Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некультивируемые формы иерсиний и листерий в почве и при взаимодействии с растениями

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Некультивируемые формы иерсиний и листерий в почве и при взаимодействии с растениями"

На правах рукописи

ЕМЕЛЬЯНЕНКО Елена Николаевна

НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ФОРМЫ ИЕРСИНИЙ И ЛИСТЕРИЙ В ПОЧВЕ И ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С РАСТЕНИЯМИ

03.00.07— Микробиология 14.00.30— Эпидемиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва^ 1997

Работа выполнена в научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Научные руководители: доктор биологических наук В. И. Пушкарева доктор биологических наук, профессор А. Л. Гинцбург

Официальные оппоненты: академик РАМН, профессор И. В. Тарасевич доктор медицинских наук, профессор Е. А. Ведьмина

Ведущая организация: Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии МЗ РФ.

Зашита диссертации состоится «¿¿5 199<£года

в « » часов на заседании Диссертационного Совета К 001.07.01 в НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан « 199 ^Тода

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук

Е. И. Коптелова

Актуальность проблемы. В последние десятилетия иереи ниоэы и листериоз заняли значимое место в инфекционной патологии человека. Основные эпидемиологические закономерности этих инфекции, относящихся к классу сапронозов, обусловлены тем, что возбудители способны, обитать не тцлько в организме хозяина, но и в объектах окружающей среды.

Экологию иерсиний и листерий активно изучали п плане влияния абиотических факторов на динамику бактериальных популяций, а также закономерностей распространения в окружающей среде (Сомов, 19741993; Гершун, 1971-1988; Ющенко, 1985; Максименкова, 1987; Беленева, 1996 и др.). В последние годы выявлены закономерности и механизмы существования иерсиний, листерий и других патогенных бактерий в сообществах рочв и водоемов. Показана важная роль биотических факиров в существовании бактериальных популяций во внешней среде (Литвин, 1988, 1991; Пушкарева, 1989-1997).

Объектом этих бактериологических исследований, естественно, были "культивируемые" формы бактерий - способные к росту на обычных питательных средах. Из литературы известно, что это - не единственная форма существования микроорганизмов: у ряда неспорообразующих бактерий - Е. coli, Salmonella sp., Shigella sp., V. cholerae, Legionella pneumophila и др. - при обитании в окружающей среде описаны так называемые "некультивируемые" - по сути, покоящиеся формы (Cclwell, 1985; Roszak, 1987 и др.), не учитываемые бактериологическим методом. Такие покоящиеся бактериальные клетки не делятся, однако вполне жизнеспособны, доказательством чего служат биосинтез белка и нуклеиновых кислот, функционирование дыхательной и электронно-транспортной цепей (МасКау, 1992; Zimmerman, 1978); способность к реверсии в вегетативную форму (Пушкарева с соавг, 1997; Романова, 1997; Colwell, 1984; Jones, 1992 и др.). В функциональном отношешж они аналогичны спорам бацилл (Романова, Гинцбург, 1993)

Н¿культивируемые формы иерсиний и листерий не были известны. Вопросы популяциоиной экологии Y. psuedotuberculosis и L. monocytogenes, связанные с переходом бактерий в некультивируемое состояние, не изучались. Могут ли иерсинии и листерии существовать в i почвах в некультивируемой форме? Каковы условия образования покоящихся форм и их реверсии в вегетативные (культивируемые) формы? Какова доля и динамика некультивируемой (покоящейся) части бактериальной популяции? Существуют ли покоящиеся формы в естественных условиях - почвах природного очага? Ответы на эти и другие вопросы имект немаловажное значение, имея в виду механизмы сохранения возбудителей в межэпидемические (межэпизоотические) периоды, а также "запуска" эпизоотического и эпидемического процессов при сапронозах. Значительный интерес для проблемы природной очаговости инфекций и эпидемиологии представляет также изучение естественных связей патогенных иерсиний и листерий с растениями и путей их инфицирования.

Цель работы - научить возможность обратимого перехода в некультивируемое (покоящееся) состояние патогенных иерсиний и листерий при обитании в почве и взаимодействии с растениями.

Основные задачи:

1. Разработать тест-систему на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления иерсиний и листерий в естественных почвах. .

2. Проверить возможность перехода Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes в некультивируемое состояние, оценить динамику численности вегетативных и покоящихся (некультивируемых) форм иерсиний и листерий в почве при паралелльном использовании бактериологического метода и ПЦР в эксперименте.

3. Выявить условия реверсии некультивируемых форм в вегетативные при обитании и почве.

4. Исследовать почвы природного очага псевдотуберкулеза на наличие некультивируемых форм возбудителя.

5. Установить характер взаимодействий иерсшшй и листерий с водорослями и их экзометаболитами.

6. Изучить возможность проникновения иерсшшй И листерий из почвы в вегетативные органы высших растений и длительность существования в них.

Научная повнзна:

- впервые в образцах почв из природного очага псевдотуберкулеза обнаружит , некультивируемые формы патогенных иерсиний, выявленные с помощью ПЦР при отрицательных результатах бактериологических исследований;

- впервые экспериментально доказан переход Y. pseudotuberculosis И L. monocytogenes в некультивируемое состояние при инкубировании в почве, оценены динамика формирования и К01щентрация таких покоящихся форм, длительно сохраняющихся в почве;

- впервые установлено, что зеленые водоросли Scenedesmus quadricaiida активно индуцируют переход иерсиний и листерий в покоящееся состояние при обитании в почве;

- впервые выявлена реверсия покоящихся форм иерсшшй и листерий в исходные вегетативные формы под воздействием ряда биотических факторов; v

- впервые экспериментально доказана возможность колонизации высших растений патогенными иерсшшями и листериями из субстрата через корневую систему.

Практическая значимость работы

Разработан экспресс-метод индикации патогенных иерсиний и листерий в субстратах внешней среды на основе ПЦР; в сочетании с бактериологическим методом он позволяет дифференцировать некультивируемые формы возбудителей и ориентировочно оценивать их концентрацию в почвах и водоемах.

Подготовлены методические рекомендации "Выявление некультивируемых форм Y. pseudotuberculosis и L. monocytogenes в объектах окружающей среды с применением полимеразной цепной реакции".

Материалы диссертации используются в курсе лекций для студентов кафедры альгологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Апробация работы. Результаты исследований отмечены на конкурсе молодых ученых НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, доложены на Всесоюзной конференции по актуальным проблемам инфекционной патологии (г. Санкт-Петербург, 1993 г.), VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, мнкообиологов и паразитологов (г. Москва, 1997 г.).

Диссертация апробирована на совместной конференции отдела природноочаговых инфекций, отдела генетики и молекулярной биологии бактерий, отдела эпидемиологии НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 22 апреля 1997г. (протокол № 2).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, выводов и списка литературы. Работа

изложена на 123 страницах, иллюстрирована 12 рисунками и 10 таблицами. Список источников литературы включает 182 работы, в том числе 60 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культивирование микроорганизмов

- иерсинии (Y. pseudotuberculosis, штаммы 995 pCad+, 244 pCad+, 15-88 pCad+, 623 Rif-r, 2160 Rif-r; Y. enterocolitica 03, 09) - на L-бульоне и L-агаре, стерильной почвенной вытяжке, среде Эндо, агоре Хоттингера;

- листерии (L. monocytogenes, вирулентный штамм EGD) - на сердечно-мозговом бульоне, стерильной почвенной вытяжке, триптозо-

С)

соевом агаре.

Инкубацию посевов проводили при температурах 4-8°С, 18-20°С и 37°С (для определения плазмиды pCad).

При посевах на плотные питательные среды подсчет бактерий проводили по КОЕ; в ПЦР концентрацию бактерий определяли по количеству амплифицировагного маркерного фрагмента ДНК (мк/мл).

Идентификация микроорганизмов

Идентификацию бактерий и оценку их ферментативной активности проводили с помощью набора индикаторных тест-систем Api (фирмы Bio-Merioux). Для определения микробного пейзажа образцов почв и семян высших растений делали высевы на селективные среды SS-, MRS-, Biggi-, Cetrimide-Enterococcus agar, ThioglicolJate Medium, Saburo-, Candida-, Rat-Agar ("Serva"). Для идентификации псевдотуберкулезного микроба и листерий использовали также полимеразную цепную реакцию.

Культивирование и заражение низших: растении. Аксекическую культуру зеленых водорослей БсепескБтиз quadricauda (любезно предоставленную проф. Ю.Т. Дьяковым, кафедра альгологии МГУ) поддерживали в стерильной среде Прата, гересевая 1 раз в 10-15 су-ок в соотношении 1 мл маточной культуры к 20 мл среды Прата, инкубировали при температуре 18-20°С и освехценнорти 1200 люкс. Заражение водорослей проводили во флаконах со стерильной почвенной вытяжкой путем внесения бактериальной культуры в количестве, необходимом для получения 106 мк/мл (по оптическому стандарту мутности). Численность водорослей подсчитывали в камере Горяева по формуле, принятой для эукариотных клеток.

Культивирование и заражение высших растении. Семена различных высших растений перед проращиванием деконтаминировали, поэтапно обрабатывая коктейлем из антибиотиков (линкомицин 100 мкг/мл + рифампицин 100 мкг/мл + гентамицин 20 мкг/мл) в течение 2 часов и фунгицидом (даконил 10 мкг/мл). Семена проращивали при температуре 18-20"С в воде или почвенной вытяжке и освещенности 1200 люкс в стерильных условиях. Растения заражали, путем внесения бактериальной суспензии в ^бстрат (почва, вода) в концентрациях от 103 до 109 мк/мл.

Вегетативные органы зараженных растений гомогенизировали и проводили высевы на плотные питательные среды в различных разведениях. Часть материала подвергали холодовому обогащению при 4-8°С в течение ' 21 суток. При моделировании передачи псевдотуберкулезного микроба по цепи почва-растение-животное в опытах использовали зеленоядных грызунов (обыкновенных полевок).

последовательности праймеров для индикации псевдотуберкулезного микроба представляют собой последовательности гена Уор А,

t ■

локализованного на плазмиде р45 (Yersl: GTA GGG AAA GTA AAC TTT ACT GC и Yers2: CCC АТС AAA TGT TTG TGT TAA TCA C) (Skurnik, Wolf-Watz, 1989), и гена инвазивности, локализованного на хромосоме (Invl: TAA GGG ГАС TAT CGC GGC GGA и lnv2: CGT GAA ATT AAC CGT CAC ACT) (Nakajaina et al., 1992). Ампшфикацто проб проводили на амплификаторе Perkin Elmer Cetus по стандартным программам.

Для индикации штаммов L.monocytogenes использовали тест-систему, основанную на последовательности гена листериолизина (lily А), разработанную Ермолаевой С. А. (1994).

Учет результатов ПЦР проводили методом электрофореза в 1% геле 10 мкл реакционной смеси в присутствии бромистого этидия в трис-ацетатном буфере (рН 8,0). За положительный результат принимали наличие в re.™после электрофореза фрагментов ДНК необходимого размера.

Объем экспериментальных исследований. В работе использовали 20 штаммов бактерий; 2 аксенические культуры водорослей и простейших; ISO высших растений различных видов; 33 образца естественных почв. Поставлено 36 опытов, в том чи.ле 1 опыт по передаче иерсиний в цепи почва-растение-животное. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрнческих критериев (Гублер, Генкнн, 1974).

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОГО МИКРОБА В ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

Для видосненнфнческой индикации псевяотуберкулезного микроба были подобраны оптимальные температуры огжлга праймеров - 63°С для пары праймеров, фланкирующих фрагмент гена Уор А на плазмиде р45,

и 66°С, необходимая для амплификации маркерного фрагмента гена инвазивности. Чувствительность разработанной тест-системы составила 103 клеток для праймеров Уеге и 102 клеток для праймеров 1пу. Перед каждым опытом ставили контроли с внеклеточной ДНК иерсиний и листерий для подтверждения того, что в длительных экспериментах ПЦР выявляет жизнеспособные клетки (в контролях ДНК выявлялась лишь 35 суток).

Предварительную обработку образцов почв проводили как описано ранее (Емельяненко с соавт., 1992). Для исключения возможных ингибиторов Taq-пoлимepaзы в ествественных почвах, проводили дополнительную очистку на колонках с БерЬайех 0-25: к 0,5 мл лизированных образцов почвенной вытяжки добавляли 50 мкл ЗМ ацетата натрия (рН 6,0) и 1 мл охлажденного (-20°С) этанола (96%), встряхивали, инкубировали при -20°С в течение нескольких часов, далее образцы центрифугировали при 14000 об/мин в течение 20 минут, осадок подсушивали при температуре 37 "С 2 часа, затем ресуспеадировали 50 мкл стерильной деионизованной воды и наносили на колонки с сефадексом.

Для определения количества клеток в пробе с помощью ПЦР делали 5-6 последовательных десятикратных раззедений, после чего пробу и разведения подвергали тестированию в ПЦР. Учет вели по последней ясно различимой полосе в геле после электрофореза, которая соответствовала амплификации ДНК числа бактериальных клеток, определяемого чувствительноегыо разработанной тест-системы. Далее рассчитывали концентрацию бактериальных клеток в 1 мл исходной пробы.

В качестве положительного контроля всегда ставили пробу, содержавшую ДНК такого количества лизированных клеток, которое соответствовало чувствительности разработанной тест-системы.

ПОКОЯЩИЕСЯ (НЕКУЛЬТПВИРУЕМЫЕ) ФОРМЫ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОГО МИКРОБА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И В ПОЧВЕ ПРИРОДНОГО ОЧАГА ИНФЕКЦИИ

При культивировании Y. pseudotuberculosis в стерильной почвенной вытяжке отмечали существование вегетативных форм иерсиний в концентрации 106 КОЕ/мл до 20-30 суток, что неизменно подтверждалось как результатами посевов, так и данными Г1ЦР (рис. I). Через месяц инкубации число вегетативных клеток неуклонно снижалось, а после 60 суток иерсинии вовсе не регистрировались бактериологическим методом. В "ю же время ПЦР выявляла ДНК иерсиний с расчетной концентрацией 104 мк/мл, соответствующей исходной концентрации бактерий (рис. 1).

Внеклеточная ДНК псевдотуберкулезного микроба (контроль) служила матрицей в ПЦР лишь до 5 суток, что свидетельствовало о выявлении в ходе длительного опыта ДНК жизнеспособных клеток иерсиний (рис. 1).

Экспериментально доказанный переход Y. pseudotuberculosis в некультивируемое состояние позволяет предположить возможность существования таких покоящихся форм иерсиний в почвах природного очага псевдотуберкулеза. Для ориентировочного анализа весной были взяты 4 образца почв из котловины озера Неро - природного очага псевдотуберкулеза. С помощью ПЦР во всех пробах почв выявили наличие Y. pseudotuberculosis в некультивируемой форме: результаты бактериологических исследований были отрицательными. При исследовании 24 проб почв из этого очяга, взятых в осенний период, возбудитель выявлен в 10. пробах с помощью ПЦР при отрицательных результатах бактериологических исследований (табл. 1). Большинство положительных находок получено из прибрежной части хотдовины, почвы которой характеризуются более высокой биологической

активностью (Максименкова, 1987), тогда как в пробах из другой части котловины (№№ 13-24) маркерный фрагмент гена ту выявлен лишь в 3 пробах.

КОЕ/мл (мк/мл)

Рис. 1. Динамика численности Y. pseudotuberculosis в стерильной почвенной вытяжке при оценке бактериологическим методом и методом

ПЦР:

1 - число бактериологически выявляемых клеток (lg КОЕ/мл);

2 - количество специфического фрагмента ДНК клеток в ПЦР

(lg мк/мл);

3 - внеклеточная. ДНК исрсишш (контроль).

Кроме того, в двух образцах из первого участка выявлен ген Уор А, чю указывает на наличие илачмиды р45, т.е. сохранение у некулынгчруемых иерснмин маимеиного потенциала. Расчетная концсшранпп церснний в пробах почв варьировала от К)2 до 2x104 мк/г

(табл. 1). Для контроля п вытяжку из этих образцов почв вносили внеклеточную ДНК псевдотуберкулезного микроба, которая регистрировалась в ПЦР только 4 суток.

Таким обргзом, псевдотуберкулезный микроб в почвах природных очагов может существовать не только в вегетативной форме, но и в покоящемся (некультавируемом) состояшш, бактериологически не выявляясь.

Таблица 1

Выявление маркерных фрагментов У. pseudotuberculosis в образцах почв

природного очага псевдотуберкулеза методом ПЦР

Номера образцов почв <) Геи инвазивпостп (хромосома) Ген белка уор А (плазмпда) Расчетная концентрация нерсипий (мк/г)

1 + t- 4х103

2 + - Ю2

3 + - 102

4 + + 3x10*

5 - -

6 - -

7 - -

8 - -

9 + М2

10 - -

11 + 10*

12 + - 102

13 - -

14 - -

15 -

16 + - 10*

17 + 10*

13 - -

19 - -

. 20 - -

21 - -

22 - -

23 -

24 + - 2x10*

о

ДИНАМИКА ВЕГЕТАТИВНЫХ И ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ ИЕРСИНИЙ И ЛИСТЕРИЙ В АССОЦИАЦИИ С ЗЕЛЕНЫМИ ВОДОРОСЛЯМИ

При инкубировании псевдотуберкулезного микроба в ассоциации с зелеными водорослями в почвенной вытяжке бактериологически наблюдали падение концентрации вегетативных клеток иерсиний, так что к концу срока наблюдений (12 недель) их численность составляла всего \02 КОЕ/мл (0,01% популяции). Паралелпьные исследования в ПЦР неизменно выявляли иерсиний в исходной концентрации - 10й мк/мл (рис. 2). В контроле (почвенная вытяжка без водорослей) нсрсинми быстрее переходили в некультивируемое состояние: уже на 50-е сутки концентрация вегетативных клеток составляла 102 КОЕ/мл; по данным ПЦР концентрация иерсиний также оставалась на исходном уровне !06 мк/мл (рис. 2).

<8 КОЕ/мл (мк/мл)

7 т '

, 3

ПЦР

1 -

о -о

недели

•о

2

4

6

8 10

12

14

Рис. 2. Динамика перехода иерсиний в покоящееся состояние:

1 - в почве; 2-е водорослями; 3 - в фильтрате водорослей (результаты бактериологических исследований).

Иная динамика характерна для псевдотуберкулезного микроба в фильтрате (стационарная фаза водорослей), который свободен от клеток водорослей, но содержит максимальную концентрацию их экзометаболитов. Уже на 3 сутки отметили значительное снижение числа вегегатвных клеток (до Ю4 КОЕ/мл), после чего последовал стремительный переход всей популяции в некультивируемое состояние: уже на 11-е сутки псевдотуберкулезньгй микроб не выявлялся при неоднократных бактериологических исследованиях. По результатам ПЦР его концентрация оставалась на уровне 106 мк/мл п течение всего срока наблюдений (рис. 2).

Итак, зеленые водоросли Бс. диас1псаис1а поддерживали более 'длительное существование иерсиний в вегетативной форме, тогда как экзометаболиты их "старых" культур индуцировали стремительный переход иерстшй в покоящееся состояние. Это объясняет истинный смысл того, Что "стареющие" (в стационарной фазе) культуры Бс. диас1псаис1а ннгибируют бактериальные популяции (Телитченко, 1972; Шестерни, 1972), а в -ассоциации "зеленые водоросли - бактерии" замедляются процессы старения обоих партнеров (Штина с соавт., 1974).

В следующей серии экспериментов мы проверили возможность реверсии покоящихся форм иерсиний в исходное (культивируемое) состояние. При добавлении в среду культивирования феталыюй сыворотки способность к росту - на агаре приобрели 104 КОЕ/мл; добавление живых или убитых инфузорий Т. рупЛэпш^ (массовых обитателей почв) способствовало реверсии 102 КОЕ/мл. В контролях (без индукторов реверсии) клетки псевдотуберкулезного микроба оставались в покоящемся состоянии, не давая роста на питательных средах.

При культивировании патогенных листерий п стерильной почвенной вытяжке концентрация бактериологически выявляемых форм снижалась после 30 суток, и до 2 месяцев (срок наблюдений) высевались единичные колонии листерий, тогда как паралелльные исследования

почвенной вытяжки в ПЦР неизменно выявляли исходную их концентрацию - 10б мк/мл (рис. 3, А). В ассоциации с водорослями листерии, однако, гораздо быстрее переходили в некультивируемое состояние: уже через 7-10 суток концентрация вегетативных клеток составляла около 104 КОЕ/мл. Начиная с 25 суток, при повторных бактериологических исследованиях они не выявлялись. По данным ПЦР общая концентрация листерий оставалась неизменной на протяжении всего срока наблюдений - 60 суток (рис. 3, Б). Сопоставляя результаты, полученные двумя методами, можно ориентировочно оценить, уменьшение доли вегетативных форм листерий в ходе экспериментов (табл. 2). При культивировании листерий с экзометаболитами водорослей существенного ускорения перехода в покоящееся состояние не отмечено - в отличие от иерсиний. Внеклето'ная ДНК листерий в стерильной почвенной вытяжке (контроль) служила матрицей в ПЦР в течешь 3 суток (рис. 3).

Покоящиеся формы листерий, как и иерсинии, были способны к реверсии в вегетативное состояние под воздействием фетальной сыворотки, убитых и живых инфузорий, фитогормона пукснна. Наибольшее число некультивируемых листерий вновь приобретало способность к росту на питательных средах при культивировании с простейшими (табл. 3).

Таким образомг водоросли активно индуцируют переход в покоящееся состояние как грамотрицательных иерсиний, так и трамположительных листерий, хотя динамика формирования покоящихся форм имеет свою специфику. Естественные факторы биотической природы способны индуцировать возврат покоящихся форм к вегетативному (культивируемому) состоянию, когда они вновь выявляются бактериологическим методом. Следует подчеркнуть, что сам по себе факт реверсии - наиболее убедительное свидетельство реального существования и жизнеспособности покоящихся форм бактерий.

>В КОЕ А

(мк)/мл

КОЕ Б

(мк)/мл

О 10 20 30 40 50 60 70

Рис. 3. Динамика перехода лнстернн в ¡»культивируемое состояние в стерильной номвенпой вытяжке (А) и в присутствии водорослей (В):

1 - концентрация лнстернн по данным бактериологических

исследований (численность вегетативных форм);

2 - концентрация листсрин поданным ПЦР (общая чмслепиость);

3 - концентрация внеклеточной ДНК листерин по данным ПЦР

(контроль).

Таблица 2

Динамика перехода лнстерий в некультивируемое состояние

в почвенной вытяжке

% вегетативных (бактериологически выявляемых) форм

Условия

исх. 10 15 30 40 50 60

сут. сут. сут. суг. сут. сут.

В ассоциации

с водороыями 100 5 1 0 0 0 0

В отсутствие i.

водорослей 100 100 100 100 0,005 0,001 0,001

Таблица 3

Реверсия иекультивируемых форм листернй при воздействии различных индуцирующих факторов

Среда культивирования Факторы реверсии Концентрация иекультивируемых форм в суспензии (мк/мл) Концентрация вегетативных форм -ревертаитов на агаре (КОЕ/мл)

Бульон Хинтона- ..' Мюллера фстальная сыворотка 10« 104

Бульон Хинтона-Мю±чера без фетальиой сыворотки (контроль) ю5 0

Почвенная вытяжка убнтие инфузории (детрит) 1Р5 105

Почвенная вытяжка живые инфузории ю5 10®

Почвенная вытяжка без Ш1фуЗОр1Ш (контроль) ю5 0

Триптозогсоеаый агар ауксин 5x10* 5х102

Трилтозо-соевыа агар без ауксина (контроль) 5*10* 0

ИЕРСИНИИ И ЛИСГЕРИИ В ВЫСШИХ РАСТЕНИЯХ

Хотя ряд косвенных данных свидетельствует о связях нерсиний и листерий, патогенных для человека и живот»гых, с растениями (растительными продуктами), специального изучения их взаимодействий с высшими растениями не проводилось.

Экспериментальное изучение иерсиний в растениях

В опытах использовали проростки высших растешгй крестоцветных (салат, капуста), бобовых (горох, фасоль), злаковых (ячмень, овес, пшеница), лилейных (зеленый лук), выращенных на инфицированных Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica субстратах (почве или воде) в концентрациях от 10б до 109 КОЕ/мл (г). В качестве отрицательного контроля использовали растения,, выращенные на интактных субстратах.

Исследовашы проростка капусты показали, что Y. enterocolitic;i проникали в вегетативные органы растений на 4-е сутки после заражения .субстрата (почвы). Концентрация иерсиний была невысокой -1Q1 КОЕ/г; холодовое обогащеш1е суспензии тканей проростка способствовало возрастанию концентрации иерсиний до 105 КОЕ/г. При бактериологических исследованиях иерсинии обнаруживались на 4-7 сутки в семени, 7-10 сутки - в Корне, 7-30 сутки - в листьях ряда растений. Концентрация иерсиний в вегетативных органах салата, гороха, пшеницы была невысокой - 10' КОЁ/г, в проросшем зерне овса концентрация псевдотуберкулезного микроба оставалась на уровне lO1-Ш5 КОЕ/г до конца наблюдений (30 суток). По мере холодового обогащения суспензии тканей проростков овса иерсинии обнаруживались в возрастающих концентрациях (до Ю5 КОЕ/г). При

исследовании зеленого лука, проростков фасоли и ячменя все попытки выделения иерсиний были безуспешными.

Если иерсинии способны пребывать в стеблях и листьях ряда растений, не могут ли они передаваться зеленоядным грызунам при поедании инфицированных побегов? В предварительном порядке мы попытались проверить принципиальную возможность такой передачи иерсиний. На первом этапе опыта вирулентной культурой Y. pseudotuberculosis 1 серогруппы (штамм 2160) инфицировали субстрат, на котором выращивали капусту и салат. Как и в предыдущих опытах, 3apei истрировано проникновение иерсшшй через корневую систему в вегетативные органы растений, где omi бактериолопгчески выявлялись в концентрации .102 КОЕ/г (капуста) и 103 КОЕ/г (салат) в течение 21 суток. На втором этапе инфицированные побеги салата (103 КОЕ/г), были скормлены 3 полевкам из расчета 5 г на 1 животное. Из фекалий 2 полевок через 2 и 3 суток удалось изолировать культуры Y. pseudotuberculosis, идентичные исходной культуре, которой инфицировали субстрат. На 14-е сутки после скармливания инфицированных растений в сыворотке крови одной полевки были обнаружены антитела в титре 1:200 к Y. pseudotuberculosis 1 серогруппы.

Таким образом, в данных экспериментах установлена способность иерсиний проникать через корневую систему растений в вегетативные органы, существовать, в них определенное время в культивируемом состоянии, а также принципиальная возможность заражения зеленоядных грызунов при поедании инфицированных растений. Последнее заключешгс носит, однако, предварительный характер в силу ограниченного объема опытов. Немаловажное значение этого вопроса для познания закономерностей циркуляции возбудителей в природных очагах сапронозных инфекций требует специальных нсследовашШ.

Экспериментальное изучение листерий в растениях

Вирулентную культуру L. monocytogenes (штамм EGD) в концентрации 109 мк/мл вносили в стерильную почвенную вытяжку (иловато-болотная почва), на которой выращивали растения (пшеница).

Бактериологические исследования в динамике показали, что листерин проникали во все вегетативные органы растений уже через сутки после заражения субстрата. В этот срок концентрация листерий в почвенной вытяжке и в корне была одинаковой, составляя 109 КОЕ/г, в стебле значительно ниже - 106 КОЕ/г, а в листе бактерии накапливались до Ю8 КОЕ/г зеленой массы. Через 6 суток эксперимента указанные концентрации листерий в вегетативных органах пшеницы и в почвенной вытяжке сохранялись. В более поздние сроки (14, 21 и 30-е сутки) бактериологические исследования неизменно выявляли высокую концентрацию листерин в вегетативных органах растений (107-109 КОЕ/г); в почвенной вытяжке их численность сохранялась на исходном уровне - 109 КОЕ/г. Даже высыхание зараженных растений "на корню" не приводило к гибели листерий: oral высевались из сухих стеблей и листьев в концентрации 104-105 КОЕ/г. Видимых патологических изменений у инфицированных растений за время наблюдений не выявлено.

Таким образом, листерин также способщл проникать из почвы через корневую систему в вегетативные органы растений, длительно сохраняясь там в стабильно высокой концентрации - очевидно, без образованна покоящихся форм.

В итоге результаты исследований позволяют утверждать, что при обитании в почвах и водоемах листерин и иерсинии могут быть представлены как вегетативными, так и покоящимися формами, бактериологически не выявляемыми, причем последние способны

сохранять вирулентность и при благоприятных условиях реверсировать в вегетативное состояние. Непосредственное заражение животных или человека от почвы маловероятно; для этого необходим вынос возбудителя из почвы в наземные экосистемы и не исключено, что он может осуществляться через растения как связующее звено между ними. Об этом свидетельствуют впервые полученные данные о заселении вегетативных органов растений иерсиниями и листериями, переходящими из почвы через корневую систему. Хорошо известно, что патогенные ■бактерии мохуг распространяться среди сельскохозяйственных животных с кормами, а продукты растительного происхождения имеют важное эпидемиологическое значение, в том числе при' п^евдотуберкулезе и листериозе. Можно полагать, что

циркуляция возбудителей по схеме почва-растения-животные вполне $

реальна, как реальна и длительная резервация возбудителя в покоящейся форме в почвах (субстратах) природных и антропуршческих очагов сапронозных инфекций.

• ВЫВОДЫ

1. На основе ПЦР создана видоспецифическая тест система, позволяющая выявлять фрагменты хромосомного гена инвазивности и плазмццного гена Уо^. A Y. pseudotuberculosis в объектах окружающей среды.

2. Впервые параллельным использованием бактериологического метода и ПЦР-анализа экспериментально установлен переход патогенных иерешшй и л истерий в покоящееся («культивируемое) состояние в почвенной вытяжке. Выявлена динамика образования покоящихся форм, доля которых в бактериальной популяции через 1-2 месяца превышала 90%.

Впервые обнаружены некультивируемые (покоящиеся) формы псевдотуберкулезного микроба, а том числе сохраняющие патогенный потенциал в 40% проб естественных почв природного очага инфекции.

3. Покоящиеся формы иерсшшй н листернй сохраняли способность к частичной или полной реверсии в вегетативные (бактериологически выявляемые) формы под воздействием индуцирующих факторов - фетальной сыворотки, живых и убитых Инфузорий, фитопормона ауксина.

4. Зеленые водоросли БсепескБпшз quadricauda обеспечивали устойчивое существование (в течение 3 месяцев) псецдотуберкулезного микроба в вегетативной (культивируемой) форме в почвенной вытяжке.

Напротив, экзометаболоты этих водорослей индуцировали стремительный (в течение 3 суток) переход нерешшй в покоящееся (некультивируеыое) состояние.

5. Патогенные лисгерин в ассоциации с зелеными водорослями, начиная с третьих суток, постепенно переходили в покоящееся состояние, и через месяц вся бактериальная популяция была Представлена некультивируемыми формами.

6. Эксперимехггально доказано, что патогетше иерстпш и лнстерии способны проникать из субстрата через корневую систему в вегетативные органы высших растений. Концентрация иерстшй в Стеблях и листьях растешгй сохранялась на уровне 10'-103 КОЕ/г не более 30 суток, тогда как листерии накапливались в листьях растений до 10» коЕ/г, устойчиво сохраняясь в этой концентрации до кмща их вегетации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Литвин В.Ю., Шустрова Н.М., Гордейко В.А., Пушкарева В.Й., Мисуренко E.H. (Емельяненко E.H.). Экспериментальное изучение иерсинийв растениях //ЖМЭИ.- 1991.- № 9- С. 5-7.

2. Шустрова Н.М., Гордейко В.А., Мисуренко E.H., Пушкарева В.И., Литвин В.Ю. Иерсиншг в растениях (экспериментальное исследование) // Сб. Потенциально патогенные бактерии в природе.-М„ 1991,-С. 86-92.

. 3. Шустрова Н.М., Мисуренко E.H., Литвин В.Ю. О возможности передачи Yersinia pseudotuberculosis по цепочке почва-растеште-животное (предварительное сообщение) //ЖМЭИ.- 1992.- К; 4.- С. 10-12.

4. Aksjonov М., Misurenko Е., Litvin V., Gintzbuig A. Revelation and study on the dynamics of occurance of nonculturable forms of Yersinia pseudotuberculosis using PCR // Сб. резюмета VII Конгрес по заразни и паразгпарни болч-ти.-Велинград, 1992.-С. 18-19.

5. Емельяненко E.H., Аксенов М.Ю., Гаровникова Ю.С., Шустрова ' Н.М., Гинцбург А.Л., Литвин В.Ю. Выявление и изучение динамики численности некультивируемых форм Yersinia pseudotuberculosis во внешней среде методом ПЦР // Акт. пробл. инфекц. патол.- С-Петербург, 1993.-Ч. 2.? С; 26.

6. Беляков В.Д., Литвин В.Ю., Емельяненко E.H., Пушкарева В.И, Патогенные бактерии, общие для человека и растений // Сб. Патогенные бактерии в сообществах.- М., 1994 - С. 11-23.

7. Емельяненко E.H., Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Л., Литвин В.Ю, Полимеразная цепная реакция как метод изучения рекультивируемых форм иерсиний в окружающей среде // Сб. Патогенные бактерии в сообществах.- М., 1994,- С. 135-139.