14.! 5.16,17 - отрицательные клинические образцы 7,1? - положительный клинический образец
Полученные сравнительные результаты по использованию различных методов при диагностике лиетериозной инфекции представлены в таблице 20, при этом процент совпадений всех трех методов составил от 98 до 100% .
Суммируя результаты проведенных исследований и учитывая, что, как правило, сопутствующая микрофлора при акушереко-гинекологических инфекциях представлена бактериями семейства Еп-terobacteriaceae (E.coli, Klebsiella spp, Proteus spp. и др.), а также Candida albicans, предлагается схсма бактериологического исследования клинического материала на листериоз с использованием разработанного нами комплекса питательных сред и микротест-системы с одновременным включением известных коммерческих сред Эпло, Левина, кандида-агар, ЖСА (желточно-солевой агар), кровяной агар для выделения энтеробактерий и кокков (рис.! 1).
На модели штаммов 56, 7973 и 4в проведены исследования сохранения стабильности биологических свойств L.monocytogenes.
Исследования показали, что все штаммы, выращенные на предлагаемых селективных средах для выделения и накопления листерий, сохраняют свои характерные ку льту рал ьно-м о рфол о г и чес кие свойства: грамположительные мелкие палочки, неподвижные при инкубации в температурном режиме 37°С, но подвижные при 23°С.
Культуры, выращенные на разработанных средах, и обладающие ß-гемолитической активностью - L.monocylogenes, L.ivunovii, после 2448ч инкубирования при (37±i)nC образовывали характерные узкие зоны гемолиза в отличие от штамма L.innocua, не продуцирующего фермент гемолизин.
Сохранение вирулентных свойств L monocytogenes, выращенных на разработанных средах, также изучали путем внутрибрюшинного и внутривенного заражения мышей этими штаммами Экспериментально показано, что независимо от среды выращивания тест-штамма, используемого для заражения животных, динамика их гибели по дням была идентичной Так, LD-50 для штамма L monocytogenes 7973 при внутрибрюшном заражении с применением среды для накопления составляла - 3,2 10б±0,1м к, с использованием среды для выделения -2,4 10б±0,1м к, а с TSA - 3,0 10б±0,1м к При внутривенном инфицировании мышей эти величины составляли соответственно 4,0 105±0,1м к., 3,5 105±0,1м к, 3,0-105±0,1м к
Испытуемые тест-штаммы, выращенные на разработанных средах, в кератоконъюнктивальной пробе на морских свинках были вирулентны. У животных через 24-48 ч развивался листериозный керато-конъюнктивит Из гнойного отделяемого кератоконъюнктивального мешка высевали типичную, идентичную исходной, культуру L monocytogenes 7973
Изучение плазмидного профиля клинического изолята L monocytogenes 204 в сравнении с бесплазмидными культурами лис-терий штаммов 7973 и 4в показало, что при сравнительном анализе образцов ДНК с помощью электрофореза в 0,7% агарозном геле у изолята 204, выращенного на разработанной среде накопления и в TSB, выявлено стабильное сохранение плазмиды с молекулярной массой 30 МД Штаммы 7973 и 4в не содержали плазмидной ДНК
По результатам изучения влияния составов разработанных сред на свойства листерий, можно сделать вывод, что среды для накопления, выделения и идентификации обеспечивают стабильное сохранение их основных биологических свойств, включая генетические характеристики (плазмидный профиль) изучаемых культур
Таким образом, впервые в России разработаны рецептурные составы и технологии промышленного изготовления питательных сред и микротест-систем для накопления, выделения и идентификации листерий
Таблица 20
Характеристика клинических штаммов L monocytogenes, выделенных от женщин с отягощенным акушерским анамнезом, %
\Диагносгические Микро- Ката- Подвижность при Гемоли- САМР-тест Ферментативные свойства ПЦР РИГА
исследования скопия (по лаза, температуре тические исследо- исследо-
\ Граму), морфология колоний % (23±1)°С (37±1)°С св-ва, % вания (совпадения) % вания (совпадения) %
Вьщеленные N. S aureus Hequi ман-нит рам-ноза араби-ноза ксилоза
культуры N.
L monocytogenes п=24 мелкие грам- 100 99 0 98 98 0 0 100 0 0 100 98
ПОЛОЖИ- <+) <-) jS-гемо- (усиле- (-) (-) (+) <-> <-> (+) (+)
тельные лиз ние зоны
папочки, (+) гемоли-
колонии за)
Э-формы (1=0,8±0,2 (+)
Исследуемый материал
¡иггибгкутнкограмма на среде для выделения J] истерий
РИС. 3 I. Схема выделения л истерии и ассоциантов из клинического материала
выводы
1 Впервые научно обоснована рецептура и разработана производственная технология получения отечественных сухих питательных сред для накопления, выделения и идентификации листерий Созданные среды обладают преимуществом перед традиционно используемыми средами по срокам выделения листерий при минимальном исходном содержании возбудителя в посевном материале Разработанные среды стандартны и обеспечивают стабильность биологических свойств листерий
2 Экспериментально доказана зависимость накопления листерий в среде на основе панкреатического гидролизата каспийской кильки от концентрации рост стимулирующих добавок - ЭКД и тиамин бромида в сочетании с глюкозой Выявлено, что содержание в среде оптимальных количеств этих компонентов- 2,0г/л -ЭКД, 0,003г/л -тиамин-бромида и 1,0г/л-глюкозы обеспечивает высокую эффективность накопления микроба и чувствительность среды
3 Установлено, что разработанная среда для накопления листерий обладает выраженным ингибирующим действием на рост микро-бов-ассоциантов Оптимальные селективные свойства в отношении широкого спектра микроорганизмов, при минимальном влиянии на рост и размножение листерий, достигнуты при внесении в среду 0,04 г/л - налидиксовой кислоты и 0,0125 г/л - акрифлавина
4 Разработан бульон для селективного обогащения листерий и обоснована целесообразность его использования при микробиологическом контроле пищевых продуктов на обсемененность листериями
5 Сконструирован теллурит-агар для первичной идентификации Listeria spp Среда по своим ингибирующим и ростовым свойствам превосходит традиционную среду лабораторного приготовления, сокращая сроки выявления листерий
6 Созданы дифференциально-диагностические среды для определения подвижности и лецитиназной активности, позволяющие подтвердить принадлежность выделенных из исследуемого материала возбудителей к Listeria spp. и ускорить сроки их идентификации
7 Впервые разработана и освоена в производстве отечественная микротест-система для ускоренной биохимической идентификации листерий (MTC-JI) по 5 и 12 информативным тестам
8 Установлена диагностическая ценность разработанных питательных сред и микротест-систем при бактериологическом исследовании клинического материала от больных с акушерско-гинекологической патологией и при микробиологическом контроле пищевых продуктов
9 Предложена схема бактериологического исследования на лис-териоз, позволяющая ускорить лабораторную диагностику с сокращением сроков установления диагноза на 18-20 ч
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Омарова С М , Меджидов Ш М , Ахмедова Э М , Тагирова Г М.
Питательная среда для диагностики листериоза Материалы научно-практической конференции, посвященной 75-летию Государственной Санитарно-эпидемиологической Службы «Региональные проблемы охраны окружающей среды и здоровья населения» - Махачкала, 1997, с 91-93
2. Омарова С М , Ахмедова Э М, Муртузалиева П М
Питательная среда для выделения листерий Материалы VII Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Москва, 1997, с 197
3. Меджидов М М , Аджиева А А , Омарова С М
Клинические испытания новых препаратов для диагностики инфекционных заболеваний Вестник ДНЦ РАН - Махачкала, 1998, с 117
4. Омарова С М , Ахмедова Э М , Тагирова Г М.
Характеристика сред для накопления и выделения листерий Материалы Международной научной конференции «Разработки и производство диагностических питательных сред и микротест-систем» -Махачкала, 1998, с 136
5. Омарова С М, Меджидов Ш М.
К вопросу разработки микротест-систем для биохимической идентификации листерий Материалы Международной научной конференции «Разработка и производство диагностических питательных сред и микротест-систем» - Махачкала, 1998, с. 147
6. Омарова С.М , Меджидов Ш М , Ахмедова Э М
Сухие питательные среды для диагностики листериоза Материалы 2-й Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» -Санкт-Петербург, 1998, с 43
7. Омарова С М , Меджидов Ш.М
Изучение эффективности использования микротест-системы для биохимической идентификации листерий MTC-J1 Материалы VI Российского национального конгресса «Человек и лекарство» Москва, 1999, с 313
8. Омарова С М, Меджидов Ш М , Тагирова Г М Питательные среды для выделения и накопления листерий
Журн микробиол , 2000, 1 45-48
9. Омарова С М, Ахмедова Э М , Тагирова Г М.
Питательная среда для идентификации листерий Материалы 3-ей международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических сухих питательных сред и микротест-систем» - Махачкала, 2001, с 43
10. Омарова С М , Меджидов Ш М , Абдуллаева М А , Муртуза-лиева П М , Тагирова Г М., Загирова Ш.М
Разработка питательных сред и микротест-систем для лабораторной диагностики листериоза Материалы 3-ей Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и микротест-систем» Махачкала, 2001, с 44
11. Омарова С М, Меджидов Ш М.,Ахмедова Э.М , Тагирова Г М О возможности использования среды выделения для определения
антибиотикочувствительности и фаголизабельности штаммов L monocytogenes Материалы IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство» - Москва, 2002, с 271
12. Омарова С М , Ахмедова Э М , Меджидов Ш М Современные подходы к идентификации листерий Материалы
VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 2002, с 215
13. Омарова С М , Меджидов Ш М
Совершенствование методов обнаружения листерий в пищевых продуктах Материалы 4-й Международной научно-практической конференции «Разработки и стандартизация микробиологических питательных сред и микротест-систем». - Махачкала, 2003, с 74
14. Омарова С М , Ахмедова Э М., Тагирова Г М, Халикова 3 М Бактериологическая характеристика урогенитальных микстинфек-
ций Материалы Международного конгресса «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней-прогресс и проблемы» -Санкт-Петербург,2003, с 89
15. Меджидова А А , Омарова С М , Меджидов М М , Алиева С С
Выявление количественного состава ассоциаций хламидий при
смешанных урогенитальных инфекциях Материалы Международного конгресса «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» - Санкт-Петербург, 2003, с 88
16. Омарова С М , Меджидов Ш М
Комплекс отечественных питательных сред и микротест-систем для диагностики листериоза Материалы научно-практической конференции с международным участием «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» - Москва, 2004, с 112
17. Омарова С М, Меджидов Ш М
Микротест-системы для биохимической идентификации листерий Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», посвященной 100-летию со дня основания Томского НПО «Ви-рион» - Томск, 2004, с 174-175
18. Сулейманова И Г, Меджидова А А., Омарова С М, Меджидов М М, Акаева Ф С , Алиева С.С
Выявление количественного состава ассоциаций хламидий при смешанной урогенитальной инфекции Материалы Российского конгресса «Генитальные инфекции и патология шейки матки», Москва,
2004, с 77
19. Султанов 3 3 , Степанова Э Д, Кулакова Л С , Омарова С М,Горелова В Г , Рамазанова Н.Р , Гаджиев С М
Разработка и оценка диагностической ценности питательной среды для накопления и выделения гемокультуры Журн микробиол,
2005, 3 19-22
20. Меджидов М М , Меджидов Ш М , Омарова С М
Кн. «Микротест-системы в лабораторной диагностике инфекционных болезней» Москва, ОАО «Издательство " Медицина"», 2006, 72 с
21. Омарова С М
Влияние культивирования в средах накопления и выделения листерий на характеристику плазмидного состава L monocytogenes Материалы XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» - Москва, 2006, с 236
22. Омарова С М
Современные подходы к диагностике листериоза Материалы XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» - Москва, 2006, с 236
23. Горелова В Г , Меджидов М М, Омарова С М , Султанов 3 3 , Степанова Э Д
Клинические испытания опытного образца коммерческой двухфазной питательной среды для выделения гемокультуры Ж Клиническая лабораторная диагностика, 2006, № 2, с 38-40
24. Меджидов М М, Степанова Э Д., Султанов 3 3 , Омарова С М.
Новые питательные среды в бактериологической диагностике бактериемии и сепсиса. Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология, 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» Москва, 2006, с 64
25,Омарова С М , Меджидов Ш.М , Ахмедова Э М
Изучение свойств питательного бульона для предварительного обогащения листерий Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология, 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» Москва, 2006, с 74
26. Омарова С М , Меджидов Ш М, Ахмедова Э.М, Муртузалие-ва П М, Тагирова Г М
Определение лецитиназной активности листерий с использованием новой питательной среды Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология, 2006 Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» Москва, 2006, с. 74
27. Омарова С М
Современные препараты для диагностики листериоза Материалы международной конференции Гоа, Индия, 1-11 марта, 2007 Ж " Успехи современного естествознания", 2007, №3, с 97-98
28. Омарова С М Кн. «Листериозная инфекция в патологии человека и методы микробиологической диагностики» Махачкала* Издательство ДНЦ РАН, 2007, 130 с
29. Омарова С М , Меджидов Ш М, Тагирова Г М
Питательная среда для накопления листерий Патент №2158758,
2000
30. Омарова С М , Меджидов Ш М, Ахмедова Э М
Питательная среда для идентификации листерий Патент
№2201957, 2001
Искреннюю благодарность автор выражает всем сотрудникам НПО «Питательные среды», принимавшим участие в выполнении настоящих исследований.
Сдано в набор 02 05 07 г Подписано в печать 03 05 07 г Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Печ л 3 Тираж 100 Заказ 41
Отпечатано в типографии ООО «А-4» Махачкала, ул Малыгина, 92
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Омарова, Салидат Магомедовна
ВВЕДЕНИЕ.
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛИСТЕРИОЗА
1.1. Роль листерий в инфекционной патологии человека.
1.2. Особенности биологических свойств листерий.
1.3. Современные методы микробиологической диагностики листериоза.
1.4. Питательные среды для культивирования листерий.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И МИКРОТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ, ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИСТЕРИЙ.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Материалы исследования.
2.1.1 .Штаммы микроорганизмов.
2.1.2.Питательные среды и реагенты.
2.1.3 .Лабораторные животные.
2.2. Методы исследования.
2.2.1.Физико-химические методы.
2.2.2.Биологические методы.
2.3.Методы статистической обработки материала.
3. РАЗРАБОТКА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛИСТЕРИЙ.
3.1. Изучение физико-химических и энергетических показателей культивирования L. monocytogenes.
3.2. Изучение различных гидролизатов как основы питательных сред для выделения, накопления и идентификации листерий.
3.3. Разработка рецептуры среды для накопления L. monocytogenes.
3.4. Разработка селективного питательного бульона для предварительного обогащения культур Listeria в пищевых продуктах.
3.5. Разработка селективной питательной среды для выделения и культивирования листерий (листерия-агар).
3.6. Разработка сухой питательной среды для первичной идентификации листерий (теллурит- агар).
3.7. Разработка дифференциалыю-диагностических питательных сред для изучения биологических свойств листерий.
3.7.1. Питательная среда для определения подвижности культур листерий.
3.7.2. Питательная среда для определения лецитиназной активности листерий.
4.0. РАЗРАБОТКА МИКРОТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ УСКОРЕННОЙ БИОХИМИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИСТЕРИЙ.
4.1. Разработка состава питательных сред для ячеек микро-контейнеров.
4.2. Подбор оптимальной микробной посевной дозы в ячейку микроконтейнера.
4.3. Изучение эффективности микротест-систем для биохимической идентификации листерий.
5.0. ПОЛУЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ СЕРИЙ РАЗРАБОТАННЫХ СУХИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И МИКРОТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ, ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИСТЕРИЙ.
5.1. Технологическая схема производства сухих питательных сред для листерий.
5.2. Технология изготовления МТС-Л для биохимической идентификации листерий.
5.3. Определение биохимических свойств листерий с использованием МТС-Л.
6.0.ИЗУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗРАБОТАННЫХ ПИТПТЕЛЬНЫХ СРЕД И МИКРОТЕСТ-СИТЕМЫ В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ МИКСТ-ИНФЕКЦИЙ У ЖЕНЩИН С
АКУШЕРСКО-ГИРНКОЛОГИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИЕЙ.
7.0. ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ L. monocytogenes, ВЫРАЩЕННЫХ НА РАЗРАБОТАННЫХ
СРЕДАХ.
ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка питательных сред и микротест-системы для накопления, выделения и идентификации листерий"
Актуальность проблемы. Несмотря на несомненные успехи, достигнутые в борьбе с инфекционными болезнями, значимость инфекционного фактора в патологии человека не только не снижается, но и проявляет тенденцию к нарастанию (63, 64, 65, 70, 71).
В связи с этим существенно расширились представления о роли инфекционных агентов в возникновении и развитии патологических процессов у человека. К числу вновь открытых в ушедшем ХХ-ом столетии инфекций с доказанной нозологической самостоятельностью относят листериоз, возбудитель которого широко распространен в природе и вызывает острое инфекционное заболевание людей и животных (2, 6, 84, 86, 91,92, 93).
Листериоз, не являлась широко распространенной инфекцией и уступая таким заболеваниям, как сальмонеллезы и кампилобактериозы по количеству выявленных случаев, значительно превосходит их по тяжести клинического течения и проценту летальных исходов. Из 2518 больных листериозом, выявленных в США в 1997г., в 20% случаев имел место летальный исход, а госпитализация требовалась в 92% случаев (Тартаковский И.С., 2000, Mead P.S. et all, 1999).
Листериоз у взрослых чаще всего протекает с симптомами менингита, менингоэнцефалита, сепсиса. Вместе с тем возрастает число случаев листериоза с необычными клиническими проявлениями, такими как: эндокардит, перитонит, холецистит, остеомиелит, абсцессы и др. Наибольшую опасность листериозная инфекция представляет для беременных и новорожденных, вызывая выкидыши, мертворождение, пороки развития плода, а также менингоэицефалиты, сепсис и пневмонии у новорожденных. Несмотря на своевременную аптибиотикотерапию, смертность при перинатальном и неонаталыюм листериозе достигает 30
50%, в том числе при внутриболышчных вспышках в роддомах (Тартаковский И.С., 2002г; Kaufmann S.H.E.,1993 г; Lorber В. 1997 г.)
В последние годы наблюдается рост числа случаев листериоза на фоне онкологических заболеваний, почечной и сердечной недостаточности, диабета, у лиц пожилого возраста, а также на фоне иммунодепресантной терапии, сопутствующих заболеваний, в том числе ВИЧ-инфекции. У этой группы пациентов листериоз встречается в 150-300 раз чаще, чем в общей популяции (84, 85, 86).
Разнообразные клинические проявления листериоза на фоне снижения клеточного иммунитета при лимфомах, СПИДе, беременности, иммуносупрессивной терапии наряду с экспериментальными данными подтверждают ведущую роль клеточного иммунитета в развитии листериозной инфекции (84,85,86).
В последние годы крупные вспышки листериоза с высоким процентом летальных исходов обусловлены потреблением пищевых продуктов, прежде всего, сыра, других молочных продуктов и салатов, мясных, куриных и рыбных изделий (84,85,86).
Начиная с 1992г. в Российской Федерации официалыю регистрируется заболеваемость листериозом. Количество положительных находок невелико (до 100 случаев ежегодно), что, вероятно, связано с отсутствием эффективной системы санитарно-эпидемиологического надзора за листериозом и неудовлетворительным качеством лабораторной диагностики.
Одним из важных этапов совершенствования санитарно-эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики листериоза в России являются разработка и промышленное производство отечественных селективных сред для накопления и выделения листерий, а также микротест-систем, необходимых для реализации современных схем выделения и экспресс-биохимической идентификации L.monocytogenes в соответствии с международными стандартами и регламентация общепринятых методов выделения и идентификации возбудителя соответствующими документами Минздравсоцразвития РФ (50,60,61,83,85,87,90,91,96,108,113).
Создание современной диагностической базы позволит осуществлять не только лабораторную диагностику листериоза среди больных, но и профилактику среди групп риска (беременных, новорожденных и лиц с нарушением иммунного статуса) (69, 86, 110, 160, 159).
Анализ различных методических подходов к диагностике листериоза выявляет ведущую роль бактериологических методов выделения и идентификации L.monocytogenes при создании новых селективных сред и микротест-систем, а также указывает на необходимость их быстрого внедрения в практику клинических лабораторий и центров санэпиднадзора.
В 2002г. утверждены методические указания, для организации контроля пищевых продуктов на наличие в них Listeria monocytogenes. Введение обязательных регламентированных требований санитарно-бактериологического контроля за обсемененностью пищевых продуктов патогенными штаммами листерий позволило обратить более пристальное внимание к проблеме листериоза и позволит получить реальную картину ситуации в целом по России.
Основные зарубежные фирмы производители питательных сред (фирмы «Oxoid», «BBL», «Merck», «bio Merieux», «HiMedia» и др.) выпускают сухие коммерческие селективные среды для выделения и накопления листерий. Однако использование этих сред в практических лабораториях нашей страны крайне ограничено по причине их высокой стоимости.
В настоящее время в арсенале лабораторной службы отсутствуют отечественные питательные среды для культивирования, выделения и идентификации патогенных листерий. Кроме того, не менее важно применение для экспресс-диагностики и биохимической идентификации листерий современных тест-систем, промышленное производство которых также отсутствует в нашей стране.
В связи с этим диссертационная работа посвящена решению ключевых вопросов микробиологической диагностики листериоза.
Цель исследования. Разработка питательных сред и микротест-системы для накопления, выделения и идентификации листерий.
Задачи исследования:
1. Экспериментально обосновать рецептуру питательной среды для накопления L.monocytogenes при выделении из клинического материала и состав селективного питательного бульона для предварительного обогащения культур Listeria при контроле пищевых продуктов.
2. Сконструировать агаризованные питательные среды для выделения, культивирования и идентификации листерий.
3. Разработать и апробировать в эксперименте и на клиническом материале микротест-систему для ускоренной биохимической идентификации листерий.
4. Отработать технологию производства питательных сред и микротест-системы для накопления, выделения и идентификации листерий.
5. Определить диагностическую ценность разработанных препаратов при бактериологическом исследовании клинического материала и контроле пищевых продуктов.
6. Предложить рациональную схему исследования клинического материала на листериоз.
Научная новизна. Впервые с учётом питательных потребностей возбудителя научно обоснованы рецептуры, экспериментально и клинически апробированы созданные на их основе отечественные питательные среды для накопления, выделения и идентификации листерий. Сконструированные среды обеспечивают высокий уровень накопления Listeria при их минимальных количествах в исследуемом клиническом материале, что позволяет существенно сократить сроки выявления возбудителя, а также провести идентификацию патогена по биохимическим тестам. Установлена диагностическая ценность созданных питательных сред для лабораторной диагностики листериозной инфекции. Приоритет разработанных питательных сред для накопления и первичной идентификации листерий подтвержден патентами (№2158758 от 10.11.ООг и № 2201957 от 04.05.01 г).
Впервые разработана отечественная микротест-система для ускоренной биохимической идентификации листерий (МТС-Л), позволяющая провести идентификацию листерий через 6 ч инкубации вместо 18 ч при использовании традиционных сред Гисса.
Экспериментально доказана стабильность сохранения биологических свойств листерий при культивировании на разработанных питательных средах с использованием расширенного набора музейных штаммов и свежевыделенных культур листерий из исследуемого материала различного происхождения.
Практическая значимость работы. Впервые в России на производстве филиала ФГУП НПО «Микрогеи» МЗ и СР РФ НПО «Питательные среды» разработаны и освоены питательные среды и микротест-система для накопления, выделения и идентификации листерий.
Питательная среда для накопления листерий, помимо, использования с целью выделения патогена из клинического материала, может применяться при получении биомассы листерий в экспериментальных исследованиях и на биотехнологических производствах.
Использование питательной среды для предварительного обогащения листерий при микробиологическом контроле пищевых продуктов позволит обеспечить эффективный эпидемиологический надзор за распространением листериоза, обусловленного инфицированными продуктами питания.
Применение разработанной среды для выделения листерий при определении чувствительности к антибактериальным препаратам сократит количество питательных сред, используемых в процессе диагностики.
Созданная микротест-система для биохимической идентификации листерий существенно ускорит сроки получения результатов бактериологических исследований в клинико-диагностических лабораториях.
Предложенная рациональная схема бактериологического исследования клинического материала на листериоз позволяет сократить сроки выделения и идентификации возбудителя с использованием сконструированных сред и микротест-системы.
На основании проведенных исследований разработана нормативно-техническая документация (НТД) для промышленного выпуска питательных сред и микротест-системы для накопления, выделения и идентификации листерий. По результатам исследований утверждены НТД: ФСП 42-0504-7919-06 и ПР №1241-02 «Сухая питательная среда для накопления листерий»; ФСП 42-0504-7918-06 и ПР №1309-03 «Сухая питательная среда для выделения и культивирования листерий».
Разработанные питательные среды и микротест-система апробированы в специализированных лабораториях ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва), РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов), ВГНИИ контроля и стандартизации ветеринарных препаратов (Москва), а также в клинических лабораториях ДНЦ РАН (Махачкала), родильных домов №1 и №2 (Махачкала). По результатам испытаний питательных сред и микротест-системы получены положительные заключения от этих учреждений о целесообразности их применения в диагностических целях.
Внедрение разработанных сред и микротест-системы в медицинскую практику позволит обеспечить лабораторную службу страны стандартными препаратами для бактериологического исследования клинического материала на листериоз и контроля пищевых продуктов на обсемененность листериями.
Методические приемы по биохимической идентификации листерий, разработанные в ходе исследований, вошли в учебное пособие для студентов медицинских вузов «Микротест-системы в лабораторной диагностике инфекционных болезней» (М.: «Медицина»,2006), рекомендованное Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России.
Основные положения, выносимые па защиту
1. Экспериментально обоснован состав и разработана технология получения сухих питательных сред для накопления, выделения и идентификации листерий.
2. Сконструирована и апробирована микротест-система MTC-JI для биохимической экспресс-идентификации листерий.
3. При бактериологическом исследовании клинического материала па листериоз и контроле пищевых продуктов на обсемененность культурами листерий доказана диагностическая эффективность разработанных препаратов.
4. Предложена рациональная схема бактериологического исследования на листериоз, позволяющая сократить сроки выделения и идентификации возбудителя.
Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции, посвященной 75-летию государственной санитарно-эпидемиологической службы «Региональные проблемы охраны окружающей среды и здоровья населения» (Махачкала, 1997г.); на VI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1999г.); на 3-й научно-практической конференции НПО «Питательные среды» МЗ РФ «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических сухих питательных сред и микротест-систем» (Махачкала, 2001 г.); на VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002г); на научно-практической конференции, посвященной 50-летию НПО «Питательные среды» МЗ РФ «Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем» (Махачкала, 2003г.); на XIИ Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006г.);
Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках НИР 01.99.0005312, 01.95.0003694, 01.98.0007058, отражено в 30 опубликованных работах.
Структура н объем диссертации. Диссертация изложена на 315 страницах и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 338 источников и приложения. Материалы исследований иллюстрированы 88 таблицами и 36 рисунками.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Омарова, Салидат Магомедовна
ВЫВОДЫ
1. Впервые научно обоснована рецептура и разработана производственная технология получения отечественных сухих питательных сред для накопления, выделения и идентификации листерий. Созданные среды обладают преимуществом перед традиционно используемыми средами по срокам выделения листерий при минимальном исходном содержании возбудителя в посевном материале. Разработанные среды стандартны и обеспечивают стабильность биологических свойств листерий.
2. Экспериментально доказана зависимость накопления листерий в среде на. основе панкреатического гидролизата каспийской кильки от концентрации ростстимулирующих добавок - ЭКД и тиамин бромида в сочетании с глюкозой. Выявлено, что содержание в среде оптимальных количеств этих компонентов- 2,0 г/л-ЭКД, 0,003г/л-тиамин-бромида и 1,0г/л-глюкозы обеспечивает высокую эффективность накопления микроба и чувствительность среды.
3. Установлено, что разработанная среда для накопления листерий обладает выраженным ингибирующим действием на рост микробов-ассоциантов. Оптимальные селективные свойства в отношении широкого спектра микроорганизмов, при минимальном влиянии на рост и размножение листерий, достигнуты при внесении в среду 0,04 г/л - налидиксовой кислоты и 0,0125 г/л - акрифлавина.
4. Разработан бульон для селективного обогащения листерий и обоснована целесообразность его использования при микробиологическом контроле пищевых продуктов на обсемененность листериями.
5. Сконструирован теллурит-агар для первичной идентификации Listeria spp. Среда по своим ингибирующим и ростовым свойствам превосходит традиционную среду лабораторного приготовления, сокращая сроки выявления листерий.
6. Созданы дифференциально-диагностические среды для определения подвижности и лецитиназной активности, позволяющие подтвердить принадлежность выделенных из исследуемого материала возбудителей к Listeria spp. и ускорить сроки их идентификации.
7. Впервые разработана и освоена в производстве отечественная микротест-система для ускоренной биохимической идентификации листерий (MTC-JI) по 5 и 12 информативным тестам. ,
8. Установлена диагностическая ценность разработанных питательных сред и микротест-системы при бактериологическом исследовании клинического материала от больных с акушерско-гинекологической патологией и при микробиологическом контроле пищевых продуктов.
9. Предложена схема бактериологического исследования на листериоз, позволяющая ускорить лабораторную диагностику с сокращением сроков установления диагноза на 18-20 ч.
286
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Омарова, Салидат Магомедовна, Махачкала
1. Ашмарин H.A., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.:Медгиз, 1962: 179.
2. Бакулов И.А. Листериоз сельскохозяйственных животных. М., «Колос», 1967 г.
3. Бакулов И.А., Цыганова A.A., Котляров В.М. Биохимические свойства листерий. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии, эпизоотологии. 1983:189-190.
4. Бакулов И.А. К вопросу таксономии бактерий рода Listeria. Ветеринария, 1983; 7: 31-34.
5. Бакулов И.А. и др. Явление L-трансформации фактор реализации иммуносупрессивных свойств листерий. Вопросы ветеринарии, вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. Покров. 1987: 87-97.
6. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Листериоз как пищевая инфекция. Вопросы диагностики и профилактики. Ульяновск. 1991.
7. Бакулов И.А. Листерия и безопасность продуктов питания /Международная конференция. Лаваль. 1991. Ветеринария. 1992; 1: 6264.
8. Бакулов И.А. Листерии в биологической системе почва-растение-животное-человек.// Научное наследие Докучаева и современное земледелие М.1992. 2: 245-250.
9. Бакулов И.А. Листерии обживают холодильник //Ветеринарная газета. 1992. 9: с.4.
10. Бакулов И.А., Котляров В.М., Шестиперова Т.И. Эпидемиологические и эпизоотологические аспекты листериоза. Журн. микробиол. 1994; 5:100-105.
11. Баснакьян И.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. М., Медицина, 1992 г.
12. Баснакьян И.А. Стресс у бактерий. М.,Медицина,2003: 50-52.
13. Бендас Л.Г.,Раскин Б.М.,Баранова А.К. Стимулятор бактериального роста из кормовых дрожжей. Лаб.Дело,1974,1:43-45.
14. Березкина Г.В. Обоснование применения модифицированных иммунологических методов в системе эпидемиологического надзора за листериозной инфекцией. Автореферат диссертации канд.мед.наук. Омск. 1993 г
15. Бузолева Л.С., Исачкова Л.М., Исаненко А.С., Сомов Г.П. Влияние температуры на изменчивость Listeria monocytogenes при длительном обитании в проточных почвенных колонках. Журн. микробиол. 2004; 3: 29-33.
16. Веревкина М.Н. Эффективность использования стимулятора роста микроорганизмов ТС-1 в зависимости от сроков его получения. Диагностическое лечение и профилактика заболевания сельскохозяйственных животных. Ставроп.гос.с/х акад. Ставрополь. 1996:19-21.
17. Воробьев А.А. Полимиразная цепная реакция и ее применение для диагностики в дерматологии. М.,2004,69с.
18. ГОСТ Р 51921-2002. Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes. Москва, 2002.
19. Гершун В.И. Листериоз сельскохозяйственных животных. Алма-Ата, 1981.
20. Гершун В.И. Экология листерий и пути их циркуляции в природном очаге. В ст.: Экология возбудителей сапрозоонозов. М., 1988:80-85.
21. Гребенюк Р.В., Чиров П.А., Кадышева A.M. Роль диких животных и кровососущих членистоногих в эпизоотологии листерий. Фрунзе, 1972: 122.
22. Ермолаева С.А., Зигангирова Н.А., Маракуша Б.И., Тартаковский И.С., Прозоровский С.В. Видоспецифическое выявление Lsteria monocytogenes методов направленной аплификации ДНК. Мол.ген.микробиол. и вирусология 1994; 1: 26-30.
23. Ермолаева С.А., Белый Ю.Ф, Тартаковский И.С., Гинцбург А.А., Прозоровский С.В. Клонирование и экспрессия фосфатидилиназитол -специфичной фосфолипазы С. L.monocytogenes. Мол.ген.микробиол. и вирусол.1995; 1:3-10.
24. Ермолаева С.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С. Изменение уровня экспрессии факторов вирулентности Listeria monocytogenes под влиянием внешних условий. Мол.ген.микробиол. и вирусол. 2000; 1: 17-19.
25. Ермолаева С.А., Тартаковский И.С. Регуляция экспрессии факторов вирулентности у Listeria monocytogenes. Журн.микробиол., 2001; 3: 106-110.
26. Ермолаева С. А. Генетические механизмы вирулентности Listeria monocytogenes. Генетика. 2001; 37: 286-293.
27. Зайцева Е.А., Терехова Е.В. Эколого-эпидемиологические особенности Listeria monocytogenes в Приморском крае. Тихоокеанский медицинский журнал, 2001.2: 29-31.
28. Зайцева Е.А., Сомов Г.П. Микробиологическая характеристика Listeria monocytogenes, изолированных из различных источников в Приморском крае. Журн.Микробиол.2006; 2: 3-6.
29. Калинин Н.М. Листериоз крупного рогатого скота. Ленинград, 1981: 95.
30. Каталог: реактивы для биохимии и исследований в области естественных наук. 2002-2003. Sigma, с: 61.
31. Карпова А.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С., Прозоровский С.В. Очистка и характеристика листериолизина О Listeria monocytogenes. Журн. микробиол. 1994; 4: 3-7.
32. Карпова Л.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С., Прозоровский С.В. Очистка и частичная характеристика белков клеточной стенки Listeria monocytogenes. Журн. микробиол. 1995; 2: 15-18.
33. Карпова Т.И., Шустрова Н.М., Снегирева А.Е., Шевелева С.А., Куваева И.Б., Тартаковский И.С. Журн. Микробиол. 2001; 1: 80-81.
34. Карпова Т.И. Ермолаева С.А., Лопырев И.В., Бродинова Н.С., Тартаковский И.С. Васкез-Боланд Х.А. Новые методы идентификации Listeria monocytogenes. Клин. Микробиол. антимикроб, химиотер. 2001; 3:266-273.
35. Карпова Т.И., Маракуша Б.И, Сапенко Т.П. и др. Эффект конститутивной активности ионов патогенности у Listeria monocytogenes. Журн. микробиол. 2005; 3: 3-8.
36. Карликанова Н.Р., Кубаева И.Б., Карликанова Н.С. Листерии в молоке и молочных продуктах. Москва- Углич. 1999.
37. Книзе А.В., Бузун А.И. Эпизоотическая ситуация по листериозу в странах мира и России. В сб. «Листериоз на рубеже тысячелетий». Покров, 1999: 188-122.
38. Кожаева Д.К., Меркулов В.А. Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы: Сборник научных работ. Ульянов.гос. с-х акад. Ульяновск. 2000; с.28-31.
39. Костенко Ю.Г., Шагова Т.С., Янковский К.Е. Листерии критерии безопасности мясных продуктов. Мясн. индустрия. 1997; 3: 23-24.
40. Котлярова Г.А., Бакулов И.А., Прозоровский С.В. Получение L-форм L. monocytogenes. Журн. микробиол. 1968; 7: 96-99.
41. Котляров В.М. Проблема листериоза на рубеже тысячелетий. В сб. «Листериоз на рубеже тысячелетий». Покров, 1999:48-52.
42. Красовский В.В., Похил С.И., Лиманский А.П., Лиманская О.Ю., Тимченко Е.Н. Разработка и апробация метода полимиразной цепной реакции для детекции возбудителя листериозной инфекции. Клинич. лабораторная диагностика. 2000; 6: 37-40.
43. Кривоносова О.В., Бакулов И.А. К определению вирулентности листерий. Ветеринария. 1973; 3:44-46.
44. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.,Медицина, 2004: 351-352.
45. Лабораторная диагностика листериоза животных и людей, меры борьбы и профилактика. Госагропром, МЗ СССР. М., 1987.
46. Листериоз, передаваемый через продукты питания. Бюлл.ВОЗ. 1988; 66 (4): 1-10.
47. Листериоз. Методические рекомендации (№11) комитета здравоохранения г.Москвы, 2001.
48. Литвин В.Ю., Емельянинко Е.Н., Пушкарева В.И. Патогенные бактерии, общие для человека и растений: проблемы и факты. Журн.микробиол. 1996; 2:101-104.
49. Маракуша Б.И., Дарвиш К., Тартаковский И.С. Характеристика штаммов Listeria monocytogenes, с помощью пульс-электрофореза. Журн.микробиол. 1996; 3: 60-64.
50. Меджидов М.М., Султанов 3.3. Использование непищевого сырья в производстве микробиологических питательных сред. Махачкала, 1986; 71.
51. Меджидов М.М., Султанов 3.3., Кулакова Л.С., Смирнова Е.Е., Сулименко И.М. Использование концентрата кормового лизина в получении питательных сред. Журн. микробиол., 1987,7; 102.
52. Меджидов М.М., Омарова Э.Б., Перминова Н.В., Гриднева Н.И. Микротест-система разового пользования для ускоренной биохимической идентификации энтеробактерий. Республ. Сб.научн.тр. Горький. 1987: 87-90.
53. Меджидов М.М., Шобухова Т.С., Гриднева Н.И. и др. Разработка микротест-системы для идентификации коринебактерий. Тез.конф. «Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии», Махачкала. 1992:77.
54. Меджидов М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам. М.,Медицина, 2003; 208 с.
55. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология. М.,Мир,1967.
56. Мельникова В.А., Скаженик В.Ю. Основы приготовления питательных сред. В кн. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований./ Под. ред. Лабинской А.С., Блинковой Л.П.,Ещиной А.С. М.,Медицина, 2004,104-118.
57. Методические рекомендации по бактериологическому контролю пищевых продуктов на наличие листерий. Ульяновск, 1992.
58. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах. МУК 4.2.1122-02.
59. Омарова Э.Б. Меджидов М.М., Султанов 3.3. Способ получения стимулятора роста микроорганизмов из кормовых дрожжей. Патент на изобретения, БИМП, 2004, №2227158,11,3 : 516.
60. Онищенко Г.Г. Контроль за инфекционными заболеваниями -стратегическая задача здравоохранения России в XXI веке. Журн. эпидемиол. и инфек. болезни. 2002,6: 4-16.
61. Онищенко Г.Г. Эпидемиологическая обстановка в России в 19911996 гг. по заболеваемости социально обусловленными инфекционными заболеваниями. Журн. микробиол. 1998 (1): 24-35.
62. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04.
63. Определитель бактерий. Берджи. Т., Дж.Хоулт, Н. Криг, П.Снит и др. (ред.) М., Мир, 1997: 196-200.
64. Покровский В.И., Годованный Б.А. Листериоз в кн.Инфекционные болезни. М.Медицина, 1996; 291-296.
65. Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология. М.,1999; 583-588.
66. Покровский В.И., Малеев В.В. Актуальные проблемы инфекционной патологии. Эпидемиология и инфекционные болезни. 1999, 2: 1730.
67. Покровский В.И., Онищенко Г.Г., Черкасский Б.И. Актуальные направления совершенствования профилактики инфекционных болезней. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2000; 1: 4-8.
68. Подунова Л.Г., Ясинский A.A., Опочинский Э.Ф. и др. Анализ деятельности центров Госсанэпиднадзора РФ по лабораторной диагностике листериоза. Инф.сборник статистических и аналитических материалов. Раздел 2. Москва; 2000.
69. Прозоровский C.B., Подунова Л.Г., Тартаковский И.С., Тясто A.C., Опочинский Э.Ф., Палей О.С., Лунина З.А. Лабораторная диагностика листериоза в России: проблемы и перспективы. матер. Международного симпозиума, Москва, 1995; 90-100.
70. Пушкарева В.И., Емельяненко E.H., Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Кулеш Е.В., Белялова Г.А., Дьяков Ю.Т. Патогенные листерии в почве и в ассоциации с водорослями: обратимый переход в некультивируемое состояние. Журн.микробиол. 1997;3: 3-10.
71. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных. Сб.сан.вет.Правит. Москва, 1996.
72. Раевский A.A., Шишов В.П., Ярцев М.Я., Павленко И.В. Разработка управляемого процесса выращивания листерий штамма «АУФ». Научн.основы технологии пром.пр-ва веет.биол.препаратов: Тез. Докл. 5 Всерос.конф., Щелково, 14-17 мая, 1996: 100.
73. Рахманова А.Г., Пригожина В.К. Справочник по инфекционным болезням. Раздел. Листериоз. Санкт-Петербург, 1999: 172-174.
74. Родина Л.В., Маненкова Г.М., Степанова Н.В., Тимошкова В.В., Салова Н.Я., Шестеперова Т.И. Состояние эпиднадзора за листериозом в г.Москве. В сб. «Листериоз на рубеже тысячелетий». Покров, 1999: 129-131.
75. Салова Н.Я, Голованова В.П., Шестеперова Т.Н., Маненкова Г.М., Степанова Н.В. Современное состояние лабораторной диагностики листериоза в санэпидслужбе г.Москва. В сб. «Листериоз на рубеже тысячелетий». Покров, 1999: 68-71.
76. Сахаров П.П., Гудкова Е.И. Листериозная инфекция. Медгиз, 1959.
77. Снелл Э. Основные бактериальные ростовые вещества. В кн. Физиология бактерий, Москва, 1954: 153-182.
78. Сомов Г.П., Литвин В.Д. Сапрофитизм и паразитизм патогенных бактерий. Новосибирск. Наука. 1988.
79. Тартаковский И.С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. Клин.микроб. антимикроб, химиотерапия. 2000; 2 (2): 20-30.
80. Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: Роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика М., «Медицина для всех», 2002,198 с.
81. Тартаковский И.С. Листериоз. В кн.: Частная эпидемиология. Москва,2002: 355-359.
82. Тутов И.К., Бобрышев В.И., Каменский Н.И. Питательная среда из отходов вакцинно-сывороточного производства для культивирования листерий. Диагностич. Лечение и профилакт. заболев, с-х животных. Ставроп.гос.с-х акад. Ставрополь. 1996: с.1013.
83. Частная эпидемиология. Москва, 2002, том.1.
84. Черкасский Б.Л. Инфекционные и паразитарные болезни человека, М., Медицинская газета, 1994, с.320.
85. Черкасский Б.Л. Теоретические аспекты проблемы надзора за пищевыми зоонозами. Международный симпозиум «Пищевые зоонозы». Москва, 1995.
86. Черкасский Б.Л. Пищевые зоонозы людей в России. Международный симпозиум «Пищевые зоонозы», Москва, 1995 г.
87. Честнова Т.В. Эпизоотолого-эпидемиологические аспекты листериоза в Тульской области. Автореферат диссертации канд.биолог.наук Тула, 1999.
88. Цыганова А.А., Тетерина А.В., Котляров В.М., Бакулов И.А. Активность каталазы в клетках слабовирулентных и вирулентных штаммов Listeria monocytogenes. Доклад ВАСХНИЛ, 1973; 8: 39-40.
89. Шарма Р.К. Совершенствование бактериологического анализа для индикации листерий в продуктах импортируемых в Россию. Автореферат диссертации кандидата медицинских наук, 1999, 24.
90. Юркина О.А, Карпова М.Р. Новицкий В.В. и др. Влияние Listeria monocytogenes на систему крови. Журн. микробиол. 1997, 6: 68-70.
91. Adams T.J. Vartivarian S., Cowant R.E. Listeria monocytogenes iron acquisition systems of Listeria monocytogenes. Infec and Immun.1990. 58, 8:.2715-2718.
92. Armstrong R.W. and Fung P.L. Brainstem encephalitis (rhomencephalitis) due to Listeria monocytogenes: case report and review. 1993. Clin.Infect. Dis. 16: 689-702.
93. Audurier A. and Martin C. Phage typing of Listeria monocytogenes. 1989. Int.J. Food Microbiol. 8: 251-257.
94. Bannerman E.S., Bille J.A new seleclive medium for isolating Listeria spp. from heavily contaminated material. «Appl. and Environ. Microbiol.», 1988,54, №1,165-167.
95. Bal N. Mintz E., Wu Clen Chou, Guillain F„ Catty P. The Cad A A.T. Hase from Listeria monocytogenes: Abstr 3 rd European Biophysics Congress, Munchen Sept. 9-13, 2000. Eur. Biophys J. 2000, 29.4-5: 326.
96. Basher H.A., Fowler D.R., Rodgers F.G., Seaman A., Woodbine M. Pathogenesis and growth of Listeria monocytogenes in fertile hens eggs. Lbi. Bakteriol, 1984, Abt. 1 A, 256, 4: 497-509.
97. Berrang M.E., Brackef R.E., Beuchat L.R. Grow of Listeria monocytogenes on fresh vegetables stored under controlled atmosphere 1989. J. Food Prot. 52:702-705.
98. Belyi Y.E. Intracellular parasitism of microorganisms. Springer -Verlag Gmbh and Co. KG. 1996.
99. Bille Y.Epidemilogy of human listeriosis in Europe, with special reference to the Swiss outbreak. In: A.J.Miller, J.L.Smith, and G.A.Somkuti (ed), Foodborn Listeriosis. Elsevier, New York, 1990; 71-74
100. Borucki Monica K., Call Douglas R. Listeria monocytogenes seratype identification by PCR. J.Clin. Microbiol. 2003.41.12:5537-5540.
101. Bouches M., Yomkura M.L.,Wallace R.Y., Phelan Y.P. Adult respiratory distress syndrome: a rare manifestation of Listeria monocytogenes infection in pregnancy. 1984. Am. Z. Obstet. Gynecol. 149:686-688.
102. Bojsen-Moller J. Human Listeriosis: diagnostic, epidemiologic and clinical studies. 1972; Acta Pathol Microbiol. Scand. Sect. B Suppl. 229:7292.
103. Bortolussi R. An ongoing problem: perinatal infection due to Listeria monocytogenes an old pathogen reborn. Clin and Invest. Med., 1984; 7. №4; 213-215.
104. Braun T.Y., Travis D., Dee R.R., Nieman R.E. Liver abscess due to Listeria monocytogenes: case report and review. 1993. Clin. Infect. Dis. 17: 267-269.
105. Braun L., Ohayon H., Cossart P. The InIB protein of Listeria monocytogenes is sufficient to promote entry into mammalian cells Mol.Microbiol-1998. 27. №5:1077-1087.
106. Breer C., and Schopfer K. Listeria and food.; 1988. Lancet 11:1022.
107. Breer C., and Schopfer K. Listerien in Nahrungsmitteln. 1989. Schweiz. Med. Wochenschr. 119: 306-311.
108. Breidt F., Fleming H.P. Modeling of the competitive growth of Listeria monocytogenes and Lactococcus lactis in vegetable broth/ Appl. Environ. Microbiol. 1998; 64. №9: 3159-3165.
109. Bruce J.L., Hubner R.Y., Cole E.M., McDonell C.I. Webstern J.A. of E.coli fragments containing ribosomal RNA sequences are conserved among different strains of Listeria monocytogenes. 1995. Proc. Nat. Acad Sci. USA.92:5222-5223.
110. Broome C.V. Listeriosis: Can we prevent it?. 1993. ASM News.59: 444446.
111. Buchrieser C.,Brosch R., Catimel B., Rocourt Y. Pulsed-field gel electrophoresis applied for comparing Listeria monocytogenes strains involved in outbreaks. Can.J. Microbiol. 1993.39.4: 395-401.
112. Cabanes D., Dussurget O., Dehoux P., Cossart P. Auto, a surface . associated aytolisin of Listeria monocytogenes reguiret for entry intoeukaryotic cells and virulence. Mol. Microbiol. 2004.51 6:1601-1614.
113. Cain D.B. and Mc Cann V.L.Anunusual case of cutaneous listeriosis. Y.Clin. Microbiol. 1986; 23:976-977.
114. Capita R., Alonsa-Calleja C., Garcia-Fernindez M.C., Moreno B. Comparison of the efficacy of different techniques, culture media and sources of blood in determining the hemolytic activity of Listeria spp. Can.J. Microbiol. 2001; 47.7: 653-661.
115. Carvajal A. and Frederiksen W.Fatal endocarditis due to Listeria monocytogenes. Rew. Intect. Dis. 1988; 10: 616-623.
116. Cassiday P.K., Brackett R.E., Beuchat L.R. Evaluation of ten selective direct plating media for enumeration of Listeria monocytogenes in hams and oysters. Food Microbiol. 1989; 6.2:113-125.
117. Center for Disease Control. Update: multistate outbreak of listeriosis -United States. Morb. Mortal. Wkly. Reep. 1998; 47:1085-1086.
118. Centers for Disease Control. Update : multistate outbreak of listeriosis United States, 1998-1999. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 1999; 47: 11171118.
119. Christie R., Atkins N.E, Munch-Petersen E. A note on lytic phenomenon shown by group B streptococcus. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 1994; 22: 197-200.
120. Chirgwin K. and Gleick S. Listeria monocytogenes osteomyelitis. Arch.Intern.Med. 1989; 149: 931-932.
121. Ciesielski C.A., Hightower A.W., Parsons S.K., Broome C.V. Listeriosis in the United States: 1980-1982. Arch.Intern. Med. 1988; 148: 1416-1419.
122. Cordon S. and Singer C. Listeria monocytogenes cholecystitis (letter). J.Infect. Dis. 1986; 154: 918-919.
123. Cossart P., Kocks C. The actin-based motility of the facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes. Molecular Microbiol, 1994; 13: 395-402.
124. Curtis G.D.W, Mitchell R.G., King A,F„ Griffin E.Y. A selective differential medium for the isolation of Listeria monocytogenes. Lett. Appl. Microbiol. 1989; 8:95-98.
125. Datta A.R., Wentz B.A., Hill W.E. Detection of hemolytic Listeria monocytogenes by using colony hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 1987; 53:2256-2259.
126. Dee R.R. and Lorber B. Brain abscess due to Listeria monocytogenes: case report and literature review. Rev. Infect. Dis. 1986; 8:968-977.
127. Del Corral F„ and R.L. Buchanan. Evaluation of the API-ZYM system for the identification of Listeria. 1990. Food Microbiol. 1990; 7: 99106.
128. Domingo P., Serra Y., Sambeat M.A., Ausina V. Pneumonia due to Listeria monocytogenes (letter). Clin. Infect. Dis. 1992; 14: 787-789.
129. Dominguez Rodriguez L., Fernandes G.S., Garayzabal Y.F.F., Ferri E.R. New methodology for the isolation Listeria monocytogenes from heavily contaminated environments. Appl. Environ. Microbiol. 1984; 47:1188-1190.
130. Donnelly C.W., Baigeat G.Y. Method for flow cytometric detection of Listeria monocytogenes in milk. Appl. Environ. Microbiol. 1986; 52:689695.
131. Donnelly C.W., Briggs E.H., Donnelly L.S. Comparison of heat resistance of Listeria monocytogenes in milk as determined by two methods. J.FoodProt. 1987; 50: 14-17.
132. Donker-Voet J. Listeria monocytogenes: some biochemical and serological spectrs. Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1972; 10: 287-291.
133. Doyle M.P. and Schoeni J.L. Comparison of procedures for isolating Listeria monocytogenes in soft surfaceripened cheese. J. Food. Prot. 1987; 50:4-6.
134. Durand M.L., Calderwood S.B., Weber D.Y. k et al. Acute bacterial meningetidis in adults: a review of 493 episods. N. Engl.J.Med. 1993; 328: 21-28.
135. Dumont J. and Cotoni L. Bacille semblable a celui du rouget du pore rencontri dans le L.C.R. d' un miningitique. Ann. Inst. Pasteur. 1921; 35: 625-633.
136. Ellis L.C., Segreti Y., Gitelis S., Huber Y.F., Joint infection due to Listeria monocytogenes: case report and review. Clin. Infect. Dis 20: 1995; 1548-1550.
137. Espaze E.P., Reynaud A.E. Antibiotic susceptibilities of Listeria: in vitro studies. «Infection». 1988; 16. Suppl. 2: 160-164.
138. Edgcomb M., Sirimanne S., Wilkinson B.J., Drocein P., Morse R. Electron paramagnetic resonance studies of the membrane fluidity of the foodborn pathogenic psychrotroph Listeria monocytogenes. 2000; 1463.1: 31-42.
139. Ermolaeva S., Karpova T., Novella S., et al. A sample method for the differentiation of Listeria monocytogenes based on induction of lacithinase activity by charcoal. Int. J.Food Microbiol. 2003; 82: 87-94.
140. Farkas J., Andrassy E., Beezner J., Vidacs L., Meszanos L. Studies on competitive growth between Lactococcus lactis and Listeria monocytogenes Acta Microbiol. Immunol Hung 2001; 2: 234-235.
141. Farber J.M., Sanders G.W., Johnston M.A. A survey of various foods for the presens of Listeria species. J. Food Prot. 1989; 52:456-458.
142. Farber J.M., Carter A.O., Varughese P.V., Ashton F.E., Ewan E.P. Listeriosis traced to the consumption of alfalfa tablets and soft cheese (letter). N.Engl. J.Mde. 1990; 322:338.
143. Faber Y.M. and Peterkin P.I. Listeria monocytogenes, a food-born pathogen. Microbiol. Rev. 1991; 55:476-511.
144. Farber Y.M., Peterkin P.J., Carter A.O., Varughese P.V., Ashton F.E., Ewan E.P. Neonatal listeriosis due to cross infection confirmed by isoenzyme typing and DNA fingerprinting (letter). J.Infect. Dis. 1991; 163: 927-928.
145. Fleming D.W., Cochi M.D., MacDonald K.L., Brondum Y., Hayes P.S., Pikaytis B.D., Holmes M.B., Audurier A., Broome C.V., Reingold A.L. Pasteurized milk as a vehicle of infection in an outbreak of Listeriosis. N. Engl.Y.Med. 1985; 312:404-407.
146. Fuzi Miklos. Az. Erysipelothrix rhusiopathiae es Listeria monocytogenes diferencialasa antibiotikum korongokkal. «Kiserl orvostud». 1983; 35. 3:289-291.
147. Fraser Y.A. and Sperber W.H. Rapid defection of Listeria spp. in food and environmental samples by esculin hydrolysis. J.Food. Prot. 1988; 51: 762-765.
148. Frehel C., Lety M-A., Autret N., Beretti J.-L., Berche P., Charbit A. Capacity of ivanolysin O to replace listerilysin O in phagosomal escape and in vivo survival of Listeria monocytogenes. Microbiology. 2003; 149. 3: 611-620.
149. Jemmi T. Actual knowledge of Listeria in meat and fish products. Mitt. Geb. Lebens mittelunters. Hyg. 1990; 31:144-157.
150. Jersek B., Tcherneva E., Rijpens N., Herman L. Repetitive element seguencebaced PCR for species and strain discrimination in the genus Listeria.Lett.Appl.Microbiol 1996; 23:55-60.
151. Jones D. and Seeliger H.P.R. International Committee on Systematic Bacteriology Subcommittee on the taxonomy of Listeria, Brochothrix, and Erysipelothrix. Minutes of the meeting. September 7-8. Manchester. Int.Y. Syst.Bacteriol. 1986; 37:176.
152. Hayes P.S., Feeley J.C., Graves L.M. et al Appl. Environ. Microbiol, 1986; 51: 438.
153. Hayes P.S., Feeley Y.C., Graves L.M. Ajello G.W. Fleming D.W. Isolation of Listeria monocytogenes from raw milk. Appl. Environ. Microbiol. 1986;51:438-440.
154. Hayes P.S., Ggaves L.M., Ajello G.W. Comparison of cold enrichment and U.S. Department of Agriculture methods for isolating Listeria monocytogenes from naturally contaminated foods. Appl. Environ. Microbiol.1991; 5: 2109-2113.
155. Henry B.S. Dissociation in the genus Brucella. J.Infect. Dis.1993; 52: 374-402.
156. Hess Y. and Kaufmann S.H.E. Vaccination strategies agains intracellular microbes. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1993; 7: 95-104.
157. Hitchins A.D., Wang S.-J. Recovery of damaged Listeria monocytogenes //Listeria 1992 : 11 th Int. Symp. Probl. Listeriosis, Copenhagen, 11-14 May, :ISOPOL XI: Book Abstr.- S. I., s.a. 1992: 19-20.
158. Hitchins A.D. FDA Bacteriological Analytical Manual, Listeria monocytogenes, 8 th edition. 1995.
159. Hof H. Treatment of experimental Listeriosis by Ci 934, a new quinolone. J.Antimicrob. Chemoter. 1990; 25: 121-126.
160. Ho Y.L. Shands K.N., Friedlaud G., Eckind P., Fraser D.W. An outbreak of type 4b Listeria monocytogenes infection involving patients from eighth Boston hospital. Arch.Intern Med. 1986; 146: 520-524.
161. Holoshitz Y, Schnider M., Yaretzky A., Berncheim Y., Klajman A. Listeria monocytogenes pericarditis in a chronically hemo dialyzed patient. 1984; 228: 34-37.
162. Gaze G.E., Brown G.D., Gaskell D.E., Banks Y.G. Heat resistance of Listeria monocytogenes in homogenates of chiken, beef steak and carrot. Food Microbiol. 1989; 6: 251-259.
163. Garcia Y.A., Dominquez L., Briones V., Blanco V., Fernandez-Garayzabal., Suarez G. Revision of antigenic structure of the genus Listeria FEMS Microbiol. Lett. 1990; 67: 113-120.
164. Gellin B.G., Broome G.V. Listeriosis. J.AMA.1989; 261: 1313-1320.
165. Gellin B.G., Broome C.V., Bill W.T., Weaver R.E., Gaventa S., Mascola L. and the Listeriosis Study Group. The epidemiology of listeriosis in the United States 1986. Am. J.Epidemiol. 1991; 1133: 392-401.
166. Genigergious C.A., Oanca P., Dutulescu D. Prevalence of Listeria spp. in turkey meat at the supermarket and slaughterhouse. J. Food Prot. 1990; 53:282-288.
167. Gholizadeh Y., Poayrt C., Livin M., Bertti Y.L., Croize Y., Berche P., Gaillard Y.L. Serodiagnosis of listeriosis based upon detection of antibodies against recombinant truncated of listeriolysin O. J. Clin. Microbiol. 1996; 34: 1391-1395.
168. Glaser P., Frangeul L., Buchriser C. et al. Comparative genomics of Listeria species. Science 2001; 294: 849-52.
169. Goulet V., Lepoutre A., Rocourt Y., Courtiru A.L., Dehaumont P., Veit P. Epidemic de listeriosis en France: bilan final et resultants de 1, ingukte epidemiologiqeu/ Bulle. Epidemiol. Hebdom. 1993; 4: 13-14.
170. Gouin E., Mengaud Y., Cossart P. The virulence gene cluster of Listeria monocytogenes is also present in Listeria ivanovii an animal pathogen, and Listeria seeligeri; a nonpathogenic species Infect. Immun. 1994; 62: 3550-3.
171. Gray M.L., Stafseth H.J., Thorp F., Yr., Sholl L.B., Riley W.F., Yr. A new technique for isolating Listerellae from bovine brain. 1948; 55: 471476.
172. Gill Alexander О. Holley Richard A. Inhibition of bacterial growth on ham and bologna by lysozyme and EDTA. Food Int. 2000; 2: 83-90.
173. Greene Sonya L., Freitag Nancy E. Negative regulation of Pfr A the key activator of Listeria monocytogenes virulence gene expression is dispensable for bacterial pathogenesis. Microbiology. 2003; 149.1: 111-120.
174. Greenwood M.H., Roberts D., Burden P. The occurrence of Listeria species in milk and dairy products: a national survey in England and Wales. Int. J. Food Microbiol. 1991; 12:197-206.
175. Grenningloh R., Daiji A., Wehland Y., Chakaraborty Т., Weiss S. Listeriolysin and I rpA are major protein targets of the human humoral response against Listeria monocytogenes. Infect. Immun.1997; 65: 39763980.
176. Guin E., Mengaud Y., Cossart P. The virulence gene cluster of Listeria monocytogenes is also present in Listeria ivanovii an animal pathogen, and in Listeria seeligeri, a nonpathogenic species. Infect. Immun.1994; 62: 3550-3553.
177. Lammerding A.M. and Doyle M.P. Evalution of enrichment procedures for recovering Listeria monocytogenes from dairy products. Int. J. Food Microbiol. 1989; 9: 249-268.
178. Lammerding A.M., Doyle М.Р.Неселктивный бульон обогащения (PE/FSIS). Int. J. Food Microbiol. 1991; 9:249.
179. Lanciotti R., Gurdini F., Bandini F., Vannini L., Guerzoni M.-E. Survey of the incidence of Listeria spp. in food of animal origin in Northern Italy. Adv. Food. Sci. 1999; 21 5-6:197-200.
180. Lavetter A., Leedom Y.M., Mathies A.W., Yr., Jvler D„ Wehrly P.F. Meningitidis due to Listeria monocytogenes, a review of 25 cases. N.Engl. Y. Med. 1971;285:598-603.
181. Leasor S.B. and Foegeding P.M. Listeria spp. in commercially broken raw liquid whole eggs. Y.Food.Prot. 1989; 52: 777-780.
182. Lee W.H. and McClain D. Improved Listeria monocytogenes selective agar. Appl. Environ. Microbiol.1986; 52: 1215-1217.
183. Leighton I. Use of selective agents for the isolation of Listeria monocytogenes. Med.Lab. Sci. 1979; 36. 3: 283-288.
184. Lennon D., Lewis B., Mantell C., Becroft D., Dove B., Farmer K., Tonkin S., Yeates N., Stamp R., Mickleson K. Epidemic perinatal Listeriosis. Pediat. Infec. Dis. 1984; 3. 1: 30-34.
185. Lorber B. Listeriosis. Clin. Infect. Dis. 1997; 24: 1-11.
186. Lou Y. and Youset A. Adaptation to sublethal environmental stresses protects Listeria monocytogenes against lethal preservation factors. Appl. Environ. Microbiol. 1997; 63: 1252-1255.
187. Lovie M., Iayarathe P., Luchsinger J., Devenish Y., Iao J., Schlech W., Simor A. Comparison of ribotyping, arbitrarily primed PCR, and Pulsed-field gel electrophoresis for molecular typing of Listeria monocytogenes. J.Clin.Microbiol. 1996; 34: 15-19.
188. Lovett Y., Francis D.W., Hunt Y.M. Listeria monocytogenes in raw milk: detection, incidence, and patogenicity. Y.Food Prot.1987; 50: 188-192.
189. Lovett Y. Isolation and identification of Listeria monocytogenes in dairy products. J.Assoc. Off.Anal.Chem. 1988; 71:658-660.
190. Lovett Y., Wesley J.V., Vandermaaten M.Y., Bradshaw Y.G., Francis D/W., Crawford R.G., Donnelly C.W., Messer Y.W. High temperature short-time pasteurization inactivates Listeria monocytogenes. J.Food. Prot.1990.
191. Low Y.C. and Donachie W.A. A review of Listeria monocytogenes and listeriosis. Vet.Y. 1997; 153: 9-29.
192. Lowry P.D. and Tiongt I. The incidence of Listeria monocytogenes in meat and meat products-factors affecting distribution. In: Proceedings of the 34th International Congress of Meat Science and Technology, Port B. Brisbane, Australia. 1991; 528-530.
193. Lund A.M., Zottola E.A., Pusch D.Y. Destruction of Listeria monocytogenes during microwave cooking. Lancet. Y. Food Prot. 1991; 54:602.
194. Lukinmar S., Micttinen M., Nakari U.-M., Korkeala H., Siitonen A., . Listeria monocytogenes isolates from invasive infections variation of seroand genotypes during an 11-year period in Finland. J.Clin Microbiol. 2003; 41.4: 1694-1700.
195. Kaufmann S.H.E. immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 1993; 11:129-163.
196. Katharion S., Rocourt Y., Hof Y., Goebel W., Levels of Listeria monocytogenes hemolysin are not directly proportional to virulence in experimental infection in mice. 1988; Infect. Immun. 56: 534-536.
197. Klinger Y.D., Johnson A., Croan D., et al. Comparative studies of nucleic acid hybridization assay for Listeria monocytogenes in foods. J.Assoc. Anal. Chem. 1988; 71: 669-673.
198. Klinger Y.D. Isolation of Listeria: a review of procedures and future perspectives. Infection. 1988; 16 (suppl.): S. 89-105.
199. Knabel S.Y., Walker H.W., Hartman P.A., Mendonca A.F. Effects of growth temperature and strictly anaerobic recovery of the survival of Listeria monocytogenes during pasterisation. Appl. Environ. Microbiol. 1990; 56: 370-376.
200. Kiilz J., Krebs H. Zum Problem der Listeriose in Kindesalter./Z.arg. Fortbild. 1990; 84. 3: 8-84.229. ' Jmbs B. Listeria monocytogenes przyczyna sytnaji Kryzysowej sero warstwic francuskim. Pizem. spoz. 1999; 53.6:12.
201. Ibrahim G.A.B., Fabian A., Ralovich B. in Proceedings of the 11th Internationa Listeriosis symposium. Copenhagen. 1992.
202. Jvanov J. Untersuchungen über die Listeriose ser schaffe in Bulgarien Monatsh. 1962; Vet.Med.17: 729-736.
203. Mackey B.M., Pritchet C., Norris A., Mead G.C. Heat resistance of Listeria; strain difference and effects of meat type and curing salts. Lett. Appl. Microbiol. 1990; 10: 251-255.
204. Martin R.S., Sumarah R.K., MacDonald M.A. A synthetic based medium for the isolation of Listeria monocytogenes. Clin. Invest. Med. 1984; 7.4:233-237.
205. Marth Elmer H. Disease characteristics of Listeria monocytogenes. Food Technol. 1988; 42.4:165-168.
206. Microbiological examination for dairy purposes . Section 3.15. Detection of Listeria monocytogenes. 180standarts 1993; 1-7.
207. Mac Kaness G.B. Cellular resistance to infection. J.Med 1962; 116: 381-406.
208. Mac. Kaness G.B. Resistance to intracellular infection. J.Infect. Dis. 123:439-445.
209. Marget W., and Suliger H.P.R. Listeria monocytogenes infection -therapeutic possibilities and problems. Infection. 1988; 16 (suppl. 2): 175-177.
210. Mazzulli T. and Salit I.E. Pleural fluid infection caused by Listeria monocytogenes: case report and review. Rev. Infect. Dis. 1991; 13: 564-570.
211. Mc Bride M.E. and Girard K.F. A selective medium for the isolation of Listeria monocytogenes from mixed bacterial populations. J.Lab. Clin. Med. 1960; 55: 153-157.
212. Mc Clain D., and Lee W.H. Development of USDA-FSIS method for isolation of Listeria monocytogenes from raw meat and poultry. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1988; 71: 660-664.
213. Mc Lauchlin J. Human listeriosis in Britain, 1967-1985, a summary of .72 cases. I. Listeriosis during pregnancy and in the newborn. Epidemiol. Infect. 1990; 104:181-189.
214. Mc Lauchlin Y., Audurier A., Taylor A.G. The evaluation of a phage-typing system for Listeria monocytogenes for use in epidemiological studies. J.Med, Microbiol. 1996; 22: 357-365.
215. Mead P.S., Slutsker L., Dietz V., Mc.Caig L.F., Brisee Y.S., Shapiro C., Griffin P.M., Tauxe R.V. Food-related illness and death in the United States. Emerg. Infect. Dis. 1999; 5: 607-625.
216. Meyer R.D. and Lin S. Determination of the effect of antimicrobics in combination against Listeria monocytogenes. Dian. Microbial. Infect. Dis. 1987; 6:199-206.
217. Miller Arthur J., Bayles Darrell O., Eblen B. Shawn. Cold shock induction of thermal sensitivity in Listeria monocytogenes. Appl. Environ. Microbiol. 2000; 66.10:4345-4350.
218. Milohanic E., Pron B., Berche P., Gaillard J.-L.Identification of new loci involved in adhesion of Listeria monocytogenes to eukaryotic cells. Microbiology.2000; 146.3: 731-739.
219. Neiman R.E. and Lorber B. Listeriosis in adults: a changing pattern. Report of eight cases and review of the literature, 1968-1978. Rev. Infect. Dis. 1980; 2: 207-227.
220. Notermans S., Wernans K., Chakraborty T. The use of the Listeria monocytogenes dth for the detection of pathogenic biovars in food. Acta Microbiol. Hang. 1989; 36: 215-218.
221. Notermans S., Chakraborty T., Leimeister-Wachter M., et al. Specific gene probe for detection of biotyped and serotyped Listeria strains. Appl. Environ. Microbial. 1989; 55:902-906.
222. Nyfelt A. Etiologic de la mononuncliose. C.R.Soc.Biol. 1979. 101: . 590-591.
223. Olive M. and Bean P. Prnciples and application of methods for DNA-based typing of microbial organisms. I. Clin. Microbiol. 1999; 37: 16611669.
224. Olive M., Pierre F., Lematre J.-P., Divies C., Rousset A., Guzzo L. Assessment of the pathogenic potential of two Listeria monocytogenes human faecal carriage isolates. Microbiology. 2002; 148. 6: 1855-1862.
225. Ottaviani F., Ottaviani M., Agosti M .Esperienze su un agar selettivo e differenziale per Listeria monocytogenes Ind. Alim. (Ital.) -1997; 36. 361: 888-889, 895.
226. O' Riordan M., Moors M.A, Portnoy D.A. Listeria intracellular growth and virulence reguire host-derived lipoic acid. Science 2003; 302. 5644: 462-464.
227. Larpent J.-P. Microbiologic et aliments. Ind alim et agr (MOHUI)-2000; 6:47-58.
228. Osset J., Garia E., Bartolome R.V., Andreu A. Papel de Lactobacillus como factor protector de la candidiasis vaginal Med. Clin. 2001; 117. 8: 285-288.
229. Partnoy D.A. Innate immunity to a facultative intracellular bacterial pathogen Curr. Opn. Immunol. 1992; 4: 20-24.
230. Paterson Y.S. The antigenic structure of organisms of the genus Listeria.J.Pathol. Bacteriol. 1940; 51: 427-436.
231. Pangallo D., Kuchta T., Drahovska H. Preparazione di un controllo intemo MIMIC per una multiplex PCR per la rivelazione di Listeria monocytogenes. Ind alim.2001; 40.400: 152-154.
232. Perenhou H. Un gain de temp s en core possible. Pev. Lait fr. 1988; 584:18-21.
233. Peel M., Donachie W., Shaw A. Temperature-dependent expression of flagella of Listeria monocytogenes studied by electron microscopy, SDS-PAGE and Western blotting. J.Gen. Microbiol. 1988; 143: 2171-2178.
234. Peterkin P.J., Idziak E.S., Sharpe A.N. Detection of Listeria monocytogenes by direct colony hybridization on hydrophobic grid-membrane filters by using a chromogen labeled DNA probe. Appl. Environ. Microbiol. 1991; 57: 586-591.
235. Pini P.M. and Gilbert R.Y. The occurrence in U.K. of Listeria species in raw chickens and soft cheese. Int. Food Microbiol. 1988; 6: 317-326.
236. Pine L., Malcolm B., Brooks Y.B., Daneshvar M.J. Physiological studies on the growth and utilization of sugars by Listeria species. Con. I. Microbiol. 1989; 35: 245-254.0
237. Pinner R.W., Schuchat A., Swaminathan B., et.al. Role of foods in sporadic listeriasis II. Microbiologic and epidemiologic investigation. YAMA. 1992; 267: 2046-2050.
238. Ralovich B., Listeriosis Research: Present Situation and Perspective. Akademiai Kiado, Budapest. 1984.
239. A. Ralovich B. Detection and epidemiological typing of Listeria strains diagnostic methods for Listeria infection. Acta. Microbiol. Hung. 1993; 40. 1:3-38.
240. Rasmussen O.F., Skouboe P., Dons L., Rossen L., Olsen J. E. Listeria monocytogenes exists in at least three evolutionary lines: Evidence from flagellin, invasive associated protein and listeriolysin O genes Microbiology. 1995; 141.9:2053-2061.
241. Ripio M.T., Dominguez-Bernal G., Suarez M., et al. Transcriptional activation of virulence genes in wildtype strains of Listeria monocytogenes in response to a change in the extracellular medium composition. Res. Microbiol. 1996; 147: 371-384.
242. Rocourt J. and Grimout P.A.D. Listeria welshimeri sp. Nov. and Listeria seeligeri sp. Nov. IntJ. Syst. Bacterid. 1983, 33: 866-869.
243. Rocourt J. Listeria monocytogenes: the state of the art. Dairy Food Environ Sanitation 1994; 14: 70-82.
244. Rocourt J. and Jacket C. Surveillance epidemiologique de la listeriose humanie en France: rove du center national de reference. Med. Infect. 1995; 25: 171-183.
245. Rocourt J. and Jacket C. Surveillance epidemiologique de la listeriose humanie en France: role de center national de reference. Med.Mal. Infect. 1995; 25:177-183.
246. Rocourt J. The genus Listeria and Listeria monocytogenes: phylogenetic position, taxonomy and identification. P. 1-20. In: E.T. Ryser and E.H. Marth (ed) Listeria, listeriosis and food safety, 2nd ed. Marcel Dekker Inc. New York. 1999.
247. Rodriguez L.D., Vazguez-Boland Y.A., Garayazabae Y.F.D., Tranchant P.E., Gomez-Lucia E., Ferri E.F.R., Fernandez G.A. Microplate technique to determine hemolytic activi ty for routine typing of Listeria strains. J. Clin. Microbiol. 1986; 24: 99-103.
248. Ryser E.T. and Marth E.H. Fate of Listeria monocytogenes during the manufacture and ripening of Comambert cheese. J.Food Pro. 1987; 50: 372378.
249. Ryser E.T. Food born listeriosis. In: S.T. Ryser and E.H.Marth (ed) Listeria, Listeriosis and food safety 2nd ed 1999. Marcel Dekker Inc.New York. 1999: 299-358.
250. Ryser E.T. and E.H. Marth (ed) Listeria, listeriosis and food safety 2nd ed. Marcel Dekker Inc. New York. N.Y. 1999.
251. Sallen B., Rajoharison S., Desverenne S., Quinn F., Mabilat C. Comparative analysis of 16S and 23S rRNA seguences of Listeria species.; : Int: J.Syst. Bacteriol. 1996; 46: 669-674.
252. Schid M.W., Ng Eva.Y.W., Lampidis R., Emmerth M., Walchu M., Kreft Y., Goebel W., Wagner M., Schileiter K.H. Evalutionary history of the genus Listeria and its virulence genes. Syst. Appl. Microbiol. 2005; 28.1:118.
253. Schuchat A., Swaminathan B., Broome C.V. Epidemiology of human listeriosis. Clin. Microbiol. Rev.1991; 4: 169-183.
254. Schuchat A., Deaver K.A., Wenger Y.D. et al. Role of foods in sporadic Listeriosis. Case-control study of dietary risk factors. 1992. YAMA.1992; 267:2041-2045.
255. Schultz E.W. Listerella infection: a review. Stanford Med. Bull 1945; 3:135-151.
256. Schwartz B., Hexter D., Broome C.V. et all. Investigation of an outbreak of listeriosis: new hypotheses for the etiology of epidemic Listeria monocytogenes infections. J. Infect. Dis. 1989; 159: 680-685.
257. Schlech W.F., Lavigne P.M., Bortolussi R.A., et.al. Epidemic Listeriosis-evidence by transmission by food. N. Engl.J.Med. 1983; 308: 203-206.
258. Seeliger H.P.R. and Jones D. Genus Listeria, In: Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt J.G: Bergey's manual of Systematic bacteriology. Williams and Wilkins, Co., Baltimore. M.D. 9th Ed. Vol.2.1986; p.1235-1245.
259. Seeliger H.P.R. Listeriosis history and actual development. 1988. Infection. 1988; 16:80-84.
260. Seeliger H.P.R. Listeriosis History and actual developments. Infection 16, Suppl. 1988; 2: 80-84.
261. Sheehan B., Kocks C., Dramsis S., Gouin E., Klarsfeld A.D., Mengaud Y., Cossart P. Molecular and Genetic Determinants of the Listeria monocytogenes infections process. Current Topics in microbiology and immunology, 1994; 192:187-216.
262. Sizmur K. and Walker C.W. Listeria in prepacked salads. Lancet. 1988; I: 1167.
263. Skalka Boris, Smola Juri. Selective diagnostic medium for pathogenic Listeria spp. J. Clin Microbiol. 1983; 18. 6:1432-1433.
264. Siragusa G.R., Elphingstone L.A., Wiese P.L., Haefner S.M., Johnson M.G. Petite colony formation by Listeria monocytogenes and Listeria species grown on esculin-containing agar //Can. J.Microbiol. 1990; 36, 10: 697-703.
265. Slutsker L., Evans M.C., Schuchat A. Listeriosis in: Emerging Disease 4. W.M. Scheld, W.A. Craig, Y.M.Hughes (ed). ASM Press, Washington D.C. 2000: 83-106.
266. Smith A.R.B., Liebermann B.A., Allen L., Barson A.Y. Listeriosis and pregnancy, Lancet 1983; 11:1364.
267. Smith A.R.B., and Archer D.L. Heat-induced injury in Listeria monocytogenes. Y.Ind. Microbiol.1968; 3:105-110.
268. Smith G. M., Klingensmith P. M., Gsell T. C. Evaluation of composite sampling in the analysis of Listeria monocytogenes in ready to eat food products. Trans III state Acad Sci. 2001; 94:70.
269. Smola Y. Possibilities of differentiation of listerial hemolysins by synergistic hemolytic reactions (CAMP reaction). Int. J.Food Microbiol. 1989; 8:265-267.
270. Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt Y.G., Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 9th Ed. Williams and Wilkins, Co., Baltimore M.D. Vol.2.1986.
271. Steinbrugge E.G., Maxcy R.B., Liewen M.B. Fate of Listeria monocytogenes on ready to serve lettuce. Y. Food Prot.1988; 51: 569-599.
272. Stephens P.I., Jones M.V. Thermal inactivation of Listeria monocytogenes studied by differential scanning calorimetry //Listeria: 11th Int. Symp. Probl. Listeriosis, Copenhagen, 11-14 May, 1992: ISOPOLXI: Book, Abstr. S. I, s.a: 1992: 333-334.
273. Swaminathan B and Hayes P.S. Sampling isolation and rapid detection, p. 21-37 In: Isolation and identification of Listeria monocytogenes 1989, US Department of Health and Human Services, CDC, Atlanta. 1989: 21-37.
274. Tham W., Alden J., Enicsson H., Helmersson S., Malmodin B., Nyberg O., Pettersson A., Venerstad H., Danielsson-Tham M-L. A. Listeriosis patient infected with two different Listeria monocytogenes strains. Epidemicl and. Infec 2001; 128. 1: 105-106.
275. Tappero Y.W., Schuchat A., Deaver K.A., Mascola L., Wenger Y.D. Reduction in the incidence of human listeriosis in the United States: effectiveness of perevention efforts. YAMA. 1995; 273: 1118-1122.
276. Tienungoon S. Ratkowky D.A. McMeekin T.A. Ross T. Growth limits of Listeria monocytogenes as a function of temperature, pH, NaCl, and lactic acid. Appl. Environ. Microbiol.2000; 66. 11: 4979-4987.
277. U.S.Food and Drug Administration. Bacteriogical analytical manual, chapter 29- Listeria isolation, revised methods of analysis : notice. Fed. Registr. 1988; 53:44147-44153.
278. Yn. V.L., Miller W.P., Wing E.Y., Romano Y.M., Ruiz C.A., Brans F.Y. Disseminating Listeriosis presenting as acute hepatitis: case reports and review of hepatic involvement in Listeriosis. Am. J. Med. 1982; 73: 773777.
279. Van-Netten P., Perales J., van-de-Moosdijk A., Curtis G.D.W., Mossel D.A.A. Liquid and solid media for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and other Listeria spp. Int. J.Food. Microbiol. 1989; 8: 299316.
280. Van-Netten R, Perales Y, Van-de-Moosdijk A., Curtis G.D.W., Mossel D.A.A. Liquid and solid media for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes. J. Food Microbiol. R 1989: 299-316.
281. Vazguez-Boland Y.A., Dominguez L., Fernandez-Garayzabal Y.F., Suarez G. Listeria monocytogenes CAMP reaction. Clin Microbiol. Rev. 1992; 5: 343.
282. Vazguez-Boland Y.A., Dominguez-Bernal G., Gonzalez-Zorn B., Kreft Y., Goebel W. Patogenicity island and virulence evolution in Listeria. 2001. Microb. Int. 3: 571-584.
283. Vazguez-Boland Y.A., Kuhn M., Berche P., Chakraborty T., Dominguez-Bernal G., Goebell W., Gonzalez-Zorn B., Wehland Y., Kreft Y. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clin. Microbiol. Rev. 2001; 14: 584-640.
284. Varabioff Y. Listeriosis human. J. Food Prof. 1990; 53: 555.
285. Vidon D.Y.M., Andre P., Baaj D., Gryczka C., Philipp P. Lumionol-enhanced chemiluminescence by Listeria monocytogenes: a test for rapid assessment of antimicrobial agents.1994; 120:225-230.
286. Wagner M., Lehner A., Mademer A. //Differenzierung von humanpathogenen Listeria monocytogenes-Isolaten. Serotyp 4b mitteils Random Amplified Polymorphie DNA-Technik and DNA/DNA Hybridisierung//Wien.Tierarztl. Monatsschr.1997; 84. 3: 74-76.
287. Weaver R.F., Morphological, physiological, and biochemical characterization. In: Yames G.L. (ed.). Isolation and identification of Listeria monocytogenes. US Department of Health and Human Services, CDC, Atlanta 1989:3943.
288. Weinberg E.D., Pregnancy-associated depression of cell-mediated immunity. Rew. Infect. Dis. 1984; 6: 814-831.
289. Welshimer H.Y. Isolation of Listeria monocytogenes from vegetation. J.Bacteriol. 1968; 95.300-303.
290. Welshimer H.J. and Donker-Voet Y. Listeria monocytogenes in nature. Apl. Microbiol. 1971; 21: 516-519.
291. Wenger Y.D., Pinner R., Schuchat A., Pierce R., Broome C.V. Epidemiology of human Listeriosis, abstr. Program Abstr 30th Intersci. Conf. Antimicrob. Agents Chemother. ASM, Washington, D.C. 1990; 45: 324.
292. Wesley J.V., Ashton F. //Restriction enzyme analysis of Listeria monocytogenes stra ns associated with food-born epidemics Appl. And Environ. Microbiol. 1991; 57.4: 969-975.
293. Wesley I.V. Listeriosis in animals. E.T.Ryser and E.H.Marth (ed) Listeria, Listeriosis and food safety. 2nd. Marcel Dekker Inc. New York, NY. 1999: 39-73.
294. Wilhelms D. and Snadow D. Preliminary studies on monocine typing of Listeria monocytogenes strains. Acta Microbiol. Hung. 1989; 36: 235238.
295. Yousef Ahmed E., Ryser Elliot T., Marth Elmer H. Methods for improved recovery of Listeria monocytogenes from cheese //Appl. and Environ Microbiol. 1988; 54.11:2643-2649.
296. Zaika Laura L. Scullen O. Joseph.Fanelli Joseph S. //Growth inhibition of Listeria monocytogenes by sodium polyphosphate as affected by polyvalent metal ions //J. Food Sci. 1997; 62,4: 867.
-
Омарова, Салидат Магомедовна
-
доктора биологических наук
-
Махачкала, 2007
-
ВАК 03.00.07
- Экспериментальное обоснование разработки и усовершенствования селективных питательных сред для диагностики листериоза
- Психрофильность Listeria monocytogenes и ее эколого-эпидемиологическое значение
- Биологические особенности Listeria Monocytogenes и совершенствование методов их выделения
- Усовершенствование методов лабораторной диагностики листериоза
- Гетерогенность популяций Listeria monocytogenes по идентификационным признакам в окружающей среде и рыбных продуктах
