Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация патогенных листерий с помощью полимеразной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жаргалова, Туяна Тумуржаповна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Эпизоотическая и эпидемическая ситуация по листериозу.

2.2. Общая характеристика возбудителя листериоза.

2.2.1. Факторы патогенности возбудителя листериоза.

2.3. Патогенез и клинические проявления болезни.

2.4. Диагностика листериоза.

2.4.1. Классификация методов типирования листерий.

2.4.2. Фенотипические методы типирования листерий.

2.4.3. Идентификация возбудителя листериоза на основе анализа генома.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация патогенных листерий с помощью полимеразной цепной реакции"

Листериоз является широко распространенной инфекционной болезнью, наносящей значительный ущерб животноводству и представляющей серьезную угрозу здоровью людей. Сложность борьбы с этой инфекцией обусловлена особенностями биологии ее возбудителя, наличием большого числа как патогенных, так и непатогенных штаммов, недостаточной изученностью генома и антигенной структуры микробных клеток.

Необходимо отметить, что листериоз является сапронозной инфекцией, при которой вегетативные клетки листерий могут переходить в L -формы, а также в некультивируемое состояние.

Основным источником возбудителя листериоза являются сельскохозяйственные животные- овцы, свиньи и крупный рогатый скот. Длительное бактерионосительство среди животных приводит к высокому уровню обсеменения листериями пищевого сырья, продуктов его переработки.

Доминирующим является алиментарный способ заражения ,который в основном связан с употреблением контаминированных продуктов питания. Анализ случаев заболеваний людей листериозом показал, что в основном болезнь наблюдается у лиц группы риска, со сниженной резистентностью организма (беременные, пожилые, новорожденные дети).

Факторами передачи при пищевой листериозной инфекции служат: молоко и молочные продукты -41,8%; мясо скота и птицы- 32,2%; овощи и салаты- 10,0%; продукты моря (рыба, креветки, морская капуста и др. -8,0;).

По данным Котлярова В.М. , Бакулова И.А. и Красовского с соавт. (1999 г.) культуры листерий выделяются с частотой 5,3% из воды; 15%- в стоках животноводческих комплексов; 10%- в почве.

Котляров В.М. с соавт. показали, что листериями были контаминированы 7,8% проб молока и молочных продуктов, 8,8% мясных и рыбных изделий; 6,3% полуфабрикатов из овощей. В 2,7% возбудитель был выявлен в смывах с элементов холодильного и торгового оборудования.

Широкий спектр восприимчивых животных, а также людей, способность листерий длительное время сохраняться во внешней среде и продуктах питания определяют необходимость дальнейшего изучения природы возбудителя с целью разработки новых, более чувствительных и специфичных средств и методов идентификации патогенных листерий.

В настоящее время для выявления и идентификации возбудителя листериоза широко используют микробиологические, серологические и биохимические методы, определение чувствительности к бактериофагам, а также постановку биопробы на лабораторных животных. Продолжительный по времени, комплексный характер исследований при идентификации направлен на то, чтобы исключить диагностические ошибки, которые могут иметь место из-за таксономической схожести представителей бактерий рода листерий.

Эффективные диагностические препараты для определения листерий могут быть созданы на основе разработки серологических методов с использованием моноклональных антител, а применение генетических методов позволит разработать лабораторные тесты, позволяющие точно дифференцировать патогенные штаммы листерии от непатогенных штаммов.

Длительность, трудоемкость, недостаточная специфичность и чувствительность применяемых в настоящее время методов диагностики заставляет исследователей обратить особое внимание на разработку и внедрение в лабораторную практику новых высокочувствительных и специфичных методов идентификации генома возбудителя листериоза, позволяющих надежно выявлять листерии в объектах ветеринарного надзора.

Для идентификации патогенных листерий в мировой практике применяют такие высокочувствительные методы анализа генома, как ДНК-фингерпринт, включающие рестрикционный анализ, блот-гибридизацию, риботипирование, электрофорез в пульсирующем поле, а также метод полимеразной цепной реакции. Указанные методы позволяют, прежде всего, выявлять не фенотипическое проявление, а непосредственно исследовать молекулярную структуру генома, выявлять генетическую вариабельность, устанавливать генетическую взаимосвязь штаммов и изолятов возбудителей, выделенных в разных регионах.

В настоящее время в развитых странах индикацию возбудителя листериоза включили в государственную систему микробиологического контроля качества продуктов питания и разработан комплекс диагностико-профилактических мероприятий для предотвращения заражения патогенными листериями людей из группы риска.

В связи с вышеизложенным назрела необходимость проведения работ по идентификации возбудителя листериоза в объектах окружающей среды-воде, почве, образцах патматериалов сельскохозяйственных животных, пищевом сырье, продуктах питания, смывах холодильного и торгового оборудования, а также в клинических материалах от больных людей.

Цель и задачи исследований. Основной целью данной работы явилась идентификация патогенных листерий в клинических материалах и продуктах питания с помощью полимеразной цепной реакции.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Подобрать специфические праймеры для избирательной амплификации фрагментов генома патогенных листерий и оптимизировать условия постановки ПЦР;

2. Провести оценку диагностической ценности полимеразной цепной реакции при анализе клинических образцов, продуктов питания и сырья животного происхождения.

3. Охарактеризовать геномы различных штаммов Listeria monocytogenes и непатогенных листерий методом RAPD-fingerprint.

Научная новизна. Экспериментально доказана возможность использования метода RAPD-fingerprint для изучения геномного полиморфизма различных штаммов листерий.

Установлено наличие в хромосомной ДНК гипервариабельных последовательностей, детектируемых универсальными праймерами, комплементарными вариабельной последовательности, расположение которых имеет родовую, видовую и штаммовую специфичность.

Определены оптимальные условия проведения полимеразной цепной реакции для идентификации патогенных листерий в клинических образцах и продуктах питания.

Практическая значимость работы. Полученные результаты и разработанные методы используются: для идентификации патогенных листерий в клинических образцах и продуктах питания; для дифференциации различных видов листерий. По результатам экспериментов разработаны и утверждены директором института методические указания, которые используются в научно-исследовательской и ветеринарной практике.

Положения, выносимые на защиту.

1). Выявление ДНК возбудителя L. monocytogenes методом ПЦР в клинических образцах, продуктах питания с использованием праймеров, комплементарных генам вирулентности.

2). Результаты исследований по определению геномного полиморфизма различных штаммов листерий методом RAPD-fingerprint.

Апробация результатов исследований. Результаты проделанной работы доложены и одобрены Ученым Советом ВНИИВВиМ, опубликованы в сборниках трудов научных конференций Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии (г.Покров, 2000,2001,2002гг.).

Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. 8

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1999-2002 г.г. во ВНИИВВиМ в соответствии с утвержденными плановыми заданиями Россельхозакадемии.

В выполнении отдельных разделов работы принимали участие старший научный сотрудник лаборатории «Биофизики» ВНИИВВиМ, кандидат биологических наук, Цыбанова Л.Я., научный сотрудник лаборатории «Биофизики», кандидат ветеринарных наук, Колбасов Д.В., и.о. заведующего лабораторией «Бактериологии» ВНИИВВиМ, Фирсова Т.Е., доцент кафедры микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Бурятской государственной сельскохозяйственной академии имени В.Р. Филиппова кандидат ветеринарных наук Муруева Г.Б., которым автор выражает искреннюю признательность.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Жаргалова, Туяна Тумуржаповна

6. ВЫВОДЫ

1. Установлено, что препараты ДНК возбудителя листериоза специфически амплифицируются с использованием праймеров, комплементарных гипервариабельным последовательностям хромосомной ДНК, расположение которых в геноме листерий имеет родовую и штаммовую специфичность.

2. Отработаны оптимальные условия постановки полимеразной цепной реакции с праймерами, комплементарными последовательностям гена листериолизина возбудителя листериоза, позволяющие при температуре отжига 55°С выявлять ДНК патогенных штаммов возбудителя листериоза.

3. Разработанная модификация ПЦР с использованием указанных праймеров позволяет обнаружить ДНК патогенных штаммов возбудителя листериоза в бульонных культурах в концентрации 10-100 КОЕ50/мл.

4. При исследовании клинических образцов больных людей и проб патологического материала животных патогенные листерии обнаружены методом ПЦР в пробах фекалий, смывах слизи и абортированных плодах.

5. Установлено, что процент контаминации листериями свежевыловленного, слабосоленого и копченого омуля составил 0,1%; 12% и 3-4% соответственно. Больше всего листерии содержит рыба, выловленная в реках вблизи крупных поселков и животноводческих ферм, куда чаще спускают сточные воды.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жаргалова, Туяна Тумуржаповна, Щелково

1. Анализ деятельности центров Госсаннадзора РФ по лабораторной диагностике листериоза. Инф. сборник статистических и аналитических материалов, раздел 2 (составители Л.Г. Подунова, А.А. Ясинский, Э.Ф. Опочинский и др.).- Москва.- 2000 Г.-С.25-30.

2. Бакулов И.А. Листериоз сельскохозяйственных животных.//Москва.-1967 г.

3. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Листериоз как пищевая инфекция.//Ульяновск,- 1991 г.

4. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Пищевой листериоз- новое направление известной болезни.//Вестник РАСХН.- 1995,- №2.- С. 69-72.

5. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Бактериологический контроль пищевых продуктов на наличие листерий.//Ульяновск.- 1999 г.

6. Бакулов И.А., Кольпикова Т.И., Васильев Д.А., А.В. Меркулов, В.М. Котляров В.М. Практическое применение листериозных фагов.// Ульяновск.- 1998 г.

7. Гершун В.И. Экология возбудителей сапронозов// Москва.-1988.-С.80-84.

8. Гинцбург А.Г., Шагинян И.А. Геномный полиморфизм возбудителей бактериальных инфекций.// Молек.ген.мик.вир.- 1991.- N 12.- С. 3-9.

9. П.Дейвис К. Анализ генома. Методы.// Москва.- Мир,- 1990.

10. Ермолаева С.А., Ю.Ф. Белый, И.С. Тартаковский. Авторегуляция экспрессии секретируемых белков у Lesteria monocytogenes.//)KM3H.-2000,.-№5.- С.3-6.

11. Книзе А.В., Бузун А.И., Шарма Р.К. Эпизоотическая ситуация по листериозу в странах мира и России.// Международный симпозиум «Листериоз на рубеже тысячелетий».- Покров.- 1999.- С. 118-123.

12. Красовский В.В., Надтока . В.Л., С.И. Похил. Листериозное бактерионосительство: метод санации.// ЖМЭИ.- 2000.- №3.- С. 1820.

13. Красовский В.В. , Н. В. Васильев, С.А Деркач, С.И Похил. Итоги пятилетнего изучения листериоза на Украине.// ЖМЭИ.- 2000.- №3.-С. 18-20.

14. Кольпикова Т.Н., В.М. Котляров, Т.Е. Фирсова Опасна ли Listeria innocua? И Международный симпозиум «Листериоз на рубеже тысячелетий».- Покров.- 1999.- С. 138-140.

15. Лабораторная диагностика листериоза.// Москва.- 1987.

16. Литвин В.Ю., Гинсбург А.Л., Пушкарева В.И.// Эпидемиологические аспекты экологии бактерий.- Москва.- 1998.

17. Радчук Н.А., Морозов Т.И., Лорутина В.В. О выделении листерий при эндометритах у коров//Сб. научн. трудов Ленинградского, ветер, института.- 1990.- 107.- СЛ 07-109.

18. Романова JI.B., Мишанкин Б.Н.,Сучков И.Ю. Полимеразная цепная реакция: генотипический скрининг штаммов Fran.tularensis с использованием неспецифических праймеров.// Биотехнология.-1993.-N 6.-С. 8-9.

19. Рысков А.Р., Джинчарадзе А.Г., Просняк М.И. Геномная "дактилоскопия" организмов различных таксономических групп. Использование в качестве гибридизационной пробы ДНК фага М-13. // Генетика.-1988,-N2.-С. 227-238.

20. Савельева Л. Д. Автореферат диссертации. Усовершенствование методов лабораторной диагностики листериоза.// Саратов.- 1999.

21. Середа А.Д., Котляров В.М., Воробьев А.А., Бакулов И.А. Иммунитет при листериозе.//ЖМЭИ.- 2000.- №5.- С. 98-102

22. Столярова Л.Г., Стришков Д.Е. Антибиотики и химиотер.- 1997.-№3.- С.25-30.

23. Шагинян И.А, Романова Ю.М, Уткин В.В и др. Изучение геномного полиморфизма штаммов Shigella Flexneri, изолированных в разных географических регионах.//Мол.ген.микроб.и вирус. -1993.-N 1.-С. 8.

24. Шагинян И.А.,Ананьина Ю.В.,Токарская О.Н. Геномная " дактилоскопия " возбудителей сапронозов.// Журн.микробиол.- 1991. N 6.-С. 25-31.

25. Шагинян И.А., Токарская О.Н., Грижебовский Г.М.// Современные направления медицинских диагностикумов.-Москва.-1990.-С.80-85.

26. Шубин Ф.Н., Сибирцев Н.Т., Рассказов В.А. Плазмиды Yersinia pseudotuberculosis и их значение в реализации эпидемического процесса при псевдотуберкулезе.// Ж.микробиологии.-1985.- N 12.- С.53-56.

27. Шустрова Н.М., Гордейко В.А. Потенциально патогенные бактерии в природе.//Москва.- 1991.- С.96-101.

28. Тимченко Н.Ф. , Булгаков В.П., Булах Е.В., Яснецкая Е.Г., Журавлев Ю.Н. Взаимодействие Yersinia, Listeria, Salmonella с растительными клетками.// ЖМЭИ.- 2000.- №1.- С.6-10.

29. Agersborg A., Dahl R., Martinez I. Sample Preparation and DNA Extraction Procedures for Polymerase Chain-Reaction Identification of Listeria-Monocytogenes in Seafoods//Inter.J.Food. Microbiology.-1997.- V. 35.- n.3.- p. 275-280.

30. Bansal N.S., Mcdonell F., Smith A., Arnold G., Ibrahim G.F. Multiplex PCR Assay for the Routine Detection of Listeria in Food// Inter.J.Food Microbiology.-1996.- V.33.- n.2-3.- p.293-300.

31. Batt C.A. Molecular Diagnostics for Dairy-Borne Pathogens.//J.Dairy Science.-1997.- v.80.- n.l.- p.220-229.

32. Belgrader P; Benett W; Hadley D; Long G; Mariella R Jr; Milanovich F; Nasarabadi S; Nelson W; Richards J; Stratton P Rapid pathogen detection using a microchip PCR array instrument.// Clin Chem.- 1998.- V.44.-n.l0.-p. 2191-2194.

33. Beyer W; Gluckner P; Otto J; Behm R Title A nested PCR method for the detection of Bacillus anthracis in environmental samples collected from former tannery sites//. Microbiol. Res.- 1995.- V.150.- n.2.- p.179-186.

34. Blais B.W., Turner G., Sooknanan R., Malek L. A Nucleic-Acid Sequence-Based Amplification System for Detection of Listeria-Monocytogenes Hlya Sequences//Appl.Environ.Microbiology.- 1997.-V.63.-n. 1.-p. 310-313.

35. Bickley J., Short J., McDowell D., Parkers H. Polymerase chain reaction detection of Listeria monocytogenes in diluted milk and reversal of PCR inhibition caused by calcium ions// Lett.Appl. Microbiol.- 1996.-V.22.-p.153-8.

36. Boerlin P., Boerlinpetzold F., Bannerman E., Bille J., Jemmi T. Typing Listeria-Monocytogenes Isolates from Fish Products and Human1.steriosis Cases//Appl.Environ.Microbiology.- 1997.- V.63.- n.4.- p. 1338-1343.

37. Brosch R, Buchrieser C, RocourtJ: Subtyping of Lis term monocytogenes serovar 4b by use of low-frequency-cleavage restriction endonucleases and pulsed-field gel electrophoresis//. Res. Microbiol.- 1991.-V.142.-p. 667-675.

38. Cooper G.L. An encephalitic form of Listeriosis in broiler chickens//. Avian Dis.- 1989.-V.33.-p. 182-185.

39. Comi G., Cocolin L., Cantoni C., Manzano M. A Re-PCR Method to Distinguish Listeria-Monocytogenes Serovars//FEMS Immun.Med.Microbiol.-1997.- V.18.- n.2.- p. 99-104.

40. Curtis G.D. A selective differential medium for the isolation of Listeria monocytogenes.//Lett.Appl.Microbiol.- 1989.- v.8.-p.95-98.

41. Danielsson-Tham M-L, Bille, Brosch K, Buchrieser C, Persson K, RocourtJ, Schwarzkopf A, Tham W, Ursing J: Characterization of Listeria strains isolated from soft cheese// Int. J. Food Microbiol.- 1993.- IS.- p.161-166.

42. Dalton C.B.,Austin C.C.,Sobel J., Hayes P., Bibb W., Graves L., Swamina- than В., Proctor M., Griffin P. An Outbreak of Gastroenteritis and Fever Due to Listeria Monocytogenes in Milk.// New Engl.J. Medicine.- 1997.-V.336.-n.2.-p. 100-105.

43. Darji A., Chakraborty Т., Wehland J., Weiss S. Listeriolysin Generates a Route for the Presentation of Exogenous Antigens by Major

44. Histocompatibility Complex Class-I//Eur.J.Immunology.-1995.- V.25.-n.lO.-p. 2967-2977.

45. DramsiS., DehouxP., LebrunM., Goossens P., Cossart P. Identification of 4 New Members of the Internalin Multigene Family of Listeria-Monocytogenes// Infect.Immunity.- 1997.-V.65.-n.5.-p. 1615-1625.

46. Duvall R.E., Hitchins A. Pooling of Noncollaborative Multilaboratory Data for Evaluation of the Use of DNA-Probe Test Kits in Identifying Listeria-Monocytogenes Strains.//J.Food Protection.-1997.- V.60.- n.8.- p. 995-997.

47. Ericsson H, Ekltiw A, Danielsson-Tham M-L, Loncarevic S, Mentzing L-O, Persson I, Unnerstad H, Tham W: An outbreak of listeriosis suspected to have been caused by rainbow trout.// J. Clin. Microbiol.-1997.-V.3 5.-p.2904-2907.

48. Ericsson H., Stalhandske P. PCR Detection of Listeria-Monocytogenes in Gravad Rainbow-Trout// Inter.J.Food. Microbiology.-1997.- V.35.- n.3.- p. 281-285.

49. Ermolaeva S.A., Belyi Yu.F., Tartakovsky I.S.// FEMS Microbiol.Lett.-1999.-V.174.- p.134-141.

50. Erlandson K., Batt C.A. Strain-Specific Differentiation of Lactococci in Mixed Starter Culture Populations Using Randomly Amplified Polymorphic DNA-Derived Probes//Appl.Environ.Microbiology.-1997.-V.63.- n.7.- p. 2702-2707.

51. Farber J.M, Peterkin P.I: Listeria monocytogenes, a Food-Borne Pathogen//. Microbiol. Reviews.- 1991.-55.- p. 476-511

52. Frankel F.R., Hegde S., Lieberman J., Paterson Y. Induction of Cell-Mediated Immune-Responses to Human-Immunodeficiency-Virus Type-1

53. GAG Protein by Using Listeria-Monocytogenes as a Live Vaccine Vector//J.Immunology.- 1995.- V.155.- n.10.- p.4775-4782.

54. Graham T.A., Golsteynthomas E., Thomas J.E., Gannon V. Interspecies and Intraspecies Comparison of the 16S-23S Ribosomal-RNA Operon IntergenicSpacerRegionsof 6 Listeria spp.//Inter.J.Syst.Bacteriology.~ 1997.- V.47.- n.3.- p.863-869.

55. Harwood D.G. Listeriosis in goats// Goat Veter. Soc. J.- 1989.- V.10.- p. 14.

56. Hacker J., Blumoehler G., Muhldorfer I., Tschape H. Pathogenicity Islands of Virulent Bacteria Structure, Function and Impact on Microbial Evolution//Mol.Microbiology.-1997.- V.23.- n.6.- p.1089-1097

57. Herman L. Detection of Viable and Dead Listeria-Monocytogenes by PCR// Food Microbiology.-1997.- V. 14.- n.2.- p. 103-110.

58. Husu J.R. Epidemiological studies on the occurence of Listeria monocytogenes in the faeces of dairy cattle// J. Vet. Med.- 1990.- V.37.-p.276-282.

59. International Dairv Federation: International Provisional IDF Standard 143:1990. Detection of Listeria monocytogenes. IDF//Square Vergote 41, B-1040.- Brussels.- Belgium.-1990.

60. Karch H., Schwarzkopf A. and Schmidt H. Amplification methods in diagnostic bacteriology (selected examples) //. J. Microbiol. Meth.-1995.- V. 23.-p. 55-73.

61. Kempf I. DNA amplification methods for diagnosis and epidemiological investigations of avian mycoplasmosis. // Acta Veterinaria Hungarica.-1997.- V.45.- n.3.- p.373-386

62. Laberge I., Blais В., Pandian S. Detection of Listeria-Monocytogenes Inoculated in Dairy Products by Ampliscript (TM)//Food Microbiology.- 1997.- V.14.- n.3.- p. 283-290 .

63. Lei X.H., Promadej N., Kathariou S. DNA Fragments from Regions Involved in Surface-Antigen Expression Specifically Identify Listeria

64. Monocytogenes Serovar-4 and a Subset Thereof Cluster lib (Serotypes 4B, 4D, and 4E) // Appl.Environ.Microbiology.-1997.- V.63.- n.3.- p. 1077-1082.

65. Loncarevic Semir. Listeria monocytogenes with special reference to Food product sand Human listeriosis. //Doctorial thesis, Swedish University of Agricultural Sciences.- Uppsala.- 1998.

66. Loessner M., Scherer S. Organization and Transcriptional Analysis of the Listeria Phage A511 Late Gene Region Comprising the Major Capsid and Tail Sheath Protein Genes Cps and TSH//J.Bacteriology.- 1995.- V.177.-n.22.-p. 6601-6609

67. Manzano M., Cocolin L., Ferroni P., Cantoni C., Comi G. A Simple and Fast PCR Protocol to Detect Listeria-Monocytogenes from Meat//J.Sci.Food Agriculture.-1997.- V.74.- n.l.- p. 25-30.

68. Makino-S Iinumaokada-Y Maruyama-T Ezaki-T Sasakawa-C Yoshikawa-M. Direct Detection of Bacillus-Anthracis DNA in Animals by Polymerase Chain-Reaction.// J.Clin. Microb.- 1993.- V.31.- p. 547-551.

69. Miller M.A., Skeen M., Ziegler H. Nonviable Bacterial-Antigens Administered with IL-12 Generate Antigen-Specific T-Cell Responses and Protective Immunity Against Listeria-Monocytogenes//J.Immunology.-1995V.155.- n.10.- p. 4817-4828

70. Peters M., J. Pohlenz, K. Jaton, B. Ninet, J. Bille Studies of the Detection of L. monocytogenes by Culture and PCR in Cerebrospinal Fluid samples from Ruminants with Listeria Encephalitis// J.Vet. Med.- 1995.- V.42.-p.84-88.

71. Rebiere Y. Epidemie de Listeriose - France - Ete 1993// Bilan au ler decembre 1993. Jet - Le bull. d'Epiter.- 1994.- V. 7.- n.l.- p. 8-11.

72. Reif-TC Johns-M Pillai-SD Carl-M Identification of Capsule-Forming Bacillus-Anthracis Spores with the PCR and a Novel Dual-Probe Hybridization Format//Appl.Environ. Microbiology.- 1994.- V.60.- p. 1622-1625

73. Renzoni A., Klarsfeld A., Dramsi S., Cossart P. Evidence That Prfa, the Pleiotropic Activator of Virulence Genes in Listeria-Monocytogenes, Can Be Present But Inactive//Infect.Immunity.-1997.- V.65.- n.4.- p. 15151518

74. Rivas A.L., Gonzalez R., Weidmann M., Bruce J., Cole E., Bennett G., Batt C.Diversity of Streptococcus-Agalactiae and Staphylococcus-Aureus Ribotypes Recovered from New-York Dairy Herds.//Amer.J.Veter. Research.-1997.- V.58.- n.5.- p. 482-487.

75. Rorvik L.M, Caugant D.A, Yndestad M: Contamination pattern of Lisleria monocytogenes and other Listeria spp. in a salmon slaughterhouse and smoked salmon processing plant.// Int. J. Food Microbiol.- 1995.- V.25.-p. 19-27.

76. Ryser E.T., Arimi S., Donnelly C. Effects of pH on Distribution of Listeria Ribotypes in Corn, Hay, and Grass-Silage.//Appl.Environ.Microbiology.- 1997.- V.63.- n.9.- p. 3695-3697.

77. SaitoA., SawadaT., TokumaruY., Hondo R. Discrimination of Listeria-Monocytogenes Strains of Serotype 4B by Restriction Enzyme Analysis of Chro- mosomal DNA.//Jap.J.Med.Sci.Biology.-1997.- V.50.- n.2.- p. 6371.

78. Safley S., Jensen P., Reay P., Ziegler H. Mechanisms of T-Cell Epitope Immunodominance Analyzed in Murine Listeriosis//J.Immunology.-1995.- V.155.- n.9.- p. 4355-4366.

79. Terplan G. Bedeutung der Listerien fur die Milchwirtsch.// Dt. Milchwirtsch.- 1990.-V. 41.- n.6.-p. 168-169

80. Unnerstad H., A. Romell, H. Ericsson, M.-L. Danielsson-Tham and W. Tham. Listeria monocytogenes in Faeces from Clinically Healthy Daiiy Cows in Sweden//Acta Vet. Scand.-2000.- V.41.- p.167-171.

81. Vaneechoutte M., Yaneldere J. The Possibilities and Limitations of Nucleic-Acid Amplification Technology in Diagnostic Microbiology// J .Med. Microbiology.- 1997.-V.46.- n.3.- p. 188-194.

82. Wesley I.V., Bryner J.H., Van der Maaten Effects of dexamethasone on shedding of L. monocytogenes in dairy cattl//. Am. J. Veter. Research.-1989.-V.50.-p. 2000-2013.

83. Wiedman M., T. Arvik, J. Bruce, J. Neubauer et al. Investigation of a listeriose epizootic in sheep in New York state// Amer. Journ. Vet. Research.-1997.- v. 58.- N.7.-p.78-80.

84. Wu F.M., Muriana P. Genomic Subtraction in Combination with PCR for Enrichment of Listeria Monocytogenes Specific Sequences.// Inter.J.Food Microbiology.- 1995.- V.27.- n.2-3.- p.161-174.

85. Zheng W., Kathariou S. Host-Mediated Modification of Sau3Ai Restriction in Listeria-Monocytogenes Prevalence in Epidemic-Associated Strains//Appl. Envir.Microbiology.-1997.- V.63.- n.8.- p.3085-3088.

86. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

87. ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ1. УТВЕРЖДАЮ

88. Директор ВНИИ ветеринарной и микробиологии фзак^гемии1. В.М. Котляров 2002 г.

89. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛИСТЕРИОЗА МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ1. Покров 2002 г.1. АКТкомиссионных испытаний набора препаратов для выявления ДНК возбудителя листериоза методом полимеразной цепной реакции

90. ОСНОВАНИЕ: Выполнение НИР по темам «Г-10», «01.01.03.» и указание директора ВНИИВВиМ №14 от 27 августа 2001 г.

91. Оценить чувствительность и специфичность «Набора препаратов.» для обнаружения ДНК патогенных листерий методом ПНР.

92. Результаты испытаний представлены в прилагаемом протоколе.2. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

93. Чувствительность «Набора препаратов.» при амплификации 10-кратных разведении бульонной культуры патогенного референс штамма L.monocytogenes 766 составила 10 100 КОЕ 50/мл.

94. Основные этапы исследований представлены в проекте

95. Методических указаний по выявлению ДНК возбудителя листериоза методом ПЦР»1. ПРЕДЛОЖЕНИЯ

96. Представить акт комиссионных испытаний «Набора препаратов по выявлению ДНК возбудителя листериоза методом ПЦР» на рассмотрение Ученого совета ВНИИВВиМ и директора института.

97. Провести межведомственные комиссионные испытания «Набора препаратов .» с целью его практического применения в схеме диагностики листериоза.

98. Председатель Члены комиссии: