Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Психрофильность Listeria monocytogenes и ее эколого-эпидемиологическое значение

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Психрофильность Listeria monocytogenes и ее эколого-эпидемиологическое значение"

На правах рукописи

Беленева Ирина Алексеевна психрофильность Listeria monocytogenes и ее эколого-зпидеыиологическое значение

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток - 1996

Диссертация выполнена в лаборатории экологии патогенных бактерий НИИ эпидемиологии и микробиологии Сибирского Отделения РАМН

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, академик РАМН Г.П. Сомов Доктор биологических наук, профессор М.Ф. Дзадзиева

инициальные оппоненты:

Доктор биологических наук, с.н.с. Л.В. Шульгина Кандидат биологических наук, с.н.с. Г.П. Голодяев

Ведущая организация: Университет Дружбы народов им. П. Лумумбы

Защита диссертации состоится на заседании Диссертационного Совета К. 084 . 24.01 во Владивостокском государственном медицинском университете а ¿л" 1996 г. по адресу: 690600,

город Владивосток, проспект Острякова, 2, главный корпус.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского Государственного медицинского университета.

Автореферат разослан ^С™ 1996г.

•Ученый секретарь Диссертационного Совета -

кандидат медицинских наук, доцег~ " " Диго

О ' х

Актуальность проблемы. Листериоз - инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое бактериями рода Listeria. Из семи видов листерий патогенными являются только два - L. monocytogenes и L. ivanovii. Однако последний встречается крайне редко и его роль в патологии человека незначительна.

Листериоз широко распространен, он зарегистрирован в 65 странах мира. Возбудитель листериоза был открыт Е.Мюрреем, Р.Уэб-бом и М.Сваном еще в 1926 году, однако пик заболеваемости приходится на 80-е годы текущего столетия. Во время многочисленных вспышек болезни в этот период даже в высокоразвитых странах (США, Великобритания, Франция, Швеция и др.) летальность при листериозе составляла 24-40 % (B.D.Shetoman et al., 1985; V.Goulet et al., 1939).

Повышению удельного веса лисгериозной инфекции в патологии человека способствовала антропогенная транформация окружающей среды, влияющая, по-видимому, на условия репродукции возбудителя, пути передачи и восприимчивость отдельных групп населения.

Клинические проявления 'листериоза отличаются большим разнообразием. Описаны нервная, глазо-железистэя, ангинозно-септическая и септико-гранулематозная формы, нередко они бывают смешанными. Известна и хроническая форма, часто не проявляющаяся клинически, а также бактерионосительство. К грушам риска при листериозе относятся беременные женщины, ослабленные хроническими болезнями люди, старики, а также лица с различными формами имму-нодефицитов. Высокая смертность при вспышках листериоза (20-40 %) (V.Goulet et al., 1989) побудила Всемирную Организацию Здравоохранения предпринять ряд мер по борьбе с этой опасной инфекцией. В результате разработаны десятки селективных сред, экспресс-метода диагностики и система эпиднадзора. Однако в России до сих пор листериоз остается мало изученной и редко диагностируемой инфекционной болезнью, проходящей часто под другими диагнозами.

При анализе вспышек листериоза, имевших место в ряде стран Европы и США, не всегда удавалось установить источники заражения. Этот факт свидетельствует о том, что хотя листериоз и считается пищевой инфекцией, по-видимому, существуют другие, не известные пока пути инфицирования человека. Для решения этой проблемы необходимо глубокое изучение экологии листериозного микроба и эпидемиологии шфекции.

Средой обитания листерий является как организм животных и человека, так и окружающая среда (Х.Зеелигер, 1959; j.Weis, X.S&-

eliger, 1975), следовательно, они относятся к груше возбудителей салрозоонозов, обладающих как сапрофитными, так и паразитическими свойствами.

По данным В.И. Гершуна (1980), особенно интенсивное накопление микроба в окружающей среде происходит в осенний и весенний периода при относительно низких температурах. Зимой количество листерий в почве, растительных субстратах стабилизируется, а высокие летние температуры возбудитель перекивает в L- и Ft-формах.

Низкие температуры не только способствуют накоплению микроба в окружающей среде. Имеются публикации (F.Picard-Bonnand et al., 1989), показывающие, что низкие температуры способствуют повышению вирулентности листерий, находящихся в почве, а культуры, выращенные при +4°С, обладают повышенной устойчивостью к поглощению и перевариванию нейтрофилами человека (P.Stecha et al., 1989).

Однако эти единичные работы, посвященные какому-либо одному частному вопросу, не отражают концепции психрофильности патогенных бактерий в целом {Г.П.Сомов, 1985, Г.П.Сомов и соавт., 1991), которая позволила бы более глубоко изучить влияние низкой температуры на возникновение и развитие эпидемического и инфекционного процессов при лисгериозе.

Вышеизложенные факты свидетельствуют об актуальности выбранного направления исследования.

Цель настоящего исследования

Изучение в эксперименте экологии внеорганизменной популяции листерий в зависимости, от условий обитания, где основное внимание уделено анализу воздействия на популяцию низких температур.

Основные задачи работы.

1. Выделить штаммы L. monocytogenes из объектов окружающей среды в Приморском крае.

2. Усовершенствовать диагностику листериоза у больных и индикацию листерий в окружающей среде путем разработки эффективной и доступной для практики селективной среды.

3. Провести идентификацию выделенных штаммов с применением генетического метода - полимеразной цепной реакции.

4. Изучить влияние разных температурных условий на морфо-тинкториальные, культурально-биохимические и антигенные свойства штаммов Ь. monocytogenes.

5. Исследовать динамику размножения листерий в жидких питательных средах и объектах окружающей среды при низких температурах.

6. Изучить особенности штаболизма L. monocytogenes в различных температурных режимах при культивировании на синтетических минеральных средах.

7. Изучить влияние низких температур (б-8°С) на адгезивные и инвазивные свойства листерий.

8. Оценить изменение вирулентности популяции микробов под влиянием температуры культивирования (37°С и 6-8°С) на лабораторных средах, а также при длительном нахождении штаммов в объектах окружающей среда.

9. Изучить влияние температуры культивирования на подвижность и хемотаксис листерий в присутствии возможных аттрактантов и репеллентов.

Научная новизна и теоретическое значение работы - Впервые установлено, что L. monocytogenes обладают способностью к х&молитоавтотрофному питанию, ассимилируя углерод из неорганических соединений, прием в условиях культивирования при низких температурах (6-8°С) названное свойство более выражено, чем при температуре 37сС.

- Листерии являются миксотрофами, обладая способностью переходить от хемоорганогетеротрофии при нахождении в организме теплокровных к хемолитоавтотрофии при обитании в объектах окружающей ср&да.

- Установлено, что листерии являются О-стратегами, использующими преимущества г- и К-отбора.

- При изучении хемотаксиса L. monocytogenes при различных температурах культивирования микроба выявлен ряд аттрактантов а репеллентов. Кроме того, показано, что низкие температуры культивирования способствуют более сильному проявлению положительного таксиса по отношению к тканям органов теплокровных животных и тканям мускула морского гребешка, а также к вытяжке из силоса.

Экология внеорганизменной популяции листерий определяет эпидемиологию возбудителя, т.е. свойства, приобретенные ими при обитании в объектах окружающей среды при низких положительных температурах, способствуют возникновению эпидемического процесса.

- При изучении динамики размножения листерий в жидких питательных средах при 6-8°С установлено, что при низких температурах культивирования на бульоне Хоттингера происходит удлинение всех фаз роста бактерий, однако концентрация микробов к началу стационарной фазы достигает такого же уровня, как и при тепловом культивировании (37°0). Экономический коэффициент в расчете на глюко-

зу при 6-8°С был в четыре раза выше, чем при 37°С. При культивировании листерий на фосфат-но-солевом буферном растворе при 6-8°С бактерии размножаются в течение 1,5 лет (срок наблюдения).

- Впервые факт размножения листерий, а не сохранения в состоянии анабиоза при низкотемпературном культивировании- (6°С) подтвержден с использованием меченого по тритию тимидина, который встраивается в реплицирующуюся ДНК, что происходит только при делении клеток.

Практическая значимость. Практическая значимость работы заключается в создании достушой селективной среда для выделения листерий из различных объектов. С использованием этой среды впервые из морских объектов залива Петра Великого (морские беспозвоночные, рыбы, трава), а также из силоса и почвы пригородного фермерского хозяйства выделены штаммы L. monocytogenes. Показано, что возбудитель выделяется от людей из груш риска, а отсутствие регистрации заболеваемости обусловлено неудовлетворительным состоянием лабораторной и клинической .диагностики листериоза в Приморском крае. Полученные результаты позволяют дать ряд рекомендаций для санитарно-гигиенических целей, а также для 'усовершенствования диагностики и личной профилактики.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 182 страницах, содержит 12 таблиц, иллюстрирована 17 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (главы I, 2), описания материалов и методов (глава 3), экспериментальной части (главы 4-8), заключения, выводов и списка литературы, включающего 276 наименований, в том числе 138 работ иностранных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. L. monocytogenes является факультативным психрофилом и способны размножаться и накапливаться в объектах окружающей среды в услб'виях низких положительных температур.

2. Способность листерий выживать и размножаться в окружающей среде определяется их способностью ассимилировать углерод из неорганических соединений, т.е. они являются миксотрофами, и в зависимости от условий обитания используют как хемолитоавтотроф-ный, так и хемоорганогетеротрофный пути метаболизма.

3. L. monocytogenes в объектах окружающей среды при низкой температуре поддерживают, а при благоприятных условиях даже повы-

щают свою вирулентность, что и обеспечивает возможность возникновения эпидемического процесса.

Материалы и методы исследования

В работе использовано 8 музейных штаммов Listeria monocytogenes I и IV сероваров, а также 29 штаммов, выделенных нами от больных людей, животных и из объектов окружающей среда.

Выделение листерий проводили из морских беспозвоночных, рыо, водорослей, воды, почвы, силоса. Для накопления листерий в исследуемом материале использовали метод холодового обогащения (M.L.Gray et al., 1948). Выросшие на разработанной нами селективной среде колонии периодически просматривали в косо проходящем свете (M.L.Gray, 1957).

Подозрительные на листерхш колонии с селективной среды откалывали на среду Г.Д. Серова (1368), что очень ускоряло исследования.

Изучение морфологических, культуральных, биохимических свойств, а также определение способности листерий к синтезу некоторых ферментов проводили по общепринятым методикам, описанным в "Справочнике по микробиологическим и вирусологическим методам исследования", изданным под ред. M.Q. Биргера (1382).

Морфологию клеток исследовали при помощи оптического микроскопа (МЕИ - 15) и электронного микроскопа (JEM - 100 S) при увеличении 25000* и 62500х. Морфологию колоний изучали на трилтозном агаре, а также.на питательном агаре КЗ с глюкозой с добавлением трипафлавина и без него, с помощью установки для косого освещения колоний по Грею.

Явление диссоциации у листерий изучали в трех температурных диапазонах 6-8°С, при комнатной температуре и при 37°С.

Биохимические свойства музейных культур исследовали в двух температурных диапазонах 6-8°0 и 370°. Количество утилизированных глюкозы, лактозы и мелецитозы определяли фенол-серным методом (Биохимические методы... под ред. А.А.Покровского, 1963), а утилизацию ксилозы и глюкозы дополнительно исследовали с помощью метода бумажной хроматографии (М.М.ХМс, К.Мацек, 1962).

Подвижность определяли методом посева культуры .в столбик с 0,3 % агаром при 20°С, а также в препаратах висячей и раздавленной капли.

В качестве жидких сред для выращивания листерий использовали бульон для листерий (Методы общей бактериологии под ред. Ф.Гер-хардта, 1т, 1983), бульон Хоттингера и 0,1 М ФСБ с рН 7,2-7,4.

Определение чувствительности к антибиотикам проводили с помощью стандартных бумажных дисков, пропитанных соответствующим антибиотиком, на питательном агаре БД.

Кинетику роста штаммов L. monocytogenes изучали на бульоне Хоттингера с D.8 % глюкозы, и на 0,1 М .ФСБ с pH 7,2-7,4, в двух температурных режимах - при 6-8°С и 37°С.

Стадии роста, максимальную концентрацию (М) бактерий определяли по подсчету числа колоний, выросших на питательном агаре ВД. Продолжительность фаз роста определяли графическим методом. Время генерации (в мин.) и экономический коэффициент рассчитывали по С. Перту (1978).

Реакцию непрямой гемагглютинации (РИГА) ставили по общепринятой методике с эритроцитарным листериозшм диагностикумом, изготовленным Омским'НИИ природно-очаговых инфекций.

Антигенные свойства культур определяли по эффекту индукции антителогенеза в линейной реакции агглютинации с использованием антисывороток, полученных наш при иммунизации кроликов музейными штаммами листерий. Иммунизацию кроликов проводили по следующей схеме: взвесь микробов в физиологическом растворе, убитых прогреванием при +58°С в течение 30 мин. шестикратно вводили кроликам внутривенно в дозах I; I; 2; 2; Р.; 2 миллиарда микробных тел с интервалом 2 дня между первой и 2й инъекциями и I день - между остальными. Кровопускание проводили на 6-8й день после последней иммунизации (А.А.Триполитова, Г.В.Борисова, 1965).

Вирулентность культур определяли методом Кербера на неин-бредных мышах весом 14-16 г., при внутрибрюшинном заражении с вычислением и определением верхней и нижней границ доверительного интервала с вероятностью 95 % (И.П.Ашмарин, А.А.Воробьев, 1962), и в кератоконъюнктивальной пробе на морских свинках, внося в коныонктивальный мешок по I капле I млрд. взвеси бульонной культуры листерий.

Хемотаксис листерий изучали, применяя количественный и качественный методы, предложенные J. Adler (1973; 1975), а также использовали принцип метода "chemical In plug" (W.-W.Tso, J.Adler, 1974), отработанный на модели псевдотуберкулезного микроба (В.С.Венедиктов, 1988).

Стратегию жизни по Мак-Артуру (R.H.MacArtur et al., 1967) и персистирование листериозного микроба изучали при помощи метода почвенных колонок (Г.М.Ларионов, 1988).

Для установления способности листерий выживать в нестериль-

ной воде в различных, температурных диапазонах (при комнатной температуре и 6-8°С были поставлены опыты по заражению морской и ручьевой воды с регулярным}! высевами проб на селективную среду для определения числа КОЕ.

Возможность ассимиляции листешями 14С из соды Яан'4С0о в

о

растворенного состоянии в качестве единственного источника углерода изучали на синтетических минеральных средах, необходимых для этого возбудителя (Методы общей бактериологии под ред. Ф.Герхард-та, т.1, 1983).

Для окончательной идентификации выделенных штаммов применили метод амплификации ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) (R.Sa-iki et al., 1989). Праймеры для постановки ПЦР получены из института им. Я.Ф. Гамалеи РАМН.

В опытах по изучению инвазивных свойств листерий использовали методики, отработанные Н.Ф. Тимченко и соавт. (1988) на модели псевдотуберкулезного микроба.

Адсорбцию in vivo и динамику накопления листерий в печени и селезенке мышей изучали, используя метод, описанный R. Broach et ai. (19S2).

Для доказательства длительного размножения листерий при 6°С использовали радиоизотопный метод (Р.Адаме, 1985).

Все цифровые данные, полученные в результате исследований, подвергали статистической обработке (И.П.Ашмарин, А.А.Воробьев, 1962).

Результаты исследования

Выделение и идентификация штаммов L. monocytogenes. Для выделения листерий из различных объектов окружающей среды и от людей наш была разработана селективная среда, состоящая из питательного агара НД (г. Махачкала), трипафлавина, налидиксовой кислота и поломиксина В.

Всего обследовано 450 образцов различного материала, из которого выделено 29 штаммов Ъ. monocytogenes. Листерии выделены от людей (6 шт.), морских беспозвоночных (15 тт.), морской травы (1 шт.), рыб (2 шт.), силоса (4 шт.) и почвы (1 шт.).

идентификацию штаммов листерий, выделенных из различных объектов, проводили согласно Определителю бактерий Берджи (1984), в котором содержится наиболее полное на сегодняшний день описание свойств бактерий рода Listeria. Применение метода амплификации ДНК в полимеразной цепной реакции позволило подтвердить принадлежность бактерий к названному виду.

Таблица I

Биохимические свойства выделенных штаммов Ь.тглюсуЬонепеэ

Субстрат

Штаммы

1М 2М ЗМ 4М 5М 6М 7М 1А 2А ЗА 234 325 47 61 62 64 65

глюкоза

сахароза

лактоза

мелибиоза

ксилоза

мальтоза

фруктоза

раффиноза

мелецитоза

рамноза

арабиноза

сорбит

салицин

адонит

маннит

эснулин

дульцит

крахмал

глицерин

мочевина

лизин

аргинин

ф/алашш

+ + + + + + + + +.+ + + + + + + +

-- + + -- -- -- - - + + - + -

+ + + + +•+ + -- -- - + + + + +

+ + + + + + + + + + + + + 4 + + +

+ + + + + + + + + + +■ + + + + + +

+ + + + ■(- + +

- + - + -

+ + + + + + +

+ + + + + + + + + +- + + ++'•+ + +

+ + + + + + +>;+ + + + + + + +

+ + + + - + + + + + + + - + + + +

Г

Все штаммы обладали подвижностью при выращивании при комнатной температуре в столбике с полужидким агаром, и через несколько дней роста формировали зону наибольшего помутнения в виде раскры-

ш т а м м ы

67 74 jß ISI 8CN 10CN 12CN 7СИ Я КК 86 77

+ + + + + + + 4- + + + +

- - - - + + - + - - + +

+ - + - - - - + - + - -

- - - + + + - + + - + +

+ + ■h + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + +

- - - - - - - + - - + +

+ + + - - + _ + + + + +

+ ++ + + + + + + + + +

+ ++ + + + + + + + + +

+ -+ --- - + + + + +

того зонтика в верхней трети агаровой толщи.

Все выделенные нами штаммы, выращенные при 6°С, имели пери-трихиально расположенные жгутики (от I до 5 на клетку). Все штаммы расщепляли глюкозу, мальтозу, фруктозу без образования газа, гидролизовали салицин и эскулин в первые сутки роста и обладали способностью редуцировать 1% водный раствор метиленовой сини (табл. I). Бактерии проверенных штаммов не образовывали индол и сероводород, не обладали нитратредуктазой, не гидролизовали мочевину, не утилизировали цитратную среду Симмонса, не разлагали аргинин, лизин, орнитин и фенилаланин. Все они были оксидазоотри-цательными, каталазоположительными, не проявляли протеолитической активности.

Выделенные штаммы образовывали ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра, хорошо росли на 10 % солевом агаре и на 40 % желчном бульоне; проба с метилротом также была положительной.

Характер гемолиза у всех выделенных нами штаммов был типичным для Ь.шопоеуЪо^епеа и проявлялся одинаково как у музейных штаммов, так и у свежевыделешшх.

Морфология и биологические свойства штаммов листерий при низкотемпературном культивировании. При электронномикроскопичес-ком исследовании ультратонких срезов листерий нами обнаружены глыбки на поверхности клеточной стенки "холодовых" вариантов бактерий, которые,возможно, являются остатками капсульного вещества, и они менее выражены у бактерий, выращенных пря 37°С. "Тепловой" вариант листерий на ультратонких срезах имеет типичную овальную или удлиненную (на продольных срезах) и округлую (на поперечных срезах) форму. Клеточная стенка бактерий имеет слегка шероховатую поверхность. Она обладает трехслойной структурой, внутренний и наружный слои клеточной стенки уплотнены и резко осшофильны. В отдельных бактериях между клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной имеется тонкий промежуток. Цитоплазма бактериальных клеток представлена мелкогранулярным, равномерно распределенным материалом, степень осмиофильности которого неодинакова в различных клетках. В центре бактерий виден нуклеоид, представленный осмшфобнсй зоной. Изредка в цитоплазме бактериальных клеток обнаруживаются осмиофильные включения.

"Холодовой" вариант листерий на ультратонккх срезах имеет размеры, в 2 раза превосходящие размеры "теплового" варианта. Поверхность клеточной стенки обладает выраженной шероховатостью, на ней отмечаются фрагменты капсульного вещества. Осмиофобная

зона нуклеовда значительно разрежена и состоит из отдельных немногочисленных осмиофильных фибрилл ДНК. Деление клеток происходит посредством образования перегородки или поперечной перетяжки

0 образованием двух и иногда трех дочерних клеток.

Отмеченное нами увеличение размеров клеток листерий при низкотемпературном культивировании имело место лишь у одного из трех изученных штаммов (81) через четыре месяца регулярных пересевов на питательном агаре КД. У двух других штаммов (546 и Т) клетки "тепловых" и "холодовых" вариантов культур были одинаковых размеров.

Обнаруженные наш глыбки на поверхности клеточной стенки "холодовых" вариантов бактерий, возможно, являются остатками кап-сульного вещества, и они менее выражены у бактерий, выращенных при 37°С.

Диссоциация и культуральные свойства. Через 8 месяцев культивирования на питательном агаре КД с регулярными пересевами

1 раз в неделю при +-6°С все штаммы оставались в З-форме. Колонии "тепловых" вариантов культур, а также выращенных при комнатной температуре были очень рыхлыми, крупными и сильно отличались от колоний 8-формы. Колонии имели сухую консистенцию, крошились, при сдвигании с агара оставляли на пластинке белый след, края колоний были неровными, волнистыми. В физиологическом растворе хлористого натрия давали спонтанную агглютинацию. В мазке были видны агрегаты, состоящие из слипшихся клеток, и короткие цепочки из 3-5-7 толстых палочек. Однако названные формы, по-видимому, не относятся к истинной Н-форме, а являются ложной й-формой (Г.В.Ющенко, 1963), образующейся в результате давления температурного фактора (37°С, комнатная температура). После снятия его действия, в течение нескольких пассажей, происходила реверсия в исхожу» З-форму. Нам не удалось получить истинную Н-форму листерий, на трудность ее получения также указывает и X. Зеелигер (1959). Аналогичная картина наблюдается у псевдотуберкулезного микроба (Т.Н.Варвашевнч, 1978).

Ферментативные свойства. Листерии не проявляли ферментативной активности как при 37? так и при 6-8°С по отношению к углеводам -сахарозе, ксилозе, раффинозе, арабинозе, спиртам - манниту, инозиту, дульвдту, адониту, сорбиту, полисахаридам - крахмалу, аминокислотам - лизину, арншошу, орнитину, фенилаланину. Вероятно, отсутствие ферментов, расщепляющих данные субстраты, является стабильным генетическим признаком и не зависит от температуры

Рис.1. Электронно-микроскопическая фотография "холодового" (а) "теплового" (б) вариантов Ь. топосу1;о£епез штамм В. Увеличена >-. 25000.

культивирования.

IIo отношению к глюкозе, мальтозе, рамнозе, салицину и эску-лкну все штаммы проявляли высокую активность при 37°С в течение 18-24 часов. Культивирование бактерий на этих субстратах при 6-8°С приводило к значительной задержке ферментативной активности. Образование кислоты без газа на глицерине при 8°С отмечалось на 10-14 сутки. Таким образом, при низких температурах проявление биохимической активности значительно задерживается, что обусловлено увеличением времени генерации микробов.

Флагеллярный аппарат, подвижность и хемотаксис. Нами установлено, что практически 100% клеток, выращенных при 6-8°0 на МПБ, 0,1 М фосфатно-солевом буферном растворе рН 7,2-7,4, в почве, обладают несколькими (2-4) перит-рихиально расположенными жгутиками, тогда как только 1-2% клеток "тепловых" культур имеют по одному жгутику (рис. I). Исключение составил только штамм 7М, выделений нами из морской звезда Asterlas amurensis, клетки которого обладали выраженным жгутиковым аппаратом при "тепловом" культивировании. Таким образом, низкие положительные температуры способствуют формировании жгутиков у преобладающего количества штаммов Ъ. monocytogenes.

Напрямую с подвижностью бактерий связан хемотаксис - поведенческая реакция на изменение условий окружающей среды. Мы поставили перед собой задачу выяснить, одинаково ли реагируют бактерии, выросшие в разных температурных условиях, на наличие в среде аттрактантов и репеллентов.

Как показали результаты экспериментов, аттрактантами для лис-териозного микроба служат практически все утилизируемые им субстраты - глюкоза, лактоза, мелецитоза, рамноза, мальтоза, салицин и эскулин независимо от температуры культивирования бактерий. Кроме этого, обнаружен положительный таксис к ряду неутилизируемых субстратов, таких как маннит, аргинин, мелибиоза. Объясняется это, по-видимому, тем, что аттрактанты не всегда служат пищей, а иногда важны как индикаторы изменения экологической обстановки. Такая же ситуация возможна и с репеллентами. По мнению Б.В. Громова и Г.В. Павленко (1989), увеличение концентрации в окружающей сред© тех или иных химических веществ для бактерий может означать, что данная экологическая ниша уже занята другим бактериальным сообществом.

Репеллентами для листерий являлись цистеин солянокислый, глутаминоваа и аспарагиновая кислоты, а также валин, мочевина,

Рис. 2 . Динамика роста популяции листерий на бульоне Хоттингера с 0,8 % глюкозы при разных температурах культивирования по оси ординат - среднегеометрическое количество бактерий по оси абсцисс - время наблюдения I - бактерии культивировали при 6-8°С, 2 - при 37°С

часы сутки месяцы

Рис. з Динамика роста популяции листерий на 0,1 Н фосфатно-солевом буфере при разных температурах культивирования

то оси ординат - среднегеометрическое количество бактерий по оси абсцисс - время наблюдения I - бактерии культивировали при 6-8°С, 2 - при 37°С

бромистый натрий, калий хромовокислый и Ь-нафтол.

Нами отмечен положительный таксис листерий к вытяжкам из силоса и ткани мускула морского гребешка, причем в количественном выражении таксисная реакция к названным субстратам была выше у бактерий, выращенных при 6°С по сравнению с "тепловым" вариантом микробов. Более выраженный таксис "холодовых" вариантов листерий обнаружен и по отношению к тканям органов мыши. Следовательно, можно предполагать, что это свойство бактерий дает им преимущество при инициации инфекционного процесса.

Динамика размножения листерий в жидких питательных средах. Графическое отражение динамики размножения листерий в указанных условиях приведено на рис. 2, 3. При культивировании микроба на бульоне Хоттингера с 0,8 % глюкозы в условиях термостата кривая роста имела классическую З-форму. Лаг-фаза была самой короткой и составляла в среднем два часа, концентрация бактерий в этот период оставалась на исходном уровне. Логарифмическая фаза была четко выражена и продолжалась 20 часов, время генерации составляло 2,7 часа. Концентрация бактерий к началу стационарной фазы увеличивалась на 5,0-5,5 по сравнению с исходным уровнем и достигала в среднем Ю9 КОЕ/мл. Стационарная фаза была короткой и продолжалась всего три часа. Гибель культуры наступала на 8-25 сутки в зависимости от штамма.

При культивировании микроба на бульоне Хоттингера в условиях низких температур 6-8°С лаг-фаза была в 2,5 раза длиннее, чем при 37°С, и составляла пять часов. Логарифмическая фаза продолжалась шесть суток протиБ 20 часов теплового культивирования. Однако к началу стационарной фазы концентрация микробов была практически на уровне теплового культивирования (9,2 1®)- Время генерации при 6-8°С составляло 17,8 часов, что в 6,5 раз больше, чем при температуре 37°С. Стационарная фаза длилась трое суток, затем происходило снижение количества бактерий на три логарифма, которое оставалось на этом уровне в течение двух месяцев. К четырем месяцам культивированияя концентрация листерий снижалась до двух логарифмов.

Для доказательства факта размнокения бактерий при низкой температуре наш был использован меченый по тритию тимидин, т.к. известно, что он встраивается только в реплицирующуюся ДНК. Результаты этого исследования отражены на рис. 4. Таким образом было доказано, что при низкой температуре 6-вЯс происходит захват и включение меченого тимидана в ДНК.

л

I \

1 \ ' \ I * I V 1 V I *

Рис. 4 Активность включения 3Н - тимидина в клетки листериозного микроба на разных стадиях роста культуры при 37°С и 6-8°С на МПБ•

По оси ординат - число импульсов радиоактивной метки в тыс. ими./мин.

/\

/ \

\ / \ '

сутки

60

Кинетика роста листерий на фосфатно-солввом буфере в условиях низких температур имела свои особенности. Лаг-фаза го продол жительности была такой же, как и на бульоне. Это указывает на то, что время адаптации микроба практически не зависит от питательного субстрата, а обусловлено главным образом температурой. Логарифмическая фаза роста листерий на фосфатно-солввом буфере при тепловом культивировании была в 3,6 раз короче, чем на питательной среде. Время генерации составило 4,6 часа, т.е. увеличилось по сравнению с таковым на бульоне Хоттингера в 1,7 раза. Стационарная фаза по продолжительности была одинаковой. Однако к началу стационарной фазы количество КОЕ было на два логарифма ниже, чем при 37UC, и составляло 6,5 логарифмов. Гибель культуры при температуре 37°0 на голодной среде наступала быстрее, чем на бульоне. Сочетание голодной среды и высокой температуры, по нашим наблюдениям, является наиболее неблагоприятным для популяции листериозного микроба.

Стратегия жизни L.monocytogenes. После изучения динамики роста листериозного микроба на лабораторных средах при разных температурах важно было узнать, каким образом ведет себя популяция листерий в условиях, в какой- то степени приближенных к естественным, т.е. изучить стратегию жизни листериозного микроба по Мак-Артуру (R.H.Mac Arthur» E.O.Wilson, 1967).

При обитании листерий в почве (рис.5) характерным было отсутствие резких колебаний численности в течение всего срока наблюдения (8 мае.), за исключением первых суток, что объясняется стрессовой ситуацией для бактерий при резкой смене условий обитания. Как при 6-8°С, так и при комнатной температуре популяция быстро достигала уровня стабилизации, причем при более низкой температуре он был на один порядок выше, и находилась на нем на протяжении всего срока наблюдения. Температура 6-8°0 способствовала сохранению бактерий в S- 'форме, тогда как при более высоких температурах происходила диссоциация листерий к R- форма.

Из ручейной воды при ее экспериментальном заражении (рис. 6) листерии выделялись только в течение ЗБ суток при комнатной температуре, а при "холодовом" культивировании 6-8°С популяция существовала в течение всего срока наблюдения (8 мес.). Б морской воде гибель популяции наступила к 13-15 суткам культивирования вне зависимости от температурных условий. Следовательно, популяция листерий хорошо приспособлена к обитанию в ручейной воде при низких температурах, тогда как морская вода не является для них

сутки месяцы

Рис. 5 • Динамика численности популяции листерзй в почве

по оси ординат - среднегеометрическое количество бактерий по оси абсцисс - время наблюдения

Тт+ - почва бурая лесная типичная, зарьгэнная штаммом 1-.т., комнатная температура Тт~ - почва бурая лезная типичная, зараженная штаммом 1_.т., 6-8°С

Рис. 6 . Динамика численности популяции листерий в воде

по оси ординат - среднегеометрическое количество бактерий в I мл то оси абсцисс - время наблюдения

в.м.+ - вода морская, 16-20°С в.р.+ - вода ручейная, 16-20°С в.м." - вода морская, 6-8°С в.р.~ - вода ручейная, 6-8°0

благоприятной средой обитания.

На основании анализа данных о выживаемости популяции листе рий в нестерильной почве и воде L.monocytogenes можно отнести к K-стратегам, способным длительное время поддерживать численность популяции на высоком уровне б условиях конкуренции с другими почвенным микроорганизмами. При тепловом культивировании (37°С) на богатой и голодной средах лисгерии вели себя как г-стратеги. Их численность быстро возрастала и достигала максимальной концентрации, а затем следовал резкий ее спад и гибель популяции. Обобщая полученные материалы, мы пришли к заключению, что по-видимому, листериозный микроб следует отнести к С-стратегу, сочетающему преимущества г- и K-отбора (Одум Ю., 1986; Ларионов Г.М., Беляков В.Д., 1990). Обе стратегии направлены на достижение одной цели -выживание популяции листэрий.

Особенности метаболизма L. monocytogene3. Возможность ассимиляции листериями углерода из неорганических соединений изучали на синтетических минеральных средах, содержащих меченый по углероду бикарбонат натрия в качестве единственного источника углеродного питания. Результаты исследований показаны в табл; 2.

Нами установлено, что при культивировании возбудителя на ФСБ происходит- наиболее интенсивная ассимиляция неорганического углерода (45,3»).

С целью оптимизации среды культивирования в фосфатно-солевой буфер мы вводили различные микроэлементы. Однако, как показали результаты экспериментов, добавление микроэлементов не только не стимулировало ассимиляцию углерода, а наоборот, снижало ее. Так, при добавлении широкого ряда минеральных солей по Хиршу (В.Bowlen, W.P. Schiegel, 1982) общий захват изотопа составил 8,4 %, а включение в состав фосфатно-солевого буфера более узкого набора микроэлементов по Классовскому (JI.H. Классовский и соавт., 1965а) увеличило захват углерода до 10,1 %. По-видимому, в составе микроэлементов могли быть ■-■ингибиторы изучаемого процесса.

На богатой органическими веществами среде (бульон КД) при низкотемпературном культивировании +(6-8°0) листерии активно ассимилировали неорганический углерод, введенный в бульон в виде гидрокарбоната натрия (35,6%), тогда как при температуре 37иС интенсивность ассимиляции была достоверно меньше * (4,13%) (р<0,05).

Следовательно, низкая температура культивирования является стимулирующим фактором для процесса утилизации неорганического

Таблица 2

Ассимиляция листвриямк неорганического углерода при культивировании на жидких синтетических средах при низкой температуре

Среда культивирования Процент захвата радиоактивной метки при температуре культивирования 6°С (Х-т)

Фосфатно-солевой буфер 45,9 - 8,5 (2,90 %)

ФСБ + микроэлементы по Хиршу 8,65 - 0,65 (7,07 %)

ФСБ + микроэлементы по

Хиршу без солей аммония 0,19 i 0,61 (1,17 %)

ФСБ + микроэлементы по

Классовскому 10,1 (5,86 %)

Примечание: в скобках в таблице указан процент ошибки, рассчитанный по Э.А. Доис (1983) для учета поправки, на фоновый шум при использовании метода радиоактивных изотопов.

углерода, и именно температура, а не состав питательной среды, является "сигналом" для перестройки метаболизма внеорганизменной популяции листерий на хемолитоавтотрофный путь питания. Переход от хемоорганогетеротрофии к хемолитоавтотрофии свидетельствует о большой метаболической пластичности листерий.

Адгезивные и инвазивные свойства листерий. Как известно, для L. monocytogenes характерно наличие двух сред обитания - окружающая среда и организм теплокровных (Г.П.Сомов, В.Ю.Литвин, 1988). Учитывая литературные сообщения о повышении вирулентности листерий при низких температурах (R.D.Jaegers, D.M.Myers, 1954; K.L.Gray, A.H.KlllInger, 1966; F.F.Stecha, 1989), нами была поставлена задача изучить влияние низких температур на реализацию некоторых патогенных свойств листерий.

В результате проведенных исследований было установлено, что адгезивные и инвазивные свойства листерий увеличивались при низкой температуре культивирования возбудителя (96,Ъ% и 97,3% клеток культуры Vero -Е6 инфицировано листериями) и ослабевали при 37°С (51,6% и 42,5% пораженных клеток).

Количество проникших внутрь клеток бактерий через i час вза-

модействия также зависело от температуры, при которой до этого сультивировались листерии (табл. 3).

При "холодовом" культивировании в клетки проникало достовер-ю большее количество листерий. Через 24 часа происходило значительное накопление внутриклеточных бактерий "холодового" варианта, тогда как количество "тепловых" микробов за этот период уве-тичилссь незначительно, что говорит о более выраженном внутриклеточном размножении листерий, выращенных при 6-8°С

Таблица 3

Указатели взаимодействия Ъ.топосу-^епез, выращенных при 6°С и 37°С с культурой клеток Уего-Еб в течение 3 суток(определение ;реднегеометрического количества жизнеспособных внутриклеточных 5актерий)

Длительность Температура куль' тивирования бактерий

контакта Штаммы 6-8°С 37°С

бактерий с клетками числа внутриклеточных бактерий /мл (Х-га)

I час П. 2,3 ± 0,3 1,39 £ 0,16

А 1,8 - 0,5 1,20 + 0,20

24 часа П. 3,2 - 0,28 1,61 + 0,12

А. 3,4 - 0,36 2,12 + 0,31

48 часов П 3,28 — 0,22 1,83 + 0,51

А 2,82 - 0,17 1,60 4- 0,20

72 часа П 1,25 - 0,38 1,47 + 0,10

А 1,34 ± 0,14 1,20 + 0,09

Примечание: для всех показателей р<0,05.

При изучении адгезии 1п у!уо и динамики численности листерий зо внутренних органах белых мышей при внутрибрюшинном способе заражения (рис. 7) нами установлено, что уже через 15 мин. после заражения микробы обнаруживались в печени и селезенке. Обсеменен-юсть органов бактериями, выросшими при 6-8°С, была значительно жше, чем при температуре 37°С. При этом наблюдалось увеличение

4Р 3,0 2,0

1,0

lg 15

мин. час

2

час.

5 12 час. час.

1 2 5 7 9 12 14 21 су т. су т. су т. сут. сут. сут. сут. сут.

4,0

3*0 2,0

1,0

Р

1 1

Й -V!

го

СП

15 I 5 12 I 2 5 8 10 14 21 мин. час час. час. сут. сут. сут. сут. сут. сут. сут.

Рис. 7. Показатели адсорбции in vivo в различные сроки после внутрибршинного

л

заражения животных листериями в дозе 10 мк А -среднегеометрическое количество бактерий в печени, Б - в селезенке (по оси ординат), по оси абсцисс -время, прошедшее после заражения животных листериями

□ -

мышей заражали бактериями, выращенными при температуре 6-6 G

- при температуре 37 С

размеров печени и селезенки и наличие на них некротических узел ков, тогда как в органах мышей, зараженных "тепловыми" листерия-ми, описываемые изменения были выражены слабо.

После 5 суток с момента заражения происходил спад численности листерий во внутренних органах. К 10 суткам бактерии "тепловых" вариантов элиминировались из органов, тогда как "холодовые" высевались в течение 22 суток (срок наблюдения).

Перечисленные особенности характеризуют Ъ. топосу^епез как микроорганизм, хорошо приспособленный к обитанию в окружающей среде с ее низкими и постоянно меняющимися температурами. Реализация психрофильных свойств позволяет микробу накапливаться в объектах окружающей среды, а способность при этом не терять, а при благоприятных условиях и повышать свою вирулентность определяет возможность заражения листериозом теплокровных животных и человека из окружающей среды.

Следовательно, Ь. гпопоеукс^епез относится к факультативным паразитам, обладающим двойственной (сапрофитной и паразитической) природой. Генетическая программа листерий обеспечивает игл возможность непрерывно переходить из окружающей среды, где они ведут сапрофитный образ жизни, в теплокровный организм, в котором они проявляют свои паразитические свойства, и снова реверсировать к сапрофитизму при возврате в окружающую среду.

ВЫВОДЫ

1. Ь. топосу^одепез является факультативным психрофшюм и способны длительное время размножаться в условиях низких положительных температур, что доказано с помощью меченого по тритию тимидина при температуре 6-8°0.

2. При изучении местообитаний листерий в окружающей'среде из различных объектов (морские беспозвоночные, морская трава, рыбы, почва, силос), а также от людей выделено 29 штаммов листерий. Их принадлежность к вида Ь. шопосу^епез доказана комплексом классических микробиологических методов и подтверждена генетическим методом амплификации ДНК в полимеразной цепной реакции.

3. Результаты изучения кинетики роста листерий при температурах 6-8°С и 37°С на фосфатно-солевом буфере и на бульоне Хот-тингера показали, что они способны длительно размножаться при низкой температуре и быстро погибают при 37°0. Сочетание голодной среды и высокой температуры является наиболее неблагоприятным для популяции листериозного микроба.

4. При изучении патогенных свойств L. monocytogenes установлено, что низкие положительные температуры способствуют сохранению, а в некоторых случаях и повышению вирулентности внеорганиз-менной популяции листерий.

5. Установлено, что культивированные при температуре 6-8иС жстерии при внутрибркшшном введении в организм теплокровных животных быстрее и в больших количествах обсеменяют внутренние органы, чем культуры, выращенные при температуре 37°С.

6. Подтверждена способность популяции листерий длительное время размножаться в почве и ручейной воде при низких положительных температурах. Морская вода является для данного микроорганизма неблагоприятной средой обитания.

7. Впервые установлено, что Ь. monocytogenes способны ассимилировать углерод из неорганических соединений, что говорит о наличии у этого вида хемолитоавтотрофного типа метаболизма.

8. Способность переходить от хемоорганогетеротрофии к хемо-литоавтотрофии при выведении из теплокровного организма в окружающую среду и реверсировать к хемоорганогетеротрофии при внедрении в организм теплокровных свидетельствует о миксотрофии листе-риозного микроба.

9. Стратегия жизни внеорганизмэнной популяции листерий определена как С-стратегия, сочетающая в себе преимущества г- и К-отбора.

10. При изучении хемотаксиса листерий выявлен ряд аттрактан-тов (глюкоза, лактоза, мелецитоза, рамноза, мальтоза, салицин, эскулин, мелибиоза, аргинин и маннит) и репеллентов (цистеш солянокислый, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, мочевина, L-нафтол, калий хромовокислый). Кроме того, установлено, что у "холодовых" вариантов бактерий таксисные реакции по отношению к тканям органов мыши и ткани мускула морского гребешка, а также к вытяжкам из силоса выражены более сильно, чем у "тепловых" вариантов .

II. Усовершенствована диагностика листериоза применением разработанной автором селективной среды и использованием известной среды Г.Д. Серова (УСС) по новому назначению.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

I. Влияние низких температур на функциональное состояние возбудителя листериоза //' II Мэждунар. симпозиум фонда медицине-

2 9

;:с-го осданз ьпопш:, Роесдд. и с~и-зк СеЕеро-Ьсстс-'шса Аггз': Нрогре-даа 2 ддддсы докладов» 13-21 еедт. 1994. Владивосток, Россик. С. .431 -'соавторы ¿.Н.Еыдддодй, Л.С.Буголеда/.

2. Сравнительно? дгудёнд^ оиоздщпчесддх г-усдсгв

-юн радндд температурах дудд':пд1:родздпд /,•' сдедгддд патогенных бчкддрпд .-ССорьш; научней рдосг). ИовосдСпрсд, 1994. с. 164-171 (соавтор А.Н.Бистроьа).

С-. Лзстерш-1 и ддетграоз -'/ Вгстинк ЛБО ГАИ, 1955. ^ 3. •?''-'■:—1-5 '.соавтор А.К.Бдстрс-да).

4. К вопрос)/ о стр&тет'пк казня ьнесргзшгшнной популяции шоп-м^ддепег- /-' с-кодогия человека :т дедпсдна труда •' Обдрндн докладов ксн^эрёнддн ''Сегрэкенные проблем одранд окрудд-дддд среды 5 Скбидк". 11овсд:/дн?дк, 1995.

5. Психрсфилъностъ патогенных бактерий (йколсго-дддддмдслогдчесное зндчение - // Вестник Ш20 ГШ. 129а. $ I. 0.

(соаддорд Г.П. Ссмов» К.Ф. Ъшчендо, М.Ф. ГддддиеБй, Л.С. Бузодева).