Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация и типирование Listeria monocytogenes на основе особенностей полиморфизма и экспрессии генов факторов патогенности

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и типирование Listeria monocytogenes на основе особенностей полиморфизма и экспрессии генов факторов патогенности"

На правах рукописи

КАРПОВА Татьяна Игоревна

Идентификация и типирование Listeria monocytogenes на основе особенностей полиморфизма и экспрессии генов факторов

патогенности

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научно-исследовательской инртйтуте эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН

(

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Тартаковский И.С.

(

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Бойченко М.Н. ^

Доктор медицинских наук, профессор Бондаренко В.М.

Ведущая организация:

Кафедра микробиологии Российской Медицинской Академии последипломного образования МЗ РФ

Защита состоится «28 » ноября 2003 г. в 11ч. на заседании

диссертационного совета Д 001.007.01 в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, г.Москва, ул.Гамалеи, 18)

I

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им Н.Ф.Гамалеи РАМН

Автореферат разослан 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,профессор

Актуальность работы:

Возбудитель листериоза Listeria monocytogenes был открыт в 20-х годах прошлого

века во время вспышки заболевания у лабораторных животных ( Seeliger H.P.R., 1988 ). Однако интерес к листериям значительно вырос в 80-ые годы, когда были зарегистрированы эпидемические вспышки и многочисленные спорадические случаи заболевания, связанные с употреблением в пищу контаминированных продуктов. Возбудитель листериоза выделяется из целого ряда продуктов (сыры, различные мясные, куриные и рыбные полуфабрикаты для еды «быстрого приготовления», салаты и т.д.) ( Farber J.M., Peterkin P.I., 1991 ). Хотя по числу выявляемых случаев листериоз уступает другим пищевым инфекциям, таким, например, как сальмонеллез и дизентерия, он существенно превосходит их по тяжести клинического течения и проценту летальных исходов. Листериоз может проявляться в таких тяжелых клинических формах как менингиты, менингоэнцефалиты, сепсис, аборты и мертворождения, при этом 90% больных нуждаются в госпитализации. Летальность при листериозе достигает 20-30%. Все это делает листериоз одной из важнейших пищевых инфекций 21 века.

В настоящее время можно выделить две основные тенденции, определяющие прогресс в изучении роли листерий в инфекционной патологии человека и совершенствовании профилактики листериоза за последние годы. Одна тенденция связана с возрастающим значением продуктов питания в возникновении случаев эпидемического и спорадического листериоза и, соответственно, с необходимостью разработки методов эффективного мониторинга за листериями в продуктах питания на этапах изготовления и хранения. Вторая тенденция связана с существенным прогрессом в изучении роли молекулярно-генетических детерминант патогенности листерий во взаимодействии с эукариотической клеткой и изучением системы генетической регуляции экспрессии факторов патогенности возбудителя.

Исследования, проведенные в данной работе, выпол left&G: )*1Ы1(1ШИ>кйЫЬкЯфций

БИБЛИОТЕКА { С.Петербург W/ } ОЭ МО? мггЬ f $

и направлены на создание современной схемы идентификации и типирования листерий, выделяемых из продуктов питания, на основе изучения особенностей экспрессии и полиморфизма генов факторов патогенности и включения их в систему оценки микробиологической безопасности продуктов питания.

Цель работы: на основе изучения особенностей полиморфизма и экспрессии генов факторов патогенности разработать методы быстрой идентификации и типирования листерий и включить их в схему оценки микробиологической безопасности продуктов \

питания.

Задачи исследования:

1. Отработать оптимальную методику выделения и получить коллекцию штаммов листерий из продуктов питания.

2. Разработать эффективные методы видовой идентификации листерий, используя особенности экспрессии генов факторов патогенности.

3. Оценить возможность включения разработанных методов в современную схему мониторинга микробиологической безопасности продуктов питания.

4. Разработать метод типирования листерий на основе изучения особенностей геномного полиморфизма.

Научная новизна работы:

разработан принципиально новый метод идентификации L monocytogenes, основанный на выявлении индукции лецитиназной активности в присутствии активированного угля;

с помощью разработанного метода продемонстрирована возможность быстрой и достоверной дифференциации L monocytogenes от непатогенных листерий на примере коллекции штаммов листерий, выделенных из продуктов питания;

показано, что сочетание лецитиназного теста и полимеразной цепной реакции с видоспецифическими праймерами plcl, plc2 в настоящее время является наиболее эффективным и надежным способом дифференциации L. monocytogenes от непатогенных листерий;

- методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) выявлено существование двух филогенетических линий у вида L. monocytogenes, к первой из которых (тип А) относятся штаммы серогрупп 1/2а, 1/2с, За, а ко второй (типы В и В1) - штаммы серогрупп l/2b, 4b, 4d;

- впервые продемонстрировано, что последовательность гена prfA, кодирующего основной регулятор генов патогенности, содержит нуклеотидные .замены, консервативные для каждой из филогенетических линий;

- впервые проведена оценка частоты встречаемости представителей разных филогенетических линий листерий в зависимости от источника выделения, показавшая преобладание штаммов, относящихся к первой линии, среди пищевых изолятов (72%), в то время как среди клинических изолятов преобладали штаммы, относящиеся ко второй линии (67%);

Практическая значимость:

- разработанный метод идентификации L. monocytogenes на основании индукции лецитиназной активности в присутствии активированного угля (патент №2196827 от 20.01.2003г) включен в Государственный стандарт и Методические указания МЗ РФ;

- разработана система рестрикционного анализа, позволяющая определить принадлежность выделенного штамма листерий к определенной филогенетической линии и оценить его возможную эпидемиологическую значимость.

Апробация диссертационной работы состоялась на научной конференции отдела медицинской микробиологии ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (2В июня 2003 г.). Материалы диссертации доложены на Всероссийской конференции с международным участием «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека» (Москва, 21-23 апреля

1999); IV международной конференции МАКМАХ «Антимикробная терапия» (Москва, 18-21 июня 2001); VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 26-26 марта 2002).

Объем и структура диссертации. Работа выполнена на 98 страницах машинописного текста и иллюстрирована 10 рисунками и 12 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 129 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ^

Материалы и методы Штаммы и среды, использованные в работе. В работе использовали штаммы

приведенные в таблице 1.

Таблица 1

№ п/п штамм ceporpynna или описание источник выделения

Listeria monocytogenes любезно предоставлен

1. SLCC 2755 l/2b J.A.Vazquez-Boland,

2. CLIP 75936 l/2a University Complutence,

3. NCTC 5348 1 /2c Spain

4. NCTC 5105 3a тот же

5. SLCC 2540 3b тот же

6. SLCC 2479 3c тот же

7. NCTC 5214 4a тот же

8. NCTC 10528 4ab тот же

9. NCTC 10527 4b тот же

10. ATCC 19116 4c тот же

11. ATCC 19118 4c тот же

12. NCTC 10888 4d тот же

13. РАМ 62 l/2b,продукты питания тот же

14. РАМ 487 тот же

15 P 14 4b,клинический тот же

16. NG 602 4b (Ermolaeva et al, 1997)

17. GIM-16 данная работа

18. GIM-87 тот же

19. GIM - 88 тот же

20. GIM-90 тот же

21. GIM-91 тот же

22. GIM-92 тот же

23. GIM - 98/20 тот же

24. GIM - 129/3 тот же

25. GIM -114/24 тот же

26. GIM-132/5 тот же

27. GIM-136/3 тот же

28. GIM-1300 тот же

29 24-T любезно предоставлен

30. 31 -T ЦГСЭН Тульск обл.

31. 35 -T тот же

32. 56-T тот же

33. 74-T тот же

34. PK-9 тот же

35 РК2/Ч 4b любезно предоставлен акад

36. РК 2/у 4b Г.П.Сомовым, НИИЭМ

37. 1549/1 г.Владивостока

38 1549/3 4b тот же

39. 1553/1 4b тот же

40 1553/2 4b тот же

41. 1553/4 4b тот же

42. 870 l/2a тот же

Listeria innocua тот же

43. SLCC 3379 тот же

44. NCTC 11188 любезно предоставлен

45. АТСС 33090 J.A.Vazquez-Boland,

Listeria ivanovii University Complutence,

46. АТСС 19119 Spain

47. NCTC 11846

48. SLCC 2379T тот же

Listeria seeligeri тот же

49. SLCC 5921 тот же

50. SLCC 3954

Listeria welshimeri тот же

51. SLCC 5334 тот же

Listeria grayi

52. L7 тот же

тог же

тот же

Listeria spp. выращивали в жидкой или агаризованной среде Brain-Heart Infusion ("Difco") при 37°С в течение ночи на круговой качалке. Также выращивали Listeria spp. на селективных дифференциально-диагностических средах: бульон Фразера с селективными добавками ("Hi-media"), бульон ПБЛ I и ПБЛ П (Оболенск), Оксфорд и Палкам Агар с селективными добавками ("Hi-media"), ПАЛ (Оболенск) при 30° С 24 - 48 ч (см. ниже). Для определения ферментации Сахаров использовали бульон с бромкрезоловым пурпурным ("Hi-media"), инкубируя при 37°С в течение 7 дней. Кроме того, для определения лецитиназной активности выращивали Listeria spp. на среде ГРМ №1 (Оболенск) с лецитином и 0,5% активированным углем.

Выделение штаммов Listeria spp из продуктов питания. Выделение Listeria spp проводилось в целом как описано в (Hitchins A.D., 1995). Идентификация выделенных клонов проводилась как описано в том же руководстве и подтверждалась с помощью API тестов (BioMerieux, France).

Приготовление сред и определение лецитиназной активности. Для определения лецитиназной активности среды готовили следующим образом. Перед стерилизацией к

агаризованной среде добавляли порошкообразный активированный уголь до концентрации 0,2 - 1%. Желток куриного яйца разводили в 100 мл физиологического раствора и добавляли 5% по объему к стерилизованному и охлажденному до 40 - 45°С питательному агару. Аналогично готовили агар с добавлением желтка, но без добавления активированного угля. Исследуемые штаммы высевали короткими штрихами (по 15-20 клонов на одну чашку Петри). Инкубировали 48 ч при температуре 37°С. Активность определяли через двое суток по появлению зон помутнения вокруг подросшего штриха.

i

Приготовление лизатов Listeria spp. для проведения ПЦР. Лизаты для ПЦР были приготовлены, как описано Ермолаевой С.А.(1994).

Полимеразная цепная реакция. ПЦР проводили с использованием Taq-полимеразы фирмы Бионем и 10х буфера, поставляемого совместно с ферментом. Реакционная смесь включала 1.5 mM MgCh, ImM dNTP, 15 пмоль праймеров. В работе были использованы пары праймеров Р1с-1, Р1с-2 и Prs-1, Prs2 (см. Табл. 2). Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл. На смесь наслаивали минеральное масло в объеме 15 мкл. Амплификация проводилась в термоциклере Терцик (ДНК-технология) по программе быстрого регулирования. Амплифицированную ДНК анализировали гель-электрофорезом в 1% агарозном геле в трис-ацетатном буфере в присутствии 0,5 мкг/мл бромистого этидия.

Осаждение продукта ПЦР для рестрикционного анализа. К 50 мкл ПЦР-продукта добавляли 50 мкл воды и 90 мкл теплого раствора 20% ПЭГ6000-2.5 М NaCl. Смешивали на Vortexe. Инкубировали 10 мин при 37°С. Осаждали на микроцентрифуге 5 мин при максимальных оборотах. Добавляли 200мкл 75% этанола, не взбалтывая осадок. Центрифугировали 1 мин, удаляли этанол. Сушили на столе 5-10 мин. Суспендировали осадок в 10-40 мкл деионизованной воды в зависимости от концентрации ампликона. Метод полиморфизма длин рестрик ционных фрагментов (ПДРФ). Рестрикцию ДНК осуществляли эндонуклеазами Hind III, Cla I, BamH I, EcoR I производства Fermentas (Литва) в соответствующих буферах в объеме 20 мкл в течение двух часов

при 37°С: 10 мкл Таблица 2

Наименование Нуклеотидный состав прайм ера Характеристика мишени

PLS1 AGGGGGCCATTTTGTATAAG Направляют амплификацию участка, размером 474 н п, гена фосфатидилинозитол-специфичной фосфолипазы С plcA

PLS2 ATCGTTGCTGTTTTGCTCGT

PRS1 GCATTGCGTGAAGCTGGCGCAAC Фрагмент размером 211 нп. гена prs, кодирующего белок фосфорибозилпирофосфатсинтазу, не связанного с вирулентностью, консервативного для всех видов листерий

PRS2 CAGAAGCATTTTCATGAAC

LMP3 CATGTTGTTCGCACCCAGTTC Фрагмент хромосомы L monocytogenes, размером 2862 н.п., содержащий гены prfA и pic А, кодирующие регуляторный белок PrfA и фосфолнпазу PI-PLC; и фрагмент гена hly, кодирующий листериолизин О

LMP4 ACATTTGTCACTGCATCTCCG

ПЦР-продукта, 2 мкл буфера, 1мкл рестриктазы и 7 мкл деионизованной воды. Рестрицированную ДНК анализировали гель-электрофорезом в 0,8% агарозном геле в трис-ацетатном буфере в присутствии 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента хромосомы L. monocytogenes, содержащего ген prfA. Образцы для секвенирования были получены в ПЦР с праймерами Lmp3, Lmp 4 (Табл. 2). Секвенирование проводилось в Центре Совместного Пользования «Геном». Сравнение последовательностей и анализ присутствия сайтов рестрикции осуществлялось с помощью программ PCGene и Clone. Исходная последовательность использованного района листериозной хромосомы была получена из базы данных генома штамма EGD, находящейся в институте Пастера. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

1. Отработка методики выделения листерий из продуктов питания.

Нами была показана на примере молочных продуктов возможность длительного

сохранения и размножения L.monocytogenes в молоке в широком диапазоне температур. Уже через 7 дней инкубации концентрация возбудителя достигала потенциально опасной

и

величины (106 - 108 КОЕ\мл), которая сохранялась в течение 2 месяцев (Рис. 1).

Динамика размножения L.monocytogenes в молоке

10

С 8

ш 6

о 4

01 2

0

-37оС -20оС -4оС

О 4 8 12 16 сутки

Рис. 1.

Выделение листерий из ранее стерильного молока, при отсутствии посторонней микрофлоры, не представляет сложности и не требует селективных сред и дополнительных методов. В то же время выделение листерий из продуктов, контаминированных листериями в естественных условиях, значительно сложнее. Наши попытки выделить листерии из продуктов питания различного происхождения на традиционных средах, используемых для культивирования возбудителя и (или) выделения листерий из стерильного клинического материала (ликвор, кровь) - кровяной агар или агар Хоттингера, а также использование какого-либо одного селективного фактора (холодовое обогащение, теллурит калия) были безуспешными. Только применение сочетания бульона обогащения и селективной твердой среды, обязательно содержащей эскулин, хлорид лития и антибиотики, позволило наладить и стандартизовать выделение листерий из продуктов питания различного происхождения. Важно, что эффективность выделения зависела не от источника изготовления среды (Оболенск, Россия; Хай Медиа Индия), а от строгого соблюдения схемы исследования продуктов питания (Рис. 2).

Для выделения листерий из продуктов питания в подготовленные флаконы со 125 мл бульона (Listeria Selective Broth) после стерилизации вносили селективные добавки непосредственно перед внесением образца. Измельченный в асептических условиях продукт добавляли к подготовленному бульону и интенсивно перемешивали. Инкубировали в течение суток при 30°С. Из каждого флакона петлей переносили на

Oxford агар или PALCAM. Инкубировали 48 ч и выявляли колонии с потемнением среды вокруг. После инкубирования производили отбор подозрительных характерных колоний (с потемнением). Не менее 5 колоний из каждого образца пересевали на триптико-соевый агар с дрожжевым экстрактом до отдельных колоний, так как на селективных средах с антибиотиками сопутствующие микроорганизмы могут проявлять слабый рост, но присутствовать вместе с листериями.

Однако, после пересева на питательный агар для получения чистой культуры и последующей микроскопии не все микроорганизмы оказывались грамположительной палочкой. Потемнение вызывали и грамположительные кокки (по литературным данным энтерококки). Однако потемнение среды, вызываемое энтерококками, имело зеленоватый оттенок в отличие от буро-коричневого, вызываемого листериями.

Всего в работе было проверено 172 образца продуктов питания различного происхождения по разработанной схеме. Из них: мяса и фарша - 48; колбасных изделий, сосисок, ветчины - 44; молочных продуктов, сыра и творога - 39; кур, куриной кулинарии (фарш, котлеты, шницель) -21; овощных салатов - 10; рыбы - 10. Рис.2 Схема выделения L.monocytogeiies из продуктов питания.

30°С 24ч 13 г (мл) образца + 125мл бульона Фразера

Oxford, PALKAM агар или ПАЛ

30°С 48ч

10мл бульона Фразера вторичного обогащения или ПБЛ.

0,1мл

30°С 24-48ч

В результате было выделено 49 культур листерий. Из них: Listeria monocytogenes-14 штаммов (8%), Listeria innocua - 32 штамма (18,5%), Listeria welshimeri - 3 штамма (менее 2%). Использование данной схемы позволило выделить листерии в 30% образцов (табл.3). Выявленный уровень контаминации продуктов соответствует данным многих зарубежных исследований ( Farber J.M., Peterkin P.I., 1991 ) и свидетельствует о том, что контаминация листериями продуктов питания в Российской федерации столь же высока, j

как и за рубежом; предлагаемая схема выделения листерий в полной мере отвечает задачам эффективного мониторинга возбудителя в продуктах питания.

Таблица 3

Наименование групп продуктов Число исследованных образцов продуктов питания (% от общего числа образцов)

Всего Свободных от листерий Всего листерий В том числе L.monocytogenes

1.Мясо и мясная кулинария 48 (100%) 29 (60,4%) 19 (39,6%) 5 (10,4%)

2.Мясо птицы и кулинария 21 (100%) 9 (43%) 12 (57%) 2 (9,5%)

З.Мясные продукты готовые к употреблению 44(100%) 28 (63,6%) 16(36,4%) 6(13,6%)

4.Молочные продукты 39(100%) 38 (97,4%) 1 (2,6%) -

5.Овощные салаты 10(100%) 10(100%) - -

Итого: 162(100%) 114(70,4%) 48 (29,6%) 13(8%)

2. Разработка метода лецитиназной активности для идентификации L.monocytogenes.

Не менее важной задачей, чем выделение листерий, является быстрая

дифференциация патогенного для человека вида L monocytogenes от 5 других непатогенных видов листерий. В наших исследованиях из 48 выделенных культур только 13 штаммов (28%) принадлежат к L monocytogenes . Остальные культуры, как показала последующая идентификация, относились к L welshimeri и L. innocua , особенно часто

контаминирующим продукты. В данном случае серологическая идентификция не работает, поскольку упомянутые виды листерий имеют существенное число общих антигенных детерминант с L.monocytogenes. Получившие наибольшее распространение методы дифференциации, основанные на ферментации углеводов и определении гемолитической активности, дают надежные результаты только при объединении в

| соответствующую панель типа API Listeria, что в значительной степени удорожает

идентификацию листерий.

i Нами разработан принципиально новый метод, основанный на определение

лецитиназной активности на среде с добавлением активированного угля. Ранее С.А.Ермолаевой с соавт. было показано, что секретируемый самими листериями продукт, выполняющий функции ауторепрессора, может быть устранен из среды гидрофобным сорбентом, в частности активированным углем (Ермолаева С.А. и др., 2000). При этом происходит активация генов патогенности и, соответственно, увеличение уровня экспрессии факторов патогенности в среде, в том числе лецитиназы. Наши исследования показали, что в присутствии активированного угля у L.monocytogenes наблюдается четко выраженная лецитиназная активность, которая при выращивании на агаризованных средах наблюдается в виде плотной зоны помутнения вокруг роста культуры. Нами были подобраны оптимальные концентрации активированного угля и куриного желтка, которые на среде ГРМ №1 (Оболенск, Россия) позволяли четко дифференцировать

I

L.monocytogenes от непатогенных листерий.

^ Условия индукции лецитиназной активности были отработаны на 16 штаммах

L.monocytogenes, полученных из коллекций NCTC, SLCC, АТСС, НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи (штаммы 1-16, Табл. 1). Была использована агаризованная среда Brain Heart Infusion (BHI, Difco); активированный уголь (Merck) добавлялся до концентраций от 0.2% до 1%. У 11 проверенных штаммов выявлена лецитиназная активность в присутствии 0,5% угля и выше, у 2 штаммов - в присутствии 0,2% и более (Таблица 4).

Два штамма (БЬСС2540 и ЫСТС10528) не обладали лецитиназной активностью в присутствии активированного угля вплоть до 1% и, видимо, вообще не активировались. Один штамм (МСТС5105) демонстрировал лецитиназную активность как в присутствии, так и при отсутствии активированного угля. Согласно полученным результатам, оптимальной для наблюдения изменения продукции лецитиназы на агаризованных средах является концентрация 0,5%.

Таблица 4. Штаммоспецифическая зависимость индукции лецитиназной активности у L monocytogenes от концентрации активированного угля

Всего изучено штаммов Лецитиназная активность выявляется Лецитиназная активность не выявляется

Независимо от угля При 0,2% и выше угля При 0,5% и выше угля

16 1 (6 %) 2 (12,5 %) 12(69%) 2 (12,5 %)

Хотя на среде ВШ ф^со) наблюдалась четко выраженная индукция лецитиназной активности в присутствии активированного угля, тем не менее эта среда не является оптимальной для масштабных исследований в силу причин экономического характера. Поэтому был исследован ряд других сред, представленных на отечественном рынке. Результаты представлены в таблице 5. Оптимальные результаты, помимо среды ВН1 (В1Й;о), были получены со средой ГРМ №1 (Оболенск). При добавлении к этой среде желтка куриного яйца (см. Материалы и Методы) штаммы дикого типа без угля не демонстрировали лецитиназной активности, а в присутствии 0,5% активированного угля демонстрировали четко различимую активность уже через 24 часа в виде плотной зоны помутнения шириной 2-4мм, которая спустя 48 часов достигала ширины 6-10мм (Рис.3). На других протестированных средах индукции лецитиназной активности не наблюдалось, или наблюдалось нечеткое исчезающее гало, трудное для интерпретации.

Таблица 5. Лецитииазная активность Ь.топосуЩепе5 в присутствии 0,5% активированного угля на различных питательных средах

Среда Лецитиназная активность

Brain Heart Infusion (Difco Lab., USA) +

Brain Heart Infusion (BioMerieux, France) -

Brain Heart Infusion (HiMedia Lab.Ltd., India) -

Listeria Selective Broth (HiMedia Lab.Ltd., India) -

MYP (HiMedia Lab.Ltd., India) -

ГРМ №1 (ННПГИП, Оболенск, Россия) +

В работе использовался активированный уголь фирмы Merck и отечественного производства. Различий в лецитиназной активности при использовании отечественного и импортного угля не было.

д g Рис.3. Индукция лецитиназной активности в

присутствии активированного угля 1 -L monocytogenes NCTC10527; 2 - Lwelshimeri SLCC 5334; 3 - Linnocua АТСС 33090; 4 -

_ _ L.ivanovii ATCC19119; 5 - Lseeligeri SLCC5921;

6 Lgrayi 17

В отличие от L.monocytogenes, у других видов листерий, имеющих ген лецитиназы, L.ivanovii и L seeligeri, специфической индукции лецитиназной активности в зависимости от присутствия активированного угля не наблюдается (рис. 3). Это, по-видимому, связано с межвидовыми различиями в регуляции экспрессии факторов патогенности. Имеющиеся на сегодняшний день данные свидетельствуют в пользу того, что причиной увеличения уровня продукции лецитиназы и других факторов патогенности у L.monocytogenes является активация положительного регулятора экспрессии факторов патогенности PrfA.

Регуляторный белок PrfA высоко гомологичен у Lmonocytogenes, L.ivanovii и L.seeligeri, однако в его последовательности у этих трех видов есть аминокислотные замены, вероятно, влияющие на его функциональные свойства. Биохимически очень близкий к Lmonocytogenes вид L.innocua, как и другие виды листерий, за исключением перечисленных выше, не имеет в своем геноме гена, кодирующего лецитиназу и не способен к гидролизу лецитина независимо от присутствия активированного угля. Таким образом, сравнение лецитиназной активности в присутствии и в отсутствии активированного угля позволяет надежно дифференцировать возбудителя листериоза от непатогенных листерий, что особенно важно при анализе штаммов, выделенных из продуктов питания.

Рисунок 3. Сравнение лецитиназной активности Lmonocytogenes и ряда бактерий, принадлежащих к другим родам. 1 -St.aureus", 2 - Ent.faecalis; 3 - St.epidermis", 4 -E.coli; 5 - St.haemoliticus; 6 -L.monocytogenes

Б клинических образцах возбудитель листсриоза морфологически может быть сходен с различными кокками и дифтероидами. Известны случаи ложной идентификации энтерококков, стафилококков и коринебактерий как L.monocytogenes, и наоборот. Индукция лецитиназной активности в присутствии активированного угля позволяет надежно дифференцировать листерий от не продуцирующих лецитиназу Enterococcus и Escherichia coli (рис.4). Напротив, отсутствие лецитиназной активности на среде, не содержащей угля, отличает возбудитель листериоза от стафилококков. Это позволяет рассматривать индукцию лецитиназной активности в зависимости от присутствия активированного угля как практически значимый способ для дифференциации

патогенного вида L monocytogenes от представителей рода Listeria и других морфологически сходных бактерий.

Разработанный метод был применен для анализа штаммов, выделенных из продуктов питания и объектов окружающей среды на территории России (Москва, Тульская область, Владивосток). Всего было проверено 26 штаммов (штаммы 17-42, | табл.1), охарактеризованных как L monocytogenes биохимическими методами и в ПЦР.

Все, кроме одного, исследованные штаммы не обладали лецитиназной активностью на S среде ГРМ№1, содержащей желток куриного яйца, и демонстрировали четкую индукцию

лецитиназной активности при использовании 0.5% концентрации угля. Единственный штамм 870 мел., выделенный из окружающей среды (г.Владивосток), не показывал индукции лецитиназной активности в присутствии угля. Таким образом, 96,2 % штаммов дикого типа, изолированных из независимых источников, демонстрировали индукцию лецитиназной активности в присутствии угля. Это свидетельствует о практической применимости разработанного метода.

3. Идентификация листерий методом ПЦР.

Наряду с лецитиназным тестом для идентификации Listeria spp. нами был

разработан метод ПЦР с родоспецифическими и видоспецифическими праймерами. В видоспецифической ПЦР системе были использованы ранее описанные праймеры (Ермолаева С.А., 1994), направляющие амплификацию фрагмента гена plcA, кодирующего синтез одного из основных факторов патогенности - фосфатидилинозитол-специфичную фосфолипазу.

Родоспецифические праймеры направляли амплификацию фрагмента гена prs, кодирующего белок фосфорибозилпирофосфатсинтазу, несвязанный с патогенностью консервативный белок, необходимый в общем метаболизме бактериальной клетки. Родоспецифические праймеры prsl, prs2 были подобраны в данной работе на основе сравнительного анализа последовательностей гена prs у L. monocytogenes, L. seeligeri и L. ivanovii. Сравнение последовательностей гена prs из L monocytogenes, L innocua, L

seeligeri и L. ivanovii, хранящихся в Genebank, с помощью программы Blast, выявило высокую степень консерватизма этого гена в роде Listeria. В результате из последовательности гена L monocytogenes были выбраны праймеры prsl и prs2, которые имели не более трех замен в последовательностях других видов. Продукт ПЦР с праймерами prsl и prs2 был получен для всех видов листерий, кроме L.grayi, что, по-видимому, связано с её более удалённым филогенетическим положением. 'I

Лизаты были приготовлены так, как описано в Материалах и методах. При первоначальном изучении листериозных культур использовали несколько иные условия ^

проведения лизиса клеток, а именно, используемая концентрация лизоцима, фермента, разрушающего бактериальную стенку, была 20 мг/мл. Однако ряд штаммов не мог быть лизирован в таких условиях. Это приводило к тому, что штаммы, идентифицированные другими методами как L.monocytogenes, давали в ПЦР отрицательный результат. Лецитиназный же метод показывал положительный результат, то есть давал зону помутнения вокруг роста данной культуры, предположительно L.monocytogenes, на плотной среде с лецитином. После изменения условий лизиса культуры, с уменьшением концентрации лизоцима до 0,2мг/мл, клеточная стенка бактерий лизировала и результат ПЦР коррелировал с другими методами дифференциации листерий.

Ранее определенная чувствительность используемой видоспецифической системы _

с праймерами plcl, plc2 на препаратах очищенной ДНК (Ермолаева С.А., 1994) ^

составляла 125 фг. Чувствительность ПЦР, проводимой на лизатах, составила 103 бактериальных клеток в образце (рис.5). При исследовании выделенных культур среднее ^

число клеток в реакции составляло 105. Все штаммы L.monocytogenes давали положительный результат в ПЦР. Листерии принадлежащие к другим видам, в ПЦР с праймерами Plcl, Р1с2 давали отрицательный результат.

12 3 4 5 6 7 8

564 t 476

к

Рисунок 5. Определение чувствительности ПЦР с праймерами Plcl, Р1с2 на лизатах ) штамма L.monocytogenes NCTC10527. Стрелками указаны: соответствующий фрагмент

маркера молекулярного веса (564 н.п.) и амлифицированный фрагмент (476 н.п.). 1 -маркер молекулярного веса, ДНК фага лямбда, обработанная рестриктазами EcoRI, Hind Ш; 2 - 105 клеток в образце; 3 — 104 клеток; 4 - 103 клеток; 5-100 клеток; 6-10 клеток; 7 - 1 клетка; 8 - отрицательный контроль.

Родоспецифические праймеры позволяли успешно дифференцировать представителей рода Listeria от бактерий других родов. Анализ 52 штаммов, выделенных из различных источников с помощью традиционных (ферментация углеводов, гемолитическая активность) методов, определения лецитиназной активности и ПЦР показал, что из совокупности применявшихся методов сочетание лецитиназного теста и ПЦР в настоящее время является наиболее надежным, простым и эффективным ^ для быстрой идентификации патогенных для человека листерий.

4.Типирование L. monocytogenes на основе полиморфизма генов факторов патогенности.

' Более 90% штаммов L. monocytogenes, изолированных при спорадических случаях

листериоза, принадлежат всего к трем серогруппам из девяти существующих: 1/2а, 1/2Ь и 4b (Wiedman М. et al., 1996). Более того, подавляющее большинство штаммов, явившихся причиной крупных эпидемических вспышек, формируют очень узкую группу, характеризующуюся принадлежностью к cepoipynne 4Ь и всего двум риботипам из 23 выявленных к настоящему времени (там же). Таким образом, очевидно, что некоторые

клональные линии L. monocytogenes обладают повышенным тропизмом по отношению к людям, и их выявление и идентификация, в частности, в продуктах питания, которые являются основным фактором заражения листериозом, имеют большую эпидемиологическую значимость.

Важнейшую роль для вирулентности листерий играет белок PrfA, который необходим для экспрессии всех остальных факторов патогенности. Ген prfA расположен (

на «островке патогенности» рядом с геном pic А, кодирующим фосфолипазу PI-PLC, секретируемый фактор патогенности. Область гена prfA была выбрана в качестве мишени jj

для анализа с целью оценки возможности его использования для дифференциации штаммов L. monocytogenes. Мы предполагали вероятность того, что область гена, продукт которого непосредственно контролирует уровень экспрессии факторов патогенности, имеет определенные различия у разных клональных линий. В качестве метода был использован метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) участка хромосомы, содержащего гены prfA и pic А. Анализируемые фрагменты синтезировались в ПЦР с использованием в качестве матрицы лизатов штаммов из коллекции ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Анализ был поведен на коллекции из 42 штаммов L. monocytogenes, перечисленных в Табл.1. Все, за исключением двух, штаммы исследованной коллекции давали в ПЦР с праймерами Lmp3, Lmp 4 ожидаемый продукт размером 2 862 н.п. Набор

«

ферментов рестрикции, который был использован в этой работе, был определен на основе анализа последовательности этой области у штамма EGD, геном которого был секвенирован. Всего было использовано 4 фермента рестрикции. В результате проведенного рестрикционного анализа штаммы были разделены на два типа А и В, причем в последнем был выделен подтип В1. Штаммы типа А имели рестрикционный спектр, аналогичный типовому штамму EGD, а штаммы типа В отличались положением сайтов узнавания рестриктазами Clal и Hindll! (рис.6).

Нами было проведено частичное секвенирование фрагментов ПЦР штаммов NCTC10527 и GIM132/5, принадлежащих к группам В и В1, соответственно. Мы обнаружили у обоих штаммов ряд нуклеотидных замен по сравнению с последовательностью штамма EGD. В том числе были обнаружены нуклеотидные замены, приводящие к изменению сайтов рестрикции: A-*G в положении 530 от начала ' фрагмента, А—»G в положении 728 и G—>А в положении 806 (Рис.6). Кроме того, у

штамма GIM132/5 мы нашли замену С—>А в положении 1448, которая картируется в

L

' последовательности гена plcA (Рис.6). Замены в положениях 728 и 806 приводили к

возникновению последовательностей, узнаваемых рестриктазами Cía I и Hind Ш, соответственно, а замены в положениях 530 у обоих штаммов и 1448 у штамма GIM132/5-наоборот, к исчезновению последовательности, узнаваемой рестриктазой Hind Ш. Таким образом, секвенирование штаммов NCTC 10527 и GIM132/5 позволило нам создать для типов В и В1 рестриктные карты, которые отличались от штамма EGD положением Hind Ш сайтов, и наличием дополнительного сайта для Clal (Рис.6).

Таким образом, разделение произошло благодаря существованию у штаммов группы В единичных нуклеотидных замен в последовательности гена prfA. В тоже время ни одна из замен не приводила к изменению в последовательности самого белка PrfA, т.е. замены были так называемыми «молчащими», j Эти данные свидетельствуют о существовании в патогенном виде

L.monocytogenes по крайней мере двух филогенетических линий, и в этом наши данные подтверждают опубликованные ранее работы зарубежных исследователей (Wiedman М. et al., 1996) в которых существование этих линий было предположено на основе анализа генов других факторов патогенности, причем только с одной из них, линией, имеющей в наших обозначениях спектр типа В, связано более 90% случаев заболевания листериозом (Farber J.M., Peterkin P.I., 1991).

ЕсоЫ ВатН1

2000 1743 И«»

1500 ШШ

1200 '

мо В •• 939 В Ж 980

800 ^В К 862/840

700

600 ШВ «

500 ЯВ

Профили рестрикции фрагмента 1_трЗ-1.тр4 рестриктазами ЕсоИ и ВатН1.

В В1

1500 1200 1031 900 800 700 600 500

|1874

2000 1500

1200 1031 900 800 700 600 500

в

1238 901

Штаммоспецифический полиморфизм фрагмента 1_трЗ - 1_тр4 при рестрикции С1а1 и Ншс1111.

Нташ Нш(1111 С1а1 С1а1

I I I I I 1~~2862

СШ НшЛП (Нт(Ш1)С1а1

С1а1

А53(Ю А728в в806А (С1448А)

Рис. 6. Схема расположения С1а1 и НшсИП сайтов рестрикции в зависимости от принадлежности к группе А (сайты указаны над чертой) или к группе В (сайты указаны под чертой). В нижней части указаны нуклеотидные замены у штаммов группы В, приводящие к изменению положения сайтов рестрикции. 20

Анализ связи между принадлежностью штамма к определенной филогенетической линии и источником выделения на примере имеющейся коллекции штаммов L. monocytogenes показал, что, действительно, 67 % клинических изолятов принадлежат к типу В, в то время как среди штаммов, выделенных из продуктов питания, к этому типу I относится менее 20%.

Таким образом, полученные в данной работе результаты свидетельствуют о ^ существенном уровне контаминации продуктов питания патогенными листериями и

позволяют рекомендовать эффективные методы идентификации и типирования листерий на основе изучения особенности экспрессии и полиморфизма генов факторов патогенности. Выводы:

1. Впервые в Российской Федерации проведена систематическая оценка уровня контаминации продуктов питания листериями. Выявлено присутствие листерий в 29,6% исследованных продуктов, из них в 26,7 % случаев присутствовал возбудитель листериоза Listeria monocytogenes (8% от общего числа исследованных продуктов), в остальных случаях выявлялись непатогенные Listeria spp.

2. Способность листерий к длительному сохранению и размножению в молоке (до 2 месяцев) показана путем анализа динамики размножения L. monocytogenes в молочных продуктах при различной температуре.

3. Разработан принципиально новый метод дифференциации L. monocytogenes от непатогенных листерий, основанный на определении индукции гидролиза лецитина в присутствии активированного угля, добавляемого в питательную среду.

4. На коллекции штаммов листерий, выделенных из продуктов питания, показано, что

№

сочетание методов определения лецитиназной активности и амплификации с

ш

ш

%

Щ

2i г

г?

видоспецифическими праймерами к гену plcA является наиболее надежным способом дифференциации L. monocytogenes от непатогенных листерий.

5. Разработан новый метод типирования штаммов L. monocytogenes на основе анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) синтезированного в ПЦР участка хромосомы, содержащего гены патогенности prfA и plcA. Разработанный метод выявляет принадлежность выделенного штамма листерий к определенной I

филогенетической линии и позволяет определить его потенциальную эпидемиологическую значимость. i

Список работ по теме диссертации.

1. И.Л.Жилина, Н.М.Шустрова, Т.И.Карпова Выделение листерий из клинического материала и изучение их чувствительности к антибиотикам // Клинич. лаб. диагностика. 1998. №9. С.12.

2. Т.И.Карпова, Н.М.Шустрова, А.Е.Снегирева, И.Б.Куваева, И.С.Тартаковский Особенности размножения листерий в молочных продуктах. Всероссийская конференция с международным участием «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека». Москва, 21-23 апреля 1999 г., с.20. _

3. Т.И.Карпова, Н.М.Шустрова, А.Е.Снегирева, С.А.Шевелева, И.Б.Куваева, И.С.Тартаковский Размножение листерий в молочных продуктах // ЖМЭИ.2001 .№1 .С.80-81.

4. Карпова Т.И., Ермолаева С.А., Лопырев И.В., и др. Новые методы идентификации Listeria monocytogenes II Клин. Микр. Антимикр. Хим. 2001; 3; с.266-273.

5. Тартаковский И.С., Шевелева С.А., Карпова Т.И., Шустрова Н.М., Ермолаева С.А., Снегирева А.Е., Куваева И.Б. Методические подходы к выделению и

идентификации листерий в продуктах питания. Сб. Профилактическая медицина практическому здравоохранению. Вып.1. часть 11.М., 2001; с.92-94.

6. Ермолаева С.А., Карпова Т.И., Тартаковский И.С. Метод дифференциации возбудителя листериоза. Сб. тез. IV Международной конференции МАКМАХ «Антимикробная терапия». г.Москва, 20-21 июня 2001. С. 13

7. Карпова Т.И., Ермолаева С.А. .Тартаковский И.С., Салова Н.Я., Голованова Т.И., Шестиперова Т.И. Новый метод идентификации Listeria monocytogenes,

угля // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва. 2002. С.283

8. Тартаковский И.С., Карпова Т.И., Попова Т.А., и др. Оценка эффективности новых методов идентификации листерий при исследовании продуктов питания в Тульской области. Материалы научно-практических конференций, посвященных 55-летию сотрудничества ММА им. И.М.Сеченова и здравоохранения Тульской области. Москва - Тула. 2002; С. 300-301

9. S. Ermolaeva, Т. Karpova, S. Novella, et al. A simple method for the differentiation of Listeria monocytogenes based on induction of lecithinase activity by charcoal. Int J Food Microbiol 2003; 82; C.87-94

10. Карпова Т.И., Фирсова Т.Е., Родина Jl.В., Котляров В.М., Тартаковский И.С., Ермолаева С.А. Типирование Listeria monocytogenes на основе полиморфизма генов факторов патогенности. Клин. Микр. Антимикр. Хим. 2003; 3; С.251-258

основанный на определении гидролиза лецитина в присутствии активированного

1

i

i

i

J

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карпова, Татьяна Игоревна

ГЛАВА 2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Особенности биологии и экологии листерий и их значение в распространении пищевого листериоза.

2.1.1 Общая характеристика и таксономия листерий.

2.1.2 Биология возбудителя.

2.1.3 Факторы патогенности листерий и их роль при взаимодействии с макроорганизмом.

2.1.4 Регуляция экспрессии факторов патогенности.

2.1.5 Резистентность к температуре и другим факторам внешней среды.

2.1.6 Листериоз как пищевая инфекция.

2.1.7 Листерии в продуктах питания.

2.2 Методы лабораторной диагностики и идентификации листерий

2.2.1 Серологическая диагностика.

2.2.2 Бактериологическая диагностика.

2.2.3 Идентификация культур.

ГЛАВА 3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Использованные штаммы.

3.2 Микробиологические методы.

3.2.1 Условия культивирования.

3.2.2 Выделение листерий из продуктов питания.

3.2.3 Идентификация клонов, выделенных из продуктов питания бактериологическими методами.

3.2.4 Приготовление сред и определение лецитиназной активности.

3.3 Молекулярно-генетические методы.

3.3.1 Приготовление лизатов клеток листерий для проведения ПЦР.

3.3.2 Полимеразная цепная реакция.

3.3.3 Осаждение продукта ПЦР для последующего анализа.

3.3.4 Рестрикционный анализ (ПЦР-РА).

3.3.5 Приготовление образцов для секвенирования.

ГЛАВА 4 РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1 Размножение листерий в молочных продуктах.

4.2 Отработка методики выделения листерий из продуктов питания.

4.2.1 Проверка различных селективных питательных сред.

4.2.2 Выделение листерий из продуктов питания и дальнейшая идентификация общепринятыми микробиологическими методами.

4.2.3 Идентификация листерий методом ПЦР.

4.3 Разработка метода лецитиназной активности.

4.4 Типирование Listeria monocytogenes на основе полиморфизма генов факторов патогенности.

4.4.1 Анализ штаммов L. monocytogenes в ПЦР.

4.4.2 Рестрикционный анализ фрагмента, полученного в ПЦР.

4.4.3 Определение сайтов изменчивости у полученных групп.

ГЛАВА 5 ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 6 ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация и типирование Listeria monocytogenes на основе особенностей полиморфизма и экспрессии генов факторов патогенности"

Структура инфекционной патологии человека за последние десятилетия двадцатого века претерпела супдественную эволюцию, обусловленную как открытием целого ряда неизвестных ранее инфекционных агентов, так и изменением роли и удельного веса хорошо известных ранее возбудителей. Ко второй группе в полной мере можно отнести листерии. Хотя упомянутые микроорганизмы давно известны эпидемиологам, бактериологам и инфекционистам, в последние годы заметно расширился удельный вес вызываемых ими инфекций, равно как и спектр их клинических проявлений. Этому способствовал, с одной стороны, существенный прогресс в области лабораторной и клинической диагностики, с другой - антропогенная трансформация внешней среды, повлиявшая на условия репродукции возбудителя, пути передачи инфекции и восприимчивость к ним групп риска человеческой популяции, прежде всего, с различными видами иммунодефицитов.Особую актуальность проблеме листериоза придает и то обстоятельство, что это инфекция с пищевым путем передачи. Ежегодно в нашей стране только официально регистрируется около 600 - 700 тысяч случаев кишечных инфекций с пищевым путем передачи. В то же время, это лишь небольшая часть, поскольку отсутствуют или слабо внедряются в практику современные методы лабораторной диагностики ротавирусных инфекций, листериоза, пищевого клостридиоза, кампилобактериоза, криптоспороидоза и др. инфекций. Листериоз из зооноза с весьма ограниченным ареалом распространения в сельской местности, обусловленного непосредственным контактом с больными сельскохозяйственными животными и грызунами, превратился в одну из наиболее значимых пищевых инфекций в мире, выделяющуюся среди других бактериальных инфекций этой группы особо тяжелым течением и высоким Процентом летальных исходов. В основе этой эволюции лежит адаптация листерии к интенсивному размножению в процессе технологической цепочки изготовления и хранения продуктов пищевой индустрии (сыры; различные мясные, куриные и рыбные полуфабрикаты для еды «быстрого приготовления»; салаты и др.), что привело к многочисленным эпидемиям и спорадическим случаям листериоза в экономически развитых странах мира.Анализ эпидемиологической ситуации с листериозом в нашей стране и мире свидетельствует, что в основе эпидемиологического надзора за листериозом должен лежать жесткий регламент содержания Listeria monocytogenes в сырье и продуктах животного происхождения, птице, рыбе в качестве гигиенического требования к качеству и безопасности пищевых продуктов.Заметный прогресс в изучении генетики листерий, в частности, механизмов генетической регуляции экспрессии их факторов патогенности, позволил определить роль различных генов и биологически активных молекул возбудителя на различных этапах взаимодействия с эукариотической клеткой и в патогенезе инфекции в целом.Цель и задачи исследования Цель работы: на основе изучения особенностей полиморфизма и экспрессии генов факторов патогенности разработать методы быстрой идентификации и типирования листерий и включить их в схему оценки микробиологической безопасности продуктов питания.Задачи исследования: 1 Отработать оптимальную методику выделения и получить коллекцию штаммов листерий из продуктов питания.2 Разработать эффективные методы видовой идентификации листерий, используя особенности экспрессии генов факторов патогенности.3 Оценить возможность включения разработанных методов в современную схему мониторинга микробиологической безопасности продуктов питания.4 Разработать метод типирования листерий на основе изучения особенностей геномного полиморфизма.Научная новизна работы: • разработан принципиально новый метод идентификации L. monocytogenes, основанный на выявлении индукции лецитиназной активности в присутствии активированного угля; • с помощью разработанного метода продемонстрирована возможность быстрой и достоверной дифференциации L. monocytogenes от непатогенных листерий на примере коллекции штаммов листерий, выделенных из продуктов питания; • показано, что сочетание лецитиназного теста и полимеразной цепной реакции с видоспецифическими праймерами plcl, р1с2 в настоящее время является наиболее эффективным и надежным способом дифференциации L. monocytogenes от непатогенных листерий; • методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) выявлено существование двух филогенетических линий у вида L. monocytogenes, к первой из которых (тип А) относятся штаммы серогрупп 1/2а, 1/2с, За, а ко второй (типы В и В1) - штаммы серогрупп 1/2Ь, 4Ь, 4d; • впервые продемонстрировано, что последовательность гена prfA^ кодирующего основной регулятор генов патогенности, содержит нуклеотидные замены, консервативные для каждой из филогенетических линий; • впервые проведена оценка частоты встречаемости представителей разных филогенетических линий листерий в зависимости от источника выделения, показавшая преобладание штаммов, относящихся к первой линии, среди пищевых изолятов (72%), в то время как среди клинических изолятов преобладали штаммы, относящиеся ко второй линии (67%); Практическая значимость: - разработанный метод идентификации L. monocytogenes на основании индукции лецитиназной активности в присутствии активированного угля (патент №2196827 от 20.01.2003г) включен в Государственный стандарт и Методические указания МЗ РФ; - разработана система рестрикционного анализа, позволяющая определить принадлежность выделенного штамма листерий к определенной филогенетической линии и оценить его возможную эпидемиологическую значимость.Материалы диссертации доложены на Всероссийской конференции с международным участием «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека» (Москва, 21-23 апреля 1999); IV международной конференции МАКМАХ «Антимикробная терапия» (Москва, 18-21 июня 2001); VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 26-26 марта 2002).Глава 2 Обзор литературы 2.1 Особенности биологии и экологии листерий и их значение в распространении пищевого листериоза

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Карпова, Татьяна Игоревна

ГЛАВА 6 ВЫВОДЫ

1. Впервые в Российской Федерации проведена систематическая оценка уровня контаминации продуктов питания листериями. Выявлено присутствие листерий в 29,6% исследованных продуктов, из них в 26,7 % случаев присутствовал возбудитель листериоза Listeria monocytogenes (8% от общего числа исследованных продуктов), в остальных случаях выявлялись непатогенные Listeria spp.

2. Способность листерий к длительному сохранению и размножению в молоке (до 2 месяцев) показана путем анализа динамики размножения L. monocytogenes в молочных продуктах при различной температуре.

3. Разработан принципиально новый метод дифференциации L. monocytogenes от непатогенных листерий, основанный на определении индукции гидролиза лецитина в присутствии активированного угля, добавляемого в питательную среду.

4. На коллекции штаммов листерий, выделенных из продуктов питания, показано, что сочетание методов определения лецитиназной активности и амплификации с видоспецифическими праймерами к гену plcA является наиболее надежным способом дифференциации L. monocytogenes от непатогенных листерий.

5. Разработан новый метод типирования штаммов L. monocytogenes на основе анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) синтезированного в ПЦР участка хромосомы, содержащего гены патогенности prfA и plcA. Разработанный метод выявляет принадлежность выделенного штамма листерий к определенной филогенетической линии и позволяет определить его потенциальную эпидемиологическую значимость.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карпова, Татьяна Игоревна, Москва

1. Бакулов И.А. Васильев Д.А. Листериоз как пищевая инфекция.

2. Вопросы диагностики и профилактики. Ульяновск. 1991.

3. Бакулов И.А. Листериоз сельскохозяйственных животных. Москва. «Колос» 1967.

4. Гершун В.И. Листериоз сельскохозяйственных животных. Алма-Ата. 1981.

5. Ермолаева С.А. Белый Ю.Ф. Тартаковский И.С. Гинцбург А.Л. Прозоровский С.В. Клонирование и экспрессия фосфатидилинозитол-специфичной фосфолипазы С L. monocytogenes. Мол. Ген. Микробиол. Вирусол. 1995,1; 3-10.

6. Ермолаева С.А. Белый Ю.Ф. Тартаковский И.С. Изменение уровня экспрессии факторов вирулентности Listeria monocytogenes под влиянием внешних условий. Мол.ген.микробиол.вирусол. 2000,1; 17-19.

7. Ермолаева С.А. Генетические механизмы вирулентности Listeria monocytogenes. 2001. Генетика. 37: 286-293

8. Ермолаева С.А. Тартаковский И.С. Регуляция экспрессии факторов вирулентности у Listeria monocytogenes. Журн.микробиол. 2001,3; 106110.

9. Ермолаева С.А., Белый Ю.Ф., Тартаковский И.С. Свидетельства ауторегуляции экспрессии секретируемых белков Listeria monocytogenes. 2000. ЖМЭИ. №5: 3-6

10. Ю.Карликанова Н.Р. Куваева И.Б. Карликанова Н.С. Листерии в молоке и молочных продуктах. Москва-Углич. 1999.п.Костенко Ю.Г. Шагова Т.С. Янковский К.С. Листерии-критерий безопасности мясных продуктов. Мясн. Индустрия. 1997 3; 23-24.

11. Котляров В.М. Проблема листериоза на рубеже тысячелетий. В сб. Листериоз на рубеже тысячелетий. Покров. 1999,48-52.

12. Лабораторная диагностика листериоза животных и людей , меры борьбы и профилактика. Госагропром, МЗ СССР.М.1987.

13. Покровский В.И. Годованный Б.А. Листериоз. В кн. Инфекционные болезни.М.Медицина. 1996 ; 291-296.

14. Рахманова А.Г. Пригожина В.К. Справочник по инфекционным болезням. Раздел.Листериоз. Санкт-Петербург. 1999; 172-174.

15. Родина Л.В. МаненковаГ.М. Степанова Н.В. Тимошков В.В. Салова Н.Я. ШестепероваТ.И. Состояние эпиднадзора за листериозом в г.Москве. В сб. Листериоз на рубеже тысячелетий. Покров. 1999.129131.

16. Салова Н.Я. Голованова В.П.Шестеперова Т.И. Маненкова Г.М.Степанова Н.В. Современное состояние лабораторной диагностики листериоза в санэпидслужбе г.Москвы. В.сб.Листериоз на рубеже тысячелетий. Покров. 1999.68-71.

17. Тартаковский И.С. Листерии:роль в инфекционной патологии человека и лабораторная диагностика. Клин.микробиол. антимикроб.химиотерапия. 2000;2;2:20-30.

18. Честнова Т.В. Эпизоотолого-эпидемиологические аспекты листериоза в Тульской области. Автореферат диссертации кандидата биологических наук ;Тула.1999.

19. Шарма Р.К. Обнаружение листерий в продуктах морей и океанов. В сб.Листериоз на рубеже тысячелетий. Покров. 1999. 97-99.

20. Belyi Y.F. Intracellular parasitism of microorganisms. 1996. Springer-Verlag GmbH&Co.KG.

21. Berrang M.E., Bracket R.E., Beuchat L.R. Growth of Listeria monocytogenes on fresh vegetables stored under controlled atmosphere. 1989. J. Food Prot. 52:702-705.

22. Beuchat L.R., & Bracket R.E. Inhibitory effect of raw carrots on Listeria monocytogenes. 1990. Appl. Environ. Microbiol. 56: 1734-1742

23. Bille J., Catimel B.JBannerman e. et al. API Listeria, a new and promising One Day System to identify Listeria isolates. 1992. Appl. Environ. Microbiol. 58: 1857-1860

24. Bockman R., Dickneite C., Goebel W., Bohne J. PrfA mediates specific binding to RNA polymerase of Listeria monocytogenes to PrfA-dependent virulence gene promoters resulting in a transcriptionally active complex. 2000. Mol. Microbiol. 36: 487-497

25. Breer C., & Schopfer K. Listeria and food. 1988. Lancet ii:1022

26. Brehm K., Ripio M.T., Krefit J., Vazquez-Boland J.A. The bvr locus of Listeria monocytogenes mediates virulence gene repression by pglucosides. 1999. J. Bacteriol. 181: 5024-5032

27. Chakraborty, Т., M. Leimeister-Wachter, E. Domann, et al. Coordinate regulation of virulence genes in Listeria monocytogenes requires the product of the prfA gene. J Bacteriol 1992;174:568-574

28. Centers for Disease Control. Update: multistate outbreak of listeriosis -United States, 1998-1999. 1999. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 47: 1117-1118

29. Centers for Disease Control. Update: multistate outbreak of listeriosis -United States, 1998. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 47: 1085-1086

30. Collins M.D., Wallbanks S., Lane D.J., Shah J., Nietupski R., Smida J., Dorsch M., Stackebrandt E. Phylogenetic analysis of the genus Listeriabased on reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA. 1991. Int. J. Syst. Bacteriol. 41: 240-246

31. Cossart P.,Kocks C. The actin-based motility of the facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes. 1994. Molecular Microbiol., 13:395-402.

32. Dickneite C., Bockmann R., Spory A., Goebel W., Sokolovic Z. Differential interaction of the transcription factor PrfA and the PrfA-activating factor (Paf) of Listeria monocytogenes with targets sequences. 1998. Mol. Microbiol. 27: 915-928

33. Donker-Voet J. Listeria monocytogenes: some biochemical and serological spects. 1972. Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 19: 287-291

34. Ermolaeva S., Belyi Y., Tartakovskii I. Characteristics of induction of virulence factor expression by activated charcoal in Listeria monocytogenes. FEMS Microbiol Lett 1999; 174:137-141

35. Ermolaeva S., Varfolomeeva N., Belyi Y., Tartakovskii I. Isolation and characterization of a Listeria monocytogenes mutant strain hyperproducing virulence factors. 1997. FEMS Microbiol. Lett. 150: 189-195

36. Farber J.M. Listeria monocytogenes. 1991. J.Assoc. Off. Anal. Chem. 74: 701-704

37. Farber J.M., & Peterkin P.I. Listeria monocytogenes, a food-borne patyhogen. 1991. Microbiol. Rev 55: 476-511

38. Farber J.M., Carter A.O., Varughese P.V,. Ashton F.E., Ewan E.P. Listeriosis traced to the consumption of alfalfa tablets and soft cheese (letter). 1990. N. Engl. J. Mde. 322:338

39. Farber J.M., Daley E., Caotes F., Beauoleil N., Fournier J. Feeding trials of Listeria monocytogenes with a nonhuman primate model. 1991. J. Clin. Microbiol. 29: 2606-2608

40. Farber J.M., Peterkin P.I., Carter A.O., Varughese P.V., Ashton F.E., Ewan E.P. Neonatal listeriosis due to cross-infection confirmed by isoenzyme typing and DNA fingerprinting (letter). 1991. J. Infect. Dis. 163: 927-928

41. Farber J.M., Sanders G.W., Johnston M.A. A survey of various foods for the presence of Listeria species. 1989. J. Food Prot. 52: 456-458

42. Fraser J.A., & Sperber W.H. Rapid detection of Listeria spp. in food and environmental samples by esculin hydrolysis. 1988. J. Food. Prot. 51: 762765

43. Freitag N.E., Rong L., Portnoy D. Regulation of prfA transcriptional activator of Listeria monocytogenes: multiple promoter elements contribute to intracellular growth and cell-to-cell spread. 1993. Infect. Immun.61: 2537-2544

44. Fuchs R.S., & Surendran P.K. Incidence of Listeria in tropical fish and fishery products. 1989. Lett. Appl. Microbiol. 9 : 49-51

45. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density responsive transcriptional regulators. 1994. J. Bacteriol. 176: 269-275

46. Garcia J.A., Dominguez L., Briones V., Blanco M., Fernandez-Garayzabal., Suarez G. Revision of antigenic structure of the genus Listeria. 1990. FEMS Microbiol. Lett. 67: 113-120

47. Gaze G.E., Brown G.D., Gaskell D.E., Banks J.G. Heat resistance of Listeria monocytogenes in homogenates of chicken, beef steak and carrot. 1989. Food Microbiol. 6: 251-259

48. Genigergious C.A., Oanca P., Dutulescu D. Prevalence of Listeria spp. in turkey meat at the supermarket and slaughhterhouse. 1990. J. Food Prot. 53: 282-288

49. Gholizadeh Y., Poayrt C., Livin M., Bertti J.L., Croize J., Berche P., Gaillard J.L. Serodiagnosis of listeriosis based upon detection of antibodies against recombinant truncated forms of listeriolysin O. 1996. J. Clin. Microbiol. 34: 1391-1395

50. Glass K.A., & Doyle M.P. Listeria monocytogenes in processed meat products during refrigerated storage. 1989. Appl. Envirn. Microbiol. 55: 1565-1569

51. Glaser P., Frangeul L., Buchrieser C. et al. Comparative genomics of Listeria species. Science 2001; 294:849-852

52. Gouin E., Mengaud J., Cossart P. The virulence gene cluster of Listeria monocytogenes is also present in Listeria ivanovii, an animal pathogen, and in Listeria seeligeri, a nonpathogenic species. 1994. Infect. Immun. 62: 3550-3553

53. Grau F.H., & Vanderlinde P.B. Growth of Listeria monocytogenes on vacuum package beef, p.518-519. In: proceedings of the 34th International Congress of Meat Science and Technology, Part B. Brisbane, Australia

54. Greenwood M.H., Roberts D., Burden P. The occurrence of Listeria species in milk and dairy products: a national survey in England and Wales. 1991. Int. J. Food Microbiol. 12: 197-206

55. Grenningloh R., Darji A., Wehland J., Chakaraborty Т., Weiss S. Listeriolysin and IrpA are major protein targets of the human humoral response against Listeria monocytogenes. 1997. Infect. Immun. 65: 39763980

56. Hayes P.S., Feeley J.C,. Graves L.M., Ajello G.W., Fleming D.W. Isolation of Listeria monocytogenes from raw milk. 1986. Appl. Environ. Microbiol. 51:438-440

57. Hayes P.S., Graves L.M., Ajello G.W. Comparison of cold enrichment and U.S. Department of Agriculture methods for isolating Listeria monocytogenes from naturally contaminated foods. 1991. Appl. Environ. Microbiol. 57:2109-2113

58. Hitchins A.D. FDA Bacteriological Analytical Manual, Listeria monocytogenes. 8th edition, 1995.

59. Jemmi T. Actual knowledge of Listeria in meat and fish products. 1990. Mitt. Geb. Lebens mittelunters. Hyg. 31: 144-157

60. Karches H., & Teufel P. Listeria monocytogenes vorkommen in Hackfleisch und verhalten in frischer Zwiebelmettwurst. 1988. Fleischwirtschaft. 68: 1388-1392

61. Kathariou S., Pine L., George V., Carlone G.M., Holloway B.P. Nonhemolytic Listeria monocytogenes mutants that are also noninvasive for mammalian cells: evidence for coordinate regulation of virulence. 1990. Infect. Immun. 58: 3988-3995

62. Kathariou S., Rocourt J., Hof H., Goebel W. Levels of Listeria monocytogenes hemolysin are not directly proportional to virulence in experimental infection in mice. 1988. Infect. Immun. 56: 534-536

63. Kerr K.G. Rotowa N.A., Hawkey P.M., Lacey R.W. Evaluation of the Mast ID and API 50 CH systems for identification of Listeria spp. 1990. Appl. Environ. Microbiol. 56: 657-660

64. Kleinlein N., Untermann F., Beissner H. Zum vorkommen von Salmonella und Yersinia Spezies sowie Listeria monocytogenes in hackfleisch. 1989. Fleischwirtschaft. 69: 1474-1476

65. Leasor S.B. & Foegeding P.M. Listeria spp. in commercially broken raw liquid whole eggs. 1989. J. Food. Prot. 52: 777-780

66. Leimeister-Wachter M., Domann E., Chakraborty T. The expression of virulence genes in Listeria monocytogenes is thermoregulated. 1992. J. Bacteriol. 174: 947-952

67. Leimeister-Wachter M., Haffner С., Domann E., Goebel W., Chakraborty T. Identification of a gene that positively regulates expression of listeriolysin, the major virulence factor of Listeria monocytogenes. 1990. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 87: 8336-8340

68. Lennon D., Lewis В., Mantell C., Beckroft D., Dove В., Farmer K., Tonkin S., yeates N., Stamp R., Mickleson K. Epidemic perinatal listeriosis. 1984. Pediatr. Infect. Dis. 3: 30-34

69. Lorber B. Listeriosis. 1997. Clin Infect. Dis. 24: 1-11

70. Lou Y. & Yousef A. Adaptation to sublethal environmental stresses protects Listeria monocytogenes against lethal preservation factors. 1997. Appl. Environ. Microbiol. 63: 1252-1255

71. Lovett J. Isolation and identification of Listeria monocytogenes in dairy products. 1988. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71: 658-660

72. Low J.C. & Donachie W. A review of Listeria monocytogenes and listeriosis. 1997. Vet. J. 153: 9-29

73. Lowry P.D., & Tiongt I. The incidence of Listeria monocytogenes in meat and meat products fadctors affecting distribution, p. 528-530. In: Proceedings of the 34th International Congress of Meat Science and Technology, Part B. Brisbane, Australia

74. Mackey B.M., & Bratchell N./ The heat resistance of Listeria monocytogenes. 1989. Lett. Apll. Microbiol. 9: 89-94

75. Mackey B.M., Pritchet C., Norris A., Mead G.C. Heat resistance of Listeria: strain difference and effects of meat type and curing salts. 1990. Lett. Appl. Microbiol. 10: 251-255

76. McBride M.E., & Girard K.F. A selective medium for the isolation of Listeria monocytogenes from mixed bacterial populations. 1960. J. Lab. Clin. Med. 55: 153-157

77. McLauchlin J,. Audurier A., Taylor A.G. The evaluation of a phage-typing system for L.monocytogenes for use in epidemiological studies. 1896. J. Med. Microbiol. 22: 357-365

78. McLauchlin J. Human listeriosis in Britain, 1967-1985, a summary of 72 cases. 1. Listeriosis during pregnancy and in the newborn. 1990. Epidemiol. Infect. 104: 181-189

79. McLauchlin J., Greenwood M.H., Pini P.N. The occurrence of Listeria monocytogenes in cheese from a manufacturer associated with a case of listeriosis. 1990. Int. J. Food. Microbiol. 10: 255-262

80. Mengaud J., Braun-Breton C., Cossart P. Identification of phosphatidylinositol-speciflc phospholipase С activity in Listeria monocytogenes-, a novel type of virulence factor?. Mol Microbiol 1991; 5:367-372

81. Mengaud J., Dramsi S., Gouin E., Vazuqez-Boland J.A., Milon G., Cossart P. Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is autoregulated. 1991. Mol. Microbiol. 5: 2273-2283

82. Papageorgiou D.K., & Marth E.H. Fate of Listeria monocytogenes during the manufacture, ripening and storage of feta cheese. 1989. J.Food Prot. 52: 82-87

83. Park S.F., & Kroll R.G. Expression of listeriolysin and phosphatidyl-inositol specific phospholipase С is repressed by the plant-derived molecule cellobiose in Listeria monocytogenes. 1993. Mol. Microbiol. 8: 653-661

84. Paterson J.S. The antigenic structure of organisms of the genus Listeria. 1940. J. Pathol. Bacteriol. 51: 427-436

85. Peel M., Donachie W., Shaw A. Temperature-dependent expression of flagella of Listeria monocytogenes studied by electron microscopy, SDS-PAGE and Western blotting. 1988. J. Gen. Microbiol. 143: 2171-2178

86. Pine L., Malcolm В., Brooks J.B., Daneshvar M.I. Physiological studies on the growth and utilization of sugars by Listeria species. 1989. Can. J. Microbiol. 35: 245-254

87. Pine L., Weaver R.E, Carl one G.M., et al. Listeria monocytogenes ATCC35152 and NCTC7973 contain a nonhemolytic, nonvirulent variant. J Clin Microbiol 1987; 25:2247-2251

88. Pini P.M., & Gilbert R.J. The occurrence in U.K. of Listeria species in rawchickens and soft cheese. 1988. Int. Food Microbiol. 6: 317-326

89. Pinner R.W., Schuchat A., Swaminathan B. et al. Role of foods in sporadiclisteriosis. II. Microbiologic and epidemiologic investigation. 1992. JAMA.267: 2046-2050

90. Portnoy D.A. Innate immunity to a facultative intracellular bacterial pathogen. 1992. Curr. Opn. Immunol. 4: 20-24

91. Rasmussen O.F., Skouboe P., Dons L., et al. Listeria monocytogenes exists in at least three evolutionary lines: evidence from flagellin, invasive associated protein and listeriolysin О genes. Microbiology 1995; 141: 20532061

92. Rocourt J. Listeria monocytogenes: the state of the art. 1994. Dairy Food Environ. Sanitation 14: 70-82

93. Rodriguez L.D., Vazquez-Boland J.A., garayazabal J.F.D., Tranchant P.E., Gomez-Lucia E., Ferri E.F.R., Fernandez G.A. Microplate technique to determine hemolytic activity for routine typing of Listeria strains. 1986. J. Clin. Microbiol. 24: 99-103

94. Ryser E.T. Foodborne listeriosis, p. 299-358. In: E.T.Ryser and E.H. Marth (ed.) Listeria, listeriosis and food safety. 2nd ed. 1999. Marcel Dekker Inc. New York, NY

95. Ryser E.T.& E.H. Marth (ed.) Listeria, listeriosis and food safety. 2nd ed. 1999. Marcel Dekker Inc. New York, NY

96. Ryser E.T., & Marth E.H. Fate of Listeria monocytogenes during the manufacture and ripening of Camambert cheese. 1987. J. Food Pro. 50: 372-378

97. Schuchat A., Deaver K.A., Wenger J.D. et al. Role of foods in sporadic listeriosis. I. Case-control study of dietary risk factors. 1992. JAMA. 267: 20412045

98. Schuchat A., Swaminathan В., Broome C.V. Epidemiology of human listeriosis. 1991. Clin. Microbiol. Rev. 4: 169-183

99. Seeliger H.P.R. & Hohne K. Serotyping of Listeria monocytogenes and related species, p.31-49. In: T.Bergan and J.R.Norris (ed.). 1979. Methods in microbiology, vol 13. Academic Press, Inc., New York, NY

100. Seeliger H.P.R. & Jones D. Genus Listeria, p. 1235-1245. In: Sneath P.H.A., Mair N.S., Sharpe M.E., Holt J.G. Bergey's manual of Systematic bacteriology. 9th Ed. Vol.2. 1986. Williams and Wilkins, Co., Baltimore. MD

101. Seeliger H.P.R. Listeriosen. 1958. Springer-Verlag KG, Berlin

102. Seeliger H.P.R. Listeriosis history and actual development. 1988. Infection. 16: S80-S84

103. Seeliger H.P.R. Listeriosis. 1961. Karger, New York, NY

104. Sheehan В., Klarsfeld A., Ebright R., Cossart P. A single substitution in the putative helix-turn-helix motiv of the pleiotropic activator PrfA attenuates Listeria monocytogenes virulence. 1996. Mol. Microbiol. 20: 785-797

105. Slutsker L., Evans M.C., Schuchat A. 2000 Listeriosis, p. 83-106. In: Emerging Disease 4. W.M.Scheld, W.A.Craig, J.M.Hughes (ed.). ASM Press, Washington, D.C.

106. Smith J.L., & Archer D.L. Heat-induced injury in Listeria monocytogenes. 1988. J. Ind. Microbiol. 3: 105-110

107. Smola J. Possibilities of differentiation of listerial hemolysins by synergistic hemolytic reactions (CAMP reaction). 1989. Int. J. Food Microbiol. 8: 265-267

108. Steinbrugge E.G., Maxcy R.B., Liewen M.B. Fate of Listeria monocytogenes on ready to serve lettuce. 1988. J. Food Prot. 51: 596-599

109. U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological analytical manual, chapter 29 Listeria isolation; revised methods of analysis:notice. 1988. Fed. Registr. 53: 44147-44153

110. Vazquez-Boland J.A., Dominguez L., Fernandez-Garayzabal J.F., Suarez G. Listeria monocytogenes CAMP reaction. 1992. Clin. Microbiol. Rev. 5: 343

111. Vazquez-Boland J.A., Dominguez-Bernal G., Gonzalez-Zorn В., Kreft J., Goebel W. Pathogenicity islands and virulence evolution in Listeria. 2001. Microb. Inf. 3: 571-584

112. Vazquez-Boland J.A., Kuhn M., Berche P., Chakraborty Т., Dominguez-Bernal G., Goebel W., Gonzalez-Zorn В., Wehland J., Kreft J. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. 2001. Clin. Microbiol. Rev. 14: 584-640

113. Weaver R.F. Morphological, physiological, and biochemical characterization, p. 39-43. In: James G.L. (ed.) Isolation and identification of Listeria monocytogenes. 1989. US Department of Health and Human Services, CDC, Atlanta

114. Wenger J.D., Pinner R., Schuchat A., Pierce R., Broome C.V. 1990. Epidemiology of human listeriosis, abstr. S-45, p.324. Program Abstr. 30th Intersci. Conf. Antimicrob. Agents Chemother. ASM, Wachington, D.C.

115. Wiedmann M., Bruce J.L., Keating C., Johnson A.E., McDonough P.L., Batt C.A. Ribotypes and virulence gene polymorphism suggest three distinct Listeria monocytogenes lineages with differences ni pathogenic potential. 1997. Infect. Immun. 65:2707-2716

116. Wimpfheimer L., Altman N.S., Hotchkiss J.H. Growth of Listeria monocytogenes and competitive spoilage organisms in raw chicken packaged under modified atmosphere and in air. 1990. Int. J. Food Microbiol. 11:205-214