Система анализа микробиологических и молекулярно-генетических маркеров для выявления высоковирулентных штаммов Listeria monocytogenes

Зайцева, Елена Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Система анализа микробиологических и молекулярно-генетических маркеров для выявления высоковирулентных штаммов Listeria monocytogenes
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Система анализа микробиологических и молекулярно-генетических маркеров для выявления высоковирулентных штаммов Listeria monocytogenes"

06460IS79

На правах рукописи

Зайцева Елена Александровна

СИСТЕМА АНАЛИЗА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЫСОКОВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ LISTERIA MONOCYTOGENES

03.02.03. - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 3 МАЙ 2010

Москва 2010

004601879

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН (г. Владивосток) и Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН (г. Москва)

Научные консультанты:

Академик РАМН,

доктор медицинских наук, Г ТТ.

, Сомов Георгии Павлович

профессор 1-

Доктор биологических наук Ермолаева Светлана Александровна Официальные оппоненты:

Академик РАМН, д.м.н., профессор Сергиев Владимир Петрович Член-корр. РАМН, д.м.н., профессор Брико Николай Иванович Доктор медицинских наук Шагинян Игорь Андроникович

Ведущая организация:

ФГУН «Санкт-Петербургский Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»

Защита состоится «Д/» .АЛО^ 2010 г. в '11 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.007.01 в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Автореферат разослан « ¡¡Я» С г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, д.м.н., профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Последние 20 лет характеризуются существенным увеличением интереса ученых и клиницистов к листериозной инфекции. Он обусловлен многочисленными эпидемическими вспышками листериоза в развитых странах (Франция, США, Германия, Испания и т.д.), связанными с употреблением в пищу продуктов, контаминированных листериями. В то время как до 1980-х годов листериоз был относительно редкой инфекцией, регистрируемой преимущественно среди людей, связанных с животноводством, в настоящее время он является одной из ведущих пищевых инфекций в Европе и Америке с летальностью до 20-40% (ВОЗ, 1988, Farber J.M., Peterkin P.I., 1991). Причины подобного изменения эпидемической ситуации до сих пор остаются до конца невыясненными. Отчасти, увеличение заболеваемости листериозом связано с длительным хранением пищевых продуктов при низкой температуре, что способствует размножению в них листе-рий при первично слабой контаминации ими. С другой стороны, нельзя исключать возможности изменения свойств штаммов листе-рий, циркулирующих в окружающей среде и представляющих опасность для человека.

В Российской Федерации заболеваемость листериозом у людей регистрируется с 1991 г. (Опочинский Э.Ф., 2001, Тартаковский И.С. и др., 2002). Однако официальная статистика (40-100 случаев в год) не отражает реального состояния заболеваемости листериозом, что обусловлено не только разнообразием клинических форм болезни, но также недостаточной осведомленностью врачей об особенностях проявления этой инфекции и нехваткой недорогих отечественных селективно-дифференцирующих сред и тест-систем для ее лабораторной диагностики.

Наряду с этим проблема листериоза становится все более актуальной в связи с увеличением случаев заражения его возбудителем людей со сниженным Т-клеточным звеном иммунитета. Одним из важных остается вопрос о распространении листериозной инфекции у беременных женщин, в связи с возможностью внутриутробного инфицирования плода, часто сопровождающегося абортами, мертворо-ждениями и высокой летальностью среди новорожденных.

Основная масса эпидемических вспышек пищевого листериоза, зарегистрированных начиная с 1982 г., связана с этиологическим зна-

чением относительно узкой филогенетической группы внутри вида Listeria monocytogenes, характеризующейся принадлежностью к серо-группам 4Ь (около 90% эпидемических случаев), 1/2а и 1/2Ь. Однако до сих пор неизвестно, какие именно свойства эпидемических штаммов L.monocytogenes обусловливают их высокую опасность. Остаются невыясненными биологические особенности L.monocytogenes, обитающих в разных экологических условиях. Особый интерес представляет вопрос о патогенных свойствах листерий, выделяемых из продуктов питания и объектов окружающей среды.

Практически отсутствуют работы, в которых была бы отражена характеристика листерий, обитающих в природе, а также дано сравнение их с эпидемически значимыми штаммами, что в настоящее время представляется важным ввиду возможности заноса высоковирулентных штаммов L.monocytogenes в окружение человека из природных очагов.

Решение перечисленных вопросов, связанных с биологией и вирулентностью возбудителя листериоза, а также с закономерностями эпидемического процесса этой инфекции, может быть осуществлено на основе микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга за возбудителем с применением эффективных методов диагностики и созданием современных систем для типирования штаммов листерий. Все вышесказанное определило направление исследований, предпринятых в данной работе.

Цель работы: разработать систему микробиологических и мо-лекулярно-генетических маркеров, позволяющую выявлять высоковирулентные штаммы L. monocytogenes, необходимую для контроля распространения листериозной инфекции.

Задачи исследования:

1. Разработать комплекс методов и средств для выделения и идентификации бактерий рода Listeria из различных источников окружающей среды, получить коллекцию дальневосточных штаммов листерий.

2. Дать характеристику микробиологических свойств и патогенного потенциала штаммов L.monocytogenes, изолированных из различных источников в Дальневосточном регионе России, и провести их сравнительный анализ со штаммами L.monocytogenes, выделенными в Европейской части России. В экспериментальных условиях установить влияние абиотических факторов на вирулентность штам-

mob L.monocytogenes.

3. Изучить молекулярно-генетические особенности штаммов L.monocytogenes, выделенных из различных объектов на Дальнем Востоке и в Европейской части России, и дать оценку их эпидемиологической значимости.

4. Выявить генетические маркеры, характерные для эпидемически значимых штаммов L.monocytogenes.

5. На основе особенностей генетического полиморфизма штаммов разработать систему типирования L. monocytogenes и дать филогенетическую характеристику бактерий вида L.monocytogenes, распространенных на Дальнем Востоке Российской Федерации.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

• Выявлено генетическое разнообразие бактерий рода Listeria, распространенных на Дальнем Востоке Российской Федерации, в том числе патогенного вида L.monocytogenes. Показано преобладание в данном регионе сероварианта 4Ь, опасного в эпидемическом плане для людей. Создана коллекция дальневосточных штаммов бактерий рода Listeria.

• Впервые доказано, что, несмотря на сходство морфологических, культуральных и биохимических свойств, штаммы L.monocytogenes из дальневосточной и европейской частей РФ могут быть дифференцированы с помощью методов молекулярно-генетического типирования. Установлены существование регион-специфического распределения штаммов L.monocytogenes на территории РФ, а также поликлональность распределения штаммов этого вида внутри регионов (Европейская часть РФ, Дальний Восток).

• Впервые в сравнительном аспекте изучены гены, кодирующие факторы адгезии и инвазии - белки семейства интерналинов (inlA, inlB, inlC, inlE, inlG, inlH, inlF), белки ActA, Auto у штаммов L. monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части России из различных источников. Определены последовательности генов inlA, inlB, inlC, inlE, prs у штаммов L.monocytogenes, часть из которых (345 фрагментов) депонированы в базу данных международного GenBank,

• Установлено, что штаммы L.monocytogenes, выделенные из эукариотических организмов, включая человека, имеют гены inlA, inlB, inlC, inlE, независимо от региона выделения; гены in IF, inlG, inlH являются штаммоспецифическими.

• Впервые установлена корреляция между развитием внутриутробной инфекции и аллелем фрагмента генов inlA и /л/С, кодирующего функционально-значимый домен (LRR-домен) факторов инвазии InlA и InlC, у штаммов L.monocytogenes. Высказано предположение о том, что развитие внутриутробной листериозной инфекции плода у беременных женщин может быть связано с определенными вариантами белков InlA и InlC возбудителя. Получены свидетельства значимости генов inlA и ш/С как маркеров штаммов L.monocytogenes, представляющих повышенную опасность для развития листериозауплода.

• Впервые показано, что выявленные среди диких грызунов и морских гидробионтов штаммы L.monocytogenes могут обусловливать внутриутробную инфекцию у человека, что предполагает возможность заноса вирулентных штаммов L.monocytogenes из окружающей среды в антропогенные системы.

• Выявлено изменение адгезивных свойств бактерий рода Listeria, включая вид L. monocytogenes различных серовариантов, под влиянием температуры, кислотности среды (рН) и экзогенной дезок-сирибонуклеиновой кислоты. Установлено, что при температуре 4-8°С, рН = 6,0 и 8,0 повышаются, а при температуре 37°С и рН = 9,0 снижаются адгезивные свойствах, monocytogenes.

Теоретическая значимость работы определяется тем, что впервые в сравнительном аспекте представлена комплексная характеристика микробиологических и молекулярно-генетических особенностей бактерий вида L.monocytogenes, выделенных из различных объектов на территории Дальнего Востока и Европейской части России. Установлены молекулярно-генетические маркеры, характеризующие высоковирулентные штаммы L.monocytogenes. Полученные результаты имеют фундаментальное значение для микробиологии и эпидемиологии, поскольку расширяют представление о патогенных бактериях рода Listeria, распространенных на территории Российской Федерации, а также дополняют и уточняют знания о развитии инфекционного процесса при листериозной инфекции.

Практическая значимость работы

• Предложена модифицированная схема выделения и идентификации листерий с использованием сконструированных для этих целей запатентованных дифференциально-диагностической среды для листерий, комплексной индикаторной среды для дифференциации бактерий рода Listeria, питательной среды на основе молок лососевых рыб (жидкой, сухой и плотной) для

севых рыб (жидкой, сухой и плотной) для культивирования бактерий. Создана коллекция дальневосточных штаммов бактерий рода Listeria. Разработанные среды и диагностические методы рекомендованы для проведения мониторинга за возбудителем листериоза в бактериологических лабораториях санитарно-эпидемиологического и ветеринарного надзора, а также в лечебно-профилактических, научно-исследовательских и учебных учреждениях как для целей диагностики инфекционных заболеваний человека и животных, так и для целей сертификации продуктов питания.

• Предложен оригинальный метод генетического типирования изолятов L.monocytogenes на основании последовательностей фрагментов генов inlA, MB, inlC, inlE и prs, позволяющий дифференцировать эпидемически несвязанные изоляты листерий с индексом дискриминации 0,982.

• На основе полимеразной цепной реакции разработан способ детекции специфических для L.monocytogenes генов, кодирующих белки-интерналины (inlA, inlB, inlC, inlE). Результаты комплексного изучения генов, кодирующих белки-интерналины, могут служить базой для анализа принадлежности штаммов листерий к определенной филогенетической линии и для оценки их эпидемиологической значимости.

• Установлен спектр антимикробных препаратов, к которым резистентны штаммы L.monocytogenes, выделенные на Дальнем Востоке, что позволяет совершенствовать рациональную схему этиотроп-ной терапии листериоза у больных.

• Полученные результаты микробиологических и молекулярно-генетических исследований могут быть использованы в исследованиях при изучении факторов патогенности L.monocytogenes, а также при создании новых диагностических и терапевтических препаратов.

• Депонированные в GenBank нуклеотидные последовательности штаммов L.monocytogenes имеют значение при проведении научных исследований, поскольку они могут быть использованы при ти-пировании вновь выделенных штаммов L.monocytogenes, а также для уточнения данных об их происхождении и для установления связи различных генетических вариантов с течением и проявлениями лис-териозной инфекции.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Существует полиморфизм факторов инвазии - семейства бел-ков-интерналинов - у L.monocytogenes, основного возбудителя листе-риоза. Все культуры L.monocytogenes, выделенные из эукариотиче-ских организмов, независимо от региона изоляции, обладают генами tnlА, inlB, inlE, inlC.

2. Молекулярно-генетическое типирование L. monocytogenes на основании полиморфизма генов inlA, inlB, inlE, inlC и prs позволяет дифференцировать филогенетически удаленные штаммы, штаммы, циркулирующие в географически удаленных областях, а также эпидемически несвязанные между собой изоляты листерий.

3.Для L. monocytogenes, выделенных на территории РФ, характерны регион-специфическое распределение штаммов и поликло-нальность распределения штаммов внутри регионов (Европейская часть РФ, Дальний Восток).

4. Имеется связь между филогенетическим положением штамма L.monocytogenes и его эпидемиологическим потенциалом. Среди L. monocytogenes из клинического материала, от грызунов и морских гидробионтов преобладают штаммы листерий, относящиеся к первой филогенетической линии; среди L. monocytogenes из продуктов питания доминируют штаммы, относящиеся ко второй филогенетической линии.

5.Эпидемически значимые штаммы L.monocytogenes, вызывающие внутриутробную листериозную инфекцию плода у человека, распространены в объектах окружающей среды в Дальневосточном регионе, в том числе среди диких грызунов, морских гидробионтов и в пищевых продуктах, реализуемых в торговой сети.

6. Выявлена корреляция между нуклеотидной последовательностью аллелей генов, кодирующих определенные факторы инвазии, и частотой выделения несущих эти последовательности штаммов L.monocytogenes от разных хозяев.

Материалы диссертации были использованы при подготовке:

1. Информационно-методического письма «По правилам взятия, доставки, методам лабораторных исследований материала от больного с подозрением на ООИ, сроки выдачи результатов» авторов Кизиловой М.Д., Коленченко Г.Н., Просянниковой М.Н., Зайцевой Е.А. Разработано и одобрено Лабораторным советом ФГУ ЦГСЭН в Приморском крае (Решение № I от 25.04.02.). Владивосток. - 2002.

2. Методических рекомендаций «Лабораторная диагностика лис-териоза» авторов Е.А.Зайцевой, Г.П. Сомова, JT.C. Бузолевой, Т.А. Глазыриной. Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. - 2006.

3. Информационного письма «Listeria monocytogenes - новый микробиологический показатель опасности пищевых продуктов» авторов Л.Н.Федяниной, Е.А.Зайцевой, Т.Н. Каленик, В.Б.Светлова. Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. - 2006.

4. Методического пособия для бактериологов «Питательные среды для изоляции, типирования и идентификации бактерий рода Listeria» авторов Е.А. Зайцевой, Г.П.Сомова, Л.Н.Фатеевой, Г.Г. Компанец, Н.Г. Плеховой. Утверждено руководителем Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. -2008.

5. Патента № 2184782 Российской Федерации. Дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий / Глазырина Т.А., Бузолева Л.С., Зайцева Е.А., Сомов Г.П./ Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 2.11.1999. Опубл. 10.07.2002.

6. Патента № 2303060 Российской Федерации. Комплексная индикаторная среда для дифференциации бактерий рода Listeria /Зайцева Е.А., Глазырина Т.А., Сомов Г.П./ Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 28.12.2005. Опубл. 20.07.2007.

7. Заявки на изобретение № 2008111691/13 (012634) МПК? С 12 N 1/20, С 12 Q 1/04. «Питательная среда для культивирования бактерий» /Зайцева Е.А., Фатеева Л.Н., Кривошеева A.M., Сомов Г.П. /Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 26.03.2008.

8. Заявки на изобретение № 2008132232 МПК? С 12 N 1/20, С 12 Q 1/04 «Питательная среда для культивирования бактерий (ее варианты)» /Зайцева Е.А., Фатеева Л.Н., Сомов Г.П. /Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 4.08.2008.

Апробация материалов диссертационной работы:

Основные положения диссертации были представлены на конгрессах и конференциях международного, российского и регионального уровня: II Дальневосточном конгрессе «Человек и лекарство» с международным участием (Владивосток, 2005); Всероссийском конгрессе «Оптимальное питание - здоровье нации»: к 75-летию Государственного учреждения Научно-исследовательского института питания РАМН (Москва, 2005); Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» («Сосновка», Новосиб. обл., 2005); III Российской научно-практической конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2006); 13 международном конгрессе по приполярной медицине (Новосибирск, 2006); Ii"1 International Symposium on Microbial Ecology (Вена, Австрия, 2006); 2nd FEMS Congress of European Microbiologists (Madrid, Spain, 2006); 16th International Symposium on Problems of Listeriosis. ISOPOL XVI (Savannah, Georgia, США, 2007); 9th Symposium on Bacterial Genetics and Ecology (Wernigerode, Германия, 2007); 5th World Congress of the World Society for Pediatric Infectious Diseases (Bangkok, Thailand, 2007); 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007»; Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); 4 международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера и 120-летию Парижского института Пастера (Санкт-Петербург, 2008); научно-практической конференции с международным участием «Роль вирусных и бактериальных инфекций в формировании перинатальной и соматической патологии у детей» (Хабаровск, 2008).

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 62 научных публикациях, в том числе: 6 - в международной печати, 18 - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, а также в 3 информационных письмах, 2 патентах на изобретение, 2 заявках на изобретение, 1 пособии для бактериологов, 1 методических рекомендациях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций для внедрения результатов исследования в медицинскую науку и практическое здравоохранение, списка использованной литературы. Работа изложена на 302 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу, 36 рисунков. Список цитированной литературы включает 459 источников, из которых - 121 отечественных и 338 - иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования

Экспериментальные исследования проведены на базе лаборатории экологии патогенных бактерий НИИЭМ СО РАМН (г. Владивосток). Отдельные фрагменты молекулярно-генетических исследований выполнены на базе лаборатории экологии возбудителей инфекций в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (г. Москва).

Все экспериментальные и клинические исследования проведены с разрешения Комитета по биомедицинской этике НИИЭМ СО РАМН (протокол № 1/2 от 22 марта 2006 г.).

Микроорганизмы. В работе использованы типовые штаммы (21 штамм) бактерий рода Listeria - ¿.monocytogenes (серовариантов 1/2а, 1/2Ь, 1/2с, За, 4а, 4b, 4с, 4d, 7), L.ivanovii NCTC 11846, L.innocua SLCC 3379, L.seeligeri SLCC 5921, L.welschimeri, L.grayi 17, полученные из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (г. Москва) и музея Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВМиВ, г. Покров), а также изоляты листерий (289 изолятов), выделенные из клинического материала, животных, объектов окружающей среды (почва, вода, пищевые продукты) на Дальнем Востоке (238 изолятов) и в Европейской части (51 изолят) Российской Федерации.

При выполнении ряда экспериментальных исследований использовали штаммы Escherihia coli 284, Staphylococcus aureus 192, Yersinia pseudotuberculosis 222, Y. pseudotuberculosis 2781, Y. enteroco-litica 2012, Y. enterocolitica 164, Shigella flexneri 73, Salmonella enteri-tidis 285, S. typhimurium.5369, S.paratyphi 286 из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН.

В экспериментах по изучению адгезивных свойств листериозно-

го микроба использовали нативные эритроциты человека О (I) Rh (+) группы крови.

В ряде исследований применяли низкомолекулярную дезокси-рибонуклеиновую кислоту (нДНК) - вещество, полученное учеными ТИНРО - Центра, защищенное патентом (г. Владивосток, патент СССР № 915446). Низкомолекулярная ДНК представляет собой аморфный порошок светло-кремового цвета, растворимый в воде при нагревании и нерастворимый в органических растворителях. В состав нДНК входит 79,0% ДНК, 7,8% белка, 2,1% липидов и 10,7% воды. Молекулярная масса нДНК составляет 270 - 500 кДа.

Лабораторные животные. Экспериментальная часть работы выполнена на неинбредных мышах массой 14 - 18 г, морских свинках весом 150 - 200 г, кроликах массой 1,5-2 кг, полученных из питомника РАМН «Столбовая». Работа выполнена с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах. Разброс животных в группе по массе не превышал ± 10%. В каждой опытной группе было от 5 до 10 животных. Животные контрольных и опытных групп были одного пола, возраста, получены из питомника одновременно. Животных выводили из опыта с использованием эфирного наркоза.

Методы. Морфологические, культуральные и биохимические исследования проводили по общепринятым методам, описанным в справочниках по микробиологическим и вирусологическим методам исследования (Биргер М.О., 1982, Лабинская A.C., 1978, Никитин В.М., 1986, Хоулт Д. и др., 1997), а также согласно методов, сред, рекомендованных ГОСТ Р 51921-2002 и МУК 4.2.1122-02 для выделения листерий.

Антигенные свойства культур определяли в линейной реакции агглютинации с типовой поливалентной и моновалентных (I и II се-ротипов) листериозных сывороток и с использованием набора бактериофагов, включающий фаги L-2A и L-4A, по методике предложенной изготовителем (ВНИИВВиМ, г. Покров).

Антибиотикорезистентность штаммов листерий изучали методом диско-диффузии в агар согласно МУК 4.2.1890-04.

Определение адгезивной активности листерий проводили по методу В.И.Брилис с соавт. (1996).

Вирулентность культур определяли на белых неинбредных

мышах (самцах), массой 14-18 г, которых заражали внутрибрюшинно десятикратно возрастающими дозами (от 10 до 109 микробных клеток), с вычислением LD50 и ее доверительного интервала при помощи метода Кербера (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962), средней продолжительности жизни (СПЖ) (Павлович Н.В. и др., 1997) а также по керато-конъюнктивальной пробе на морских свинках.

Молекулярно-генетические методы. В работе использовали оли-гонуклеотидные праймеры, синтезированные фирмой «Синтол» (Москва). Праймеры, ограничивающие фрагменты изучаемых генов, были выбраны в 5' и 3' областях открытых рамок считывания (ОРФ) с помощью программы 01igo38. Для проведения ПЦР использовали бактериальные лизаты, приготовленные из суточных культур листе-рий, как описано Т.И. Карповой с соавт. (2003).

Идентификацию выделенных листерий до вида L.monocytogenes проводили с помощью тест-системы АмплиСенс Listeria monocytogenes (ООО «ИнтерЛабСервис», г. Москва) методом ПЦР по программе фирмы-изготовителя, и с помощью видоспецифических для L.monocytogenes праймеров plct - pic2, и Imp/ - Imp у (Карпова Т.И. и др., 2001; 2003).

Определение принадлежности выделенных культур к бактериям рода Listeria проводили методом амплификации ДНК бактерий при помощи ПЦР с праймерами для определения гена prs, кодирующего родоспецифический белок общего метаболизма - фосфорибозилпи-рофосфатсинтазу (Сапенко Т.П., Ермолаева С. А., 2003).

Серогруппоспецифические маркерные гены выявляли с помощью мультиплекс-ПЦР метода, предложенного М. Doumith и соавт. (2004).

Определение генов, кодирующих белки-интерналины (InlA, InlB, InlC, InlE, InlG, InlH, InlF), и генов, кодирующих белки Auto и Act А, осуществляли с использованием в ПЦР праймеров, которые были выбраны на основе последовательностей генов, полученных из базы данных ListiList (http://www.pasteur.fr), содержащей последовательность генома штамма EGD-e (положительного контроля). ПЦР осуществляли по программам, которые были подобраны экспериментально для каждой пары праймеров. Продукты ПЦР анализировали методом гель-электрофореза в 1% агарозе (Sigma).

Подготовка образгрв для секвенирования. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих белки -. интерналины А, В, С, Е (inlA, inlB, inlC, inlE) и гена prs были получены из базы данных ListiL-

ist (ht t p : //www, pasteur. It) . Концентрацию ампликонов проверяли путем электрофореза на агарозном геле в сравнении со стандартным маркером (1 kb DNA Ladder, «Fermentas»), Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля осуществляли с помощью набора GFXtm PCR DNA and Gel Band Purification Kit («Amersham», Англия).

Секвенирование фрагментов ДНК проводили в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН в Центре коллективного пользования «Геном» (г. Москва). Последовательности, полученные в результате секвенирования, были прочитаны с помощью программы Chromas v. 1.45 (Copyright© 1996-1998 Conor McCarthy, http://www.technelvsiiim,com.aii/cliromas.html). Множественное выстраивание последовательностей было осуществлено с помощью программы ClustalW 1.83.ХР (Thompson J.D. et al, 1994). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием пакета программ DnaSP version 4.10 (Rozas J. et al.,2003). Построение дендрограмм было осуществлено с помощью программы Mega version 3.1 (Kumar S. et al., 2004). Индекс дискриминации (D.I.) вычисляли, как предложено (Hunter P.R., Gaston М.А., 1988).

Нуклеотидные последовательности (345 последовательностей) штаммов L.monocytogenes были депонированы в GenBank.

Статистическую обработку материала осуществляли с использованием общепринятых параметрических критериев (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962, Гланц С., 1999). В работе были использованы методы корреляционного и регрессионного анализов (Гланц С., 1999), расчеты произведены с использованием программы электронных таблиц Excel - 4.1 на компьютере типа IBM-PC, Pentium IV.

Для выявления различий между данными опытных и контрольных групп применяли t-критерий Стьюдента. В работе использованы известные графические приемы выражения статистических данных (Лакин Г.Ф., 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Биологические свойства листерий, изолированных на Дальнем Востоке

Подбор оптимальных питательных сред, схемы выделения, культивирования и изучения биологических свойств листерий. В начале работы были подобраны оптимальные питательные среды для изоляции и культивирования листерий, ингибиторы для приготовления селективной дифференциальной среды (патент РФ № 2184782), разработана индикаторная среда (патент РФ № 2303060) с целью эффективного выделения культур из разнообразных объектов окружающей среды, клинического материала, а также модифицированы среды для изучения свойств листерий - определение подвижности, ДНКазной и липазной активности, биохимических свойств. Наилучшие результаты при определении подвижности отмечались при посеве культур листерий на полужидкий 0,3%-ный агар с 2,3,5-трифенилтетразолием хлористым (ТТХ). Из-за высокой чувствительности и наглядности предпочтение в практической работе, возможно, следует отдать этой среде.

Отработана оптимальная схема исследования различных проб для выделения листерий. В результате сформирована коллекция дальневосточных культур листерий, включающая 238 изолятов.

В ходе исследований выявлено, что на Дальнем Востоке выделяются разнообразные виды бактерий рода Listeria - L.monocytogenes (47,1% от общего числа изолятов), L. innocua (19,7%), L.seeligeri (2,9%), L.ivanovii (1,2%), L.welschimeri (0,8%). Эти бактерии были обнаружены в различных объектах окружающей среды - в речной воде, наземных растениях, водорослях, изолированы из органов грызунов, морских гидробионтов, клинического материала, пищевых продуктов (мясных, молочных, рыбных, мясе птицы), а также из смывов с оборудования на производственных предприятиях.

Выявлена контаминация патогенными L. monocytogenes продуктов питания в 6,3% исследованных образцов. Чаще всего патогенный вид L.monocytogenes выделяли из мясных (12,7% от числа исследованных образцов), куриных (2,9%) и рыбных (1,6%) продуктов. Наряду с L.monocytogenes (2,8%), часто пищевые продукты были контами-нированы и бактериями вида L.innocua (2,7 %), особенно мясные (13,3% от числа исследованных образцов; отечественного и импортного производства), овощи (8,1%), реже рыбные (1,2%).

Среди биотических объектов в Дальневосточном регионе России патогенный вид ¿.monocytogenes обнаружили у мышевидных грызунов рода Apodemus (52,6% от общего числа изолятов, полученных от грызунов; полевая и восточно-азиатская мыши), лесных полевок рода Myod.es (47,4%; красная и красно-серая полевки), серой крысы, морских гидробионтов (1,4%; морской гребешок, морская звезда, морской еж, камбала). Среди обследованных грызунов, отловленных на территории края, по числу инфицированных патогенным для человека и животных видом L.monocytogenes доминировала полевая мышь (Ар. agrarius), обитающая на равнинной территории Приморского края. Было также зафиксировано выделение L.monocytogenes из воды и ила реки Кневичи. Полученные результаты свидетельствуют о существовании на Дальнем Востоке РФ патогенных бактерий L.monocytogenes в естественных экосистемах.

Следствием широкого распространения листерий в природе явилось выделение возбудителя от людей (из абортированных плодов, клинического материала от беременных женщин, плацент, трупного материала от больного, умершего от листериозного менингита).

Обращает на себя внимание выделение из биологических объектов на территории Дальнего Востока и других видов листерий -L.ivanovii (0,1% от числа изолятов), L.innocua (0,2%), L.seeligeri (0,3%). Эти микроорганизмы обнаружены в пробах из органов грызунов (0,3%), морских гидробионтов (0,4%).

Сравнительный анализ микробиологических свойств L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части России. Для решения вопроса о стабильности или изменчивости микробиологических свойств листерий, изолированных в различных регионах России, коллекции культур L. monocytogenes, выделенных в Дальневосточном регионе и Европейской части России, были исследованы по культурально-биологическим и ферментативным свойствам.

Для обеих коллекций отмечена стабильность биологических свойств листерий - типичный рост колоний на питательных средах с характерным кисломолочным запахом, при нормальном освещении колонии имеют голубовато-серый цвет, характерное голубое или голубовато-зеленое свечение в косо-проходящем свете, наличие каталазной и гемолитической активности, подвижность при 20-22°С и ее отсутствие у большинства культур при 37°С, отсутствие оксидазнои активности.

У культур Ь.топосу^епея, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части России, не было найдено выраженных отличий и по биохимическим свойствам. Все культуры L.monocytogenes независимо от их происхождения сбраживали с образованием кислоты -глюкозу, фруктозу, рамнозу, эскулин, мальтозу, салицин и не ферментировали ксилозу, раффинозу, мочевину, маннит, адонит.

Вариабельные результаты в зависимости от региона выделения листерии показали по отношению к мелецитозе, арабинозе, крахмалу, образованию ацетилметилкарбинола в реакциях с метиловым красным и Фогес-Проскауэра (табл. 1).

Таблица 1

Биохимические свойства Ь.топосу^епеэ, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части России

Углевод Ферментирование углевода ¿.monocytogenes в зависимости от региона выделения (% культур, М ± т)

Дальний Восток (п=102) Европейская часть(п=41) Достоверность различий, Р

Мелецитоза 82,4 ±3,8 56,1 ±7,7 <0,05

Арабиноза 25,5 ± 4,3 0 <0,01

Крахмал 8,8 ±2,8 0 <0,05

Глюкоза (в реакции с метиловым красным) 12,7 ±3,3 68,3 ± 7,3 <0,01

Глюкоза (в реакции Фогес-Проскауэра) 23,5 ±4,2 51,2 ± 7,8 <0,05

Культуры L.monocytogenes, выделенные на Дальнем Востоке в большинстве ферментировали мелецитозу, арабинозу, крахмал и реже образовывали ацетилметилкарбинол, по сравнению с культурами листерий из Европейской части России.

Для выявления отличительных особенностей среди L.monocytogenes в зависимости от источника изоляции было выделено 4 группы культур (независимо от региона): 1) от мертворожден-

ных плодов, 2) от мышевидных грызунов, 3) из морских гидробио-нтов, 4) пищевых продуктов (как контроль) (табл.2).

Выявлено, что чаще разлагали мелецитозу и образовывали аце-тилметилкарбинол в реакции с метиловым красным Ь.топосу^епея в группах «Мертворожденные плоды» и «Грызуны», сахарозу - культуры из группы «Мертворожденные плоды» по сравнению с культурами листерий контрольной группы.

Таблица 2

Биохимические свойства Ь.топосу^епея в зависимости от группы сравнения

Группа сравнения Ферментирование углевода L.monocytogenes в зависимости от источника выделения (% культур, М ± т)

мелецитоза сахароза глюкоза (в реакции с метиловым красным)

Мертворожденные плоды (п=21) 95,2±4,8* 85,7±7,8* 42,9±11,1*

Морские гид- робионты (п=16) 81,3*10,1** 56,3±12,8** 18,8±10,1**

Грызуны (п=25) 84,0 ±7,5* 72,Ш 1,6** 44,Ш 0,1*

Пищевые продукты (п=59) (контроль) 64,4±6,2 47,5±6,5 16,9±4,9

Примечание: * - р < 0,05; ** - р > 0,05

Сравнительный анализ патогенных свойств Ь.топосу1о^епе5, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части России. В последние годы достигнут существенный прогресс в изучении различных факторов патогенности листерий. Без учета патогенного потенциала невозможно оценить клинико-эпидемиологическое значение того или иного \птшм& L.nwtюcytogenes.

С помощью микробиологических методов у культур

Ь.топосу1о§епе5 была исследована ферментативная активность, связанная с их патогенностью (табл.3). Не было найдено статистически значимых отличий по ферментативной активности у культур Ъ.топосу1о§епез, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части РФ. Выявлены отличия в ферментативной активности (гиалуронидазной, лецитиназной и липазной в отношении к твину 80 и 20) только в зависимости от источника выделения.

Таблица 3

Ферментативная активность, связанная с патогенностью, у L.monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе и в Европейской части России

Активность % обнаружения в зависимости от источника изоляции культуры (М±ш)

Продукты питания (п=50) Мертворожденные плоды (п=20) Морские гидроби-онты (п=20) Грызуны (п=28)

Каталазная 100,0 100,0 100,0 100,0

Гемолитическая 100,0 100,0 100,0 100,0

Гиалуронидазная 92,0 ±3,8 100,0* 60,0±11,2 ** 100,0*

Лецитиназная 79,5±6,4 100,0** 81,8±8,4* 80,0±7,4*

Липазная в отношении: твин 20 твин 60 твин 80 60,0±9,1 20,0±9,2** 50,0±11,5* 82,1±7,4*

100,0 100,0 100,0 100,0

62,0±8,7 10,0±6,9 *** 30,0±10,5 ** 75,0±8,3 *

Примечание: * - р > 0,05; ** - р < 0,05; *** - р < 0,01

В экспериментах in vivo изучена вирулентность культур L.monocytogenes на белых неинбредных мышах и морских свинках. По вирулентности для белых мышей культуры L.monocytogenes были чрезвычайно неоднородны. Встречались листериозныс культуры как вирулентные, так и слабовирулентные, независимо от источника их выделения. Часть изолятов L.monocytogenes вызывала развитие парезов или параличей у белых мышей, а у морских свинок развивался конъюнктивит, кератоконъюнктивит или кератит, протекавшие с раз-

личной длительностью и выраженностью. Нами не установлено связи между вирулентностью штаммов L.monocytogenes, географическим местом и объектом их выделения.

Антибиотикорезистентность культур L.monocytogenes, выделенных в различных регионах России (Дальний Восток и Европейская часть). В процессе адаптации микроорганизма к определенным условиям существования немаловажное значение отводится резистентности к антибиотикам (Домарадский И.В., 1997). Анализ антибиотико-резистентности изолятов L.monocytogenes с использованием диско-диффузионного метода показал, что изоляты листерий в той или иной степени устойчивы к действию 28 антибактериальных препаратов из 33 использованных. Все культуры L.monocytogenes (100%) оказались резистентными к цефалоспоринам II и III поколения (цефуроксиму и цефтазидиму, цефотаксиму, цефтриаксону, цефаперазону соответственно), налидиксовой кислоте и полимиксину. Высокий уровень резистентности L.monocytogenes был обнаружен к цефалоспорину I (цефалексину) и фторхинолонам (пефлоксацину, ломефлоксацину, цнпрофлоксацину).

Все исследуемые культуры листерий обладали полиантибиоти-корезистентностью. Отмечено, что наименьший индекс множественной антибиотикорезистентности (MAP) определялся у культур L.monocytogenes, изолированных из пищевых продуктов, особенно из Европейской части РФ (индекс MAP = 0,03 -0,2) (табл.4).

Таблица 4

Антибиотикорезистентность культур L.monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части РФ из различных источников

Источник Антибиотикорезистентность культур L.monocytogenes (индекс MAP) в зависимости от региона изоляции

Дальний Восток Европейская часть РФ

Пищевые продукты 0,14-0,62 0,03 - 0,2

Объекты окружающей среды 0,36 - 0,47 не исследовали

Клинический материал 0,24 - 0,54 0,1-0,6

Морские гидробионты 0,15-0,47 0,27 - 0,45

Грызуны 0,18-0,53 0,36 - 0,47

Наиболее выраженная множественная антибиотикорезистент-ность отмечалась у культур ¿.monocytogenes, изолированных из объектов окружающей среды, клинических изолятов, органов животных. В ходе исследований не было отмечено существенных различий в чувствительности к антимикробным препаратам и между культурами, изолированных из клинического материала, органов грызунов, объектов окружающей среды (в том числе из пищевых продуктов), что согласуется с данными других исследователей (Тартаковский И.С. и др., 2002, Troxler R. et al., 2000).

Не выявлено зависимости между антибиотикорезистентностью культур ¿.monocytogenes и их вирулентностью для животных.

Независимо от источника выделения, все тестируемые культуры ¿.monocytogenes показали высокую чувствительность к антибактериальным препаратам из групп: пенициллинов (пенициллину, ампициллину, карбенициллину, амоксициллину, амоксиклаву (амоксицил-лин/клавуланат)), тетрациклинов (доксициклину, тетрациклину), гли-копептидов (ванкомицину), а также к гентамицину, цефалоспорину I поколения (цефазолину), рокситромицину, кларитромицину, рифам-пицину, меропенему, офлоксацину, хлорамфениколу, что также согласуется с данными других исследователей (Тартаковский И.С. и др., 2002, HofH., 1997, 2004, Safdar А., 2003, Troxler R„ 2000).

Таким образом, анализ биологических свойств ¿.monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе и Европейской части России из различных источников, показал, что подавляющее большинство культур обладали однотипными свойствами. Свойства штаммов, выделенных на территории Дальнего Востока и в Европейской части России, оказались тождественными свойствам типовых штаммов листерий, что позволяет уверенно рассматривать их как типичные для ¿.monocytogenes. Наличие отдельных штаммов, имеющих некоторые атипичные свойства (отсутствие способности проявлять (3-гемолитическуго, лецитиназную активности, ферментировать отдельные углеводы, наличие подвижности при температуре 37°С), не меняет общего представления о возбудителе.

Отмеченная вариабельность подвижности, биохимической и ферментативной активности факторов патогенности, антибиотикоре-зистентности ¿.monocytogenes указывала на определенную фенотипи-ческую неоднородность природных популяций ¿.monocytogenes. Важно отметить, что проведенные исследования еще раз показали

необходимость учитывать при идентификации культур, предполагаемых как листерии, всю совокупность признаков и свойств, а не совпадение отдельных из них. Правильная идентификация возбудителя приобретает большое значение еще и в связи с тем, что на сегодняшний день именно бактериологическое подтверждение диагноза остается единственно достоверным (Тартаковский И.С. и др., 2002). Однако необходимо подчеркнуть, что полученные результаты не позволили выделить специфические особенности, характерные для штаммов листерий, изолированных из определенных источников, в частности, из клинических изолятов. Поэтому с целью выявления специфических особенностей эпидемически значимых штаммов, мы обратились к молекулярно-генетическим методам исследования.

Генетическая вариабельность штаммов L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части России

В нашей стране до настоящего времени работа по характеристике внутривидовой генетической вариабельности, в том числе факторов патогенности у L.monocytogenes, и определению их связи с источниками изоляции не проводилась. Коллекции культур L. monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части РФ были проанализированы на присутствие генов, кодирующих ин-терналины, и другие факторы инвазии (гены actA и ant) с помощью ПЦР.

Не было обнаружено отличительных особенностей встречаемости генов, кодирующих белки-интерналины у штаммов L.monocylogenes, выделенных в различных регионах РФ, но выявлены различия в частоте встречаемости генов, кодирующих отдельные ин-терналины, в зависимости от источника выделения (табл. 5).

Только ген inlA, кодирующий InlA, был обнаружен у всех исследованных штаммов. Гены inlB, inlC, inlE были выявлены у всех изолятов L. monocytogenes, выделенных из эукариотических организмов, включая человека. Штаммы L. monocytogenes, у которых данные гены не выявлялись методом ПЦР, встречались только среди изолятов из продуктов питания.

Встречаемость генов inlF, inlG и inlH существенно отличалась от вышеописанных генов (табл. 5). Полимеразная цепная реакция давала положительный ответ только у части культур, что говорит о том,

что у остальных культур L.monocytogenes данные гены отсутствуют, либо область связывания праймеров вариабельна.

Таблица 5

Встречаемость генов, кодирующих интерналины и другие факторы инвазии у культур L. monocytogenes (% культур, М±т)

Ген Культуры L.monocytogenes, изолированные от/из

мертворожденных плодов(n=36) органов животных (п=54) продуктов питания (п=31)

inlA 100,0 100,0 100,0

inlB 100,0 100,0 96,8±3,2

ilnC 100,0 100,0 96,8±3,2

inlE 100,0 100,0 96,8±3,2

inlF 100,0*** 72,2±6,1** 54,8±8,9

inIG 38,8±8,1* 3,7±2,6*** 54,8±8,9

inlH 19,4±6,6* 3,7±2,6** 29,03±8,1

actA 100,0 100,0 100,0

aut 33,3±7,8* 12,9±4,6** 51,6±8,9

Примечание: * - р > 0,05; ** - р < 0,05; *** - р < 0,01

Кроме того, проведенный скрининг показал вариабельность в размере гена inlF (табл.6). Аллель гена inlF, дающий укороченный продукт в ПЦР, преобладал среди культур, выделенных из морских гидробионтов. Данный аллель гена inlF не встречался среди культур L.monocytogenes из других источников. Экспериментальное изучение рядом авторов роли продуктов генов inIG и inlH показало, что эти белки не только не являются необходимыми в процессе внутриклеточной инфекции, но, напротив, частично подавляют адгезию и инвазию L. monocytogenes in vitro (Bergmann В. ct al., 2002). В наших исследованиях эти гены были выявлены у двух из трех культур L.monocytogenes, относящихся ко второй филогенетической линии и изолированных у здоровых носителей, в то время как среди культур, выделенных от больных людей с клиническими проявлениями листе-риоза, ген inIG был выявлен у двух, a inlH у одного из пяти изолятов. Важно также отметить, что гены inIG и inlH не выявлялись у подав-

ляющего большинства штаммов L. monocytogenes, изолированных из животных. Полученные нами данные подтверждают предположение о том, что белки InlG и InlH не являются необходимыми для развития листериозной инфекции.

Таблица 6

Вариабельность гена inlF у культур L. monocytogenes, выделенных из различных источников (% культур, М±т)

Продукт ПЦР с праймерами inlFrinlFj Мертворожденные плоды (п=36) Животные (п=43) Продукты питания (п=27)

Грызуны (п=19) Морские гидробионты (п=24)

нормальный 100,0*** 84,2±8,6** 4,2±4,2*** 51,8±9,8

укороченный 0 0 70,8±9,5*** 0

удлиненный 0 0 4,2±4,2* 3,7±3,7

отсутствует 0 15,8±8,6** 20,8±8,5** 44,4±9,7

Примечание: * - р > 0,05; ** - р < 0,05; *** - р <0,01

Таким образом, установлено, что штаммоспецифический полиморфизм спектра интерналинов у L.monocytogenes коррелирует с источником выделения штамма и не зависит от региона изоляции.

Результаты, полученные при выявлении генов, кодирующих белки ActA и Auto, показали наличие гена, кодирующего белок ActA, у всех без исключения штаммов ¿.monocytogenes. Ген aut, кодирующий белок Auto, методом ПЦР обнаруживали менее чем у половины штаммов ¿.monocytogenes, изолированных как на Дальнем Востоке, так и в Европейской части России (32,9 и 25% соответственно). Ген aut, чаще определялся среди ¿.monocytogenes, изолированных из пищевых продуктов (51,6±8,9%), и реже - среди штаммов листерий, изолированных из клинического материала (33,3±7,8%) и из органов грызунов (18,7 %).

Таким образом, нами были выявлены гены факторов инвазии, которые встречаются у подавляющего большинства изолятов ¿.monocytogenes,выделенных из эукариотических организмов, включая человека, - inlA, inlB, inlC, inlE. Эти гены были использованы нами в качестве мишеней для разработки системы генотипирования.

Сравнительный анализ полиморфизма генов, кодирующих белки-интерналины (inlA, inlB, inlC, inlE), и гена pis у штаммов L.monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе и Европейской части России

Анализ полиморфизма был проведен для генов факторов инвазии, которые, как описано выше, присутствовали у всех культур L. monocytogenes. Такими генами являются гены интерналинов inlA, inlB, inlC, inlE. Была изучена вариабельность внутренних фрагментов этих генов, а именно фрагментов, кодирующих LRR-домены, непосредственно вовлеченные в процесс взаимодействия интерналинов со специфическими рецепторами эукариот. Кроме генов, кодирующих интерналины, был секвенирован внутренний фрагмент гена prs, кодирующего фосфорибозилсинтазу - белок общего метаболизма, выявленный у всех представителей рода Listeria (табл.7).

Таблица 7

Сравнительный анализ секвенированных фрагментов генов у культур L.monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе и Европейской части Российской Федерации

Число замен Число аллелей

Ген Длина фрагмента, ПН (% общей ОРФ) Аминокислоты с и но ни-мич-ных неси-нони-мич-ных линия специфичных несинонимичных общее спе-ци-фич-ных для ЕЧ специфичных для ДВ

МА 648 (27) 54-269 14 6 0 11 5 3

in 1В 618 (33) 64-269 37 25 7 18 5 12

in 1С 586 (66) 70-264 17 8 4 ¡2 3 7

in IE 558 (37) 82-267 45 46 29 1! 4 4

prs 618(66) 39-244 24 1 0 6 3 1

Примечание: ОРФ - открытая рамка считывания, ЕЧ - Европейская часть России, ДВ - Дальний Восток.

У гена рк все замены (24), кроме одной, были синонимичны. Отсутствие несинонимичных замен в последовательности гена ргя подтверждает представление об отсутствии адаптивной вариабельности среди белков общего метаболизма и отражает аминокислотную

стабильность этого белка для изолятов L.monocytogenes, эволюционирующих в разных условиях.

Напротив, интерналины характеризовались значительной изменчивостью, в том числе на аминокислотном уровне. Наибольшую вариабельность продемонстрировали гены inlE и inlB, у которых было выявлено 45 и 37 синонимичных, 46 и 25 несинонимичных замен, соответственно. Фрагменты генов inlA и inlC были более консервативны (14 и 17 - синонимичных, 6 и 8 - несинонимичных замен соответственно). Установлено наличие специфических аллелей генов inlA, inlB, inlC, inlE, prs, присущих определенному географическому региону (табл.7).

Для всех пяти маркерных фрагментов в сумме было выявлено 223 единичных нуклеотидных замен. Высокая вариабельность изученных генов позволила нам разработать систему типирования, описанную ниже.

Филогенетическая характеристика популяции L.monocytogenes, распространенной на Дальнем Востоке Российской Федерации

Прежде чем приступать к разработке независимой системы типирования, мы охарактеризовали филогенетическую структуру популяции L.monocytogenes, распространенной на Дальнем Востоке, уже существующими методами.

Известно, что бактерии вида L.monocytogenes имеют сложную антигенную структуру и включают 13 серологических вариантов. Большая часть случаев заболеваний листериозом связана с серовари-антами 4b, 1/2а, 1/2Ь, причем эпидемические вспышки заболевания чаще всего связаны с серовариантом 4Ь. За последние годы установлено, что внутри вида L.monocytogenes выделяют три филогенетические линии, отличающиеся по своему эпидемиологическому потенциалу, каждая из которых объединяет штаммы, принадлежащие к определенным серовариантам (Piffaretti J.C. et al., 1989, Wiedman M. et al., 1997, Doumith M. et al., 2004).

С целью оценки вариабельности и эпидемиологической значимости изолятов ¿.monocytogenes, выделенных из разнообразных источников, первоначально нами были использованы методы серо- и фаготипирования.

В нашей стране для серотипирования используются сыворотки двух вариантов. Отмечено, что большинство дальневосточных культур L.monocytogenes, принадлежали ко второй серогруппе согласно

отечественной классификации. Культуры ¿.monocytogenes, изолированные из пищевых продуктов, в большинстве (72,2±7,5%) относились к первой серогруппе (рис. 1).

46,«

О 1 ■ .........................

I ceporpvnna II ceporpvnria

»ДВ ЕТТ

Рис. 1. Частота встречаемости (%) L.monocytogenes различных серогрупп на территории РФ: ДВ - Дальний Восток, ЕЧ - Европейская часть РФ.

Результаты, полученные при изучении коллекции ¿.monocytogenes, показали, что среди дальневосточных ¿. monocytogenes 34,1±7,1% культур типировались бактериофагом L-4A, 15,9±5,5 % культур - бактериофагом L-2A (рис.2).

'.... _ "ш-%......■:'Ч

■ .....' >■ :

i Г "".........— ...

1ч»

тяби&гяческиг > ба&гичесмис

Рис. 2. Фаговарианты (%) культур ¿.monocytogenes, изолированных из различных источников в Дальневосточном регионе (ДВ) и Европейской части (ЕЧ) России.

В то же время анализ антигенной структуры штаммов ¿.monocytogenes с использованием отечественных сывороток и бактериофагов двух типов показал относительно низкую специфичность данной системы дифференциации. Кроме того, ее низкая разрешаю-

щая способность не позволяет проводить анализ эпидемически значимых штаммов листерий.

Исследования, выполненные с помощью метода мультиплексной ПЦР, предложенной (Doumith М. al., 2004), позволили более детально охарактеризовать структуру популяции L.monocytogenes, распространенной на разных территориях России, и прежде всего, установить преобладание эпидемиологически значимого сероварианта 4Ь среди L. monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке (табл. 8).

Таблица 8

Типирование культур ¿.monocytogenes,изолированных в Дальневосточном регионе и Европейской части РФ, на основе выявления генетических маркеров, специфичных для определенных

серогрупп

Частота выделения культур в

Серогруппа зависимости от территории изоляции L.monocytogenes (%, M±m) Р

Дальний Восток (п=52) Европейская часть (п=17)

1/2а 19,2±5,5 41,17±12,3 <0,05

\12Ъ 3,8±2,6 11,8±8,1 >0,05

1/2с 1,92±1,9 17,64±9,5 <0,05

4Ь 75,4±6,0 29,4±11,4 <0,01

Таким образом, полученные результаты показали гетерогенность штаммов L.monocytogenes, изолированных из различных объектов на территории России. Однако использованные методы характеризовались низкой дискриминационной способностью, не отражали полной картины вариабельности популяции и не выявляли степени генетического родства между эпидемическими и неэпидемическими штаммами L.monocytogenes.

В последние годы для типирования наиболее значимых в эпидемиологическом отношении штаммов L.monocytogenes разрабатываются молекулярно-генетические методы, среди которых мультило-кусное секвенирование превосходит все остальные по воспроизводимости и, во многих случаях, по разрешающей способности. Для разработки системы типирования нами было выбрано 40 независимых культур L. monocytogenes, изолированных в разных регионах России

(Дальний Восток и Европейская часть России), у которых было осуществлено секвенирование внутренних областей генов inlA, MB, inlC, inlE и prs, по схеме, описанной выше (табл. 7).

Суммарная длина конкатемеров, включающих фрагменты 5 маркерных генов, равнялась 3029 н.п., что составляет около 0,1% хромосомной ДНК ¿.monocytogenes. Изучаемые последовательности относились к 25 аллелям. Только один изолят из 40 имел продолжительную делецию - изолят VIMHA009 имел делецию 69 п.и. в гене inlE. Остальные различия заключались в единичных нуклеотидных заменах. Вычисление индекса дискриминации (ОЛ.)для предлагаемого метода типирования дало величину 0,982. Это означает, что если два эпидемически не связанных изолята, принадлежащих к разным штаммам, будут произвольно выбраны из популяции, то в предлагаемом методе типирования с вероятностью 98 % они будут относиться к разным типам. Полученная величина, хотя и не является максимально возможной (теоретически максимально возможная величина для индекса дискриминации равна 1), обеспечивает приемлемый уровень дифференциации эпидемически не связанных изолятов.

Для установления филогенетических связей между изолятами L.monocytogenes была построена дендрограмма, с использованием метода минимальной эволюции (рис. 3), которая позволила разделить L.monocytogenes на две группы, соответствующие описанным филогенетическим линиям и коррелирующие с принадлежностью к определенному сероварианту (Карпова Т.И. и соавт., 2003, Piffaretti J.С. et al., 1989, Wiedman M. et al„ 1997).

Большинство культур L.monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе, принадлежали к первой филогенетической линии, наиболее опасной в эпидемическом плане (по Wiedman М. et al., 1997). Было отмечено, что среди изолятов L. monocytogenes, полученных из клинического материала (от мертворожденных плодов), от грызунов и морских гидробионтов преобладают штаммы листерий, относящиеся к первой филогенетической линии; среди изолятов L. monocytogenes из продуктов питания доминируют штаммы, относящиеся ко второй филогенетической линии.

¡96

Vrt.ilVH3i54

зС

ммчлшз viMH^oas viMH^ioe V1MHA034 V1MVF047 VU4VTS7&-I-V1MPH07S

36!-viMVFim *

■V1MVF067

VIMPHOOi

^ЬятаРНСПТ--, 9

viMPwoai MMPRO»7 VIMVf 133 * — \ИМР/Ч)03 rVIMPH006

V/1MPM2SO V1MPR0S2

■90

линия

VIM И ¿017 ч ММНАЧ115 j

VIM ими i / -W.rPUkii I—VJMHA01D VIM H ¿003

-MM Н^ООЭ

7j|V»MVHi34 10д\лм\ллл>

I—V1MPR212

,— VlMVVutO? VIM H ¿007 ЛЛМИЯ6Й--Ч

VIM H £006 \ VlMVuWiS

линия

Рис. 3. Дендрограмма, устанавливающая степень схожести последовательностей ДНК среди изолятов ¿.топосу^епея.

Овальные скобки - два основных кластера, соответствующих I (нижняя) и II (верхняя) клональным линиям. Окружности - группы изолятов, имеющих идентичные последовательности изученных фрагментов; * - изоляты из разных регионов, образующие совместные кластеры.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами впервые установлена филогенетическая структура L. monocytogenes, распространенных на Дальнем Востоке, а также подтверждено существование двух филогенетических линий внутри вида L.monocytogenes.

Анализ филогенетической принадлежности изолятов L.monocytogenes в зависимости от региона и источника выделения

Разработанная система была применена для анализа распределения штаммов L. monocytogenes в зависимости от региона и источника выделения. Используя данную систему, была осуществлена дифференциация всех имеющихся изолятов L.monocytogenes, выделенных в Дальневосточном и Европейском регионах РФ, которая выявила 32 сиквенс-типа (СТ) (табл.9).

Отмечено, что все сиквенс-типы имели региональную приуроченность. Среди изолятов листерий, выделенных на Дальнем Востоке, было найдено 19, а в Европейской части России - 13 сиквенс-типов. Не было найдено ни одного сиквенс-типа, который встречался бы в обоих регионах. Среди дальневосточных L.monocytogenes заметно преобладали СТ 1, СТ 9 и СТ 17. Не отмечено превалирования какого-либо сиквенс-типа среди L.monocytogenes, изолированных в Европейской части РФ.

Таким образом, доказано существование регион-специфического распределения штаммов L.monocytogenes на территории РФ. Кроме того, выявленное разнообразие сиквенс-типов предполагает поликлональное распределение вида L. monocytogenes в пределах географически отдаленных областей.

Важно отметить, что были выявлены два сиквенс-типа, к которым принадлежали как клинические изоляты, так и изоляты, полученные из дикой природы. Так, к СТ1 принадлежали культуры L.monocytogenes, выделенные от мертворожденных плодов, из окружающей среды и грызунов.

Таблица 9

Характеристика сиквенс-типов (СТ) среди изолятов Ь.топосу^епея, полученных на Дальнем Востоке и в Европейской части РФ

Ре г Аллель Число изолятов

БТ ион Об- В группе специфичного хозяина

ША ЫВ ыс ш1Е ргх щее «МП» «н» «г» «МГ» «п»

1 ДВ 1 1 1 1 1 12 4 0 7 0 1

2 ДВ 1 3 1 1 1 1 1 0 0 0 0

3 ДВ 1 9 1 1 I 1 1 0 0 0 0

4 ДВ 1 9 1 4 2 2 1 0 0 0 1

5 ДВ 1 9 1 3 2 4 4 0 0 0 0

б ДВ 1 10 1 3 2 1 1 0 0 0 0

7 ЕЧ 5 14 6 8 4 1 1 0 0 0 0

8 ЕЧ 5 14 6 10 5 1 1 0 0 0 0

9 ДВ 9 14 9 6 5 7 3 2 0 I 1

10 ЕЧ 8 14 6 10 5 2 0 1 0 0 1

11 ДВ 2 1 5 I 1 1 0 0 1 0 0

12 ДВ 10 14 8 7 6 2 0 0 2 0 0

13 ЕЧ 9 14 6 6 5 1 0 0 1 0 0

14 ЕЧ 2 7 4 1 1 1 0 0 0 0 1

15 ЕЧ 4 14 6 8 4 4 0 0 1 0 3

16 ЕЧ 6 12 6 6 5 1 0 0 0 0 1

17 ДВ 2 1 6 1 1 10 3 0 0 9 1

18 ДВ 2 5 4 1 I 1 0 0 0 1 0

19- ДВ 2 6 4 1 1 1 0 0 0 1 0

20 ДВ 2 2 и 4 1 1 1 0 0 0 1 0

21 ДВ 3 8 3 1 2 1 0 1 0 0 0

22 ДВ 2 1 4 1 1 1 0 1 0 0 0

23 ЕЧ 8 15 6 10 5 1 0 1 0 0 0

24 ЕЧ 4 15 6 8 4 1 0 1 0 0 0

25 ЕЧ 1 16 2 3 3 1 0 1 0 0 0

26 ЕЧ 4 14 6 8 4 1 0 1 0 0 0

27 ЕЧ 1 1 14 11 11 5 I 0 1 0 0 0

2Б ЕЧ 9 11 7 8 6 1 0 0 0 0 1

29 ДВ I 4 1 1 1 1 0 0 0 0 1

30 ДВ 7 18 9 6 5 1 0 0 0 0 1

31 ДВ 10 17 12 2 5 1 0 0 0 0 1

32 ДВ 7 13 10 9 5 1 0 0 0 0 1

Примечание: ДВ - Дальний Восток, ЕЧ - Европейская часть России, «МП» - изоляты 1^.то1юсу!о°епе5, выделенные из мертворожденных плодов, «Н» - изоляты от носителей, «Г» - изоляты от грызунов, «МГ» - изоляты из морских гидробионтов, «П» - изоляты из продуктов, объектов окружающей среды и млекопитающих (кроме грызунов).

К сиквенс-типу ¡7 принадлежали культуры L.monocytogenes, выделенные от морских гидробионтов, из морепродуктов из торговой сети и от мертворожденных. Полученные данные свидетельствуют о распространении в природных очагах штаммов L. monocytogenes, высоковирулентных для человека.

Для более детального выявления характеристик, которые могли быть специфическими для культур, выделенных из конкретных источников, мы установили частоту встречаемости определенных аллелей для каждого из генов в зависимости от источника выделения. В результате, впервые нами была обнаружена корреляция между источником выделения L.monocytogenes и аллелем генов инвазии (табл.10).

Таблица 10

Оценка достоверности неравномерного распределения аллелей генов у штаммов ¿.monocytogenes, связанных с определенным видом хозяина

Группа % тест "Тирсона Тест рандомизации

р < 0,01 p<0,05 p<0,01 p<0,05

«МП» inlA inlC in IB in I A inlC

«н» inlB

«г» inlB MB

«МГ» inlA inlC inlE inlA inlC inlE

«п» inlB

Примечание: «МП» — изоляты L.monocytogenes из мертворожденных плодов. «Н» - изоляты L.monocytogenes от носителей, «Г» - изоляты L.monocytogenes от грызунов, «МГ» - изоляты L.monocytogenes из морских гидробионтов, «П» - изоляты L.monocytogenes из объектов окружающей среды, пищевых продуктов, млекопитающих, кроме грызунов из группы «Г».

Анализ частоты встречаемости аллелей отдельных генов, кодирующих интерналины, у штаммов L.monocytogenes, изолированных от различных организмов, показал статистически достоверную неравномерность распределения аллелей некоторых генов у изолятов, полученных от конкретного хозяина (табл. 10). Для генов inlA и inlC

специфические аллели преобладали среди культур L.monocytogenes, выделенных из мертворожденных плодов (группа «МП», аллели 1 и 5 для inlA, 1 и 6 для ш/С); аллель 1 гена inlB преобладал среди культур, выделенных от грызунов (группа «Г»), но не других хозяев. В группе контроля (изоляты из пищевых продуктов, «П») все аллели изучаемых генов были распределены равномерно. Аллели гена prs были распределены однородно во всех группах.

Полученные данные позволяют предположить, что развитие внутриутробной листериозной инфекции у беременных женщин может быть связано с определенными аллелями генов inlA и inlC. Кроме того, полученные нами результаты свидетельствуют о значимости генов inlA и inlC как маркеров штаммов L. monocytogenes, представляющих повышенную опасность для беременных женщин в развитии листериоза у плода.

Отмеченное низкое генетическое разнообразие аллелей генов inlA, inlC и inlE у изолятов L.monocytogenes, полученных из морских гидробионтов на Дальнем Востоке России, предполагает, что эти изоляты могли быть потомством одного клона. В то же время они отличались по аллелям гена inlB, что предполагает отсутствие предпочтения аллелей гена inlB в возникновении инфекции у данной группы хозяев.

Таким образом, наши результаты предполагают распространенность специфических аллелей генов, кодирующих интерналины у культур L.monocytogenes, инфицирующих определенного хозяина. Наличие несинонимичных замен у генов, кодирующих интерналины, свидетельствует о возможности селективного отбора, в результате которого могут отбираться варианты, более адаптированные для выживания в определенных условиях и, поскольку интерналины принадлежат к факторам патогенности, для паразитирования в определенных хозяевах.

выводы

1. Создана комплексная система анализа микробиологических и молекулярно-генетических свойств возбудителя листериоза, L.monocytogenes, включающая: (1) оригинальные селективные и дифференциальные питательные среды на основе отечественного сырья; (2) адаптированные и оптимизированные для отечественных условий методы микробиологической дифференциации; (3) экспресс-методы выявления и идентификации возбудителя листериоза, основанные на ПЦР, специфичной в отношении консервативных фрагментов генов патогенности; (4) систему типирования L.monocytogenes на основе мультилокусного секвенирования генов факторов патогенности, позволяющую дифференцировать эпидемически несвязанные между собой изоляты листерий с индексом дискриминации 0,982.

2. Впервые дана комплексная характеристика бактерий вида L.monocytogenes, распространенных на Дальнем Востоке РФ; показано преобладание в этом регионе штаммов вида L.monocytogenes, относящихся к эпидемически значимому сероварианту 4Ь.

3. Впервые доказано, что, несмотря на сходство морфологических, культуральных и биохимических свойств, дальневосточные и европейские штаммы L.monocytogenes могут быть дифференцированы с помощью методов молекулярно-генетического типирования. Установлены существование регион-специфического распределения штаммов L. monocytogenes на территории РФ, а также поликлональ-ность распределения штаммов L. monocytogenes внутри регионов (Европейская часть РФ, Дальний Восток).

4. Впервые установлена филогенетическая структура L. monocytogenes, распространенных на Дальнем Востоке. Подтверждено существование двух филогенетических линий внутри вида L.monocytogenes. Установлена связь между филогенетическим положением штамма L. monocytogenes и его эпидемиологическим потенциалом. Впервые показано, что среди изолятов L. monocytogenes из клинического материала, от грызунов и морских гидробионтов преобладают штаммы листерий, относящиеся к первой филогенетической линии; среди изолятов L. monocytogenes из продуктов питания доминируют штаммы, относящиеся ко второй филогенетической линии.

5. Впервые показано, что штаммы L. monocytogenes, распространенные в природе среди мышевидных грызунов и среди морских

гидробионтов, вызывают внутриутробную инфекцию у человека. Это подтверждает предположение о возможности заноса вирулентных штаммов L. monocytogenes из окружающей среды в человеческую популяцию.

6. Показано существование у L.monocytogenes штаммоспецифи-ческого полиморфизма спектра факторов инвазии - белков семейства интерналинов. Определено, что все культуры L.monocytogenes, выделенные из эукариотических организмов, независимо от региона изоляции, обладают генами inlA, inlB, inlE, inlC. Впервые установлено, что ген, кодирующий белок InlF, проявляет вариабельность в размере и последовательности нуклеотидов у ¿.monocytogenes, выделенных из разных источников; показано, что гены inlG и inlH не выявляются у большинства штаммов L.monocytogenes, изолированных из организма человека и животных. Эти данные свидетельствуют о том, что кодируемые этими генами белки InlG и InlH не являются необходимыми для возникновения листериозной инфекции.

7. Впервые установлена корреляция между последовательностью определенных аллелей генов, кодирующих факторы инвазии, и частотой выделения штамма L. monocytogenes от разных хозяев. Среди штаммов, вызывающих развитие внутриутробной инфекции у человека, преобладают определенные аллели гена inlA, и гена inlC, кодирующих факторы инвазии InlA и InlC. Среди штаммов L. monocytogenes, выделенных от мышевидных грызунов, доминируют определенные аллели гена inlB, кодирующего функциональный домен фактора инвазии InlB.

8. Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности фрагментов генов inlA, inlB, inlC, inlE и prs показал значимость LRR-кодирующего фрагмента генов inlA и inlC, как маркера штаммов L.monocytogenes, представляющих повышенную эпидемиологическую опасность для развития листериоза у плода.

9. Впервые комплексно определено влияние абиотических факторов среды на адгезивные свойства листерий. Установлено значение температуры, кислотности среды и экзогенных нуклеиновых кислот в изменении адгезивных свойств листериозного микроба, что может воздействовать на инициацию инфекционного процесса.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ:

- в науку:

1. Использование метода мультилокусного секвенирования при типировании L. monocytogenes на основании полиморфизма генов ин-терналинов и гена prs позволит дифференцировать филогенетически удаленные штаммы листерий и штаммы, циркулирующие в географически удаленных областях, а также эпидемически несвязанные изоля-ты, что поможет решать задачи микробиологии и эпидемиологии.

2. Полученные нуклеотидные последовательности генов инвазии inlA, inlB, inlC inlE и гена общего метаболизма prs, депонированные в базе данных Международного GenBank, могут служить стандартами для исследования геномного полиморфизма штаммов L.monocytogenes в научных целях.

- в медицинскую практику:

1. Для здравоохранения разработана система микробиологического и молекулярно-генетического мониторинга за возбудителем листериоза, что позволит проводить систематический анализ и прогнозирование заболеваемости этой инфекцией. Начиная с 2002 г. на базе лаборатории экологии патогенных бактерий НИИЭМ СО РАМН осуществляется мониторинг за возбудителем листериоза в Приморском крае и г. Владивостоке.

2. Для накопления культур возбудителей сапрозоонозов, включая бактерии рода Listeria, рекомендовано использовать питательные среды на основе молок дальневосточных рыб, которые обеспечивают активное размножение микробов (заявка на изобретение № 2008111691 от 26.03.2008 г. «Питательная среда для культивирования бактерий»; заявка на изобретение № 2008132232 от 4.08.2008 «Питательная среда для культивирования бактерий (ее варианты)»). Предложенные питательные среды (жидкие, агаризованные, в т.ч. сухие) предназначены для культивирования различных бактерий, обладают хорошими ростовыми свойствами и накопительным эффектом. Данные среды просты и экономичны в изготовлении, легко могут быть освоены на производстве и приготовлены в бактериологической лаборатории. Использование отходов рыбного производства - молок рыб различной стадии зрелости, в том числе текучих, позволяет расширить отечественную сырьевую базу для приготовления питательных бактериологических сред.

3. Для контроля за инфицированностью листериями пищевых продуктов и объектов окружающей среды рекомендовано использовать дифференциально-диагностическую среду (патент РФ № 2184782 от 10.07.2002 г. «Дифференциально-диагностическая среда для листерий»). Предложенная селективная среда не уступает по своим качествам известным селективно-дифференциальным средам для выделения листерий.

4. На начальных этапах бактериологического исследования рекомендовано использовать комплексную индикаторную среду для дифференциации бактерий рода Listeria (патент РФ № 2303060 от 20.07.2007 г. «Комплексная индикаторная среда для дифференциации бактерий рода Listeria»), которая позволяет в первые 18-24 ч удалить посторонние микроорганизмы. Это сокращает использование дорогостоящих сред и реактивов, ускоряет процесс идентификации листерий в сравнительно короткие сроки, что значительно упрощает работу врача-бактериолога (методическое пособие «Питательные среды для изоляции, типирования и идентификации бактерий рода Listeria» /авторы Е.А. Зайцева, Г.П. Сомов, Л.Н. Фатеева, Г.Г. Компанец, Н.Г. Плехова. Утверждено руководителем Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток.- 2008).

5. Предприятиям, деятельность которых связана с пищевой продукцией, в том числе пищеблокам различных учреждений, рекомендовано усилить меры по профилактике листериоза (информационное письмо «Listeria monocytogenes - новый микробиологический показатель опасности пищевых продуктов» / авторы J1.H. Федянина, Е.А. Зайцева, Т.К. Каленик, В.Б. Светлов. Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток.- 2006).

пирования и идентификации бактерий рода Listeria» / авторы Е.А. Зайцева, Г.П. Сомов, J1.H. Фатеева, Г.Г. Компанец, Н.Г. Плехова. Утверждено руководителем Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток.- 2008).

- в учебный процесс:

Материалы диссертации рекомендовано использовать при преподавании курса медицинской микробиологии, экологии бактерий, эпидемиологии, инфекционных болезней.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бузолева Л.С., Зайцева Е.А., Терехова В.Е., Сомов Г.П. Биохимические механизмы адаптации Listeria monocytogenes к факторам окружающей среды // Листериоз на рубеже тысячелетий: материалы межд. конференции. Покров, 18-20 мая 1999 г. С.91 - 93.

2. Сомов Г.П., Бузолева Л.С., Зайцева Е.А., Терехова В.Е. О существовании патогенных бактерий в окружающей среде // Вестник ДВО РАН. 2000. №3. С. 3-9.

3. Зайцева Е.А., Терехова В.Е. Эколого-эпидемические особенности Listeria monocytogenes в Приморском крае // Тихоокеанский мед. журнал. Спец. выпуск. 2001. №2. С.29 -31.

4. Зайцева Е.А., Бузолева Л.С., Терехова В.Е, и др. Изоляция Listeria monocytogenes из различных объектов в Приморском крае и их биологические свойства// Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. № 1. С. 47 - 49.

5. Терехова В.Е., Бузолева Л.С., Айздайчер Н.А., Зайцева Е.А. и др. Окраинные моря северо-западной части Тихого океана как среда обитания Listeria monocytogenes и эпидемиологическое значение этого явления // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2002. №1. С. 43 - 46.

6. Глазырина Т.А., Бузолева Л.С., Зайцева Е.А., Сомов Г.П. Дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий /Патент № 2184782 Российской Федерации. Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 2.11.1999. Опубл. 10.07.2002.

7. Зайцева Е.А, Распространение бактерий рода Listeria на территории Приморского края // Ветеринарная патология. 2004. Т 4, № 11. С. 28 - 31.

8. Зайцева Е.А. Изучение чувствительности к антимикробным препаратам штаммов Listeria monocytogenes, выделенных а Приморском крае. // Антибиотики и химиотерапия. 2005. Т. 50. № 7. С. 27 - 31.

9. Зайцева Е.А., Сомов Г.П. Применение полимеразной цепной реакции для идентификации бактерий Listeria monocytogenes II Генодиагностика инфекционных болезней: материалы Российской научно-практической конференции. «Сосновка», Новосиб.обл., 25-27 октября

2005. С. 112-114.

10. Федянина J1.H., Зайцева Е.А., Эпштейн JI.M. и др. Влияние ДНК из молок лососевых рыб на Т-клеточный иммунитет в эксперименте // Антибиотики и химиотерапия. 2005. № 2 - 3. С. 14-17.

11. Зайцева Е.А. О контаминации пищевых продуктов Listeria monocytogenes в Приморском крае // Оптимальное питание - здоровье нации: материалы VIII Всерос. Конгресса к 75-летию Государственного учреждения Науч.-исслед. инст. питания РАМН. Москва, 2005. С. 97.

12. Зайцева Е.А., Сомов Г.П. Микробиологическая характеристика Listeria monocytogenes, изолированных из различных источников в Приморском крае // Журн. микробиол. 2006. № 2. С. 3 - 6.

13. Зайцева Е.А., Сомов Г.П. Влияние температуры на адгезивные свойства листерий // Журн. микробиол., Приложение. 2006. № 3. С. 20 - 23.

14. Зайцева Е.А., Федянина J1.H., Потапова В.В., Беседнова Н.Н. Влияние ДНК из молок лососевых рыб на адгезивные свойства Listeria monocytogenes и выживаемость белых мышей при экспериментальном листериозе // Журн. микробиол., Приложение. 2006. № 3. С. 61 - 64.

15. Федянина Л.Н., Зайцева Е.А., Каленик Т.К. .Изучение эффективности применения биологически активного вещества ДНК из молок лососевых рыб при экспериментальном листериозе // Журн. микробиол., Приложение. 2006. № 3. С. 65 - 68.

16. Зайцева Е.А., Федянина Л.Н., Коленченко Г.Н., Антоненко О.М. Listeria monocytogenes - новый микробиологический показатель безопасности пищевых продуктов // Мясная индустрия. 2006. № 4. С. 30-32.

17. Зайцева Е.А., Ермолаева С.А, Сомов Г.П. Гены, кодирующие факторы инвазии у штаммов Listeria monocytogenes, изолированных в Европейской части и Дальневосточном регионе России // Журн. микробиол.

2006. № 4. С. 42 - 44.

18. Зайцева Е.А., Ермолаева С.А., Пуховская Н.М. и др. Эпидемиологическая значимость Listeria monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе из клинического материала // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: материалы III Российская научно-практическая конференция с международным участием. Новосибирск, 27-29 сентября 2006 г. С. 192-193.

19. Zaytseva Е.А., Ermolaeva S.A., Somov G.P. Genes coding invasion factors in Listeria monocytogenes strains isolated from macroorganisms on the Russian Far East // 2nd FEMS Congress of European Microbiologists: abstr.

Madrid, Spain. 5-8 Jule, 2006. P. 134.

20. Zaytseva E., Ermolaeva S., Somov G. Genes coding invasion factors in Listeria monocytogenes strains isolated on the Russian Far East // 11International Symposium on Microbial Ecology: abstr. Vienna, Austria, 20-25 August 2006. P. 442.

21. Зайцева E.A., Сомов Г.П., Бузолева JI.С., Глазырина Т.А. Лабораторная диагностика листериоза: методические рекомендации. Владивосток. 2006. 44 с.

22. Зайцева Е.А., Ермолаева С.А., Сомов Г.П. Гены, кодирующие факторы инвазии, у штаммов Listeria monocytogenes, изолированных из пищевых продуктов // Бюллетень СО РАМН. Приложение: материалы конференции. Новосибирск, 12-16 июня, 2006. С.231-232.

23. Зайцева Е.А., Пуховская Н.М., Мусатов Ю.С. и др. Молекуляр-но-генетические особенности и эпидемиологическая значимость штаммов Listeria monocytogenes, выделенных от беременных женщин и из абортного материала в дальневосточном регионе России // Клин, микробиол., антимикроб. химиотер. 2007. Т. 9. № 1. С.81-89.

24. Zaytseva Е.А., Ermolaeva S.A., Somov G.P. Phylogenetic features of Listeria monocytogenes clinical strains isolated on the Russian Far East // 1 б"' International Symposium on Problems of Listeriosis. ISOPOL XVI: abstr. Savannah, Georgia, USA. March 20-23, 2007. P-I6.

25. Zaytseva E.A. , Ermolaeva S.A., Somov G.P. SNP analysis of the virulence gene inlB and the housekeeping gene prs in Listeria monocytogenes isolated in the Far East of Russia // 9th Symposium on Bacterial Genetics and Ecology-Bageco-9: abstr. Wemigerode, Germany. 23-27 June 2007. P. 82.

26. Zaytseva E.A., Pukhovskaya N.M., Musatov Y.S., Ivanov L.I., Ermolaeva S.A., Somov G.P. Genetic diversity and epidemiological significance of Listeria monocytogenes from pregnant women and aborted fetuses on the Russian Far East // 5йЧУогЫ Congress of the World Society for Pediatric Infectious Diseases: abstr. Bangkok, Thailand. November 15-18, 2007. P. 51.

27. Зайцева E.A., Кушнарева T.B., Ермолаева С.А. Диагностический мониторинг за листериозной инфекцией в очаге ГЛПС на территории Приморского края // Молекулярная диагностика - 2007: материалы 6-ой Всероссийской научно-практической конф. с межд. участием. М., 2007. Т. 2. С. 298-299.

28. Zaytseva Е., Ermolaeva S., Somov G.P. Low genetic diversity and epidemiological significance of Listeria monocytogenes isolated from wild animals in the Far East of Russia // Infect. Genet. Evol. 2007. Vol. 7, No. 6. P. 736-742.

29. Зайцева E.A., Глазырина T.A., Сомов Г.П. Комплексная индикаторная среда для дифференциации бактерий рода Listeria / Патент №

2303060 Российской Федерации. Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 28.12.2005. Опубл. 20.07.2007.

30. Зайцева Е.А., Савина О.Г., Ерохина Л.Г., Гордеец А.В. Выявление Listeria monocytogenes у больных с клиникой инфекционного моно-нуклеоза // Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний: материалы Всероссийской научной конференции. Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008. № 2 (22). Приложение, Часть I. С. 225-226.

31. Зайцева Е.А., Ермолаева С.А., Сомов Г.П. Филогенетические особенности L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке России // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: материалы 4 межд. конф. Санкт-Петербург. 2 - 4 июня 2008 г. С. 147.

32. Зайцева Е.А., Ермолаева С.А., Сомов Г.П. Распространение Listeria monocytogenes среди мышевидных грызунов на территории Приморского края // Тихоокеанский мед. журнал. 2008. № 2. С. 65 - 69.

33. Зайцева Е.А., Сомов Г.П., Фатеева Л.Н.и др. Питательные среды для выделения, типирования и идентификации бактерий рода Listeria: методическое пособие для бактериологов. Владивосток. 2008. 76 с.

34. Зайцева Е.А., Беляев К.Р., Егорова И.Ю. и др. Дифференциация штаммов Listeria monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части России, на основе полиморфизма генов, кодирующих факторы инвазии // Журн. микробиол. 2008. № 6. С. 10 - 14.

35. Зайцева Е.А., Фатеева Л.Н., Кривошеева A.M., Сомов Г.П. Питательная среда на основе молок рыб для культивирования бактерий // Известия ТИНРО. 2009. Т. 157. С. 229-236.

36. Зайцева Е.А., Глазырина Т.А., Сомов Г.П. Ускоренный метод дифференциации бактерий рода Listeria II Клиническая лабораторная диагностика. 2009. № 6. С.46 - 48.

Отпечатано в издательстве и типографии газеты ТОФ «Боевая Тираж 100 экз. Заказ № 242

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Зайцева, Елена Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ЛИСТЕРИОЗЕ

1.1. Краткий исторический очерк изучения возбудителя листериоза

1.2. Эколого-эпидемические аспекты листериоза

1.3. Микробиология листериоза

1.4. Факторы патогениости L.monocytogenes и их участие в развитии инфекционного процесса

1.4.1. Факторы патогенности L.monocytogenes, участвующие в адгезии, инвазии эукариотических клеток и внутриклеточном выживании

1.4.2. Продукция бактериальных экзоферментов и их вклад в инфекционный процесс

1.5. Молекулярно-генетическая организация листерий

1.6. Клинико-патогенетические особенности листериоза

1.6.1. Патогенез листериозной инфекции

1.6.2. Клинические варианты листериозной инфекции 63 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Материал

2.1.2. Микроорганизмы 72 2.1.3 Животные

2.1.4. Среды для культивирования и идентификации бактерий

2.1.5. Аппаратура

2.2. Методы исследования

2.2.1. Микробиологические методы

2.2.2. Молекулярно-генетические методы

2.2.3. Статистические методы

ГЛАВА 3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛИСТЕРИЙ, ИЗОЛИРОВАННЫХ НА ДАЛЬНЕМ ВОСТОКЕ

3.1. Подбор оптимальных питательных сред, схемы выделения, культивирования и изучения биологических свойств листерий

3.2. Микробиологическая характеристика листерий, изолированных в Дальневосточном регионе

3.2.1. Микробиологическая характеристика листерий, изолированных из биотических объектов

3.2.2. Микробиологическая характеристика листерий, изолированных из абиотических объектов

3.3.Сравнительный анализ микробиологических свойств L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части России

3.4. Факторы патогенности у L.monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке

3.5. Гены патогенности у L. monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке

3.6. Сравнительный анализ патогенных свойств L.monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части России

3.7. Антибиотикорезистентность культур L.monocytogenes, выделенных в различных регионах России (Дальнем Востоке и Европейской части)

ГЛАВА 4. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ШТАММОВ L.MONOCYTOGENES, ИЗОЛИРОВАННЫХ НА ДАЛЬНЕМ ВОСТОКЕ РОССИИ

4.1. Спектр генов, кодирующих белки - интерналины у L.monocytogenes

4.2. Полиморфизм гена общего метаболизмаprs у L.monocytogenes

4.3. Сравнительный анализ полиморфизма генов, кодирующих белкиинтерналины (inlA, inlB, inlC, inlE), и генаprs у штаммов L.mono-cytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе и в Европейской части России 152 4.3.1. Структура гена inlB у дальневосточных изолятов L.monocytogenes

ГЛАВА 5. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОПУЛЯЦИИ L.MONOCYTOGENES, РАСПРОСТРАНЕННОЙ НА ДАЛЬНЕМ ВОСТОКЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

5.1. Серологическая принадлежность изолятов L.monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке

5.2. Фаготипическая принадлежность штаммов L.monocytogenes

5.3. Новая система типирования на основании полиморфизма пяти маркерных генов: inlA, inlB, inlC, inlE, prs для анализа филогенетического положения изолятов L. monocytogenes

5.4. Анализ филогенетической принадлежности изолятов

L.monocytogenes в зависимости от региона и источника выделения

5.4.1. Анализ специфичности филогенетического положения изолятов L.monocytogenes в зависимости от региона выделения

5.4.2. Анализ специфичности филогенетического положения изолятов L.monocytogenes и распределения аллелей генов, кодирующих белки-интерналины, в зависимости от источника выделения

5.4.3. Анализ аминокислотных замен у изолятов L.monocytogenes, связанный с филогенетическим происхождением и источником выделения

5.5. Анализ филогенетического положения изолятов L. monocytogenes, полученных от беременных женщин и мертворожденных плодов на Дальнем Востоке России

5.5.1. Филогенетическое разделение среди клинических изолятов L.monocytogenes

5.5.2. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагментов генов inlA, inlB и prs у изолятов L. monocytogenes 5.5.3. Анализ вариабельности генов инвазии и гена общего метаболиз- 196 ма у клинических изолятов L. monocytogenes внутри филогенетических линий

ГЛАВА 6. ВЛИЯНИЕ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА ВИРУЛЕНТНОСТЬ ШТАММОВ L.MONOCYTOGENES 202 6.1. Изменение адгезивных свойств бактерий рода Listeria под влиянием абиотических факторов

6.1.1. Изменение адгезивных свойств листерий под влияние температуры

6.1.2. Изменение адгезивных свойств листерий под влияние рН среды

6.1.3. Изменение адгезивных свойств листерий под влияние экзогенной нуклеиновой кислоты

Введение Диссертация по биологии, на тему "Система анализа микробиологических и молекулярно-генетических маркеров для выявления высоковирулентных штаммов Listeria monocytogenes"

Актуальность проблемы

В последние годы структура инфекционной патологии человека претерпевает существенные изменения, связанные в первую очередь с открытием ранее неизвестных возбудителей, а также с изменением удельного веса и роли известных ранее патогенов. К числу таких микроорганизмов относятся и листе-рии, которые давно известны микробиологам и клиницистам, но их роль в инфекционной патологии человека за последнее время значительно изменилась, причем расширился и клинический спектр проявления листериозной инфекции.

До 80-х годов XX столетия листериоз не привлекал к себе большого внимания исследователей, поскольку заболеваемость им была невысокой и проявлялась в разных странах несколькими десятками случаев в год (0,5 на 100 тыс. населения - в США, меньше 0,1 - в Российской Федерации) [103]. Положение с заболеваемостью существенно изменилось в 80-х годах, когда в развитых странах (США, Великобритании, Франции, Испании и др.) стали регистрировать эпидемические вспышки листериоза пищевого происхождения с тяжелым клиническим течением и летальностью до 24-40% [60, 103, 201, 305, 408, 414]. Причины подобного изменения эпидемической ситуации в мире до настоящего времени остаются до конца невыясненными. Отчасти, увеличение заболеваемости листериозом связано с длительным хранением пищевых продуктов при низкой температуре, что способствует размножению в них листерий при первично слабой контаминации ими. С другой стороны, нельзя исключать возможности изменения свойств штаммов, циркулирующих в окружающей среде и представляющих опасность для человека.

Основная масса эпидемических вспышек пищевого листериоза, зарегистрированных начиная с 1982 г., связана с относительно узкой филогенетической группой внутри вида Ь.топосуШ$епеБ, характеризующейся принадлежностью к серогруппам 4Ь (около 90% эпидемических случаев), 1/2а и 1/2Ь. Однако до сих пор неизвестно, какие свойства эпидемических штаммов Ь.топосу^епеБ обусловливают их высокую опасность.

В Российской Федерации заболеваемость листериозом у людей официально регистрируется с 1991 г. [72, 103]. Однако официальная статистика (40100 случаев в год) не отражает реального состояния заболеваемости листериозом, что обусловлено не только разнообразием клинических форм болезни, но также недостаточной осведомленностью врачей об особенностях проявления этой инфекции, нехваткой недорогих отечественных селективно-дифференцирующих сред и тест-систем для ее лабораторной диагностики. Образовался своеобразный вакуум между реальной ролью листерий в инфекционной патологии человека и практическими исследованиями в этой области в нашей стране. Вместе с тем, проблема листериоза становится все более актуальной в связи с увеличением случаев заражения его возбудителем людей со сниженным Т-клеточным звеном иммунитета. Одним из важных остается вопрос о распространении листериозной инфекции у беременных женщин, в связи с возможностью внутриутробного инфицирования плода, часто сопровождающегося абортами, мертворождениями и высокой летальностью среди новорожденных. В связи с вышесказанным, в России возникла острая необходимость активизировать работу по изучению листериоза и усилить ее в направлении повышения уровня профилактики инфекции.

Проблема пищевого листериоза, кроме медицинского, имеет существенное социально-экономическое значение. Изъятие зараженных листериями партий продуктов из торговли, ограничение ввоза и вывоза продуктов, остановка их производства, заболеваемость и падеж сельскохозяйственных животных наносят ущерб в сотни миллионов долларов странам - экспортерам сыра и мясных продуктов. Все вышеизложенное побудило Всемирную организацию здравоохранения предпринять ряд мер по борьбе с этой опасной инфекцией. Были разработаны и предложены для выявления возбудителя различные селективные дифференциальные среды, методы экспресс-диагностики и система эпиднадзо-ра. Рабочей группой ВОЗ по проблемам листериоза было рекомендовано проведение исследований по изучению патогенности и факторов вирулентности L.monocytogenes, что зафиксировано включением в список рекомендаций [60, 329].

В последние годы достигнут существенный прогресс в изучении различных факторов патогенности листерий, их роли на различных этапах инфекционного процесса, генов, определяющих их синтез, а также механизмов регуляции их экспрессии. Однако, несмотря на достигнутые за последние годы успехи в изучении биологии и экологии возбудителя листериоза, различных этапов патогенеза, факторов патогенности, многие их свойства остаются нераскрытыми.

Остаются невыясненными биологические особенности L.monocytogenes, обитающих в разных экологических условиях. Практически отсутствуют работы, в которых была бы отражена характеристика листерий, обитающих в природе, а также дано сравнение их с эпидемически значимыми штаммами, что в настоящее время представляется важным ввиду возможности заноса высоковирулентных штаммов L.monocytogenes в окружение человека из природных очагов. В нашей стране до настоящего времени работ по характеристике внутривидовой генетической вариабельности, в том числе факторов патогенности L.monocytogenes, и определению ее связи с источниками изоляции листерий не проводилось.

Цель работы: разработать систему микробиологических и молекуляр-но-генетических маркеров, позволяющую выявлять высоковирулентные штаммы L. monocytogenes, необходимую для контроля распространения листериоз-ной инфекции.

Основные задачи исследования:

4. Выявить генетические маркеры, характерные для эпидемически значимых штаммов L.monocytogenes.

Научная новизна и теоретическая значимость работы:

• Выявлено генетическое разнообразие бактерий рода Listeria, распространенных на Дальнем Востоке Российской Федерации, в том числе патогенного вида L.monocytogenes. Показано преобладание в данном регионе серовари-анта 4Ь, опасного в эпидемическом плане для людей. Создана коллекция дальневосточных штаммов бактерий рода Listeria.

• Впервые доказано, что, несмотря на сходство морфологических, куль-туральных и биохимических свойств, штаммы L.monocytogenes из дальневосточной и европейской частей РФ могут быть дифференцированы с помощью методов молекулярно-генетического типирования. Установлены существование регион-специфического распределения штаммов L.monocytogenes на территории РФ, а также поликлональность распределения штаммов этого вида внутри регионов (Европейская часть РФ, Дальний Восток).

• Установлено, что штаммы L.monocytogenes, выделенные из эукариоти-ческих организмов, включая человека, имеют гены inlA, inlB, inlC, inlE, независимо от региона выделения; гены inlF, inlG, inlH являются штаммоспецифиче-скими.

• Впервые установлена корреляция между развитием внутриутробной инфекции и аллелем фрагмента генов inlA и inlC, кодирующего функционально-значимый домен (LRR-домен) факторов инвазии InlA и InlC, у штаммов L.monocytogenes. Высказано предположение о том, что развитие внутриутробной листериозной инфекции плода у беременных женщин может быть связано с определенными вариантами белков InlA и InlC возбудителя. Получены свидетельства значимости генов inlA и inlC как маркеров штаммов L.monocytogenes, представляющих повышенную опасность для развития листериоза у плода.

• Выявлено изменение адгезивных свойств бактерий рода Listeria, включая вид L. monocytogenes различных серовариантов, под влиянием температуры, кислотности среды (рН) и экзогенной дезоксирибонуклеиновой кислоты. Установлено, что при температуре 4-8°С, рН = 6,0 и 8,0 повышаются, а при температуре 37°С и рН = 9,0 снижаются адгезивные свойствах, monocytogenes.

Теоретическая значимость работы определяется тем, что впервые в сравнительном аспекте представлена комплексная характеристика микробиологических и молекулярно-генетических особенностей бактерий вида L. monocytogenes, выделенных из различных объектов на территории Дальнего Востока и Европейской части России. Установлены молекулярно-генетические маркеры, характеризующие высоковирулентные штаммы L.monocytogenes. Полученные результаты имеют фундаментальное значение для микробиологии и эпидемиологии, поскольку расширяют представление о патогенных бактериях рода Listeria, распространенных на территории Российской Федерации, а также дополняют и уточняют знания о развитии инфекционного процесса при листе-риозной инфекции.

Практическая значимость работы

• Предложена модифицированная схема выделения и идентификации листерий-с использованием сконструированных для этих целей запатентованных дифференциально-диагностической среды для листерий, комплексной индикаторной среды для дифференциации бактерий рода Listeria, питательной среды на основе молок лососевых рыб (жидкой, сухой и плотной) для культивирования бактерий. Создана коллекция дальневосточных штаммов бактерий рода Listeria. Разработанные среды и диагностические методы рекомендованы для проведения мониторинга за возбудителем листериоза в бактериологических лабораториях санитарно-эпидемиологического и ветеринарного надзора, а также в лечебно-профилактических, научно-исследовательских и учебных учреждениях как для целей диагностики инфекционных заболеваний человека и животных, так и для целей сертификации продуктов питания.

• Предложен оригинальный метод генетического типирования изолятов L.monocytogenes на основании последовательностей фрагментов генов inlA, inlB, inlC, inlE и prs, позволяющий дифференцировать эпидемически несвязанные изоляты листерий с индексом дискриминации 0,982.

• Установлен спектр антимикробных препаратов, к которым резистентны штаммы L.monocytogenes, выделенные на Дальнем Востоке, что позволяет совершенствовать рациональную схему этиотропной терапии листериоза у больных.

• Депонированные в GenBank нуклеотидные последовательности штаммов L.monocytogenes имеют значение при проведении научных исследований, поскольку они могут быть использованы при типировании вновь выделенных штаммов L.monocytogenes, а также для уточнения данных об их происхождении и для установления связи различных генетических вариантов с течением и проявлениями листериозной инфекции.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Существует полиморфизм факторов инвазии - семейства белков-интерналинов - у L.monocytogenes, основного возбудителя листериоза. Все культуры L.monocytogenes, выделенные из эукариотических организмов, независимо от региона изоляции, обладают генами inlA, inlB, inlE, inlC.

3. Для L. monocytogenes, выделенных на территории РФ, характерны регион-специфическое распределение штаммов и поликлональность распределения штаммов внутри регионов (Европейская часть РФ, Дальний Восток).

5. Эпидемически значимые штаммы L.monocytogenes, вызывающие внутриутробную листериозную инфекцию плода у человека, распространены в объектах окружающей среды в Дальневосточном регионе, в том числе среди диких грызунов, морских гидробионтов и в пищевых продуктах, реализуемых в торговой сети.

Материалы диссертации были использованы при подготовке:

2. Методических рекомендаций «Лабораторная диагностика листериоза» авторов Е.А.Зайцевой, Г.П. Сомова, Л.С. Бузолевой, Т.А. Глазыриной. Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. - 2006.

3. Информационного письма «Listeria monocytogenes — новый микробиологический показатель опасности пищевых продуктов» авторов Л.Н.Федяниной, Е.А.Зайцевой, Т.Н. Каленик, В.Б.Светлова. Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. - 2006.

5. Патента № 2184782 Российской Федерации. Дифференциально-диагностическая среда для выделения* листерий / Глазырина Т.А., Бузолева Л.С., Зайцева Е.А., Сомов Г.П./ Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 2.11.1999. Опубл. 10.07.2002.

7. Заявки на изобретение № 2008111691/13 (012634) МПК7 С 12 N 1/20, С 12 Q 1/04. «Питательная среда для культивирования бактерий» /Зайцева Е.А., Фатеева Л.Н., Кривошеева A.M., Сомов Г.П. /Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 26.03.2008.

8. Заявки на изобретение № 2008132232 МПК7 С 12 N 1/20, С 12 Q 1/04 «Питательная среда для культивирования бактерий (ее варианты)» /Зайцева Е.А., Фатеева Л.Н., Сомов Г.П. /Заявитель и патентообладатель: НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Заявл. 4.08.2008.

Апробация материалов диссертационной работы:

Новосибирск, 2006); 11 International Symposium on Microbial Ecology (Вена, j

Австрия, 2006); 2 FEMS Congress of European Microbiologists (Madrid, Spain, 2006); 16th International Symposium on Problems of Listeriosis. ISOPOL XVI (Savannah, Georgia, США, 2007); 9th Symposium on Bacterial Genetics and Ecology (Wernigerode, Германия, 2007); 5th World Congress of the World Society for Pediatric Infectious Diseases (Bangkok, Thailand, 2007); 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007»; Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 16-17 апреля 2008 г.); 4 международной конференции «Идеи Пасте-ра в борьбе с инфекциями», посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера и 120-летию Парижского института Пастера (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008 г.); научно-практической конференции с международным участием «Роль вирусных и бактериальных инфекций в формировании перинатальной и соматической патологии у детей» (Хабаровск, 10-11 июня 2008 г.).

Публикации. Основные положения и результаты работы отражены в 62 научной работе, в том числе: 6 - в международной печати, 21 - в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, а также в 3 информационных письмах, 2 патентах на изобретение, 2 заявках на изобретение, 1 пособии для бактериологов, 1 методических рекомендациях.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, главы обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, рекомендаций для внедрения результатов исследования в медицинскую науку и практическое здравоохранение, библиографического списка использованной литературы. Работа изложена на 302 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу, 32 рисунка. Список использованной литературы включает 473 источника, из которых - 109 отечественных и 364 - иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Зайцева, Елена Александровна

250 ВЫВОДЫ

1. Создана комплексная система анализа микробиологических и молеку-лярно-генетических свойств возбудителя листериоза, L.monoeytogenes, включающая: (1) оригинальные селективные и дифференциальные питательные среды на основе отечественного сырья; (2) адаптированные и оптимизированные для отечественных условий методы микробиологической дифференциации; (3) экспресс-методы выявления и идентификации возбудителя листериоза, основанные на ПЦР, специфичной в отношении консервативных фрагментов генов патогенности; (4) систему типирования L.monoeytogenes на основе мультило-кусного секвенирования генов факторов патогенности, позволяющую дифференцировать эпидемически несвязанные между собой изоляты листерий с индексом дискриминации 0,982.

2. Впервые дана комплексная характеристика бактерий вида L.monoeytogenes, распространенных на Дальнем Востоке РФ; показано преобладание в этом регионе штаммов вида L.monoeytogenes, относящихся к эпидемически значимому сероварианту 4Ь.

3. Впервые доказано, что, несмотря на сходство морфологических, куль-туральных и биохимических свойств, дальневосточные и европейские штаммы L.monoeytogenes могут быть дифференцированы с помощью методов молеку-лярно-генетического типирования. Установлены существование регион-специфического распределения штаммов L. monocytogenes на территории РФ, а также поликлональность распределения штаммов L. monocytogenes внутри регионов (Европейская часть РФ, Дальний Восток).

4. Впервые установлена филогенетическая структура L. monocytogenes, распространенных на Дальнем Востоке. Подтверждено существование двух филогенетических линий внутри вида L.monoeytogenes. Установлена связь между филогенетическим положением штамма L. monocytogenes и его эпидемиологическим потенциалом. Впервые показано, что среди изолятов L. monocytogenes из клинического материала, от грызунов и морских гидробионтов преобладают штаммы листерий, относящиеся к первой филогенетической линии; среди изо-лятов L. monocytogenes из продуктов питания доминируют штаммы, относящиеся ко второй филогенетической линии.

5. Впервые показано, что штаммы L. monocytogenes, распространенные в природе среди мышевидных грызунов и среди морских гидробионтов, вызывают внутриутробную инфекцию у человека. Это подтверждает предположение о возможности заноса вирулентных штаммов L. monocytogenes из окружающей среды в человеческую популяцию.

6. Показано существование у L.monocytogenes штаммоспецифического полиморфизма спектра факторов инвазии - белков семейства интерналинов. Определено, что все культуры L.monocytogenes, выделенные из эукариотиче-ских организмов, независимо от региона изоляции, обладают генами inlA, inlB, inlE, inlC. Впервые установлено, что ген, кодирующий белок InlF, проявляет вариабельность в размере и последовательности нуклеотидов у L.monocytogenes, выделенных из разных источников; показано, что гены inlG и inlH не выявляются у большинства штаммов L.monocytogenes, изолированных из организма человека и животных. Эти данные свидетельствуют о том, что кодируемые этими генами белки InlG и InlH не являются необходимыми для возникновения листериозной инфекции.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ:

- в науку:

1. Использование метода мультилокуснош секвенирования при типиро-вании L. monocytogenes на основании полиморфизма генов интерналинов и гена prs позволит дифференцировать филогенетически удаленные штаммы листерий и штаммы, циркулирующие в географически удаленных областях, а также эпидемически несвязанные изоляты, что поможет решать задачи микробиологии и эпидемиологии.

- в медицинскую практику:

1. Для здравоохранения разработана система микробиологического и мо-лекулярно-генетического мониторинга за возбудителем листериоза, что позволит проводить систематический анализ и прогнозирование заболеваемости этой инфекцией. Начиная с 2002 г. на базе лаборатории экологии патогенных бактерий НИИЭМ СО РАМН осуществляется мониторинг за возбудителем листериоза в Приморском крае и г. Владивостоке.

Г.П. Сомов, JI.H. Фатеева, Г.Г. Компанец, Н.Г. Плехова. Утверждено руководителем Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток,-2008).

5. Предприятиям, деятельность которых связана с пищевой продукцией, в том числе пищеблокам различных учреждений, рекомендовано усилить меры по профилактике листериоза (информационное письмо «Listeria monocytogenes - новый микробиологический показатель опасности пищевых продуктов» / авторы JI.H. Федянина, Е.А. Зайцева, Т.К. Каленик, В.Б. Светлов. Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток.- 2006).

6. Бактериологическим лабораториям, осуществляющим диагностику инфекционных заболеваний, рекомендовано активизировать работу по изоляции патогенного вида L.monocytogenes из клинического материала и пищевых продуктов (методические рекомендации «Лабораторная диагностика листериоза» / авторы Е.А. Зайцева, Г.П. Сомов, Л.С. Бузолева, Т.А. Глазырина. Утверждено руководителем ТУ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток. -2006; методическое пособие «Питательные среды для изоляции, типирования и идентификации бактерий рода Listeria» / авторы Е.А. Зайцева, Г.П. Сомов, Л.Н. Фатеева, Г.Г. Компанец, Н.Г. Плехова. Утверждено руководителем Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Приморскому краю. Владивосток.- 2008).

- в учебный процесс:

255

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что бактерии рода Listeria широко распространены в окружающей среде, обладают двойственной природой и способны в зависимости от среды обитания вести как сапрофитный, так и паразитический образ жизни. Огромному многообразию условий сред обитания этих бактерий соответствует широкий спектр их адаптационных свойств, увеличивающий их шансы на выживание в различных экологических условиях.

Несмотря на то, что листериоз регистрируется во многих странах мира и микроб выделяют из большого количества объектов окружающей среды, многих видов животных, пищевых продуктов, клинического материала, следует подчеркнуть, что к началу нашей работы вопрос о распространении бактерий рода Listeria на Дальнем Востоке был совершенно не изучен. Отсутствовала утвержденная схема выделения этого возбудителя из образцов различного происхождения. Не было сведений о биологических особенностях бактерий вида L. monocytogenes, обитающих в разных экологических условиях Дальневосточного региона. Особый интерес представлял вопрос о патогенных свойствах и вирулентном потенциале штаммов листерий, выделяемых на Дальнем Востоке Российской Федерации.

В начале наших исследований были подобраны оптимальные питательные среды для изоляции, культивирования листерий, ингибиторы для приготовления селективной дифференциальной среды с целью эффективного выделения культур листерий из разнообразных объектов окружающей среды и клинического материала, что было связано с отсутствием стандартных отечественных сред, а использование сред, предложенных зарубежными авторами, было затруднено из-за дороговизны и дефицита входящих в их состав компонентов.

Для этих целей были разработаны и апробированы на большом количестве материала «Дифференциально-диагностическая среда для листерий» (патент РФ № 2184782 от 10 июля 2002 г., НИИЭМ СО РАМН), «Комплексная индикаторная среда для дифференциации листерий» (патент РФ № 2303060 от 20 июля

2007 г., НИИЭМ СО РАМН), жидкая, сухая (заявка на изобретение № 2008111691 от 26.03.2008, НИИЭМ СО РАМН) и плотная (заявка на изобретение № 2008132232 от 4.08.2008, НИИЭМ СО РАМН) питательные среды для культивирования бактерий рода Listeria и других микроорганизмов на основе молок рыб, модифицированы среды для определения подвижности листерий и наличия у них фермента дегидролазы с использованием 2,3,5-трифенилтетразолий хлористого, для определения ДНКазы и липазы.

Была подобрана оптимальная схема исследования различных проб для выделения листерий. Чаще всего прямой высев исследуемого материала (особенно при исследовании проб из объектов окружающей среды - воды, почвы - и биологических образцов - клинического материала, органов грызунов) на селективную среду не позволял сразу выявить колонии листерий, что, возможно, связано с низкой концентрацией листерий и значительным числом колоний сопутствующих видов бактерий. Поэтому была использована комбинация селективного (при температуре 35 - 37°С) и холодового обогащения (4 - 8°С) исследуемого материала. Элементы селективного и холодового обогащения включались в ранее разработанные схемы выделения листерий [8, 238, 239, 372], но наши модификации и разработанные питательные среды являются оригинальными (патенты РФ № 2184782 от 10. 07. 02, № 2303060 от 20. 07. 07, заявки на изобретение № 2008111691 от 26.03.2008, № 2008132232 от 4.08.2008).

Используя комплекс современных питательных сред, а также среды в авторской разработке, была сформирована коллекция, включающая 238 изолятов листерий (из них 112 - отнесены к виду L.monocytogenes).

При изучении вопроса о распространении листерий на Дальнем Востоке было отмечено, что в этом регионе выделяются разнообразные виды бактерий рода Listeria - L.monocytogenes (47,1% от общего числа изолятов), L. innocua (19,7%), L.ivanovii (1,2%), L.seeligeri (2,9%), L.welschimeri (0,8%). Эти бактерии были обнаружены в различных объектах окружающей среды - в речной воде, наземных растениях, водорослях, изолированы из органов грызунов, морских гидробионтов, клинического материала, пищевых продуктов (мясных, молочных, рыбных, мясе птицы), а также в смывах с оборудования на производственных предприятиях.

По нашим данным наиболее контаминированными бактериями рода Listeria оказались продукты питания. Чаще всего патогенный вид L.monocytogenes выделяли из мясных (12,7% от числа исследованных образцов; свинина, говядина), куриных (2,9%) продуктов и морепродуктов (1,6%; навага, пеленгас, кальмары, сельдь). Наряду с L.monocytogenes (2,8%), пищевые продукты были контаминированы бактериями вида L.innocua (2,7%), особенно мясные (13,3% от числа исследованных образцов; отечественного и импортного производства) - говядина, свинина, пельмени, мясные палочки, реже рыбные (1,2%; семга, горбуша). Кроме пищевых продуктов на территории Приморского края L.innocua выделили из силоса. Другие виды листерий, например L.seeligeri, встречались в рыбных продуктах (в горбуше, волосозубе), L.welschimeri - в мясных.

Среди биотических объектов в Дальневосточном регионе России патогенный вид L.monocytogenes обнаружили у мышевидных грызунов рода Apodemus (полевая и восточно-азиатская мыши), лесных полевок рода Myodes (красная и красно-серая полевки), серой крысы, морских гидробионтов (морской гребешок, морская звезда, морской еж, камбала). Важно подчеркнуть, что грызунам и другим диким животным отводится важная роль в инфицировании лис-териями окружающей среды и формировании природных очагов инфекции [23, 36, 51, 62, 109]. Однако на Дальнем Востоке вопрос о циркуляции этого возбудителя среди грызунов до сих пор изучен недостаточно. Наши исследования свидетельствуют о распространении L.monocytogenes в популяции мышевидных грызунов на территории Приморского края. Среди обследованных грызунов, отловленных на территории края, по числу инфицированных патогенным для человека и животных видом L.monocytogenes доминировала полевая мышь (Ар. agrarius), обитающая на равнинной территории Приморского края, которая при определенных условиях может явиться фактором передачи возбудителя.

Было также зафиксировано выделение L.monocytogenes из абиотических объектов природных экосистем, например, воды и ила реки Кневичи. Резерву-арная роль почв и водоемов для возбудителей сапрозоонозов, к которым относится L.monocytogenes, была доказана в целом ряде теоретических и экспериментальных работ [28, 31, 61, 90]. Полученные нами результаты свидетельствуют о существовании на Дальнем Востоке РФ патогенных бактерий L.monocytogenes в естественных экосистемах.

Следствием широкого распространения листерий в природе явилось выделение на Дальнем Востоке возбудителя от человека (из абортированных плодов, клинического материала от беременных женщин, плацент, трупного материала от больного, умершего от листериозного менингита). Более того, используя методы молекулярно-генетического типирования, нам удалось показать, что один и тот же сиквенс-тип штамма L.monocytogenes, выявленный среди мышевидных грызунов, возможно, вызвал вспышку внутриутробного листериоза у беременных женщин в г. Хабаровске. Штаммы листерий, выделенные среди морских гидробионтов, выявляются в морепродуктах, предназначенных для употребления в пищу, что свидетельствует о возможности прямого заноса вирулентных штаммов из окружающей среды в человеческую популяцию.

Известно, что существование возбудителя в определенных экологических условиях влияет на его биологические свойства, которые могут отражаться на морфологии колоний бактерий, особенностях их роста, активности ряда ферментов, антигенной структуре и вирулентности возбудителя [92, 94, 95]. Как показали наши исследования, изоляты L.monocytogenes независимо от источника и региона выделения морфологически были полиморфны: наряду с палочками, встречались кокковидные и овоидные формы бактерий, которые окрашивались по Граму положительно.

Анализ микробиологических свойств культур L. monocytogenes, выделенных из разнообразных объектов окружающей среды, подтвердил относительную стабильность многих их свойств: наличие подвижности при 20-22°С и ее отсутствие у большинства культур при 37°С, голубоватое или голубовато-зеленое свечение колоний в косо-проходящем свете, характерный рост на жидких и плотных питательных средах, каталазную и гемолитическую активности, отсутствие оксидазной активности.

Не было найдено выраженных отличий и по биохимическим свойствам у культур L.monocytogenes, выделенных на Дальнем Востоке и в Европейской части России. Все культуры L.monocytogenes независимо от их происхождения сбраживали с образованием кислоты - глюкозу, фруктозу, рамнозу, эскулин, мальтозу, салицин и не ферментировали ксилозу, раффинозу, мочевину, ман-нит, адонит.

Вариабельные результаты свойств L.monocytogenes в зависимости от региона их выделения выявлены по отношению к мелецитозе, арабинозе, крахмалу, образованию ацетилметилкарбинола в реакциях с метиловым красным и Фогес-Проскауэра. Обнаружено, что 82,4±3,8% дальневосточных культур L.monocytogenes ферментировали мелецитозу, тогда как культуры листерий, выделенные в Европейской части России, ее ферментировали в 1,5 раза реже. Все изученные культуры листерий из Европейской части России не ферментировали арабинозу и крахмал, тогда как часть культур L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке, их утилизировали (25,5±4,3 и 8,8±2,8% соответственно). Анализ полученных результатов также показал, что дальневосточные культуры L.monocytogenes, выделенные из абиотических объектов, по сравнению с биотическими, чаще ферментируют арабинозу (в 4,1 раза) и реже мелецитозу (в 1,2 раза). Выявлено, что часть штаммов листерий утилизируют крахмал. Однако в работе С.М. Омаровой (2007) отмечены отрицательные результаты по отношению к арабинозе и крахмалу у штаммов L.monocytogenes [71]. В то же время полученные нами результаты согласуются с данными литературы, что отдельные штаммы листерий могут продуцировать кислоту из арабинозы, крахмала [392, 417, 420, 461, 470].

Большинство изолятов листерий из Дальневосточного региона и Европейской части России ферментировали галактозу (91,8±3,5 и 96,1±2,7% соответственно). Сходные результаты встречаются и в литературе. Например, в работе В.В. Красовского с соавт. (2000) отмечено, что большинство штаммов ¿.топосу^епея, изолированных в Украине, ферментировали галактозу [53]. В исследованиях, проведенных С.М.Омаровой (2007), штаммы Ь.топосу1о£епеЕ были галактозоотрицательными [71].

По отношению к мелибиозе наши результаты отличались от сообщений других исследователей, т.к. часть культур листерий, изолированных из пищевых продуктов (мясных и рыбных) в Дальневосточном регионе и Европейской части России, ее ферментировали.

Нами отмечено, что большинство штаммов L.monocytogenes, изолированных как в Дальневосточном регионе, так и в Европейской части России, были лактозоположительными (98,2% и 92,7% соответственно). В то же время В.Ф. Москаленко (2000), изучавший биологические свойства листерий, циркулирующих в Украине, в сравнении со штаммами, изолированными в Бельгии, отметил, что украинские штаммы Ь.топосу^епеБ в 86,4% были лактозоотрица-тельные, тогда как бельгийские штаммы Ь.топосу^^епеБ ферментировали лактозу [65]. В исследованиях С.М. Омаровой (2007) штаммы Ь.топосу^епез лактозу не разлагали [71].

Согласно данным литературы реакция на ацетоин (реакция Фогес-Проскауэра) и с метиловым красным - у листерий позитивна [73]. Однако у большинства культур Ь.топосу^епез, выделенных в Дальневосточном регионе, по сравнению с культурами из Европейской части РФ, отмечалась отрицательная метил-рот реакция и реакция Фогес-Проскауэра на полужидком агаре. Положительная реакция на ацетоин наблюдалась в 2,1 раза (р<0,05) чаще у дальневосточных культур Ь.топосу^епея, изолированных из биотических объектов по сравнению с абиотическими. Возможно, это связано с тем, что лис-терии, обладая широкими адаптационными возможностями, изменили свою ферментативную активность в зависимости от условий и места обитания. Кроме того, также как выделяют у листерий серотипы, фаготипы, генотипы, то и среди L.monoeytogenes существуют разнообразные биохимические варианты по отношению к образованию ацетилметилкарбинола при утилизации глюкозы (реакция Фогес-Проскауэра) и образованию разных количеств кислоты из этого сахара (проба с метиловым красным).

Для выявления отличительных особенностей среди L.monoeytogenes в зависимости от источника изоляции было выделено 4 группы культур (независимо от региона): 1) от мертворожденных плодов, 2) от мышевидных грызунов, 3) из морских гидробионтов, 4) пищевых продуктов (как контроль). Установлено, что чаще разлагали мелецитозу и образовывали ацетилметилкарбинол в реакции с метиловым красным L.monoeytogenes в группах «Мертворожденные плоды» и «Грызуны», сахарозу - культуры листерий контрольной группы.

В процессе адаптации микроорганизма к определенным условиям существования немаловажное значение отводится резистентности к антибиотикам [38, 39]. В настоящее время установлено, что в связи с усилением генетического обмена плазмидами полиантибиотикорезистентности между циркулирующими штаммами различных видов бактерий могут приобретаться и новые признаки, ранее не характерные для той или иной таксономической группы микроорганизмов. Нами был проведен анализ антибиотикорезистентности листерий, который показал, что они в той или иной степени устойчивы к действию 28 антибактериальных препаратов из 33 использованных. Все культуры L.monoeytogenes (100%) оказались резистентными к цефалоспоринам II и III поколения (цефуроксиму и цефтазидиму, цефотаксиму, цефтриаксону соответственно), налидиксовой кислоте и полимиксину. Высокий уровень резистентности L.monoeytogenes был обнаружен к цефалоспоринам I (цефалексину) и III поколений (цефаперазон), а также фторхинолонам (пефлоксацину, ломефлок-сацину, ципрофлоксацину). В настоящее время фторхинолоны по частоте использования в инфекционной патологии стоят на втором месте после (3лактамовых антибиотиков. В отличие от других антибактериальных препаратов факторы резистентности к фторхинолонам (ФХ) не переносятся при помощи плазмид. Резистентность к ним формируется вследствие хромосомных мутаций двух типов: мутация ДНК-гиразы (мишени фторхинолонов) и мутации клеточных мембран, препятствующей проникновению препарата в бактериальную клетку. Тем не менее, наши исследования свидетельствуют о появлении устойчивых к ФХ культур L.monocytogenes - норфлоксацину, пефлоксацину, ципроф-локсацину, ломефлоксацину, левофлоксацину, хотя данные препараты не используются в качестве этиотропных при листериозе. Данный факт еще не нашел отражения в литературе.

Все исследуемые культуры листерий обладали полиантибиотикорези-стентностью. Отмечено, что наименьший индекс множественной антибиотико-резистентности (MAP) определялся у культур L.monocytogenes, изолированных из пищевых продуктов, особенно из Европейской части РФ (индекс MAP = 0,03 - 0,2). Наиболее выраженная множественная антибиотикорезистентность отмечалась среди культур L.monocytogenes, изолированных из объектов окружающей среды, клинических изолятов, органов животных. Несомненно, что широкий и часто бесконтрольный прием антибиотиков способствует росту резистентности к ним многих бактериальных видов, включая листерии, которые распространены повсеместно. При этом нельзя исключить и обмен факторами резистентности между микроорганизмами, сосуществующими рядом с листе-риями [171, 386, 391]. Известно, что множественная лекарственная устойчивость кодируется R плазмидами, которые свободно циркулируют в бактериальной популяции и обеспечивают штаммам L.monocytogenes, носителям плазмид, определенные селективные преимущества. Установлено, что антибиотикорезистентность у листерий кодируется в основном гетерогенными по размеру плазмидами и, частично, хромосомными генами [155, 249, 382, 386].

Проведенный нами анализ выявил фенотипическую неоднородность популяций L.monocytogenes. Интересно отметить, что у дальневосточных культур

L.monocytogenes наблюдалась 100% резистентность к 12 антибактериальным препаратам у изолятов, выделенных из объектов окружающей среды, а наименьшая - у листерий, выделенных из пищевых продуктов, морских гидробио-нтов и органов грызунов. Возможно, что основу такого фенотипического разнообразия листерий составляет геномный (включая внехромосомные гены) полиморфизм данных бактерий, способствующий отбору из гетерогенных бактериальных популяций клонов с определенным гено- и фенотипами, адекватными специфическим условиям среды обитания микроорганизмов.

В ходе исследований не было отмечено существенных различий в чувствительности к антимикробным препаратам и между культурами, изолированных из клинического материала, органов грызунов, объектов окружающей среды (в том числе из пищевых продуктов), что согласуется с данными других исследователей [103, 445]. Не выявлено зависимости между антибиотикорези-стентностью культур L.monocytogenes и их вирулентностью для животных.

Независимо от источника выделения, все тестируемые культуры L.monocytogenes показали высокую чувствительность к антибактериальным препаратам из групп: пенициллинов (пенициллину, ампициллину, карбеницил-лину, амоксициллину, амоксиклаву (амоксициллин/клавуланат)), тетрацикли-нов (доксициклину, тетрациклину), гликопептидов (ванкомицину), а также к гентамицину, цефалоспорину I поколения (цефазолину), рокситромицину, кла-ритромицину, рифампицину, меропенему, офлоксацину, хлорамфениколу. Полученные в ходе исследования результаты могут быть рекомендованы к использованию в клинической практике при лечении больных листериозом на Дальнем Востоке.

Естественно, что без учета патогенного потенциала невозможно адекватно оценить клинико-эпидемическое значение того или иного штамма L.monocytogenes. Не было найдено статистически значимых отличий по ферментативной активности культур L.monocytogenes, изолированных на Дальнем Востоке и в Европейской части РФ, но выявлены отличия в гиалуронидазной, лецитиназной и липазной (в отношении к твину 20 и 80) активности только в зависимости от источника их выделения. Липазная активность определялась у всех изучаемых культур L.monocytogenes, независимо от источника и региона выделения, но отношение к твинам у листерий, изолированных в разных источниках, было вариабельным (кроме твина 60). Меньше половины культур L.monocytogenes ферментировали твин 20 из группы «Мертворожденные плоды», твин 80 - культуры из групп «Мертворожденные плоды» и «Морские гид-робионты» по сравнению с культурами листерий контрольной группы («Пищевые продукты»). Полученные результаты отличаются от данных О.В. Бойко (1997), свидетельствующих о наличии липазы у части штаммов L.monocytogenes, изолированных из объектов окружающей среды, и ее отсутствие у штаммов, выделенных из организма человека и животных [14]. В то же время мы обратили внимание на то, что некоторые изоляты L.monocytogenes гидролизу ют твин 20 и 80 длительно от 4 до 14 дней, что согласуется с данными литературы о длительности ферментации твинов до 10 - 14 дней [8] и необходимо учитывать при изучении липазы у листерий.

Лецитиназная активность определялась у 83,6% изученных культур L.monocytogenes. Причем, среди дальневосточных L.monocytogenes это свойство было обнаружено у большего числа культур, чем у выделенных в Европейской части РФ (91,2% и 62,5% соответственно), и также коррелировало с источником выделения. Лецитиназная активность наблюдалась у 100% культур L.monocytogenes, изолированных из клинического материала (мертворожденных плодов), и не отмечалась у части культур, изолированных из пищевых продуктов, из органов грызунов и морских гидробионтов.

Гиалуронидазная активность отмечалась у большинства (89,9%) изученных культур листерий. Все исследуемые культуры L.monocytogenes, изолированные из клинического материала и органов грызунов, обладали гиалурони-дазной активностью независимо от региона выделения. Культуры листерий, у которых данная активность не определялась, были обнаружены только среди изолятов, выделенных на Дальнем Востоке России из продуктов питания (мясных, куриных, рыбных) и морских гидробионтов.

В последние годы у штаммов L. monocytogenes с помощью молекулярно-генетических методов активно изучаются гены, кодирующие факторы патоген-ности листерий [166, 168, 230, 453]. Известно, что при инвазии энтероцитов и других клеток, не являющихся профессиональными фагоцитами, листерии индуцируют эти клетки к их поглощению, которое происходит при активном участии белков InlA и InlB. Данные, полученные нами при выявлении генов inlA, inlB у культур L.monocytogenes показали, что только ген, кодирующий InlA, был выявлен у всех исследованных штаммов без исключения. Результаты в отношении гена in 1В показали, что культуры L. monocytogenes, выделенные из эу-кариотических организмов, включая человека, обладали этим геном. Ген inlB не был выявлен в реакции ПЦР у одного изолята, выделенного из пищевых продуктов, что, возможно, связано с делецией целого гена или его части, или значительной вариабельностью области связывания используемых праймеров.

Эти данные свидетельствуют в пользу того, что продукты генов inlA, inlB необходимы L. monocytogenes при взаимодействии с эукариотическими клетками. При сапрофитном существовании, которое ведут бактерии, размножающиеся на продуктах питания, наличие полноценных копий генов, кодирующих ин-терналины, не является необходимым условием для проявления патогенных свойств. Это приводит к появлению штаммов, утративших консервативный аллель данных генов.

Известно, что поверхностный белок ActA, являясь основным продуктом листерий, обеспечивающим полимеризацию актина, участвует во вхождении L.monocytogenes в эукариотическую клетку [114, 473]. В последнее время пред

I j полагается, что белок Auto также необходим L.monocytogenes для инвазии в не-фагоцитирующие эукариотические клетки и является у бактерий фактором па-тогенности нового типа [148].

Интересные результаты получены нами при выявлении генов, кодирующих белки ActA и Auto. У всех без исключения штаммов L.monocytogenes был обнаружен ген, кодирующий белок ActA, что свидетельствует о необходимости данного белка для вне- и внутриклеточного паразитирования. У менее чем половины штаммов L.monocytogenes, изолированных как на Дальнем Востоке, так и в Европейской части России (32,9 и 25% соответственно), методом ПНР обнаруживали ген, кодирующий белок Auto. Ген aut чаще определялся среди L.monocytogenes, изолированных из пищевых продуктов (51,6±8,9%), относящихся к серовариантам 1/2а, 1/2Ь, 1/2с, и реже - среди штаммов листерий, изолированных из клинического материала (33,3±7,8%) и из органов грызунов (12,9±4,6%), принадлежащих к сероварианту 4Ь. Возможно, что в процессе эволюции у штаммов листерий, находящихся в условиях сапрофитного существования, появился ген aut, синтезирующий белок Auto для дополнительного взаимодействия с рецепторами на поверхности нефагоцитирующих эукариоти-ческих клеток, тем самым способствуя к более эффективному проникновению листерий в макроорганизм.

Кроме ферментативных свойств и генов, кодирующих факторы патоген-ности, в экспериментах in vivo изучена вирулентность культур L.monocytogenes на неинбредных мышах и морских свинках. По степени вирулентности для белых мышей культуры L.monocytogenes были чрезвычайно неоднородны. Встречались листериозные культуры как вирулентные, так и слабо- или авирулент-ные независимо от источника их выделения. Часть изолятов L.monocytogenes вызывала развитие парезов или параличей у белых мышей, а у морских свинок развивался конъюнктивит, кератоконъюнктивит или кератит, протекавшие с различной длительностью и выраженностью. Нами не установлено корреляции между вирулентностью штаммов L.monocytogenes, географическим местом и объектом их выделения. Возможно, что такие разнообразные клинические проявления и гибель животных связаны не только с патогенными свойствами самих штаммов L.monoeytogenes, но и восприимчивостью макроорганизма.

Принимая во внимание всю совокупность данных, характеризующих факторы патогенности штаммов L.monoeytogenes, выделенных на Дальнем Востоке, следует подчеркнуть, что, несмотря на разнообразие источников их выделения, эти штаммы по основным свойствам однотипны. Имеющиеся различия характеризуют собой индивидуальные особенности штаммов L.monoeytogenes.

Свойства штаммов, выделенных на территории Дальнего Востока и Европейской части России, оказались тождественными свойствам типовых штаммов листерий, что позволяет уверенно рассматривать их как типичные для представителей вида L.monoeytogenes. Наличие отдельных штаммов, имеющих некоторые атипичные свойства (отсутствие способности проявлять (3-гемолитическую, лецитиназную активности, ферментировать отдельные углеводы, наличие подвижности при температуре 37°С), не меняет общего представления о возбудителе.

Важно отметить, что проведенные исследования еще раз показали необходимость учитывать при идентификации культур, предполагаемых как листе-рии, всю совокупность признаков и свойств, а не совпадение отдельных из них. Правильная идентификация возбудителя приобретает большое значение еще и в связи с тем, что на сегодняшний день именно бактериологическое подтверждение диагноза остается единственно достоверным [103]. Однако необходимо подчеркнуть, что полученные результаты не позволили выделить специфиче-i ские особенности, характерные для штаммов листерий, изолированных из оп

1 ределенных источников, в частности из клинических изолятов.

Известно, что одним из важных свойств, обеспечивающих проникновение патогенных бактерий в организм человека и животных, является адгезия. Бактерии, как при паразитическом, так и сапрофитном существовании, широко используют способность адсорбироваться к различным субстратам, в том числе и I г к клеткам-мишеням макроорганизма, с помощью сложных механизмов, на которые могут влиять различные физико-химические и биологические факторы.

В настоящее время установлено, что заражение человека листериями происходит преимущественно алиментарным путем через различные продукты питания. Способность листерий эффективно размножаться при низких температурах (6-8°С), приводящая к накоплению возбудителя в высоких концентрациях в продуктах питания при длительном хранении в холодовых условиях, привела к тому, что листериоз стали называть «болезнью холодильников» [60]. Ряд данных указывает на то, что помимо увеличения численности бактерий L.monocytogenes низкие температуры могут влиять на свойства, связанные с вирулентностью [162, 300, 306]. Возникло предположение, что помимо температуры хранения таите свойства продуктов питания, как химический состав, рН и другие, могут повлиять на адгезивные и инвазивные свойства листерий и тем самым изменять эффективность начального этапа взаимодействия микроба с человеческим организмом.

Экспериментально in vitro было установлено, что температура культивирования по-разному оказывает влияние на адгезивные свойства листерий. У одних видов листерий (.L.monocytogenes, L.seeligeri, L.welschimeri) температура 6-8°С достоверно усиливала адгезию к эритроцитам человека по сравнению с контролем (20-22°С), тогда как при 37 С эти свойства у них ослабевали (in vitro). Низкая температура усиливала адгезивные свойства у L.monocytogenes серовариантов 1/2а, 1/2Ь, 1/2с, 4а, 4с, 4d. Было отмечено, что различная температура культивирования (6-8°С, 20-22°С и 37°С) никак не повлияла на изменение адгезивных свойств у штаммаХ.monocytogenes сероварианта 4Ь.

Отчасти полученные нами результаты можно сопоставить с данными литературы о том, что многие патогенные бактерии обладают подвижностью, обеспечиваемой флагеллярным аппаратом. Об этом свидетельствуют данные о важной роли жгутиков бактерий и связанной с ней подвижностью и хемотаксисом в осуществлении первого этапа инфекционного процесса — приближение к слизистым оболочкам кишечника или дыхательных путей, проникновение через мукозный гель, прикрепление к эпителиальным клеткам [21, 22, 106, 134]. В исследованиях, проведенных И.А. Веленевой (1996), установлено, что низкие положительные температуры (6-8°С) способствовали формированию жгутиков у преобладающего количества штаммов L.monocytogenes [11]. Как установлено, регуляция синтеза и формирования жгутикового аппарата кодируется на уровне хромосомы и в значительной степени зависит от температуры. Многими авторами отмечена тенденция к уменьшению подвижности бактерий при повышении температуры культивирования с 2-4°С до 30-37°С [106, 134, 278]. Возможно, поэтому у листерий при длительном культивировании их при 37°С может снижаться адгезивный потенциал.

При изучении влияния разных значений рН (6,0; 7,0; 8,0; 9,0) было определено, что кислотность среды по-разному влияет на адгезивные свойства листерий, но наблюдается их усиление у бактерий рода Listeria при рН = 6,0 и 8,0. У штаммов L.monocytogenes (девять серовариантов) также отмечалось усиление адгезивных свойств при рН = 6,0 и рН = 8,0, а у сероварианта 1/2Ъ это усиление наблюдалось и при рН = 9,0. Известно, что при нахождении L.monocytogenes в кислых средах в ряде их генов происходят изменения, приводящие к изменению экспрессии более 23 белков [173, 212, 367], что влияет на повышение устойчивости листериозного микроба к другим стрессовым воздействиям (тепловому, осмотическому и др.), на рост и выживаемость L.monocytogenes и, возможно, приводит к повышению вирулентности [160, 223, 313, 340, 367, 433].

Учитывая, что чаще всего заражение листериями происходит через различные продукты питания (сыры, молоко, мясо, рыбу, овощи и т.д.), имеющие разный химический состав и кислотность среды, то можно считать, что эти факторы могут влиять на способность бактерий к более быстрому проникновению в макроорганизм.

При анализе взаимодействия листерий с эритроцитами человека с помощью светового микроскопа на поверхности эритроцитов выявляли как отдельные бактериальные клетки, так и группы клеток, «соединенных» между собой. Такая картина наблюдалась у среднеадгезивных (СПА от 2,01 до 4) и высокоадгезивных (СПА выше 4) листерий, культивированных в холодовых, кислых (рН = 6,0) и щелочных (рН = 8,0) условиях. Если культуры листерий были слабоадгезивными (СПА от 1,0 до 2,0), то на поверхности эритроцитов обнаруживались единичные бактерии или они совсем не выявлялись.

В то же время из литературы известно, что в процессе жизнедеятельности бактерии могут выделять вещества, усиливающие или подавляющие рост и размножение симбионтов, изменять их биологические свойства [341]. Используя механизмы межмикробных взаимодействий, клетки прокариот могут формировать внутриколониальные межклеточные контакты за счет многообразных структур поверхностей, слипания бактериальных клеток или слияния пептидог-ликановых слоев клеточных стенок и т.д. [19, 24, 76, 77, 105]. Колонии практически всех прокариотических организмов обладают способностью к такой организации, которая проявляется в образовании биопленок, цепочек, микроколоний [56].

На основании полученных нами данных можно считать, что свойства, приобретаемые листериями при пониженной температуре, в кислой (рН = 6,0) или щелочной (рН = 8,0) среде, помогают им противостоять неблагоприятным условиям окружающей среды и активно перемещаться в более благоприятные экологические условия, прикрепляться к субстратам среды, конкурировать с другими микроорганизмами и простейшими. Для этих целей они могут использовать подвижность, хемотаксис, адгезивный потенциал и т.п.

Было изучено влияние дезоксирибонуклеиновой кислоты на адгезивные свойства листериозного микроба in vitro. В исследованиях использовали биологически активное вещество (БАВ) - низкомолекулярную ДНК (нДНК), полученную из молок лососевых рыб. Известно, что молоки лососевых рыб содержат нуклеопротеиды, состоящие из нуклеиновых кислот и простейших белков -протаминов и гистонов. Протамины и гистоны построены из аминокислот, среди которых преобладают аргинин, лизин и гистидин; в состав протаминов входят тирозин, триптофан, серии, валин и пролин, а в состав гистонов - серин, ва-лин, аланин, фенилаланин и тирозин [46].

В проведенных исследованиях отмечено усиление адгезивной способности под влиянием экзогенной ДНК у L.monocytogenes. Кроме того, отмечено стимулирующее влияние нДНК из молок лососевых рыб на размножение листерий in vitro. Установлено, что под влиянием низкомолекулярной ДНК через 24 часа культивирования отмечено усиление размножения листерий в разведениях от 101 до 10б КОЕ/мл в 2 - 4 раза по сравнению с контролем при всех изучаемых концентрациях нДНК (5, 25 и 50 у/мл). Подобные результаты мы обнаружили при использовании для культивирования микроба бульона, приготовленного на основе нативных молок лососевых рыб (без ферментативного гидролиза молок). Эти результаты исследований были использованы нами для разработки питательных сред для культивирования бактерий рода Listeria и других микроорганизмов - жидкой (заявка на изобретение № 2008111691 от 26.03.2008, НИИЭМ СО РАМН) и плотной (заявка на изобретение № 2008132232 от 4.08.2008, НИИЭМ СО РАМН).

Для возникновения листериозной инфекции необходима инвазия L.monocytogenes в клетки хозяина, обусловленная продукцией бактериями белковых факторов патогенности. Основную роль в инвазии играют поверхностные и секретируемые белки листерий, относящиеся к семейству интерналинов. Наиболее изучены в настоящее время интерналины А и В. Помимо InlA и InlB семейство интерналинов включает ряд менее изученных белков - секретируе-мый белок InlC, поверхностные белки InlG, InlH, InlE, InlF [123, 186, 195]. He все штаммы L. monocytogenes содержат полный набор генов, кодирующих интерналины [184]. В нашей стране до настоящего времени работ по характеристике внутривидовой генетической вариабельности, в том числе факторов патогенности у L.monocytogenes, и определению их связи с источниками изоляции не проводилось. По нашему мнению, характеристика внутривидовой генетической вариабельности является важным подходом, который необходим для получения принципиальных ключей к выяснению молекулярных механизмов, опосредующих эпидемиологический потенциал разных штаммов листерий.

При проведении молекулярно-генетического анализа не было обнаружено отличительных особенностей встречаемости генов, кодирующих белки-интерналины у штаммов L.monoeytogenes, выделенных в различных регионах РФ. У исследованных штаммов L. monocytogenes выявлены особенности встречаемости генов, кодирующих отдельные интерналины, в зависимости от источника выделения.

Среди генов, присутствие которых характерно для представителей вида L. monocytogenes, независимо от филогенетической линии (гены inlA, inlB, inlC, inlE, inlF), только ген, кодирующий InlA, был обнаружен у всех исследованных штаммов без исключения.

Результаты, полученные при выявлении генов inlB, inlC, inlE, показали, что все штаммы L. monocytogenes, выделенные из эукариотических организмов, включая человека, обладали этими генами. Штаммы L. monocytogenes, у которых данные гены не выявлялись методом ПЦР, встречались только среди изолятов из продуктов питания. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что продукты генов in!A, inlB, inlC, inlE необходимы L.monoeytogenes при взаимодействии с эукариотическим организмом. В условиях же сапрофитного существования, которое ведут бактерии, размножающиеся на продуктах питания, наличие полноценных копий генов, кодирующих интерналины, не является необходимым условием. Это приводит к появлению штаммов, утративших консервативный аллель исследуемых генов.

Встречаемость гена inlF, который, согласно ранее опубликованным исследованиям [184], также является консервативным для вида L. monocytogenes, существенно отличалась от вышеописанных генов. Все штаммы, выделенные от людей, как с клиническими проявлениями листериоза, так и носителей без признаков заболевания, обладали полноразмерной копией гена inlF. Однако на

ДНК 28% штаммов, изолированных из животных, в ПЦР продукта этого гена получено не было. Среди штаммов, выделенных из продуктов питания, положительный результат в реакции ПЦР был получен на ДНК 55,5% штаммов. Проведенный скрининг показал широкую вариабельность в размере гена inlF. Отсутствие продукта ПЦР гена inlF для ряда штаммов указывает либо на возможность утраты этого гена без влияния на внутриклеточное размножение в организме животных, либо высокую вариабельность его последовательности. Интересно отметить, что аллель гена inlF, дающий укороченный продукт в ПЦР, преобладал среди штаммов, выделенных из морских гидробионтов. Данный аллель не встречался среди изолятов из других источников.

Не исключено, что наблюдаемые вариации в размере и/или последовательности гена inlF отражают вклад белка InlF в тропизм бактерий к определенному хозяину. По данным литературы, проведенные in vitro исследования не выявили роли белка InlF в адгезии и инвазии к ряду клеточных линий человека и лабораторных мышей [186]. Однако это не исключает возможности вклада InlF и других мало охарактеризованных интерналинов во взаимодействия с клетками других типов или с представителями других классов многоклеточных организмов.

Известно, что присутствие генов inlG и inlH связано с принадлежностью изолята L. monocytogenes ко второй филогенетической линии и является штам-моспецифическим [184]. Кроме того, изучение роли продуктов генов inlG и inlH показало, что эти белки не только не являются необходимыми в процессе внутриклеточной инфекции, но, напротив, частично подавляют адгезию и инвазию L. monocytogenes in vitro [123]. В наших исследованиях эти гены были выявлены у двух из трех культур L.monocytogenes, относящихся ко второй филогенетической линии и изолированных у здоровых носителей, в то время как среди культур, выделенных от больных людей с клиническими проявлениями листериоза, ген inlG был выявлен у двух, a inlH у одного из пяти изолятов. Хотя количество исследованных клинических изолятов L.monocytogenes недостаточно, чтобы делать определенные выводы, вместе с тем полученные данные свидетельствуют в пользу того, что развитие инфекции может быть связано, скорее, с отсутствием, чем с присутствием данных генов. Важно также отметить, что гены inlG и inlH не выявлялись у подавляющего большинства штаммов L. monocytogenes, изолированных из животных.

Таким образом, анализ присутствия генов, кодирующих белки — интерна-лины у L.monocytogenes, позволяет нам сделать ряд выводов, касающихся необходимости отдельных интерналинов в развитии листериозной инфекции. Во-первых, данные свидетельствуют в пользу того, что белки InlA, InlB, InlC, InlE являются необходимыми для персистирования L. monocytogenes внутри клеток макроорганизмов, причем это, по-видимому, касается не только человека, но и филогенетически удаленных от него видов животных. Во-вторых, на основании анализа размера продукта ПЦР был сделан вывод, что белок InlF проявляет вариабельность в размере и, возможно, последовательности нуклеотидов, коррелирующую с источником выделения. Наконец, полученные данные подтверждают предположение о том, что белки InlG и InlH не являются необходимыми для развития листериозной инфекции.

Исследования последних лет показывают, что внутри вида L. monocytogenes выделяются три филогенетические линии, отличающиеся по своему эпидемическому потенциалу, а также по экологическим характеристикам, в частности, частоте встречаемости в определенных экологических нишах. Эпидемиологически значимая линия, с которой связано до 90% эпидемических вспышек листериоза у человека, у разных авторов имеет обозначение как линия I [460], линия II [184] или линия В [49]. Для нее характерны принадлежность L.monocytogenes к определенному сероварианту и наличие в геноме определенных генов, кодирующих интерналины.

В настоящее время установлено, что из 13 известных серовариантов бактерий вида L.monocytogenes не все серотипы способны вызывать заболевание. Подавляющее большинство случаев (90%) заболеваний у людей связано только с L.monocytogenes трех серовариантов - 1/2а, l/2b и 4b, причем, около 50% случаев листериоза в мире вызывают только штаммы сероварианта 4Ь.

Метод серотипирования широко применяется для характеристики выделенных штаммов L.monocytogenes с целью оценки вариабельности и эпидемической значимости изолятов листерий, полученных из разнообразных источников. Проведенные нами исследования показали антигенное разнообразие культур L.monocytogenes, распространенных на разных географических территориях России. Установлено, что большинство (75%) дальневосточных культур L.monocytogenes относились к сероварианту 4Ь, значительно реже встречались изоляты, принадлежащие к серовариантам 1/2а (19,2% культур), 1/2Ь (3,8%) и 1/2с (1,9 % культур). Чаще всего культуры листерий сероварианта 4Ь на Дальнем Востоке выделяли из биологических объектов (из клинического материала, органов грызунов, морских гидробионтов), что подтверждалось и результатами фаготипирования. Среди изолятов L.monocytogenes, выделенных из пищевых продуктов, в большинстве случаев отмечались сероварианты 1/2а, 1/2Ь, 1/2с, реже - серовариант 4Ь. Среди культур L. monocytogenes, изолированных в Европейской части России, встречались сероварианты 1/2а (41,2%), 4Ь (29,4%), 1/2с (17,6% культур), 1/2Ь (11,8% культур), с преобладанием среди изолятов L.monocytogenes сероварианта 1/2а.

Полученные нами результаты показали превалирование определенных серовариантов L.monocytogenes в Дальневосточном регионе и Европейской части России. Причины такого своеобразия в распространении серовариантов пока не ясны. Возможно, что определенное значение имеет географическое происхождение штаммов, на что указывают данные литературы. Например, известно, что в США преобладают листерии серовариантов 4а, 4b, 4ab, 4с, в Европе -1/2а, 1/2Ь, 1/2с, в Японии - 1/2а, l/2b, 4Ь, 1/2с [448], в Украине - 1/2а (47,8%), 1/2Ь (9,0%), 1/2с (9,4%), 4Ь (9,1%) [65]. Аналогичные результаты по антигенной структуре штаммов L.monocytogenes, изолированных в Украине, отмечают В.В. Красовский с соавт. (2000), а именно: изоляция штаммов сероварианта 1/2а составила 47,6%, серовариантов l/2b, 1/2с, 4b - по 9,5%, а сероварианта 4а -4,8%, у 19,1% штаммов L.monocytogenes серотип не определялся [53].

Важно подчеркнуть, что проведенный анализ антигенной структуры L.monocytogenes с использованием отечественных сывороток двух типов показал относительно низкую специфичность серологической дифференциации. Кроме того, ее низкая разрешающая способность не позволяет производить анализ эпидемически значимых штаммов листерий. В то же время, выполненные с помощью метода мультиплексной ПЦР исследования, показали разнообразие культур L.monocytogenes, циркулирующих на разных географических территориях России с дифференциацией эпидемически значимых и опасных для человека штаммов листерий. Поэтому этот метод можно рекомендовать для использования в практической и научной работах для дифференциации и выявления разнообразия культур листерий.

В настоящее время метод фаготипирования также широко используется для оценки эпидемической значимости выделенных штаммов L.monocytogenes из клинического материала, продуктов питания и образцов окружающей среды [50, 308, 309]. Результаты, полученные при изучении коллекции L.monocytogenes, показали чувствительность к фагам L-2A и L-4A более половины (53,9%) всех исследованных культур. Было отмечено, что бактериофагом L-2A лизировалось 24,4% культур L.monocytogenes, бактериофагом L-4A -24,4% культур, в то же время 5,1% культур лизировались двумя фагами сразу. Среди дальневосточных изолятов L. monocytogenes 34,1% культур типирова-лись фагом L-4A, 15,9 % штаммов - бактериофагом L-2A, причем, выделенные из абиотических объектов, лизировались фагом L-2A - 21,7±4,7% (р<0,05) культур, а изолированные из биотических объектов фагом L-4A - 42,9±5,6% (р 1 0,01) , что в эпидемическом плане является неблагополучным фактором.

В то же время, культуры L.monocytogenes, изолированные в Европейской части России из биотических объектов, в большинстве лизировались бактериофагом L-2A (42,1±5,6 %, р<0,01) по сравнению с культурами, выделенными из i абиотических объектов (26,7±5,01 %, р<0,05).

Полученные результаты показали гетерогенность штаммов L.monocytogenes, изолированных из различных объектов на территории России. Однако использованные методы характеризовались низкой дискриминационной способностью, не отражали полной картины вариабельности популяции и не выявляли степени генетического родства между эпидемическими и неэпидемическими штаммами L.monocytogenes.

В последние годы для типирования наиболее значимых в эпидемиологическом отношении штаммов L.monocytogenes активно разрабатываются моле-кулярно-генетические методы, среди которых мультилокусное секвенирование превосходит все остальные. Правильный выбор мишеней, в этом случае, позволяет исследовать клональную структуру бактериальной популяции, а также более четко дифференцировать изоляты, неразличимые другими методами [202, 210].

Для разработки системы типирования нами было выбрано 40 независимых культур L. monocytogenes, изолированных в разных регионах России (Дальнем Востоке и Европейской части России), у которых было осуществлено секвенирование внутренних областей генов inlA, inlB, inlC, inlE, кодирующих соответствующие белки-интерналины. В качестве пятого маркера использовали внутренний фрагмент гена prs, кодирующего белок общего метаболизма у бактерий рода Listeria - фосфорибозилсинтазу. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов генов prs, inlA, inlB, inlC, inlE позволило разделить изоляты L.monocytogenes на две группы, соответствующие описанным филогенетическим линиям и коррелирующие с принадлежностью к определенному се-роварианту. Большинство культур L.monocytogenes, изолированных в Дальневосточном регионе, принадлежали к первой филогенетической линии, наиболее опасной в эпидемическом плане (по Wiedman М. et al., 1997) [460]. Было отмечено, что среди изолятов L.monocytogenes, полученных из клинического материала (от мертворожденных плодов), от грызунов и морских гидробионтов преобладают штаммы листерий, относящиеся к первой филогенетической линии; среди изолятов L.monoeytogenes из продуктов питания доминируют штаммы, относящиеся ко второй филогенетической линии.

Отмечено отсутствие установленных различий гена prs, а также относительно низкое нуклеотидное разнообразие гена in 1В среди L.monoeytogenes первой филогенетической линии, выделенных из различных источников в Дальневосточном регионе России.

Внутри каждой линии ген prs, кодирующий консервативный для рода Listeria белок фосфорибозилпирофосфатсинтазу, продемонстрировал минимальное нуклеотидное разнообразие (имел различие только в одном полиморфном сайте), что является характерным для генов общего метаболизма. Отсутствие несинонимичных замен в последовательности гена prs подтверждает замечание об отсутствии адаптивной вариабельности и отражает аминокислотную стабильность этого белка у изолятов L.monoeytogenes, эволюционирующих в разных условиях.

На основании анализа коллекции независимых изолятов, выделенных на территории РФ из разных регионов и источников, было показано, что в разработанной нами системе дифференциации листерий по пяти маркерным генам inlA, inlB, inlC, inlE, prs) индекс дискриминации (D.I.) составил 0,982. Полученная величина, хотя она и не является максимально возможной (теоретически максимально возможная величина для индекса дискриминации равна 1), обеспечивает приемлемый уровень дифференциации эпидемически не связанных изолятов. Эта система применена для анализа распределения штаммов L. monocytogenes в зависимости от региона и источника выделения, что позволило дифференцировать филогенетически удаленные штаммы и штаммы, циркулирующие в географически удаленных областях, а также эпидемически не связанные между собой изоляты листерий.

Используя данную систему, была осуществлена дифференциация всех имеющихся изолятов L.monocytogenes, выделенных в Дальневосточном и Европейском регионах РФ, которая выявила 32 сиквенс-типа: 19 СТ - среди дальневосточных и 13 СТ - среди европейских изолятов листерий. Не было найдено ни одного сиквенс-типа, который встречался бы в обоих регионах. Среди дальневосточных L.moпocytogenes заметно преобладали СТ1, СТ9 и СТ17. Не отмечено превалирования какого-либо сиквенс-типа среди L.monocytogenes, изолированных в Европейской части России. Тем самым было доказано существование регион-специфического распределения штаммов L. monocytogenes на территории РФ и показана поликлональность распределения штаммов L. monocytogenes внутри регионов (Европейская часть, Дальний Восток).

При анализе распределения сиквенс-типов в зависимости от источника выделения, было найдено, что некоторые сиквенс-типы обнаруживаются среди специфических хозяев с более высокой частотой, по сравнению с другими сик-венс-типами: СТ1, СТ5, СТ9 и СТ17 чаще встречались среди изолятов L.monocytogenes, полученных из мертворожденных плодов, СТ1 - среди изолятов от грызунов и СТ17 - из морских гидробионтов. Важно отметить, что были выявлены два сиквенс-типа, к которым принадлежали как клинические изоляты, так и изоляты, полученные из дикой природы: к СТ1 принадлежали культуры L.monocytogenes, выделенные от мертворожденных плодов, из окружающей среды и грызунов, к СТ17 - от морских гидробионтов, из морепродуктов из торговой сети и от мертворожденных плодов. Полученные данные свидетельствуют о распространении в природных очагах штаммов L.monocytogenes, высоковирулентных для человека.

Для более детального выявления характеристик, которые могли быть специфичными для культур, выделенных из конкретных источников, мы установили частоту встречаемости определенных аллелей каждого из генов в зависимости от источника выделения. В результате, впервые нами была установлена корреляция между источником выделения L. monocytogenes и аллелем генов инвазии. Анализ изменений аллелей индивидуально для каждого гена показал статистически достоверное распределение специфических аллелей изучаемых генов в определенном хозяине. Для генов inlA и inlC специфические аллели отмечались среди L.monocytogenes, выделенных из абортированных плодов; аллели гена inlB - среди изолятов, полученных от грызунов; специфические аллели генов inlA, inlC, inlE - среди изолятов листерий из морских гидробионтов. Аллели гена prs были распределены однородно во всех группах. Полученные результаты подтверждают роль интерналинов в специфике взаимодействия L. monocytogenes с определенным хозяином.

В целом, полученные результаты (система типирования, определение связи молекулярно-генетических маркеров с источником выделения) могут быть использованы для решения различных задач микробиологии и эпидемиологии, включая выявление эпидемически значимых штаммов L.monocytogenes и установление эпидемиологических связей между изолятами.

Особая роль продукта гена inlA - белка интерналина А - в развитии патологии плода была недавно предположена на основании экспериментального изучения инвазии листерий в трофобласты [296]. Полноразмерная копия интерналина А необходима для взаимодействия с Е-кадгерином. Однако связано ли это взаимодействие с определенными вариантами интерналина А в настоящее время неизвестно. Не изучена также роль и других факторов инвазии, в частности, интерналина В.

Мы предполагали, что особенности в последовательности ДНК генов inlA,inlC и inlB, характерные для штаммов L.monocytogenes, изолированных из клинического материала, могут быть выявлены именно у фрагментов, кодирующих LRR-домены. Выявленные нами закономерности в последовательности фрагмента генов inlA и inlC, кодирующего LRR-домен, свидетельствуют об объективности выдвинутого нами предположения. Наше предположение подтверждается также сравнением результатов, полученных в данной работе на коллекции, включающей только изоляты, ассоциированные с патологией у беременных, с данными, полученными группой M.Wiedmann на коллекции, включающей изоляты из разных источников [359].

Полученные нами данные подтверждают важную роль интерналина А и указывают на то, что штаммы L.monocytogenes, несущие определенные аллели генов inlA и inlC, представляют особую угрозу для развития патологии беременности. Кроме того, полученные нами результаты свидетельствуют о значимости генов inlA и inlC как маркеров штаммов L.monocytogenes, представляющих повышенную опасность для беременных женщин в развитии листериоза плода.

Эти данные подчеркивают необходимость особого внимания к лицам из групп риска, а также свидетельствуют о необходимости проведения бактериологического мониторинга за листериозной инфекцией у беременных женщин. В то же время полученные результаты закладывают основу для проведения дальнейших исследований, направленных на установление молекулярных механизмов, позволяющих L. monocytogenes вызывать заболевания с чрезвычайно разнообразными клиническими проявлениями у пациентов, относящихся к различным группам риска.

Полученные результаты предполагают распространенность специфических аллелей генов, кодирующих интерналины у культур L.monocytogenes, инфицирующих определенного хозяина. Наличие несинонимичных замен у генов, кодирующих интерналины, свидетельствует о возможности селективного отбора, в результате которого могут отбираться варианты, более адаптированные для выживания в определенных условиях и, поскольку интерналины принадлежат к факторам патогенности, для паразитирования в определенных хозяевах.

Таким образом, нами создана комплексная система анализа микробиологических и молекулярно-генетических свойств возбудителя листериоза, L.monocytogenes, включающая: 1) оригинальные селективные и дифференциальные питательные среды на основе отечественного сырья; 2) адаптированные и оптимизированные для отечественных условий методы микробиологической дифференциации; 3) экспресс-методы выявления и идентификации возбудителя листериоза, основанные на ПЦР, специфичной в отношении консервативных фрагментов генов патогенности; 4) систему типирования L.monocytogenes на основе мультилокусного секвенирования генов факторов патогенности, позволяющую дифференцировать эпидемически несвязанные между собой изоляты листерий с индексом дискриминации 0,982.

Проведенные исследования позволили впервые на основании сравнительного изучения биологических свойств, молекулярно-генетических особенностей листерий, представить характеристику бактерий вида L.monocytogenes, распространенных на Дальнем Востоке, проанализировать особенности факторов патогенности L.monocytogenes, изолированных из разных экониш, оценить значение LRR-доменов генов inlA, inlC, inlB в развитии листериозной инфекции. Полученные в данной работе результаты позволяют разработать методы направленного скрининга изолятов L. monocytogenes с целью определения их эпидемической значимости, а также закладывают основу для проведения исследований, направленных на установление механизмов экологической пластичности L. monocytogenes, позволяющих им паразитировать в исключительно широком круге хозяев.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Зайцева, Елена Александровна, Москва

1. Агеенко A.B., Максецова Г.Ф., Титова Н.М. и др. Предварительные итоги изучения листериозной инфекции на территории Ленинградской области // Медико-ветеринарные аспекты листериоза: материалы научно-практической конференции. Покров. 1993. С. 20-22.

2. Адамович М.М. Эпидемиологические и клинические особенности листериоза в г. Минске // Медико-ветеринарные аспекты листериоза: материалы научно-практической конференции. Покров, 1993. С. 18-19.

3. Анализ деятельности центров Госсанэпиднадзора Российской Федерации по лабораторной диагностике листериоза: информационный сборник статистических и аналитических материалов. Москва. 2000. 13 с.

4. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л. Медгиз. 1962. 180 с.

5. Бакулов И.А. Листериоз сельскохозяйственных животных. М: Колос, 1967. 120 с.

6. Бакулов И.А. Основные вехи истории изучения листериоза животных и людей // Медико-ветеринарные аспекты листериоза: материалы научно-практической конференции. Покров, 1993. С. 43—47.

7. Бакулов И.А. Экология листерий в биологической системе почва -растение животное - человек // Медико-ветеринарные аспекты листериоза: материалы научно-практической конференции. Покров, 1993. С.25-26.

8. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Бактериологический контроль пищевых продуктов на наличие листерий: метод, рекомендации. Изд-во Ульяновской гос. сельскохозяйственной академии, 1999. 38 с.

9. Бакулов И.А., Котляров В.М., Душко Т.И. Листериоз пищевая инфекция (масштабы опасности, методы индикации и меры борьбы) // Ветеринария. 1991. №4. С. 32-36.

10. Бакулов И.А., Котляров В.М., Шестиперова Т.И. Эпидемиологические и эпизоотологические аспекты листериоза//Журн. микробиол. 1994. № 5. С. 100-105.

11. Беленева И.А. Психрофильность Listeria monocytogenes и ее эколо-го-эпидемиологическое значение: автореф. диссер. . канд. биол. наук. Владивосток, 1996. 29 с.

12. Бердышев Г.Д. Нуклеиновые кислоты пойкилотермных морских животных. Киев.: Наукова думка, 1973. 172 с.

13. Березкина Г.В. Эпидемиологическая и эпизоотологическая характеристика листериозной инфекции в Омской области //Медико-ветеринарные аспекты листериоза: материалы научно-практической конференции. Покров, 1993. С. 17-18.

14. Бойко О.В. Персистентные характеристики Listeria monocytogenes, выделенных из различных источников // Журн. микробиол. 1998. № 4. С.23-25.

15. Бойко А.В., Бойко О.В. Рибонуклеазная активность бактерий как фактор персистенции некоторых возбудителей сапронозных инфекций // Журн. микробиол. 1997. № 4. С. 71-73.

16. Воронина Л.Г., Саевич М.Е. Бактериологическая диагностика урологических заболеваний листериозной этиологии у детей // Медико-ветеринарные аспекты листериоза: материалы научно-практической конференции. Покров, 1993. С. 28-29.

17. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П. и др. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лаб. дело. 1996. № 4. С. 210-212.

18. Бухарин О.В. Персистенция микроорганизмов. Куйбышев, 1987. С.4-10.

19. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Хуснутдинова Л.М. Межбактериальные взаимодействия // Журн. микробиол. 2003. № 4. С. 3-8.

20. Васильев Д.А. Роль пищевых продуктов в распространении листериоза // Ветеринария. 1992. № 4. С. 46-48.

21. Венедиктов B.C. Влияние низких температур на биологические свойства псевдотуберкулезного микроба: автореф. дис. .канд. мед. наук. Владивосток, 1989. 12 с.

22. Венедиктов В.С, Тимченко Н.Ф., Степаненко В.И. Психрофиль-ность патогенных микроорганизмов//Новосибирск. 1989. С. 50-55.

23. Гальцева Г.В., Цепко И.Н., Маевский М.П. и др. Методические подходы к лабораторной диагностике листериоза // Листериоз на рубеже тысячелетии: материалы межд. симпозиума. Покров, 1999. С. 73-76.

24. Герасимов В.Н., Кисличкина Н.Н. Электронно-микроскопическое изучение межклеточного контакта вакцинного штамма Francisella tularensis с грамположительными и грамотрицательными бактериями // Журн. микробиол. 1991. №4. С. 4-5.

25. Герхард Ф. Методы общей бактериологии. М. Мир, 1984. Т.2. 467 с.

26. Гершун В.И. Распространение листерий в объектах внешней среды // Известия АН КазССР. 1980. № 6. С. 42-44.

27. Гершун В.И. Листериоз сельскохозяйственных животных. Алма-Ата: Кайнер, 1981. 95 с.

28. Гершун В.И. Экология листерий и пути их циркуляции в природном очаге // Сб.: Экология возбудителей сапронозов. М., 1988. С.80-85.

29. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов: СанПиН 2.3.2.1078-01; Введ. 01.09.02 г. //М. 2001. 186 с.

30. Гланц С. Медико-биологическая статистика / пер. с англ. М. Практика, 1998. 459 с.

31. Гордейко В.А. Цепь циркуляции иерсиний в агроценозе и эпидемическое ее проявление // Сб.: Потенциально патогенные бактерии в природе.М. 1991. С. 75-85

32. ГОСТ Р 51921-2002. Продукты пищевые. Методы выделения и определения бактерий Listeria monocytogenes. Госстандарт России. Москва. 2002. с.17.

33. Гудкова Е.И., Воронина Т.П. Диагностика ангин листериозной этиологии // Журн. микробиол. 1956. № 8. С. 31-39.

34. Гуславский И.И. Эпизоотологический мониторинг листериоза в Алтайском крае // Листериоз на рубеже тысячелетий: материалы межд. симпозиума Покров, 1999. С. 127-129.

35. Далин М.В., Фиш Н.Г. Белковые токсины микробов. М. Медицина, 1980. С. 157-159.

36. Джупина С.И., Фомин В.М. Особенности эпизоотической ситуации листериоза в Новосибирской области // Медико-ветеринарные аспекты листериоза: материалы научно-практической конференции. Покров. 1993. С. 15-17.

37. Домарадский И.В. Вирулентность бактерий как функция адаптации // Журн. микробиол. 1997. № 4. С. 16-20.

38. Домарадский И.В. Некоторые проблемы адаптации патогенных бактерий в окружающей среде // Журн. микробиол. 1997. № 4. С. 31-35.

39. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий // М. Наука. 1977. 216 с.

40. Ерин А.Н., Прищепов Е.Д., Перелыгин В.В., Воробьев А.А. Механизмы инактивации микроорганизмов фагоцитами // Журн. микробиол. 1983. № 12. С.3-9.

41. Ермолаева С.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С. и др. Клонирование и экспрессия фосфатидилинозитол-специфичной фосфолипазы С Listeria monocytogenes //Мол. Ген. Микробиол. Вирусол. 1995. № 1. С. 3-10.

42. Ермолаева С.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С. Изменение уровня экспрессии факторов вирулентности Listeria monocytogenes под влиянием внешних условий // Мол. Ген. Микробиол. Вирусол. 2000. № 1. С.17-19.

43. Ермолаева С.А., Тартаковский И.С. Регуляция экспрессии факторов вирулентности у Listeria monocytogenes II Журн. микробиол. 2001. № 3. С. 106-110.

44. Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А., Нитяга И.М. и др. Современныеподходы к идентификации листерий при производственном контроле ферментированных мясных продуктов // Вопросы питания. 2005. № 2. С.39-45.

45. Зайцев В.П., Кизеветтер И.В., Лагунов Л.Л. и др. Технология рыбных продуктов. М., Изд-во «Пищевая промышленность», 1965. с.73-74.

46. Земсков A.M. Дрожжевая NaPHK как стимулятор вирулентности, иммуногенности и антигенности сальмонелл // Журн. микробиол. 1979. № 7. С. 99-102.

47. Земсков A.M., Земсков В.М. Острый шигеллез: роль нуклеиновых кислот в инфекции и иммунитете (новая концепция) //Изд.-во Воронежского университета, 1992. 135 с.

48. Карпова Т.И., Фирсова Т.Е., Родина Л.В. и др. Типирование Listeria monocytogenes на основе полиморфизма генов факторов патогенности // Клин, микр. антимикр. хим. 2003. № 5. С. 251-258.

49. Кольпикова Т.И., Бакулов И.А., Котляров В.М. Использование лис-териозных бактериофагов при диагностике и индикации листерий // Листериоз на рубеже тысячелетий: материалы межд. симпозиума. Покров, 1999. С.64-67.

50. Котляров В.М. Проблема листериоза на рубеже тысячелетий // Листериоз на рубеже тысячелетий: материалы междун. симпозиума. Покров, 1999. С. 48-52.

51. Красовский В. В., Васильев Н. В., Деркач Н. А., Похил С.И. Итоги пятилетнего изучения листериоза на Украине // Журн. микробиол. 2000. № 3. С.80-85.

52. Красовский В.В., Надтока В.Л., Похил С.И. Листериозное бактерионосительство: методы санации // Журн. микробиол. 2000. № 3. С. 18-20.

53. Кратохвиль Н.И. Выделение возбудителя листереллеза от обыкновенных полевок и клещей Ixodes Ricinus II Журн. микробиол. 1953. № 1. С. 6061.

54. Кузнецов О.Ю. Бактериальная колония как сложно организованное сообщество клеток // Журн. микробиол. 2005. № 2. С. 3-7.

55. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М. 1978. С. 47-53.

56. Лаврова Д.Б., Самсыгина Г.А., Михайлов А.В. и др. Скрининговое выявление листерий у новорожденных // Педиатрия. 1998. № 5. С. 10-15.

57. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. С.255-303.

58. Листериоз, передаваемый через продукты питания // Бюллетень ВОЗ. 1988. Т. 66, №4. С.1-10.

59. Литвин В.Ю., Коренберг Э.И. Природная очаговость болезней: развитие концепции к исходу века // Сб.: Природная очаговость болезней: исследования института Гамалеи / Под ред. Коренберга Э.И. М.: Изд-во Русаки, 2003. С. 12-34.

60. Маненкова Г.М., Цвиль Л.А. Организация эпиднадзора за листерио-зом в г. Москве // Медико-ветеринарные аспекты листериоза: материалы научно-практической конференции. Покров. 1993. С. 19-20.

61. Методические указания МУК 4.2.1122-02 «Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах» // М.: Минздрав России. 2002.

62. Минаева Н.Э., Ладный В.И. Микробиологические аспекты эпидемиологии листериоза // Листериоз на рубеже тысячелетий: материалы межд. симпозиума. Покров. 1999. С. 137.

63. Москаленко В.Ф. Биологические свойства и патогенный потенциал листерий, циркулирующих в Украине // Провизор. 1998. № 14. URL: http: / www.provisor.com.ua/release.php?code=l99814 (дата обращения 17.03.08).

64. Мухина Л.Б., Дмитриева Л.Ю. Возбудитель листериоза показатель биологической опасности рыбной продукции // Рыбное хозяйство. 2002. №2. С.50-51.

65. Никитин В.М. Справочник методов биохимической экспресс-индикации микробов. Кишинев: Картя Молдовеняскэ, 1986. 296 с.

66. Олсуфьев Н.Г., Емельянова О.С. Обнаружение листереллезной инфекции у диких грызунов, насекомоядных и иксодовых клещей //Журн. микро-биол. 1951. №6. С. 67-71.

67. Олсуфьев Н.Г., Емельянова О.С. О смешанной эпизоотии туляремии, листериоза и стрептококковой инфекции среди обыкновенных полевок в условиях зимнего периода // Журн. микробиол. 1954. № 2. С.36^41.

68. Олсуфьев Н.Г., Петров В.Г., Шлыгина К.Н. Об обнаружении возбудителей эризипелоида и листериоза в воде ручьев // Журн. микробиол. 1959. №3. С. 89-94.

69. Омарова С.М. Разработка питательных сред и микротест-систем для накопления, выделения и идентификации листерий: автореф. дис. . докт. биол. наук. Махачкала, 2007. 46 с.

70. Определитель бактерий Берджи /под ред. Д. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Д. Стейли и др. М.: Мир, 1997. 799 с.

71. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: методические указания МУК 4.2.1890-04 // Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. 2004. Т.6, № 4. С. 306-359.

72. Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах: методические указания. МУК 4.2.1122-02.

73. Минздрав России. М., 2002. с.31.

74. Павлова И.Б., Куликовский A.B., Ботвинко И.В. и др. Электронно-микроскопическое исследование развития бактерий в колониях. Гетероморф-ный рост бактерий в процессе естественного развития популяции // Журн. микробиол. 1990. № 12. С. 12-15.

75. Павлова И.П., Левченко Е.М. Электронно-микроскопическое исследование адгезивности бактерий // Журн. микробиол. 2002. № 1. С. 3-6.

76. Павлович Н.В., Цимбалистова М.В., Маслова H.H. Быстрый метод оценки вирулентности Francisella tularensis in vitro // Журн. микробиол. 1997. №2. С. 17-20.

77. Плетнева H.A., Стиксова В.Н. Глазожелезистая форма листереллеза. (Окулогландулярная форма листереллеза) // Вест, офтальмол. 1950. Т. 29, № 4. С.17-21.

78. Поманская Л.А. К вопросу о полиморфизме листерий // Журн. микробиол. 1961. № 3. С. 124-128.

79. Поманская Л.А. О размножении листерий в воде // Журн. микробиол. 1962. № 9. С. 102-105.

80. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / под ред. Л.С. Страчунского, Ю.Ю. Белоусова, С.Н. Козлова. М. 2002. 382 с.

81. Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Каган Г.Я. L-формы бактерий //М., Медицина. 1981. 239 с.

82. Прозоровский С.В., Тартаковский И.С. Возбудители оппортунистических инфекций роль в инфекционной патологии человека и методы лабораторной диагностики // Клинич. лаборат. диагностика. 1998. № 2. С.24-35.

83. Пуховская Н.М., Мусатов Ю.С., Иванов Л.И. и др. ПЦР-диагностика листериоза в перинатальной патологии // Генодиагностика инфекционных болезней: материалы Российской научно-практической конференции. Сосновка. Новосибирская обл., Россия, 2005. С. 146-148.

84. Рудакова Р.И., Пайманова Л.Н., Бударина H.A. и др. Клиникоэпидемиологическая характеристика групповых заболеваний листериозом в Омской области // Природно-очаговые болезни человека: тез. докл. Омск. 1991. С. 141-146.

85. Сахаров П.П., Гудкова Е.И. Листереллезная инфекция. М: Изд-во АМН СССР, 1950. 202 с.

86. Сахаров П.П., Гудкова Е.И. Листереллезная инфекция. М: Медгиз, 1959. с.221.

87. Серов Г.Д. Усовершенствованная питательная среда для первичного определения разных микробов. // Лаб. дело. 1978. № 11. С. 685-688.

88. Сомов Г.П.Еще раз о сапронозах // Журн. микробиол. 1985. № 5. С.98-104.

89. Сомов Г.П., Бузолева Л.С., Черкасов К.А. и др. О миксотрофии патогенных бактерий // Журн. микробиол. 1994. № 5. С. 3-6.

90. Сомов Г.П., Бузолева Л.С. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды. Владивосток: Изд-во ОАО «Приморский полиграфкомбинат», 2004. 168 с.

91. Сомов Г.П., Варвашевич Т.Н., Тимченко Н.Ф. Психрофильность патогенных бактерий. Новосибирск: Наука, Сиб. отд ние, 1991. 204 с.

92. Сомов Г.П., Варвашевич Т.Н. Влияние низкой температуры на вирулентность некоторых патогенных бактерий // Журн. микробиол. 1992. № 4. С. 62-66.

93. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова H.H. Псевдотуберкулез М.: Медицина, 1990. С.

94. Сомов Г.П., Тимченко Н.Ф. Основные итоги изучения психрофиль-ности патогенных бактерий // Журн. микробиол. 1997. № 5. С. 12-16.

95. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. М.О. Биргера. М.: Медицина, 1982. 464 с.

96. Степанов В.М., Меркер В.А., Безрукова Л.С. и др. Современные проблемы листериоза в Казахстане // Развитие международного сотрудничествав области изучения инфекционных заболеваний: материалы междун. конф. «Сосновка», Новосиб. обл., 2004. С. 129.

97. Столярова Л.Г., Ершиков Ю.Е. Листериозы // Антибиотики и химиотерапия. 1997. Т. 42, № 3. С. 25-30.

98. Султанов Г.В., Саидов М.С. Внутриутробные зоонозные инфекции в Дагестане // Журн. микробиол. 1998. № 4. С. 33-36.

99. Тартаковский И.С. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика // Клин, микробиол. антимикроб, химиотерапия. 2000. т. 2 , № 2. С. 20-30.

100. Тартаковский И.С., Белый Ю.Ф., Прозоровский С.В. Механизмы внутрифагоцитарного паразитизма легионелл и других бактерий // Журн. микробиол. 1989. № 12. С. 93-100.

101. Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева С.А. Листерии: роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. М.: Медицина для всех, 2002. 200 с.

102. Тартаковский И.С., Прозоровский С.В. Оппортунистические инфекции новая область клинической микробиологии // Российские медицинские вести. 1997. № 1. С. 46-51.

103. Тец В.В., Рыбальченко О.В., Савкова Г.А. Контакты между клетками в бактериальных колониях // Журн. микробиол. 1991. № 2. С.7-13.

104. Тимченко Н.Ф., Венедиктов B.C., Павлова Т.Н. Моделирование инициации псевдотуберкулезной инфекции // Журн. микробиол. 1988. № 7. С. 16-20.

105. Тимченко Н.Ф., Сомов Г.П. Патогенетическое значение психро-фильности Y. pseudotuberculosis II Журн. микробиолог. 1986. № 3. С.33-38.

106. Триполитова А.А., Борисова Г.В. Листериоз. Томск: Изд-во Томского университета, 1965. 260 с.

107. Юзвик Л.Н., Агапов В.А., Ежинов И.П. Листериоз в Читинской области //Медико-ветеринарные аспекты листериоза: материалы научнопрактической конференции. Покров, 1993. С.23-25.

108. Adele Е. G., Levett P.N. Effect of temperature and pH on survival of Listeria monocytogenes in coleslaw // Int. J. Food Microbiol. 1990. Vol. 11, No. 3-4. P. 345-350.

109. Albrecht M. Listeria in silages and rot milk: Diss. Dok. Ing. // Fak. Brauw. Lebensmitteltechnot. Milehwiss. Techn. Univ. München, 1991. p. 109.

110. Alexander A.V., Walker R.L., Johnson B.J. et al. Bovine abortions attributable to Listeria ivanovii: four cases (1988-1990) // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1992. Vol. 200. P.711-714.

111. Al-Ghazali M.R., Al-Azawi S.K. Listeria monocytogenes contamination of crops grown on soil treated with sewage sludge cake // J. Appl. Bacteriol. 1990. Vol. 69, No. 5. P.642-647.

112. Andre P., Genicot A. First isolation of Listeria welschimeri from human beings // Zentbl. Bacteriol. Parasitenkd. Infektkrankh. Hyg. Abt. I Orig. ReiheA. -1987. Vol. 263. P.605-606.

113. Antunes P., Reu С., Sousa J.C. et al. Incidence and susceptibility to antimicrobial agents of Listeria spp. and Listeria monocytogenes isolated from poultry carcasses in Porto, Portugal //J. Food Prot. 2002. Vol. 65, No. 12. P. 1888-1893.

114. Atkinson E. Meningitis associated with gram-positive bacilli of diphter-oid type // Med. J. Australia. 1917. Vol. 1. P. 115-118.

115. Audurier A., Taylor A.G., Carbonnelle В., McLauchlin J. A phage typing system for Listeria monocytogenes and its use in epidemiological studies // Clin. Invest. Med. 1984. Vol.7, No. 4. P. 229-232.

116. Aureli P., Fioruci G.C., Caroli D. et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes II Engl. J. Med.2000. Vol. 342. P. 1236-1241.

117. Baek S.Y., Lim S.Y., Lee D.H. et al. Incidence and characterization of Listeria monocytogenes from domestic and imported foods in Korea // J. Food Prot. 2000. Vol. 63, No. 2. P. 186-189.

118. Beckerman K.P., Rogers H.W., Corbett J. A. et al. Release of nitric oxide during T-cell independent pathway of macrophage activation. Its role in resistance to Listeria monocytogenes II J. Immunol. 1993. Vol. 150. P. 888-895.

119. Berenguer J., Solera J., Diaz M.D. et al. Listeriosis in patients infected with human immunodeficiency virus // Rev. Infec. Diseases. 1991. Vol. 13, No. 1. P. 115-119.

120. Bergmann B., Reffelsbauer D., Kuhn M. et al. InlA- but not InlB-mediated internalization of Listeria monocytogenes by non-phagocytic mammalian cells needs the support of other internalins // Mol. Microbiol. 2002. Vol. 43. P. 557575.

121. Bermudez L.E. Differential mechanisms of intracellular killing of Mico-bacterium avium and Listeria monocytogenes by activated human and murine macrophages: the role of nitric oxide // Clin. Exp. Immunol. 1993. Vol. 91. P. 277-281.

122. Beuchat L.R., Bracket R.E. Inhibitory effect of raw carrots on Listeria monocytogenes //Appl. Environ. Microbiol. 1990. Vol. 56. P. 1734-1742.

123. Bielecki J.,Youngman P., Connelly P., Portnoy D.A. Bacillus subtilis expressing a haemolysin gene from Listeria monocytogenes can grow in mammalian cells //Nature. 1990. Vol. 345. P. 175-176.

124. Bierne H., Cossart P. InlB, a surface protein of Listeria monocytogenes that behaves as an invasion and a growth factor // J. Cell Sci. 2002. Vol. 115. P. 3357-3367.

125. Bierne H., Garandeau C., Pucciarelli M.G. et al. Sortase B, a new class of sortase in Listeria monocytogenes II J. Bacteriol. 2004. Vol. 186, No. 7. P. 19721982.

126. Bille J., Glauser M.-P. Listeriose en Suisse //Bulletin de ^Office Federalde la Sante Publique. 1988. Vol. 3. P. 28-29.

127. Blended D.C., Kampelmacher E. H., Torres-Anjel M. J. Listeriosis // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1987. Vol. 191. P. 1546-1551.

128. Bohne J., Crass A., Ehrilch S.D., Maguin E. Transcriptional regulation of prfA and prfA-regulated virulence genes in Listeria monocytogenes II Mol. Microbiol. 1994. Vol. 11. P. 1141-1150.

129. Boland A., Havaux S., Cornelis G.R. Heterogeneity of the Yersinia YopM protein // Microb. Pathog. 1998. Vol. 25. P. 343-348.

130. Borezee E., Pellegrini E., Beretti J.L., Berche P. SvpA, a novel surface virulence-associated protein reguired for intracellular survival of Listeria monocytogenes // Microbiology. 2001. Vol. 147. P. 2913-2923.

131. BottoneE.I. Yersinia Enterocolitica J I New York. 1983.

132. Braumann A., Halle E., Saballus R., Presber W. Ventrikulitis and peritonitis durch Listeria monocytogenes II Z.arztl. Fortbild. 1992. Vol. 86, No. 21. P. 1073 1075.

133. Braun L, Cossart P. Interactions between Listeria monocytogenes and host mammalian cells II Microbes Infect. 2000. Vol. 2, No. 7. P. 803-811.

134. Braun L., Dramsi S., Dehoux P. et al. InlB: an invasion protein of Listeria monocytogenes with a novel type of surface association // Mol. Microbiol. 1997. Vol. 25. P. 285-294.

135. Braun L., Ghebrehiwet B., Cossart P. gClq-R/p32, a Clq-binding protein, is a receptor for the InlB invasion protein of Listeria monocytogenes IIEMBO J. 2000. Vol. 19. P. 1458-1466.

136. Braun T.J., Travis D., Dee R.R., Nieman R.E. Liver abscess due to Listeria monocytogenes: case report and review // Clin. Infec. Diseases. 1993. Vol. 17,1. No. 2. P. 267-269.

137. Braun W., Whallon S. The effects of DNA and enzyme treated DNA on bacterial population II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1954. Vol. 40, № 3. P. 162-169.

138. Brown P. H., Ingram C.W., Van Den Horst C. Listeria monocytogenes. Brain abscess caused by Listeria monocytogenes II Rev. Infec. Diseases. 1991. Vol. 13, No. 4. P. 768-769.

139. Bubert A., Riebe J., Schnitzler N. et al. Isolation of catalase-negative Listeria monocytogenes strains from listeriosis patients and their rapid identification by anti-p60 antibodies and/or PCR // J. Clin. Microbiol. 1997. Vol. 35, No.l. P. 179183.

140. Buncia S. The incidence of Listeria monocytogenes in slaughtered animals, in meat, and in meat products in Yugoslavia // Int. J. Food Microbiol. 1991. Vol. 12. P. 173-180.

141. Burn C.G. Clinical and pathological features of an infection caused by a new pathogen of the genus Listerella II Am. J. Pathol. 1936. Vol. 12. P. 341-348.

142. Busch L.A. Human listeriosis in the United States: 1967 1969 // J. Infect. Diseases. 1971. Vol. 123. P. 328-332.

143. Cabanes D., Dehoux P., Dussurget O. et al. Surface proteins and the pathogenic potential of Listeria monocytogenes II Trends Microbiol. 2002. Vol. 10. P. 238-245.

144. Cabanes D., Dussurget O., Dehoux P., Cossart P. Auto, a surface associated autolysin of Listeria monocytogenes required for entry into eukaryotic cells and virulence // Mol. Microbiol. 2004. Vol. 51, No. 6. P. 1601-1614.

145. Cai S., Kabuki D.Y., Kuaye A.Y. et al. Rational design of DNA sequence-based strategies for subtyping Listeria monocytogenes II J. Clin. Microbiol. 2002. Vol. 40. P. 3319-3325.

146. Camilli A., Goldfine H., Portnoy D.A. Listeria monocytogenes mutants lacking phosphatidylinositol-specific phospholipase C are avirulent // J. Exp. Med. 1991. Vol. 173. P. 751-754.

147. Campbell A.N., Sill P.R., Wardle J.K. Listeria meningitis acquired by cross-infection in a delivery suite // Lancet ii. 1981. P.752-763.

148. Cantoni C., Valenti M. Listeria spp. in prodotti avicoli // Ind. Alim. 1990. Vol. 29, No. 288. P. 1109-1110.

149. Chakraborty T., Hain T., Domann E. Genome organization and the evolution of the virulence gene locus in Listeria species // Int. J. Med. Microbiol. 2000. Vol. 290. P. 167-174.

150. Chand P., Sadana J.R. Outbreak of Listeria ivanovii abortion in sheep in India//Vet. Rec. 1999. Vol. 145. P. 83-84.

151. Charpentier E., Courvalin P. Antibiotic resistance in Listeria spp. II An-timicrob. Agents Chemother. 1999. Vol. 43, No.9. P. 2103-2108.

152. Chastanet A., Derre I., Nair S., Msadek T. clpB, a novel member of the Listeria monocytogenes CtsR regulon, is involved in virulence but not in general stress tolerance // J. Bacteriol. 2004. Vol. 186, No.4. P. 1165-1174.

153. Choi Y.C., Cho S.Y., Park B.K., Chung D.H. et al. Incidence and characterization of Listeria spp. from foods available in Korea // J. Food Prot. 2001. Vol. 64, No. 4. P. 554-558.

154. Christie R., Atkins N. E., Munch-Petersen E. A note on a lytic phenomenon shown by group B streptococci II Aust. J. Exp. Biol. 1944. Vol.22. P. 197-200.

155. Ciesielski C.A., Hightower A.W., Parsons S.K., Broome C.V. Listeriosis in the United States: 1980 1982 // Arch. Intern. Med. 1988. Vol. 148. P.1416-1419.

156. Cole M.B., Jones M.V., Holyoak CJ. The effect of pH, salt concentration and temperature on the survival and growth of Listeria monocytogenes II Appl. Bacteriol. 1990. Vol. 69, No. 1. P. 63-72.

157. Collins M.D., Wallbanks S., Lane D.J. et al. Phylogenetic analysis of the genus Listeria based on reverse transcriptase sequencing of 16SrRNA // Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. Vol. 41. P. 240-246.

158. Conte M.P., Longhi C., Petrone G. et al. Listeria monocytogenes infection of Caco-2 cells: role of growth temperature I I Res. Microbiol. 1994. Vol. 145,1. No. 9. P. 677-682.

159. Conte M.P., Longhi C., Polidoro M. et al. Iron availability affects entry of Listeria monocytogenes into the enterocytelike cell line Caco-2 // Infect. Immun. 1996. Vol. 64, No. 9. P. 3925-3929.

160. Cossart P. Met, the HGF-SF receptor: another receptor for Listeria monocytogenes II Trends Microbiol. 2001. Vol. 9, No. 3. P. 105-107.

161. Cossart P., Bierne H. The use of host cell machinery in the pathogenesis of Listeria monocytogenes 11 Infect. Immun. 2001. Vol. 13. P. 96-103.

162. Cossart P., Kocks C. The actin-based motility of the facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes II Mol. Microbiol. 1994. Vol.13. P. 395-402.

163. Cossart P., Jonquieres R. Sortase, a universal target for therapeutic agents against Gram-positive bacteria? // Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 5013-5015.

164. Cossart P., Lecuit M. Interaction of Listeria monocytogenes with mammalian cells during entry and actin-based movement: bacterial factors, cellular li-gands and signaling // EMBO J. 1998. Vol. 17. P. 3797-3806.

165. Cossart P., Sansonetti P.J. Bacterial invasion: the paradigms of enteroin-vasive pathogens II Science. 2004. Vol. 304. P. 242-248.

166. Cottin J., Loiseau O., Robert R. et al. Surface Listeria monocytogenes carbohydrate-binding components revealed by agglutination with neoglycoproteins // FEMS Microbiol. Lett. 1990. Vol. 68. P. 301-306.

167. Courvalin P. Transfer of antibiotic resistance genes between grampositive and gram-negative bacteria // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. Vol. 38. P. 1447-1451.

168. Cummins A.J., Fielding A.K., McLauchlin J. Listeria ivanovii infection in a patient with AIDS // J. Infect. 1994. Vol. 28. P. 89-91.

169. Davis M.J., Coote P.J., C/Byrne C.P. Acid tolerance in Listeria monocytogenes-. The adaptive acid tolerance response (ATR) and growth-phase-dependent acid resistance //Microbiology. 1996. Vol.142, No. 10. P. 2975-2982.

170. Decek J., Nattermann H., Loepeimann H. et al. Ergebnisse serologischer Untersuchungen auf ausgewählte infection beim Feldhasen (Lepus europaeus Pallan, 1778) // Monatsh. Veterinnarmed. 1990. Vol. 45, No. 23. P. 833-836.

171. Decker C.F., Simon G.L., DiGioia R.A., Tuazon C.U. Listeria monocytogenes infections in Patients with AIDS: Report of five cases and review // Rev. In-fec. Diseases. 1991. Vol. 13, No. 3. P. 413-^17.

172. Dennis S.M. Perinatal lamb mortality in Western Australia. 6. Listeric infection // Aust. Vet. J. 1975. Vol. 51. P. 75-79.

173. Dhar G., Faull K.F., Schneewind O. Anchor structure of cell wall surface proteins in Listeria monocytogenes // Biochemistry. 2000. Vol. 39. P. 3725-3733.

174. Doorduyn Y., de Jager C.M., van der Zwaluw W.K. et al. Invasive Listeria monocytogenes infections in the Netherlands, 1995 2003 // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2006. Vol. 25. P.433-442.

175. Domann E., Wehland J., Rohde M. et al. A novel bacterial virulence gene in Listeria monocytogenes required for host cell microfilament interaction with homoloy to the praline-rich region of vinculin I I EMBO J. 1992. Vol. 11. P. 19811990.

176. Domingo P., Serra J., Sambeat M., Ausina V. Listeria monocytogenes. Pneumonia due to Listeria monocytogenes II Clin. Infec. Disease. 1992. Vol. 14, No. 3. P. 787-789.

177. Doumith M., Buchrieser C., Glaser P. et al. Differentiation of the major1.steria monocytogenes serovars by multiplex PCR // J. Clin. Microbiol. 2004. Vol. 42. P. 3819-3822.

178. Doumith M., Cazalet C., Simoes N. et al. New aspects regarding evolution and virulence of Listeria monocytogenes revealed by comparative genomics and DNA arrays // Inf. Immun. 2004. Vol.72. P. 1072-1083.

179. Dramsi S., Bourdichon F., Cabanes D. et al. FbpA, a novel multifunctional Listeria monocytogenes virulence factor // Molecular. Microbiology. 2004. Vol. 53, No. 2. P. 639-649.

180. Dramsi S., Dehoux P., Lebrun M. et al. Identification of four new members of the internalin multigene family of Listeria monocytogenes EGD // Inf. Immun. 1997. Vol.65. P. 1615-1625.

181. Drevets D. Listeria monocytogenes infection of cultured endothelial cells stimulates neutrophil adhesion and adhesion molecule expression // J. Immunol. 1997. Vol. 158. P. 5305-5313.

182. Dunne D.W., Resnick D., Greenberg J. et al. The type I macrophage scavenger receptor binds to gram-positive bacteria and recognizes lipoteichoic acid // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol. 91. P. 1863-1867.

183. Dunny G.M. Cell-cell communication in Gram-positive bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 1997. Vol. 51. P. 527-564.

184. Dussurget O., Cabanes D., Dehoux P. et al. Listeria monocytogenes bile salt hydrolase is a PrfA-regulated virulence factor involved in the intestinal and hepatic phases of listeriosis // Mol. Microbiol. 2002. Vol. 45. P. 1095-1106.

185. Dussurget O., Pizarro-Cerda J., Cossart P. Molecular determinants of Listeria monocytogenes virulence // Annu. Rev. Microbiol. 2004. Vol. 58. P. 587610.

186. Eilertz I., Danielsson-Tham M.-L., Hammarberg K.E. et al. Isolation of Listeria monocytogenes from goat cheese associated with a case of listeriosis in goat // Acta vet. Scand. 1993. Vol. 34, No. 2. P.145-149.

187. Elischerova K., Cupkova E., Urgeova E., Lysy J. et al. Isolation of Listeria ivanovii in Slovakia // Cs. epidemiol. microbial, immunol. 1990. Vol. 39, No. 4. P. 228-236.

188. Eisner H.-A., Sobottka I., Bubert A., Albrecht H. et al. Catalase-negative Listeria monocytogenes causing lethal sepsis and meningitis in an adult hematologic patient // European J. Clinical Microbiol. Infect. Diseases. 1996. No. 15. P. 962-965.

189. Engelbrecht F., Chun S.K., Ochs C. et al. A new PrfAjregulated gene of Listeria monocytogenes encoding a small, secreted protein which belongs to a family of intemalins // Mol. Microbiol. 1996. Vol. 21. P. 823-837.

190. Engelbrecht F., Dickneite C., Lampidis R. et al. Sequence comparison of the chromosomal regions encompassing the internalin C genes (inlC) of Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii II Mol. Gen. Genet. 1998. Vol. 257. P. 186-197.

191. Enocksson E., Wretlind B., Sterner G., Anzen B. Listeriosis during pregnancy and in neonates // Scond. J. Infec. Diseases. Suppl. 1990. Vol. 71. P. 79-85.

192. Enright M.C., Spratt B.G., Kalia A. et al. Multilocus sequence typing of Streptococcus pyogenes and the relationships between emm type and clone // Infect. Immun. 2001. Vol.69. P.2416-2427.

193. Evans J.R., Allen A.C., Bortolussi R. et al. Follow-up study of survivors of fetal and early-onset neonatal listeriosis // Clin. Investig. Med. 1984. Vol. 7. P.329-334.

194. Facinelli B., Giovanetti E., Magi G. et al. Lectin reactivity and virulence among strains of Listeria monocytogenes determined in vitro using enterocyte-like cell line Caco-2 II Microbiol. 1998. Vol. 144. P. 109-118.

195. Farber J.M., Peterkin P.I. Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen//Microbiol. Rev. 1991. Vol. 55. P. 476-511.

196. Feil E.J., Enright M.C. Analysis of clonality and the evolution of bacterial pathogens // Curr. Opin. Microbiol. 2004. Vol.7. P. 308-313.

197. Fenlon D.R. Silage as a potential source of Listeria monocytogenes in the food chain // Microbiol, alim. nutr. 1989. Vol. 7, No. 2. P. 171-173.

198. Fenlon D.R. The influence of gaseous environment and water availability on the growth of Listeria II Microbiol, alim. nutr. 1989. Vol. 7, No.2. P. 165-169.

199. Fernandez G.S. Listeria monocytogenes. Heat resistance of Listeria monocytogenes I I Acta microbial, hung. 1989. Vol. 36, No. 2-3. P. 277-280.

200. Filice G.A., Cantrell H.F., Smith A.B. et al. Listeria monocytogenes infection in neonates: investigation of an epidemic // J. Infect. Dis. 1978. Vol. 138.P.17-23.

201. Finlay B.B., Cossart P. Explitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens // Science. 1997. Vol. 276. P. 718-725.

202. Fischetti V.A., Pancholi V., Schneewind O. Conservation of a hexapep-tide sequence in the anchor region of surface protein from gram-positive cocci // Mol. Microbiol. 1990. Vol. 4. P. 1603-1605.

203. Fleming D.W., Sochi S.L., MacDonald K.L. et al. Pasteurized milk as a vehicle of infection in an outbreak of listeriosis //New Engl. J. Med. 1985. Vol. 312. P. 404^107.

204. Foxman B., Zhang L., Koopman J.S. et al. Choosing an appropriate bacterial typing technique for epidemiologic studies // Epidemiol. Perpect. Innov. 2005. Vol.2. P. 10-18.

205. Friedman M.E., Aim W.L. Effect of glucose concentration in the growth medium on some metabolic activities of Listeria monocytogenes II J. Bacteriol. 1962. Vol. 84. P. 375-376.

206. Gahan Cormac G.M., C/Driscoll B., Hill C. Acid adaptation of Listeria monocytogenes can enhance survival in acideic foods and during milk fermentation // Appl. Environ. Microbiol. 1996. Vol. 62, No.9. P. 3128-3132.

207. Gaillard J.L., Berche P., Frehel C. et al. Entry of L. monocytogenes into cells is mediated by Internalin, a repeat protein reminiscent of surface antigens from gram-positive cocci // Cell. 1991. Vol. 65. P. 1127-1141.

208. Gaillard J.-L., Berche P., Mounier J. et al. In vitro model of penetration and intracellular growth of Listeria monocytogenes in the human enterocyte-like line Caco-2 // Infect. Immun. 1987. Vol. 55. P. 2822-2829.

209. Gaillot O., Pellegrini E., Bregenholt S. et al. The ClpP serine protease is essential for the intracellular parasitism and virulence of Listeria monocytogenes II Mol. Microbiol. 2000. Vol. 35. P. 1286-1294.

210. Gallaguer P.G., Watakunakorn C. Listeria monocytogenes endocarditis: a review of the literature 1950-1986 II Scand. J. Infect. Dis. 1988. Vol. 20. P. 359368.

211. Gandhi M., Chikindas M.L. Listeria: A foodborne pathogen that knows how to survive // Intern. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 113. P. 1-15.

212. Garcia J.A., Dominguez L., Briones V., Blanco M. et al. Revision of antigenic structure of the genus Listeria IIFEMS Microbiol. Lett. 1990. No. 67. P. 113120.

213. Gardan R., Cossart P., Labadie J. Identification of Listeria monocytogenes genes involved in salt and alkaline-pH tolerance //Appl.Environ. Microbiol. 2003. Vol. 69, No. 6. P. 3137-3143.

214. Gauto A.R., Cone L.A., Woodward D.R. et al. Arterial infections due to Listeria monocytogenes', report of four cases and review of the world literature // Clin. Infect. Dis. 1992. Vol. 14. P. 23-28.

215. Gedde M.M., Higgins D.E., Tilney L.G. et al. Role of Listeriolisin O in cell-to-cell spread of Listeria monocytogenes II Infection and Immunity. 2000. Vol. 68, No. 2. P. 999-1003.

216. Gellin B.G., Broome C.V., Bibb W.F. et al. The Epidemiology of listeriosis in the United States 1986 // Am. J. Epidemiol. 1991. Vol. 1133. P. 392-401.

217. George A.E., Levett P.N. Effect of temperature and pH on survival of Listeria monocytogenes in coleslaw // Int. J. Food Microbiol. 1990. Vol.11, No. 3-4. P. 345-350.

218. Gerl A., Mittermuller J., Bise K., Wilmanns W. Listeriosis bei malignen Erkrankungen // Dtsch. med. Wochenschr. 1991. Vol. 116, No. 30. P. 1144-1148.

219. Gerner-Smidt P., Rosdalil V.T., Fre W. A new Danish Listeria monocytogenes phage typing system // APMIS. 1993. Vol. 101. P. 160-167.

220. Gianfranceschi M., D'Ottavio M.C., Gattuso A., Pourshaban M. et al. Listeriosis associated with gorgonzola (Italian blue-veined cheese) // Foodborne Pathog. Dis. 2006. Vol. 3, No. 2. P. 190-195.

221. Giannati-Stefanou A., Leontides S., Psychas V. Listeriosis Mavrides // Th. Bull. Hell. Vet. Med.Soc. 1997. Vol. 48, No. 4. P. 188-197.

222. Gill D.A. Circling disease: a meningoencephalitis of sheep in New Zealand. Notes on a new species of pathogenic organism // Vet. J. 1933. Vol. 89. P. 258270.

223. Gilot P., Andre P., Content J. Listeria monocytogenes possesses adhesions for fibronectin // Infect. Immun. 1999. Vol. 67. P. 6698-6701.

224. Glaser P., Frangeul L., Buchrieser C. et al. Comparative genomics of Listeria species // Science. 2001. Vol. 294. P. 849-852.

225. Gottesman S., Clark W. P., Maurizi M.R. The ATP-dependent Clp protease of Escherichia coli. Sequence of clpA and identification of a Cip-specific substrate //J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 7886-7893.

226. Gottesman S., Squires C., Pichersky E., Carrington M. et al. Conservation of the regulatory subunit for the Clp ATP-dependent protease in prokaryotes and eukaryotes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87. P. 513-3517.

227. Gottesman S., Wickner S., Maurizi M.R. Protein quality control: triage by chaperones and proteases // Genes Dev. 1997. Vol. 11. P. 815-823.

228. Gouin E., Mengaud J., Cossart P. The virulence gene cluster of Listeria monocytogenes is also present in Listeria ivanovii, an animal pathogen, and Listeria seeligeri, a nonpathogenic species // Infect. Immun. 1994. Vol. 62. P. 3550-3553.

229. Goulet V., Rocourt J., Rebiere I., Jacguet Ch. et al. Listeriosis outbreak associated with the consumption of rilettes in France in 1993 // Scand. J. Infect. Dis. 1993. Vol. 177, No. 1. P. 155-160.

230. Goulet V., Lepoutre-Toulemon A. et al. Epidemia de listeriose en France en 1992 // Energ.Sante/Serv.etud.med. 1994. Vol. 5, No. 1. P. 156-157.

231. Graham J.C., Lanser S., Bignardi G. et al. Hospital-acquired listeriosis //

232. J. Hosp. Infect 2002. Vol. 51, No. 2. P. 136-139.

233. Gray M. L., Killinger A. H. Listeria monocytogenes and listeric infections // Bacterid. Rev. 1966. Vol. 30. P. 309-382.

234. Grayi M.L., Stafseth H.J., Thorp F. et al. A new technique for isolating Listerellae from the bovine brain // J. Bacteriol. 1948. Vol. 55. P. 471-476.

235. Greenberg J.W., Fischer W., Joiner K.A. Influence of lipoteichoic acid structure on recognition by the macrophage scavenger receptor // Infect. Immun. 1996. Vol. 64. P. 3318-3325.

236. Greenwood M.H., Roberts D., Burden P. The occurrence of Listeria species in milk and dairy products: a national survey in England and Wales // Int. J. Food Microbiol. 1991. Vol. 12. P. 197-206.

237. Gunn J. S. Mechanisms of bacterial resistance and response to bile // Microbes Infect. 2000. Vol. 2. P. 907-913.

238. Guzman C.A., Domann E., Rohde M. et al. Apoptosis of mouse dendritic cells is triggered by listeriolysin, the major virulence determinant // Mol. Microbiol. 1996. Vol. 20. P. 119-126.

239. Hain T. Whole-genome sequence of Listeria welschimeri reveals common steps in genome reduction with Listeria innocua as compared to Listeria monocytogenes II J. Bacteriol. 2006. Vol. 188, No. 21. P. 7405-7415.

240. Hanawa T., Yamamoto T., Kamiya S. Listeria monocytogenes can growin macrophages without the aid of proteins induced by environmental stresses // Infect. Immun. 1995. Vol. 63. P. 4595-4599.

241. Hansen S., Schonheyder H.C., Pedersen C. Septics infection of hoftepro-tese med Listeria monocytogenes //Ugeskr. Laeger. 1996. Vol. 158, No. 42. P. 5949 -5950.

242. Hardorn K., Hachler H., Schaffner A., Kayser F.H. Genetic characterization of plasmid-encoded multiple antibiotic resistance in a strain of Listeria monocytogenes causing endocarditis // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1993. Vol. 12. P. 928-937.

243. Hartemink R., Georgsson F. Incidence of Listeria species in seafood and seafood salads // Int. J. Food Microbiol. 1991. Vol. 12. P. 189-195.

244. Hensel M., Shea J. E., Gleeson C. et al. Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection // Science. 1995. Vol. 269. P. 400403.

245. Hiroshi U., Keiichi Y., Takanori A. et al. The prevalence of Listeria monocytogenes in the environment of dairy farms // Microbiol. And Immunol. 1996. Vol. 40, No. 2. P. 121-124.

246. Ho J.L., Shands K.N., Friedland G. et al. An outbreak of type 4b Listeria monocytogenes infection involving patiens from eight Boston hospitals // Arch. Intern. Med. 1986. Vol. 146, No. 3. P.520-524.

247. Hof H. Virulence of different strains of Listeria monocytogenes serovar l/2a // Med. Microbiol. Immunol. 1984. Vol. 173, No. 4. P. 207-218.

248. Hof H. An update on the medical management of listeriosis // Expert. Opion. Fharmacother. 2004. Vol. 5, No. 8. P. 1727-1735.

249. Hof H. History and epidemiology of listeriosis // FEMS Immunology and Medical Microbiology. 2003. Vol. 1489. P. 1-4.

250. Hof H. Therapeutic activities of antibiotics in listeriosis // Infection. 1991. Vol.19, suppl. 4. P. 229-233.

251. Hof H., Nichterlein T., Kretschmsr M. Management of listeriosis // Clin.

252. Microbiol. Rev. 1997. Vol. 10, No.2. P. 345-357.

253. Hoffman A.D., Gall K.L., Norton D.M., Wiedmann M. Listeria monocytogenes contamination patterns for the smoked fish processing environment and for raw fish // J. Food Prot. 2003. Vol. 66, No. 1. P. 52-60.

254. Huillet E., Larpin S., Pardon P. et al. Identification of a new locus in Listeria monocytogenes involved in cellobiose-dependent repression of hly expression // FEMS Microbiol. Lett. 1999. Vol.174. P. 265-272.

255. Hunter P.R., Gaston M.A. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity // Jbid. 1988. Vol. 26. P. 2465-2466.

256. Husu J., Asikainen E. Listeria and listeriosis in dogs // Listeria 1992: 11th Int. Symp. Probl. Listeriosis, Copenhagen. 1992: ISOPOL XI: Book Abstr. S.I., s.a. P. 186.

257. Ireton K., Payrastre B., Cossart P. The Listeria monocytogenes protein InlB is an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 17025-17032.

258. Ireton K., Payrastre B., Chap H. et al. A role for phosphoinositide 3-kinase in bacterial invasion // Science. 1996. Vol. 274. P. 780-782.

259. Jacquet C., Doumith M., Gordon J.I. et al. A molecular marker for evaluating the pathogenic potential of foodborne Listeria monocytogenes II J. Infect. Dis. 2004. Vol. 189. P. 2094-2100.

260. James S.M., Fannin S.L., Agree B.A. et al. Listeriosis outbreak associated with Mexican style cheese California // Morbidity and mortality weekly report. 1985. Vol. 34. P. 357-359.

261. Jaradat Z.W., Bhunia A.K. Adhesion, invasion and translocation characteristics of Listeria monocytogenes serotypes in Caco-2 cell and house models // Appl. Environ. Microbiol. 2003. Vol. 69, No. 6. P. 3640-3645.

262. Jaradat Z.W., Wampler J.W., Bhunia A.W. A Listeria adhesion protein-deficient Listeria monocytogenes strains shows reduced adhesion primarily to intestinal cell lines I I Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 2003. Vol. 192, No. 2. P. 85-91.

263. Jayarao B.M., Donaldson S.C., Straley B.A. et al. A survey of foodborne pathogens in bulk tank milk and raw milk consumption among farm families in Pennsylvania // J. Dairy Sci. 2006. Vol. 89, No. 7. P.2451-2458.

264. Jemmi T. Actual knowledge of Listeria in meat and fish products // Mitt. Geb. Lebens mittelunters. Hyg. 1990. Vol. 31. P. 144-157.

265. Jensen A., Frederiksen W., Gerner-Smidt P. Risk factors for listeriosis in Denmark, 1989-1990 // Scand. J. Infec. Deseases. 1994. Vol. 26, No. 2. P. 171-178.

266. Jensen V.B., Harty J. T., Jones B. D. Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimureum, Listeria monocytogenes and Schigella flexneri with M cells and murine Peye/s patches // Infect. Immun. 1998. Vol. 66. P. 3758-3766.

267. Jeyasekaran G., Karunasagar I., Karunasagar I. Incidence of Listeria spp. In tropical fish // Intern. J. Food Microbiol. 1996. Vol. 31, No. 1-3. P. 333-340.

268. Jonquieres R., Pizarro-Cerda J., Cossart P. Synergy between the N- and C-terminal domains of InlB for efficient invasion of non-phagocytic cells by Listeria monocytogenes //Mol. Microbiol. 2001. Vol. 42. P. 955-965.

269. Jonquieres R., Bierne H., Mengaud J, Cossart P. The inlA gene of Listeria monocytogenes L028 harbors a nonsense mutation resulting in release of inter-nalin // Infect. Immun. 1998. Vol. 66. P. 3420-3422.

270. Jung W., Gots H., Sulzer G., Busse M. Distribution of Listeria in cheese and environment // Mod. Microbiol. Methods Dairy Prod.: Int. Semin., Santander, 2224 May, 1989 / Int. Dairy Feol. Brussels, 1989. P. 153-159.

271. Karunasagar I., Krohne G., Goebel W. Listeria ivanovii is capable of cell-to-cell spread involving acting action polymerization // Infect. Immun. 1993. Vol. 61. P. 162-169.

272. Katharion S., Kanenaka R., Allen R.D. et al. Repression of motility and flagellin production at 37°C is stronger in Listeria monocytogenes than in the nonpathogenic species Listeria innocua II Can. J. Microbiol. 1995. Vol. 41, No. 7. P. 572-577.

273. Kempton G. Listeria monocytogenes: a protocol for rapid identification // Med. J. Austr. 1989. Vol. 150. P. 607.

274. Khan K.M., Pao W., Kendler J. Epidural abscess and vertebral osteo-myelitics caused by Listeria monocytogenes case report and literature review // Scand. J. Infect. Dis. 2001. Vol. 33. P.714-716.

275. Khelef N., Lecuit M., Bierne H., Cossart P. Species specificity of the Listeria monocytogenes InlB protein // Cellular Microbiology. 2006. Vol. 8, No. 3. P. 457-470.

276. Klatt E.C., Pavlova Z., Teberg A.J.et al. Epidemic neonatal listeriosis at autopsy//Hum. Pathol. 1986. Vol. 17. P. 1278-1281.

277. Kocks C., Gouin E., Tabouret M. et al. L.monocytogenes-induced actin assembly requires the actA gene product, a surface protein // Cell. 1992. Vol. 68. P. 521-531.

278. Kohler S., Leimeister-Wachter M., Chakraborty T. et al. The gene coding for protein p60 of Listeria monocytogenes and its use as a specific probe for Listeria monocytogenes II Infect. Immun. 1990. Vol. 58. P. 1943-1950.

279. Krull M., Nost R., Hippenstiel S. et al. Listeria monocytogenes potently induces upregulation of endothelial adhesion molecules and neutrophil adhesion to* cultured human endothelial cells //J. Immunol. 1997. Vol. 159. P. 1970-1976.

280. Krumperman P.H. Multiple antibiotic resistance indexing Escherichia coli to identify risk sources of fecal contamination of foods // Appl. Environ. Microbiol. 1983. Vol. 46. P. 165-170.

281. Kuhn M., Goebel W. Identification of an extracellular protein of Listeria monocytogenes possibly involved in intracellular uptake by mammalian cells // Infect. Immun. 1989. Vol. 57. P. 55-61.

282. Kumar S., Tamura T., Nei M. MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and, sequence alignment // Briefings in Bioinfor-matics. 2004. Vol. 5. P. 150-163.

283. Laciar A.L., de Centorbi O.N.P. Listeria species in seafood: isolation andcharacterization of Listeria spp. from seafood in San Luis, Argentiana // Food Microbiol. 2002. Vol. 19, No. 6. P. 645-651.

284. Lapin R.H. Treatment of foodborne Listeriosis // Clinical Infect. Diseases. 2001. Vol. 32. P. 1518-1519.

285. Larsson S. Listeria monocytogenes causing hospital-acquired enterocolitis and meningitis in newborn infants // Br. Med. J. 1978. Vol. 2. P. 473-474.

286. Lebrun M., Mengaud J., Ohayon H. et al. Internalin must be on the bacterial surface to mediate entry of Listeria monocytogenes into epithelial cells // Mol. Microbiol. 1996. Vol. 21. P. 579-592.

287. Lecuit M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers // Clinical. Mcrobiology and Infection. 2005. Vol. 11, No. 6. P. 430-436.

288. Lecuit M., Dramsi S., Gottardi C. et al. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes I IEMBO J. 1999. Vol. 18. P. 3956-3963.

289. Lecuit M., Hurme R., Pizarro-Cerda J. et al. A role for alpha- and beta-catenins in bacterial uptake // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 1000810013.

290. Lecuit M., Nelson D.M., Smith S.D. et al. Targeting and crossing of the human maternofetal barrier by Listeria monocytogenes'. Role of internalin interaction with trophoblast E-cadherin // PNAS. 2004. Vol. 101, No. 16. P. 6152-6157.

291. Lecuit M., Ohayon H., Braun L. et al. Internalin of Listeria monocytogenes with an intact leucine-rich repeat region is sufficient to promote internalization //Infect. Immun. 1997. Vol. 65. P. 5309-5319.

292. Lecuit M., Vandormael-Pournin S., Lefort J. et al. A transgenic model for listeriosis: role of Internalin in crossing the intestinal barrier // Science. 2001. Vol. 292, No. 5522. P. 1665-1667.

293. Leimeister-Wachter M., Chakraborty T. Detection of listeriolysin, the thiol-dependent hemolysin in Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii and Listeriaseeligeri 11 Infect. Immun. 1989. Vol. 57. P. 2350-2357.

294. Leimeister-Wachter M., Domann E., Chakraborty T. The expression of virulence genes in Listeria monocytogenes is thermoregulated // J. Bacteriol. 1992. Vol. 174. P. 947-952.

295. Leiti O., Gross J.W., Tuazon C.U. treatmentof brain abscess caused by Listeria monocytogenes in a patient with allergy to penicillin and trimethoprim-sulfamethoxazole // Clin. Infect. Dis. 2005. Vol. 40. P. 907-908.

296. Lemaire V., Cerf O., Audurier A. Thermal resistance of Listeria monocytogenes il Ann. rech. vet. 1989. Vol. 20, No. 4. P. 493-500.

297. Lessing M. P., Curtis G. D., Bowler I. C. Listeria ivanovii infection. // J. Infect. 1994. Vol. 29. P. 230-231.

298. Lewis H.C., Little C.L., Elson R. et al. Prevalence of Listeria monocytogenes and other Listeria species in butter from United Kingdom production, retail, and catering premises I I J. Food Prot. 2006. Vol. 69, No. 7. P. 1518-1526.

299. Liston J. Microbial hazards of seafood consumption toxins, bacteria and viruses are the principal causes of seafoodborne diseases // Food.Technol. 1990. Vol.44, No. 12. P.58-62.

300. Liu S., Graham J.E., Bigelow L. et al. Identification of Listeria monocytogenes genes expressed in response to growth at low temperature I I Appl. Environ. Microbiol. 2002. Vol. 68, No. 4. P. 1697-1705.

301. Litvin C.M., Calderwood S.B. Role of iron in regulation of virulence genes // Clin. Microbiol. Rev. 1993. Vol. 6. P. 137-149.

302. Loessner M.J. Improved procedure for bacteriophage typing of Listeria-monocytogenes //Appl. Environ. Microbiol. 1991. Vol.57, No.3. P. 882-884.

303. Loessner M.J., Busse M. Bacteriophage typing of Listeria speces // Appl. Environ. Microbiol. 1990. Vol.56, No.6. P. 1912-1918.

304. Long S. G., Leyland M. J., Milligan D.W. Listeria meningitis after bone marrow transplantation // Bone marrow transplant. 1993. Vol. 12, No. 5. P. 537-539.

305. Lorber B. Listeriosis following shigellosis // Rev. Infec. Diseases. 1991.

306. Vol. 13, No. 5. P. 865-866.

307. Lorber B. Listeriosis // Clin. Infect. Dis. 1996. Vol. 24. P. 1-11.

308. Lou Y., Yousef A. Adaptation to sublethal environmental stress protects Listeria, monocytogenes against lethal preservation factors // Appl. Environ. Microbiol. 1997. Vol. 63. P. 1252-1255.

309. Louthrenoo W., Schumacher H.R. Listeria monocytogenes osteomyelitis complicating leukemia: report and literature review of Listeria osteoarticular infections//J. Rheumatol. 1990. Vol. 17. P. 107-110.

310. Low J.C., Donachie W. A review of Listeria monocytogenes and listeriosis//Vet. J. 1997. Vol. 153. P. 9-29.

311. Low J.C., Wright F., McLauchlin J. et al. Serotyping and distribution of Listeria isolates from cases of ovine listeriosis // Vet. Rec. 1993. Vol. 133. P. 165166.

312. Lubani M.M., Sharda D.C., Al-Shab T., Sethi S. Neonatal listeriosis:a report of seven cases // Ann. Trop. Paediatr. 1987. Vol. 7. P. 42-46.

313. Luppi A., Baretta G. Su alcune caratteristiche metabolico-culturali della Listeria monocytogenes. I. Attivita fosfatasica della Listeria monocytogenes II Boll. 1st. Sieroterap. Milan. 1964. Vol. 43. P. 206-208.

314. Luppi A., Baretta G. Su alcune caratteristiche metabolico-culturali della Listeria monocytogenes. III. Attivita lipasica della Listeria monocytogenes II Boll. 1st. Sieroterap. Milan. 1964. Vol. 43. P. 280-283.

315. Luu P.-T., Mahouin F., Alige S. Acid responses of Listeria monocytogenes II J. Food Microbiol. 2000. Vol. 55, No. 1-3. P. 121-126.

316. Lyytikainen O., Autio T., Maijala R. et al. An outbreak of Listeria monocytogenes serotype 3a infections from butter in Finland // J. Infect. Dis. 2000. Vol. 181. P. 1838-1841.

317. Lyytikainen O., Siitonen A., Johansson T., Hatakka M. Listeriosis cases suspected to have been caused by vacuum-packed fish products in Finland // Euro-surveillance weekly. Vol.4, Issue 15, April 13, 2000.

318. Mackey B.M., Pritchet C., Norris A., Mead G.C. Heat resistance of Listeria: Strain differences and effects of meat type and curing salts // Lett. Appl. Microbiol. 1990. Vol. 10, No. 6. P.251-255.

319. Maiden M.S.J., Bygraves J.A., Feil E. et al. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms // Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 3140-3145.

320. Manian F. A. Liver abscess due to Listeria monocytogenes II Clin. Infec. Diseases. 1994. Vol. 18, No. 5. P. 841-842.

321. Marino M., Braun L., Cossart P. et al. A framework for interpreting the leucine-rich repeats of the Listeria internalins // PNAS. 2000. Vol. 97, No. 16. P. 8784-8788.

322. Marino M., Braun L., Cossart P. et al. Structure of the InlB leucine-rich repeats, a domain that triggers host cell invasion by the bacterial pathogen L.monocytogenes //Mol. Cell. 1999. Vol. 4. P. 1063-1072.

323. Marino P., Maggioni M., Preatoni A. et al. Liver abscesses due to Listeria monocytogenes II Liver. 1996. Vol. 16. P. 67-69.

324. Mascola L., Drummond W.K., Chao Shin M. Decreasing incidence of listeriosis and shifting risk factor in Los Angeles Country (LAC), CA. Implications for future prevention strategies. // Clin. Infec. Diseases. 1999. Vol. 29, No. 4. P. 1063.

325. Marranzano M., Pitrolo S., Vicari O., Fallico R. Presence of Listeria spp. in vegetables// Arm. Ig: Med. Rev. e comunita. 1996. Vol. 8, No. 5. P. 531-535.

326. Massarotti E.M., Dinerman H. Septic arthritis due to Listeria monocytogenes: report and review of the literature // J. Rheumatol. 1990. Vol. 17. P. 11-113.

327. Mei J. M., Nourbakhsh F., Ford C. W. et al. Identification of Staphylococcus aureus virulence genes in a murine model of bacteraemia using signature-tagged mutagenesis // Mol. Microbiol. 1997. Vol. 26. P. 399-407.

328. Mengaud J., Braun-Breton C., Cossart P. Identification of phosphatidy-linositol-specific phospholipase C activity in Listeria monocytogenes: a novel type ofvirulence factor? // Mol. Microbiol. 1991. Vol. 5. P. 367-372.

329. Mengaud J., Ohayon H., Gounon P. et al. E-cadherin is receptor for in-ternalin, a surface protein reguired for entry of L.monocytogenes into epithelial cells // Cell. 1996. Vol. 84, No.6. P. 923-932.

330. Mever D.H., Donnelly C.W. Effect of incubation temperature on repair of heat-injured Listeria monocytogenes in milk // J. Dairy Sci. 1991. Vol. 74, No. 1. P. 105.

331. Midelet-Bourdin G., Leleu G., Copin S. et al. Modification of a virulence-associated phenotype after growth of Listeria monocytogenes on food // J. Appl. Microbiol. 2006. Vol. 101, No. 2. P. 300-308.

332. Miettinen H., Wirtanen G. Ecology of Listeria spp. in a fish farm and molecular typing of Listeria monocytogenes from fish farming and processing companies // Int. J. Food Microbiol. 2006. Vol. 112, No. 2. P. 138-146.

333. Milenbachs A., Brown D., Moors M., Youngman P. Carbon-source regulation of virulence gene expression in Listeria monocytogenes I I Mol. Microbiol. 1997. Vol. 23. P. 1075-1085.

334. Milohanic E., Jonquieres R., Cossart P. et al. The autolysin Ami contributes to the adhesion of Listeria monocytogenes to eukaryotic cells via its cell wall anchor//Molecular Microbiology. 2001. Vol. 39, No. 5. P. 1212-1224.

335. Miller A.J., Bayles D.O., Eblen B.S. Cold shok induction of thermal sensitivity in Listeria monocytogenes II Appl. Environ. Microbiol. 2000. Vol. 66, No. 10. P. 4345-4350.

336. Miller M.B., Bassler B.L. Quorum sensing in Bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 2001. Vol. 55. P. 165-199.

337. McLauchlin J. Human listeriosis in Britain, 1967-1985, a summary of 722 cases. 1. Listeriosis during pregnancy and in the newborn // Epidemiol. Infect. 1990. Vol. 104. P. 181-189.

338. McLauchlin J. Human listeriosis in Britain, 1967-1985, a summary of 722 cases. 2. Listeriosis in non-pregnant individuals, a changing pattern of infectionand seasonal incidence // Epidemiol. Infect. 1990. Vol. 104. P. 191-201.

339. McLauchlin J., Audurier A., Taylor A.G. The evaluation of a phage-typing system for Listeria monocytogenes for use in epidemiological studies // J. Med. Microbiol. 1986. Vol.22. P. 357-365.

340. McLaughlan A.M., Foster S J. Molecular characterization of an autolytic amidase of Listeria monocytogenes EGD // Microbiology. 1998. Vol. 144. P. 13591367.

341. Moellering R.C., Medoff J.C., Leech J. et al. Antibiotic synergism against Listeria monocytogenes I I Antimicr. Agents and Chemotherapy. 1972. Vol.1, No.l.P. 30-34.

342. Molla B., Yilma R., Alemayehu D. Listeria monocytogenes and other Listeria species in retail meat and milk products in Addis Ababa, Ethiopia // Ethiop. J. Health Dev. 2004. Vol. 18, No. 3. P. 208-212.

343. Multistate Outbreak of Listeriosis United States, 1998 // Morbidity and Mortality Weekly Report. December 25, 1998. Vol. 47, No. 50. P. 1085-1086.

344. Murray E.G.D., Webb R.A., Swann H.B.R. A disease of rabbits characterized by a large mononuclear leucocytosis caused by a hitherto undescribed bacillus Bacterium monocytogenes (n.sp.) // J. Pathol. Bacteriol. 1926. Vol. 29. P. 407-439.

345. Mylonakis E., Hohmann E.L., Calderwood S.B. Central nervous system infection with Listeria monocytogenes. 33 yers' experience at a general hospital and review of 776 episodes from the literature // Medicine (Baltimore). 1998. Vol.77. P. 313-336.

346. Nair S., Frehel C., Nguyen L. et al. ClpE, a novel member of the HSP100 family, is involved in cell division and virulence of Listeria monocytogenes II Mol. Microbiol. 1999. Vol. 31, No. 1. P. 185-196.

347. Nair S., Milohanic E., Berche P. ClpC ATPase Is Required for Cell Adhesion and Invasion of Listeria monocytogenes II Infection and Immunity. 2000. Vol. 68, No. 12. P. 7061-7068.

348. Nakama A., Maruyma T., Kokubo Y. et al. Incidence of Listeria monocytogenes in foods in Japan //Listeria 1992: 11th Int. Symp. Probl. Listeriosis, Copenhagen. 11-14 May, 1992: ISOPOLXI: Book Abstr. S.I., s.a. P. 317-318.

349. Nalla-Salas I., Anto J.M., Gasser I. et al. Estudio clinico-epidemiologico dela listeriosis en Barselona 1990-1991 // Enferm. Infect. Microbiol.Clin. 1992. Vol. 10, supl. 2. P. 88.

350. Navarre W.W., Schneewind O. Proteolytic cleavage and cell wall anchoring at the LPXTGX motif of surface proteins in gram-positive bacteria // Mol. Microbiol. 1994. Vol.14. P. 115-121.

351. Navarre W.W., Schneewind O. Surface proteins of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. Vol. 63. P. 174-229.

352. Nieman R.E., Lorber B. Listeriosis in adults: a changing pattern. Report of eight cases and review of the literature // Rev. Infect. Dis. 1980. Vol. 2. P. 207227.

353. Nightingale K.K., Schukken Y.H., Nightingale C.R. et al. Ecology and transmission of Listeria monocytogenes infecting ruminants and in the farm environment // Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol. 70. P. 4458-4467.

354. Nightingale K.K., Windham K., Wiedmann M. Evolution and molecular phylogeny of Listeria monocytogenes isolated from human and animal listeriosis cases and foods // J. Bacteriology 2005. Vol. 187, No. 16. P. 5537-5551.

355. Nei M., Li W.H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. Vol.76. P.5269-5273.

356. Nelson K.E., Whole genome comparisons of serotype 4b and l/2a strains of the food-borne pathogen Listeria monocytogenes reveal new insights into the core genome components of this species // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32, No. 8. P. 2386-2395.

357. Nerbink E., Borch E. Chill room, a critical point in ListeriaaVcontamination of red meat // Listeria 1992: 11 Int. Symp. Probl. Listeriosis, Copenhagen. 1992: ISOPOL XI: Book Abstr. S.I., s.a. P. 319-320.

358. Notermans S., Soentoro P.S.S., Bolder N.M. et al. Adaptation of Listeria in liquid egg containing sucrose resulting in survival and outgrowth I I Int. J. Food Microbiol. 1991. Vol. 13, No.l. P. 55-61.

359. Notermans S., Chakraborty T. Pathogenicity of Listeria monocytogenes: protection acquired by infection // Listeria 1992: 11th Int. Symp. Probl. Listeriosis, Copenhagen. 1992: ISOPOL XI: Book Abstr. S.I., s.a. P. 78-79.

360. Ofek I., Sharon N. Lectinophagocytosis: a molecular mechanism of recognition between cell surface sugars and lectins in the phagocytosis of bacteria // Infect. Immun. 1988. Vol. 56. P. 539-547.

361. Olsson A. Listeria monocytogenes forekomst hos katt II Sven. Vet-erinartidn. 1991. Vol. 43, No. 10. P. 411-413.

362. Padovan C.S., Liebertrau M., Danek A et al. Polyradiculitis, perimyo-carditis and nephritic syndrome: Unusual manifestations of infection due to Listeria monocytogenes //Curr. Opinion Struct. Biol. 1998. Vol. 8, No. 4. P. 152-153.

363. Pandiripally V.K., Westbrook D.G., Sunki G.R. et al. Surface protein pi 04 is involved in adhesion of Listeria monocytogenes to human intestinal cell line, Caco-2 // J. Med. Microbiol. 1999. Vol. 48, No. 2. P. 117-124.

364. Parihar V.S., Barbuddhe S.B., Danielsson-Tham M.L., Tham W. Isolation and characterization of Listeria species from tropical seafoods // Food Control. 2008. Vol.19, No.6. P. 566-569.

365. Paterson I.S., Cook K.A. A method for the recovery of Pasteurellapseudotuberculosis from faeses // J. Path. Bact. 1963. Vol. 85, No. 1. P. 241-242.

366. Perrin M., Bemer M., Delamare C. Fatal Case of Listeria innocua Bacteremia // J. Clin. Microbiol. 2003. Vol. 41, No.l 1. P. 5308-5309.

367. Phillips E.J., Simor A.E. Bacterial meningitis in children and adults // CNS Infections. 1998. Vol. 103, No.3. P. 97-103.

368. Pigrau C., Almirante B., Panissa A., Gasser J. et al. Clinical presentation and outcame in cases of listeriosis // Clin. Infec.Diseases. 1993. Vol. 17, No. 1. P. 143-144.

369. Picard-Bonnaud F., Cottin J., Carbonnelle B. Persistence of Listeria monocytogenes in three sorts of soil // Acta microbial. Hung. 1989. Vol. 36, No. 2-3. P. 263-267.

370. Piffaretti J.C., Kressebuch H., Aeschenbacher M. et al. Genetic characterization of clones of the bacterium Listeria monocytogenes causiong epidemic disease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. Vol. 86. P. 3818-3822.

371. Pine L., Malcolm B., Brooks J.B., Daneshvar M.I. Physiological studies on the growth and utilization of sugars by Listeria species // Can. J. Microbiol. 1989. Vol. 35. P. 245-254.

372. Pinto B., Reali D. Prevalence of Listeria monocytogenes and other listerias in Italian made soft cheeses // Zentrall. Hyg. und Umwelth. 1996. Vol. 199, No. l.P. 60-68.

373. Popowska M. Analysis of the peptidoglycan hydrolases of Listeria monocytogenes: multiple enzymes with multiple functions // Pol. J. Microbiol. 2004. Vol. 53. P. 29-34.

374. Popowska M., Markiewicz Z. Classes and functions of Listeria monocytogenes surface proteins // Pol. J. Microbiol. 2004. Vol. 53, No. 2. P.75-88.

375. Poyart-Salmeron C., Carlier C., Tricu-Cuot P. et al. Transferable plas-mid-mediated antibiotic resistance in Listeria monocytogenes II Lancet. 1990. Vol. 335, No. 8703. P. 1422-1426.

376. Portnoy D.A., Jacks P.S., Hinrichs D.J. Role of hemolysin for the intracellular growth of Listeria monocytogenes II J. Exp. Med. 1988. Vol. 167. P. 14591471.

377. Portnoy D. A., Tweten R. K., Kehow M., Bielecki J. Capacity of listerio-lysin O, streptolysin O, and perfringolysin O to mediate growth of Bacillus subtilis within mammalian cells // Infection and Immunity. 1992. Vol. 60. P. 2710-2717.

378. Prasad D.N., Gupta R.K. Listeria monocytogenes in dairy products. An overview // Microbiol. Alim. Nutr. 1990. Vol. 8, No. 4. P. 383-405.

379. Purwati E., Radu S., Ismail A. et al. Characterization of Listeria monocytogenes isolated from chiken meat evidence of conjugal transfer of plasmid-mediated resistance to antibiotic // J. Animal. Veterinary Advances. 2003. Vol.2, No. 4. P. 237-246.

380. Quei P. Perturbation of the normal mechanisms of intraleucocytik killing of bacteria// J. Infect. Dis. 1983. Vol. 148, No. 2. P. 189-193.

381. Raffelsbauer D., Bubert F., Engelbrecht F. et al. The gene cluster inlC2DE of Listeria monocytogenes contains additional new Internalin genes and is important for virulence in mice // Mol. Gen. Genet. 1998. Vol. 260. P.144-158.

382. Rasmussen O.F., Skouboe P., Dons L. et al. Listeria monocytogenes exists in at least three evolutionary lines: evidence from flagellin, invasive associated protein and listeriolysin O genes // Microbiology. 1995. Vol. 141. P. 2053-2061.

383. Research news. Microbiology of milk products // Milk Ind. 1992. Vol. 94, No. 4. P. 29, 32,33.

384. Roberts M.C., Facinelli B., Giovanetti E., Varaldo P.E. Transferable erythromycin resistance in Listeria spp. isolated from food // Appl. Environ. Microbiol. 1996. Vol. 62. P. 269-270.

385. Rocourt J., Schrettenbrunner A. Seeliger H. P. Biochemical differentiation of the "Listeria monocytogenes" (sensu lato) genomic groups // Ann. Microbiol. 1983. Vol. 134AP. 65-71.

386. Rocourt J., Rocca M. La listeriosis neonatale // Minerva pediat. 1993. Vol. 45, No. 10. P. 415-417.

387. Rocourt J., Hof H., Schrettenbrunner A., Malinverni R. et al. Acute purulent Listeria seeligeri meningitis in an immunocompetent adult // Schweiz. Med. Wo-chenschr. 1986. Vol. 116. P. 248-251.

388. Rogers H.W., Callery M.P., Deck B., Unanue E.R. Listeria monocytogenes induces apoptosis of infected hepatocytes // J. Immunol. 1996. Vol. 156. P. 679-684.

389. Rorvik L.M., Yndestad M. Listeria monocytogenes in foods in Norway // Int. J. Food Microbiol. 1991. Vol. 13, No. 2. P. 97-104.

390. Rowan N.J., Anderson J.G. Effects of above-optimum growth temperature and cell morphology on thermotolerance of Listeria monocytogenes cells suspended in bovine milk // Appl. And Environ. Microbiol. 1998. Vol. 64, No. 6. P. 2065-2071.

391. Rouquette C., Berche P. The pathogenesis of infection by Listeria monocytogenes //Microbiología. 1996. Vol. 12, No.2. P. 245-258.

392. Rouquette C., de Chastellier C., Nair S., Berche P. The ClpC ATPase of Listeria monocytogenes is a general stress protein required for virulence and promoting escape from the phagosome of macrophages // Mol. Microbiol. 1998. Vol. 27. P. 1235-1245.

393. Rouquette C., Ripio M.T., Pellegrini E., Bolla J.M.et al. Identification of a ClpC ATPase required for stress tolerance and in vivo survival of Listeria monocytogenes //Mol. Microbiol. 1996. Vol. 21. P. 977-987.

394. Rozas J., Sanches-Del Barrio J.C., Messequer X., Rozas R. DnaSP: DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods // Bioinformatics. 2003. Vol. 19. P. 2496-2497.

395. Ryu C.H., Igimi S., Inoue S., Kumagai S. The incidence of Listeria species in retail foods in Japan // Int. J. Food Microbiol. 1992. Vol. 16, No. 2. P. 157160.

396. Sabet C., Lecuit M., Cabanes D. et al. LPXTG protein InlJ, a newly identified internalin involved in Listeria monocytogenes virulence //Infect. Immun.2005. Vol. 73, No. 10. P. 6912-6922.

397. Safdar A., Armstrong D. J. Antimicrobial activities against 84 Listeria monocytogenes isolates from patients with systemic listeriosis at a comprehensive cancer center (1955-1997) // Clin. Microbiol. 2003. Vol.41, No.l. P. 483-485.

398. Sailen B.A., Rajoharison S., Desverenne S. et al. Comparative analysis of 16S and 23S rRNA sequences of Listeria species // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. Vol. 46. P. 669-674.

399. Schlech W.F., Lavigne P.M., Bortolussi R.A. et al. Epidemic listeriosis -evidence for transmission by food //N. Engl. J. Med. 1983. Vol. 308. P. 203-206.

400. Schirmer E. C., Glover J. R., Singer M. A. et al. HSP100/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions // Trends Biochem. Sei. 1996. Vol. 21. P. 289-296.

401. Schlech W.F. Foodborne Listeriosis // Clinical Infect. Dis. 2000. Vol. 31. P. 770-775.

402. Schlüter D., Domann E., Buck C., Hain T. et al. Phosphatidylcholine-specific phospholipase C from Listeria monocytogenes is an important virulence factor in murine cerebral listeriosis // Infect. Immun. 1998. Vol. 66, No. 12. P. 59305938.

403. Schneewind O., Fowler A., Faull F. Structure of the cell wall anchor of surface proteins in Staphylococcus aureus II Science. 1995. Vol. 268. P. 103-106.

404. Schubert W.D., Urbanke C., Ziehm T. et al. Structure of internalin, a major invasion protein of Listeria monocytogenes, in complex with its human receptor E-cadherin // Cell. 2002. Vol. 111. P. 825-836.

405. Schuchat A., Lizano C., Broome C.V. et al. Outbreak of neonatal listeriosis associated with mineral oil // Pediat. Infec. Disease J. 1991. Vol. 10, No. 3. P.183-189.

406. Schuchat A., Robinson K., Wenger J.D. et al. Bacterial meningitis in United States in 1995. Active surveillance team//N. Engl. J. Med. 1997. Vol. 337. P. 970-976.

407. Schuchat A., Swaminathan B., Broome C.V. Epidemiology of human Listeriosis // Clin. Microbiol. Rev. 1991. Vol. 4, No. 2. P. 169-183.

408. Schwartz B., Hexter D., Broome C.V. et al. Investigation of an outbreak of listeriosis: new hypotheses for the etiology of epidemic Listeria monocytogenes infections //J. Infect. Dis. 1989. Vol. 159. P. 680-685.

409. Schwarze R., Bauermeister C.-D., Ortel S., Wiedmann G. Perinatal listeriosis in Dresden 1981 1986: Clinical and microbiological findings in 18 cases // Infection. 1989. Vol. 17, No. 3. P. 131-138.

410. Seeliger H. P. R. Listeriosis // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1961. Vol. 10, No. 6. P. 928-929.

411. Seeliger H. P. R. Serovars of Listeria monocytogenes and other Listeria species 11 Acta Microbiol. 1975. Vol. 22. P. 179-181.

412. Seeliger H.P.R., Hohne K. Serotyping of Listeria monocytogenes and related species // In T. Bergan and J.R. Norris (ed.), Methods in microbiology, Academic Press, London, UK. 1979. Vol. 13. P. 31-49.

413. Seeliger H. P. R., Welshimer H. J. Genus Listeria II In: Buchanan R. E., Gibbons N. E. (eds.), Bergey's manual of determinative bacteriology, 8th ed. Baltimore: William & Wilkins. 1974. P. 593-596.

414. Sergeant E.S.G., Love S.C.J., Mclnnes A. Abortions in sheep due to Listeria ivanovii II Aust. Vet. J. 1991. Vol. 68. P. 39.

415. Sharp J.C.M. Foodborne infections and poultry // J. Roy. Soc. Health. 1991. Vol. Ill,No. l.P. 35-37.

416. Shen Y., Liu Y., Zhang Y., Cripe J. et al. Isolation and characterization of Listeria monocytogenes isolates from ready-to-eat foods in Florida // Appl. Environ. Microbiol. 2006. Vol. 72, No. 7. P. 5073-5076.

417. Shen Y., Naujokas M., Park M. et al. InlB-dependent internalization of Listeria is mediated by the Met receptor tyrosine kinase // Cell. 2000. Vol. 103. P. 501-510.

418. Sibelius U., Schulz E.C., Rose F et al. Role of Listeria monocytogenesexotoxins listeriolysin and phosphatidylinositol-specific phospholipase C in activation of human neutrophils // Infect. Immun. 1999. Vol. 67. P. 1125-1130.

419. Simili M., Castellucci M.C., Adorisio E. et al. It ruolo degli Storni nella diffusione della Listeria monocytogenes e di Listeria spp. II Ann. Ig.: Med. prev.e comunita. 1996. Vol. 8, No. 5. P. 543-546.

420. Skovgaard N. The impact of the prevalence of Listeria monocytogenes in the environment on meat and milk hygiene // Microbiol., alim., nutr. 1990. Vol. 8, No. l.P. 15-20.

421. Slutsker L., Schuchat A. Listeriosis in humans // In E.T.Ryser, E.H.Marth (ed.). Listeria, listeriosis, and food safety. 2nd ed. Marsel Dekker Inc., New York, N.Y. 1999. P.75-95.

422. Smith L.T. Role of osmolytes in adaptation of osmotically stressed and chill-stressed Listeria monocytogenes grown in liquid media and on processed meat surfaces II Appl. And Environ. Microbiol. 1996. Vol. 62, No. 9. P. 3088-3093.

423. Snapir Y.M., Vaisbein E., Nassar F. Low virulence but potentially fatal outcome Listeria ivanovii // Eur. Intern. Med. 2006. Vol. 17, No. 4. P. 286-287.

424. Southwick F.S., Purich D.L. Intracellular Pathogenesis of Listeriosis // NEJM. 1996. Vol. 334, No. 12. P. 770-776.

425. Stamm A.M., Smith S.H., Kirklin J.K., McGiffin D.C. Listerial myocarditis in cardiac transplantation // Rev. Infec. Diseases. 1990. Vol. 12, No. 5. P. 820823.

426. Stephens P.I., Jones M.V. Thermal inactivation of Listeria monocytogenes studied by differential scanning calorimetry // Listeria 1992: 11th Int.Symp. Probl. Listeriosis. Copenhagen. 1992: ISOPOL XI: Book. Abstr. S.I., s.a.: P. 333334.

427. Stover C.K., Pham X.Q., Erwin A.L. et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PA01, an opportunistic pathogen // Nature. 2000. Vol. 406. P. 959-964.

428. Strom M.S. Phenotypic and genetic characterization of anon-hemolyticvariant of Listeria monocytogenes from cold smoked salmon // Food Microbiol. 1998. Vol. 15, No. 3. P. 329-337.

429. Swartz M.A., Welch D.F., Narayanan R.D. et al. Catalase-negative Listeria monocytogenes causing meningitis in an adult // Am. J. Clin. Pathol. 1991. Vol. 96. P. 130-133.

430. Takeda Y., Takeda T., Honda T., Miwatani T. Inhibition by gangliosides of hemolysis induced by streptolysin O and Listeria monocytogenes hemolysin proceedings. //Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1978. Vol. 31. P. 198-200.

431. Tang P., Rosenshine I., Cossart P. et al. Listeriolysin O activates mito-gen-activated protein kinase in eucaryotic cells // Infect. Immun. 1996. Vol. 64. P. 2359-2361.

432. Tasara T., Stephan R. Cold stress tolerance of Listeria monocytogenes: A review of molecular adaptive mechanisms and food safety implications // J. Food Prot. 2006. Vol. 69, No. 6. P. 1473-1484.

433. Tham W., Ericsson H., Loncarevic S. et al. Lessons from an outbreak of listeriosis related to vacuum-packed gravid and cold-smoked fich // Int. J. Food Microbiol. 2000. Vol. 62, No. 3. P. 173-175.

434. Tilney L.G., Portnoy D.A. Actin filaments and the growth, movement and spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes II J. Cell Biol. 1989. Vol. 109. P. 1597-1608.

435. Tsai Y.H., Orsi L.H., Nightingale K.K., Wiedmann M. Listeria monocytogenes internalins are highly diverse and evolved by recombination and positive selection// Infect. Genet. Evol. 2006. V. 6. P.378-389.

436. Tuazon C.U., Shamsuddin D., Miller H. Antibiotic susceptibility and synergy of clinical isolates of Listeria monocytogenes // Antimicrob. Agents Chemother. 1982. Vol. 21, No. 3. P. 525-527.

437. Ueda F., Ogasawara K., Hondo R. Analysis of molecular evolution of Listeria monocytogenes isolated from Japanese meats and environment // Jpn. J. Infect. Dis. 2005. Vol. 58. P. 320-322.

438. Ueno H., Yokota K., Arai T. et al. The prevalence of Listeria monocytogenes in the environment of dairy farms // Microbiol. And Immunol. 1996. Vol. 40, No. 2. P. 121-124.

439. Unnerstad H., Romell A., Ericsson H. et al. Listeria monocytogenes in faeces from clinically healthy dairy cows in Sweden // Acta Vet. Scand. 2000. Vol. 41, No. 2. P. 167-171.

440. Valk H., Vaillant V., Jacquet C. et al. Two consecutive nationwide outbreaks of Listeriosis in France, October 1999 February 2000 // Am. J. Epidemiol. 2000. Vol. 154, No. 10. P. 944-950.

441. Vazquez-Boland J.A., Dominguez-Bernal G., Gonzalez-Zorn B. et al. Pathogenicity islands and virulence evolution in Listeria // Microb. Infect. 2001. Vol. 3. P. 571-584.

442. Vazquez-Boland J. A., Kuhn M., Berche P. et al. Listeria pathogenesisand molecular virulence determinants I I Clin. Microbiol. Rev. 2001. Vol.14. P. 584640.

443. Vázquez-Boland J. A., Domínguez L., Fernández-Garayzábal J. F., Suárez G. Listeria monocytogenes cAMP reaction // Clin. Microbiol. Rev. 1992. Vol.5. P. 343

444. Vázquez-Boland J.A., Kocks C., Dramsi S. et al. Nucleotide sequence of the lecithinase operon of Listeria monocytogenes and possible role of lecithinase in cell-to-cell spread//Infect. Immun. 1992. Vol. 60. P. 219-230.

445. Vazques-Salinas C., Rodas-Suarez O., Quinones-Ramires E.I. Occurence of Listeria species in raw milk in farms on the outskirts of Mexico city // Food Microbiol. 2001. Vol. 18, No. 2. P. 177-181.

446. Volokhov D., George J., Anderson C. et al. Discovery of natural atypical nonhemolytic Listeria seeligeri isolates // Appl. Environ. Microbiol. 2006. Vol.72. P. 2439-2448.

447. Walker S.J., Archer P., Banks J.G. Growth of Listeria monocytogenes at refrigeration temperatures // J. Appl. Bacterid. 1990. Vol. 68. P. 157-162.

448. Wiedmann M., Arvik T.J., Hurley R.J., Boor K.J. General stress transcription factor aB and its role in acid tolerance and virulence of Listeria monocytogenes II J. Bacteriol. 1998. Vol. 180, No. 14.P. 3650-3656.

449. Wiedman M., Bruce J.I., Keating C. et al. Ribotypes and virulence gene polymorphism suggest three distinct Listeria monocytogenes lineages with differences in pathogenic potential // Infect. Immun. 1997. Vol. 65. P. 2707-2716.

450. Wilkinson B. J., Jones D. A Numerical Taxonomic Survey of Listeria and Related Bacteria // J. General Microbiology. 1977. Vol. 98. P. 399-421.

451. Winslow-Dean L., Steele-Moore L. Ventriculoperitoneal shunt infection dur to Listeria monocytogenes II Clin. Infec. Diseases. 1995. Vol. 20, No. 5. P. 1437.

452. Weaver R.F. Morphological, physiological and biochemical characterization, //In: James G.L. (ed.) Isolation and identification of Listeria monocytogenes. US Department of Health and Human Services, CDC, Atlanta, 1989. P. 39-43.1. Q ^n

453. Weber A., Potel J., Schafer^Schmi'dt R. Untersuchungen zum Vorkommen von Listeria monocytogenes and Listeria spp. in Kotproben von Pferden // Monatsh. Veterinarmed. 1994. Vol. 49, No. 5. P. 199-201.

454. Weinberg E.D. Pregnancy-associated depression of cell-mediated immunity//Rev. Infect. Dis. 1984. Vol. 6. P. 814-831.

455. Weiss J., Seeliger H. Incidence of Listeria monocytogenes in nature // Appl. Microbiol. 1975. Vol. 30, No. 1. P. 29-31.

456. Welch D.F. Role of catalase and superoxide dismutase in the virulence of Listeria monocytogenes I I Arm. Inst. Pasteur Microbiol. 1987. Vol. 138. P. 241284.

457. Welshimer H.J., Donker-Voet J. Listeria monocytogenes in nature // Appl. Microbiol. 1971. Vol. 21. P. 516-519.

458. Wesley I.V. Listeriosis in animals /In E.T. Ryser, E.H. Marth (ed.). // Listeria, listeriosis and food safety. 2nd ed. Marcel Dekker Inc., New York, N.Y. 1999. P. 39-73.

459. Wetzler T.F., Freeman N.R., French L.M.V. et al. Biological characterization of Listeria monocytogenes II Health Lab. Sei. 1968. Vol. 5. P. 46-62.

460. Wuthe H.-H., Schonberg A. Listeriose bein Feldhasen in Norddeutscland // Berl. And Tierarztl. Wochenschr. 1999. Vol. 112, No. 3. P. 98-99.

461. Zhang W., Jayaray B.M., Knabel S.J. Multi-virulence-locus sequence typing of Listeria monocytogenes II Appl. Environ. Micorbiol. 2004. V. 70, No. 2. P. 913-920.

462. Zimmermann P., David G. The syndecans, tuners of transmembrane signalling II FASEB J. 1999. Vol. 13. P. 91-100.

Информация о работе

Зайцева, Елена Александровна
доктора медицинских наук
Москва, 2010
ВАК 03.00.07

Диссертация

Система анализа микробиологических и молекулярно-генетических маркеров для выявления высоковирулентных штаммов Listeria monocytogenes - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы