Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Усовершенствование методов выделения и идентификации Listeria monocytogenes

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование методов выделения и идентификации Listeria monocytogenes"

На правах рукописи

ПИСКУНОВ Антон Валерьевич

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ LISTERIA MONOCYTOGENES

06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

2 8 НОЯ 2013

Владимир-2013

005540004

005540004

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор

Прунтова Ольга Владиславовна

Официальные оппоненты: Пирожков Михаил Константинович - доктор

ветеринарных наук, ФГБУ «ВГНКИ», ведущий научный сотрудник лаборатории качества и стандартизации бактерийных лекарственных средств для ветеринарного применения.

Потехин Андрей Владимирович - кандидат ветеринарных наук, ФГБУ «ВНИИЗЖ», ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики болезней свиней и рогатого скота.

Ведущая организация - Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВиМ Россельхозакадемии, г. Покров).

Защита состоится 17 декабря 2013 г. в 10— на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»),

Автореферат разослан 15 ноября 2013г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ФГБУ «ВНИИЗЖ», »б-Тя и

кандидат биологических наук /¡Р А--' ь ■ "ЗКбанова Татьяна Валентиновна

1 Общая характеристика работы

1.1. Актуальность темы

Listeria monocytogenes является причиной возникновения листериоза у животных и человека. В настоящее время данное заболевание все чаще регистрируется в виде пищевой токсикоинфекции. Это обусловлено повсеместным распространением листерий в природе, полиморфизмом клинических признаков болезни, высоким уровнем летальности при генерализированных формах инфекции, возрастающими объемами оборота кормов и пищевых продуктов (в частности продуктов быстрого питания). Учитывая способность листерий размножаться в готовых к употреблению пищевых продуктах, хранящихся в холодильниках при низких температурах (при +4°С), перерабатывающая и пищевая промышленность вынуждена расходовать огромные средства для предотвращения выпуска контаминированной продукции [5, 7].

Работы по изучению биологических свойств листерий показывают, что L. monocytogenes адаптируется к условиям окружающей среды, особенно под воздействием антропогенных факторов (применение антибиотиков в медицине и пищевой промышленности, консервантов, дезинфицирующих средств и т.п.). Адаптация листерий выражается в изменении биологических свойств. В основном эти изменения проявляются невосприимчивостью к антибактериальным препаратам определенных групп, способностью образовывать биопленки, появлением авирулентных и слабовирулентных форм бактерий [4, 11, 12, 13].

В РФ испытания пищевого сырья и пищевых продуктов на контаминацию L. monocytogenes проводят в соответствии с ГОСТ Р 51921-2002 бактериологическими методами, которые включают в себя выделение, идентификацию чистой культуры и постановку биопробы [3]. За рубежом для идентификации бактерий вида L. monocytogenes, помимо классических методов, используют инструментальные методы идентификации (ПЦР-РВ, масс-спектрометрия).

Учитывая вышеизложенное, усовершенствование методов выделения и идентификации изолятов и штаммов L. monocytogenes, выделенных на территории РФ и за рубежом, имеет научное и практическое значение. Наша работа позволит дать в будущем качественную оценку циркуляции возбудителя пищевого листериоза, а з'совершенствование методов выделения и идентификации листерий даст возможность выявлять возбудителя в пищевых продуктах и продуктах

животного происхождения в кратчайшие сроки.

1.2. Степень разработанности проблемы

Отечественными и зарубежными учеными опубликовано значительное число работ по изучению биологических свойств изолятов L. monocytogenes классическими методами (выделение чистой культуры и идентификация). В то же время за рубежом происходит совершенствование методов идентификации листерий в пищевых продуктах и в объектах окружающей среды, в частности с использованием ПЦР-РВ и масс-спектрометрического метода.

1.3. Цель и задачи исследований

Основной целью данной работы являлось усовершенствование методов выделения и идентификации бактерий рода Listeria, в частности вида L. monocytogenes, полученных из различных пищевых продуктов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить культуралыю-морфологические и биохимические свойства референтных штаммов и изолятов L. monocytogenes и L. innocua при помощи традиционных бактериологических методов.

2. Охарактеризовать штаммы и изоляты по патогенности и вирулентности на белых мышах.

3. Усовершенствовать схему выделения и идентификации L. monocytogenes из патологического материала и пищевых продуктов.

4. Оптимизировать метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для идентификации L. monocytogenes.

5. Создать базу данных для идентификации бактерий рода Listeria методом MALDI-TOF.

1.4. Научная новизна работы

В результате проведенных исследований получено: 3 изолята L. monocytogenes и 5 изолятов L. innocua.

Изучены биологические свойства 14 референтных штаммов и 27 штаммов и изолятов L. monocytogenes.

Усовершенствована схема выделения L. monocytogenes из патологического материала и пищевых продуктов.

Оптимизирована полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для идентификации L. monocytogenes.

Создана база данных по идентификации L. monocytogenes масс-спектрометрическим методом (MALDI Autoflex).

1.5. Теоретическая и практическая значимость работы

В результате проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по выявлению генома L. monocytogenes в пищевых продуктах методом ПЦР-РВ», одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» (протокол № 6, 28.06.13), и «Методические рекомендации по идентификации L. monocytogenes с применением масс-спектрометра Autoflex MALDI biotyper», одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» (протокол № 6, 28.06.13).

В коллекцию бактериальных культур ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», референтной лаборатории болезней КРС, после изучения биологических свойств заложены следующие изоляты: L. monocytogenes «L-l», «L-2» и L. innocua «1-1», «1228 (Р)» «1229 (F)», «1231 (М)», «1232».

1.6. Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения биологических свойств 27 штаммов и изолятов L. monocytogenes, 14 референтных штаммов L. monocytogenes и 5 изолятов L. innocua;

- определение патогенности и вирулентности изолятов и референтных штаммов L. monocytogenes на белых мышах;

- оптимизация ПЦР-РВ для идентификации бактерий рода Listeria;

база данных для идентификации L. monocytogenes масс-спектрометрическим методом.

1.7. Соответствие диссертации паспорту научной специальности

В диссертационной работе приведены результаты исследований по идентификации бактерии вида L. monocytogenes. Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности 06.02.02 - 1, 4, 5, 6, 7.

1.8. Степень достоверности и апробация результатов исследования

Результаты проведенных исследований получены с использованием большого объема экспериментального материала, данные опытов обработаны статистическими методами, а их достоверность подтверждена комиссионными испытаниями. Акты комиссионных испытаний утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 28.06.13. Основные материалы доложены и опубликованы в материалах научных конференций: «Достижения молодых ученых - в

ветеринарную практику», посвященной 30-летию создания СМУ ФГБУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2010 г.), «Трансмиссивные заболевания животных: актуальные аспекты биобезопасности и контроля» (г. Алушта, Украина, 2012 г.), «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2012 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2009-2012 гг.

1.9. Публикации результатов научных исследований

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ в журналах и материалах научных конференций, 3 из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1.10. Структура и объем работы

Диссертация изложена на 134 страницах компьютерного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, выводы, практические предложения. Список литературы включает 226 источников, в том числе 86 отечественных и 140 зарубежных. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 20 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.

1.11. Место выполнения работы

Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2009-2013 гг. в референтной лаборатории болезней КРС ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир.

1.12. Личный вклад соискателя

Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с Шадровой Н.Б., Спрыгиным А.В., Третьяковым А.В., Егоровой И.Ю., за что автор выражает им сердечную благодарность.

2. Собственные исследования 2.1. Материалы исследований

В работе использовали:

- референтные штаммы: Е. coli штамм №338, Bacillus subtilis штамм №6633, Staphylococcus aureus штамм №6538 (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), Salmonella dublin штамм №373 (ФГБУ «ВГНКИ»);

- 24 штамма L. monocytogenes: «СЭС-33», «рыба №6», «К-4», «1 кр 11», «1кр23», «1кр12», «1кр22», «1кр24», «1кр14», «СЭС-36», «СЭС-37», «1кр6», «1кр9», «1кр10», «СЭС-30», «243-09», «191», «1кр1», «1кр2», «1крЗ», «1кр4», «1кр5», «1кр7», «634»; 14 референтных штаммов L. monocytogenes'. №15, №17,

№5348, №57, №5214, №10528, №66, №10527, № 71, №10888, №74, №19118, №4883, №82 (ГНУ «ВНИИВиМ»); 3 изолята L. monocytogenes: «L-l», «L-2», «№608»; 5 изолятов L. innocua: «1-1», «1228 (Р)», «1229 (F)», «1231 (М)», «1232»;

- для культивирования и изучения биологических свойств листерий использовали следующие ростовые среды. МПБ, МПБ с добавлением 1% раствора глюкозы, МПА, ХА, ХБ, кровяной агар, PPLO-arap, Колумбийский агар, среду Эндо, оксфордский агар, ПЖА, PALCAM-агар, PALCAM-arap с добавлением крови, лецитин-агар, бульон Фрайзера, агар Агости-Оттавиани;

- набор реагентов «РИБО-сорб» для выделения ДНК листерий в реакции ПЦР (ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, г. Москва);

- в экспериментальной работе использовали следующие виды животных:

- белые мыши массой 15-20 г. (для постановки биопробы);

- бараны 2-летнего возраста (для взятия крови).

Содержание и кормление животных проводили согласно принятым нормам.

2.2. Методы

Биомассу листерий получали в результате культивирования на МПА, Колумбийском агаре и агаре Хоттингера при температуре 37°С в течение 24 часов. Суточную культуру пересевали на агар Агости-Оттавиани и инкубировали при температуре 37°С в течение 24-48 часов.

Культурально-морфологические свойства штаммов и изолятов бактерий изучали при выращивании па различных жидких, полужидких и твердых питательных средах при 3 7°С в течение 24-48 часов.

Световую микроскопию мазков-отпечатков проводили на микроскопе В-350 («ОРТ1КА», Италия) при увеличении в 1000 раз. Микроскопировали под иммерсионным маслом.

Биохимические свойства определяли посредством системы (СИБ), сред Гисса и с помощью автоматического бактериологического анализатора VITEK2 Compact при использовании карт GP (для грамположительных бактерий) в соответствии с инструкциями по их применению.

Концентрацию бактерий в заражающих дозах определяли посредством титрования исследуемых культур на плотных питательных средах и выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ).

Гемолитическую активность листерий определяли на кровяном агаре с содержанием 5% дефибринированной крови барана. Инкубировали в течение 24-48 часов при 37°С.

Фосфолмпазную активность определяли при посеве на твердую дифференциальную среду Агости-Оттавиани. Инкубировали в течение 24-48 часов при 37°С.

Для определения патогенности использовали белых мышей массой 15-20 г. Культуры бактерий выращивали на МПБ в течение 24 часов при 37°С. Полученную суспензию вводили 3 мышам внутрибрюшинно в дозе 1 х Ю9 КОЕ в объеме 0,5 см3. Наблюдение вели в течение 72 часов после инокуляции культуры.

Для оценки вирулентности определяли летальную дозу LD50. Для этого формировали животных в группы по 6 мышей в каждой группе (7 групп) для каждого разведения. Культуру, выращенную на агаре Хоттингера, смывали 0,9% NaCl, готовили последовательные десятикратные разведения с концентрацией 1хЮ9КОЕ, 1ХЮ8КОЕ, 1ХЮ7КОЕ, 1ХЮ6КОЕ, 1ХЮ5КОЕ, 1ХЮ4КОЕ, 1ХЮ3КОЕ соответственно, в объеме 0,5 см3 (табл. 2). Животных заражали внутрибрюшинно. Наблюдение вели в течение 10 суток со времени заражения. Концентрацию определяли посредством титрования культур на плотных питательных средах. Летальную дозу LD50 определяли по формуле Кербера в модификации И. Ашмарина.

Выделение бактериальной ДНК для постановки ПЦР проводили методом нуклеосорбции с использованием коммерческого «Набора ДНК-сорб» (ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, Москва) согласно прилагаемой инструкции. Все исследования были выполнены в 3-х повторностях.

Для исключения ложноположительных результатов применяемый метод тестировали на специфичность с близкородственными бактериями.

В работе использовали смесь праймеров для идентификации L. monocytogenes [14] в объеме 1 мкл на пробу, предназначенные для hlyA гена.

Анализ проводили на ДНК-амплификаторе в режиме реального времени фирмы Rotor GeneQ, USA. Температурный режим реакции ПЦР-РВ представлен в табл. 1. Таблица 1

Температурный режим реакции

Стадия реакции Температура Продолжительность Количество циклов

Прогрев реакционной смеси 95°С 20 сек 1

Денатурация 95°С 20 сек. 45

Отжиг праймеров (Green) 57°С 20 сек.

Элонгация 72°С 20 сек.

Структура праймеров и зонда для L. monocytogenes:

hlyA MF (TGCAAGTCCTAAGACGCCA);

hlyA MR (CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA);

hlyA Mprobe (CGATTTCATCCGCGTGTTTCTTTTCG).

Пробоподготовку для масс-спектрометрического метода проводили согласно инструкциям MALDI «Bruker» Daltonik (Германия) и методическим рекомендациям «Идентификация микроорганизмов с применением масс-спектрометра «microflex MALDI Biotyper» при исследовании продовольственного сырья и пищевых продуктов» [6, 16].

Калибровку масс-спектрометра проводили перед каждым экспериментом, согласно инструкциям [16] ((«Bruker» Daltonik, Германия), используя в качестве калибранта Bruker Bacterial Standard («Bruker» Daltonik, Германия).

Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре «MALDI Autoflex III Biotyper» («Bruker» Daltonik, Германия), используя линейный режим. Параметры анализа оптимизировали для диапазона масс от 2000 до 20137 m/z (масса/время), записывали спектр, полученный в результате суммирования 10 одиночных спектров. Для записи, обработки и анализа полученных масс-спектров использовали программное обеспечение FlexControl, MALDI biotyper версия 3.0 и MALDI Biotyper RTC («Bruker» Daltonik, Германия).

Статистическая обработка результатов. Для статистической обработки результатов определяли среднее арифметическое при количестве опытов (п), стандартное отклонение среднего арифметического и коэффициент рангов Спирмана [2].

2.3. Результаты исследований 2.3.1. Определение биологических свойств культур (штаммов и изолятов) L. monocytogenes и L. innocua

На первом этапе нашей работы исследовали образцы пищевой продукции строго в соответствии с нормативными документами.

В дальнейшем, на основании полученных результатов, в схему бактериологического анализа были внесены следующие изменения (рис. 1, зеленым цветом показаны изменения, которые были включены в общую схему).

Применение ПЦР-РВ при исследовании пищевых продуктов, патологического материала и чистой лиофилизированной культуры позволило существенно сократить количество этапов выделения и идентификации бактериологического анализа, а именно: этап двойного селективного обогащения пищевых продуктов (48-72 часа), этап обогащения патологического материала

(+4°С - «холодовое обогащение») при отрицательном первичном результате (10 суток), этап посева чистой лиофилизированной культуры на питательные среды

патологического материала, пищевых продуктов и лиофилизированных

чистых культур.

Использование масс-спектрометрического метода позволило сократить следующие этапы идентификации L. monocytogenes', вторичное селективное обогащение в пищевых продуктах (24-48 часов), а также идентификацию листерий при микроскопии мазков-отпечатков, по морфологическим, культуральным, биохимическим признакам и постановке биопробы (24-72 часа) (рис. 1).

Установлено, что культуры листерий по тинкториальным свойствам соответствуют характеристикам бактерии рода Listeria, а именно, клетки в мазках имели форму овоидов, не образовывали спор и окрашивались по Граму положительно в синий цвет. Множество бактерий вида L. monocytogenes под микроскопом выглядели в виде английской литеры "V".

При определении подвижности установлено, что все культуры листерий, за исключением штамма L. monocytogenes «1кр14», обладали подвижностью при культивировании в условиях комнатной температуры - 22°С. У большинства культур, выросших при 37°С, подвижность отсутствовала. Штамм «1кр14» не обладал подвижностью при обоих температурных режимах. Штаммы L. monocytogenes «1кр10» и «1кр4», «рыба №6» и изоляты L. innocua «1228», «1229»,

«1231», «1232», «1-1», наоборот, обладали подвижностью как при 22°С, так и при 37°С.

Определение бихимическнх свойств L. monocytogenes и L. innocua: При определении способности продуцировать каталазу выявлено, что все исследуемые штаммы и изоляты образуют каталазу, кроме референтных штаммов L. monocytogenes «66», «10527» и «10888».

При исследовании биохимических свойств листерий с использованием наборов СИБ, сред Гисса все штаммы имели отрицательную реакцию по оксидазе, индолу и сероводороду. Кроме того, реакция была отрицательной по уреазе. Изолят L. innocua 1231 отличался от других штаммов и изолятов по D-маннозе.

Была показана мономорфность проявления ферментативной активности в отношении многих Сахаров, а именно: сахарозе (штамм L. monocytogenes 243 положителен по сахарозе), а-галактозидазе, (5- галактозидазе,, маннозе, салицину и D-трегалозе (L. innocua «1-1» положителен по D-трегалозе) при испытании исследуемых культур на бактериологическом анализаторе VITEK2 Compact. В отличие от других штаммов, положительную реакцию по аспарат-ариломидазе наблюдали у штаммов L. monocytogenes «рыба №6», «СЭС-36», «СЭС-37», «1крЗ», «1кр7», «1кр10», «1кр14», «1кр24» и «634», а также у изолятов L. innocua 1228, 1232. Все штаммы не образовывали кислоту из D-галактозы и D-рибозы, за исключением штамма L. monocytogenes «1кр10» и изолята L. innocua 1231.

2.3.2. Гемолитическая и фосфолипазная активность Основными факторами патогенное™ листерий являются листериолизин О и фосфолипаза С.

При изучении гемолитической и фосфолипазной активности были получены следующие результаты:

23 из 41 культуры L. monocytogenes продуцировали гемолизины на высоком уровне, 15 - на среднем уровне. Штаммы «1кр14», «82» вырабатывали гемолизины па низком уровне. Штамм «10528» L. monocytogenes не вырабатывал экзотоксины, вызывающие деградацию красных кровяных телец.

38 из 41 штамма и изолята L. monocytogenes продуцировали фосфолипазу С на высоком уровне, 2 штамма L. monocytogenes - на низком уровне. Штамм L. monocytogenes «10528» не продуцировал данный экзотоксин. У всех изолятов L. innocua фосфолипазная активность отсутствовала, т.к. данный вид бактерий не является патогенным для макроорганизмов.

2.3.3. Патогенные свойства

При определении патогенности на белых мышах выявлено, что все штаммы и изоляты L. monocytogenes, при введении суспензии суточной культуры в концентрации 1 х 109 КОЕ в объеме 0,5 см3 внутрибрюшинно, были патогенны [1, 8].

При заражении штаммами L. monocytogenes «1кр14», «10528», «82» и «15» падеж подопытных животных отсутствовал, но наблюдали следующие клинические признаки: взъерошенный шерстный покров, угнетение и нарушение координации движения.

С целью подтверждения специфичности заболевания во все опытах по изучению патогенных свойств проводили отбор проб головного мозга, крови и внутренних органов. Все исследуемые культуры, выделенные от павших и вынужденно убитых мышей, были идентифицированы как бактерия вида L. monocytogenes.

Вирулентность листерий определяли по значению летальной дозы LD50. В зависимости от величины LD50 штаммы и изоляты листерий разделили на 5 групп [10]:

- высоковирулентные штаммы - LD50 в пределах от 104 до 105 КОЕ;

- вирулентные штаммы - LD50 в пределах 10б КОЕ;

- умеренновирулентные штаммы - LD50 составляет 107 КОЕ;

- слабовирулентные штаммы - LD50 составляет 10s- Ю9КОЕ;

- авирулентные штаммы - показатель LD50 не титруется (LD100 свыше 109

КОЕ).

Большинство исследуемых штаммов и изолятов L. monocytogenes были высоковирулентные (табл. 2) по отношению к белым мышам, 6 - вирулентные, 6 штаммов умеренно вирулентные при экспериментальном заражении, 9 были слабовирулентные.

По полученным данным (табл. 2), 3 штамма из 41, а именно штаммы «82», «10528» и «1кр14», являлись авирулентными, т.к. летальная доза при экспериментальном заражении белых мышей составляла >109 КОЕ.

Оценку взаимосвязи между гемолитической, фосфолипазной активностью и вирулентностью определяли с использованием коэффициента корреляции рангов Спирмена [2].

С вероятностью 99% установлена умеренная степень прямой корреляции (rs=0,402) уровня продукции фосфолипазы С с вирулентностью L. monocytogenes.

Также была показана умеренная степень прямой корреляции (rs=0,386) уровня продукции листериолизина О с вирулентностью L. monocytogenes с вероятностью 98%.

Кроме того, была отмечена средняя степень прямой корреляции (rs=0,478) между гемолитической активностью L. monocytogenes и ее способностью продуцировать фосфолипазу С. Таблица 2

Дифференциация штаммов и изолятов L. monocytogenes по ___вирулентности__

№ п/п Наименов. штамма/ изолята LD50 № п/п Наименов. штамма/ изолята LD50

LD,„ (КОЕ) Оценка патогенн. LD,o (КОЕ) Оценка патогенн.

1 ¿.от. L-1 7,0x10' в/в 22 L.m. 1кр14 >10" а/в

2 ¿.от. L-2 1,0x106 в 23 L.m. 1кр22 7,2x10" в

3 L.m. 1кр11 7,1 х104 в/в 24 ¿.от. 1кр24 3,2x10" в

4 L.m. 1кр23 1,8x10' в/в 25 L.m. 191 3,2x107 у/в

5 ¿.от. К-4 1,1 хЮ' в/в 26 L.m. 243 2,2x10" в

6 L.m. рыба№ 6 7,1x10' в/в 27 L.m. 634 7,2x10' у/в

7 L.m. СЭС-30 1,1 X10G в 28 ¿.от. 57 6,9x10' у/в

8 L.m. СЭС-33 2,2x10' в/в 29 L.m. 5214 4,8x10' у/в

9 L.m. СЭС-36 1,5x10' в/в 30 L.m. 66 3,2x10" с/в

10 L.m. СЭС-37 7,2x104 в/в 31 ¿.от. 10527 7,0x10s с/в

11 L.m. 311 4,9x10' в/в 32 ¿.от. 10528 >10'' а/в

12 L.m. 1кр1 2.2x10"' в/в 33 ¿.от. 4883 2,2x10* с/в

13 ¿.от. 1кр2 6,9x10' в/в 34 L.m. 71 1,5x10" с/в

14 L.m. 1крЗ 3,3x10-' в/в 35 L.m. 10888 2,2x10" с/в

15 L.m. 1кр4 7,0x10' у/в 36 L.m. 74 7,0x10" с/в

16 L.m. 1кр5 4,7x10' в/в 37 ¿.от. 19118 3,2x10" с/в

17 L.m. 1кр6 3,3x10-' в/в 38 L.m. 82 >10" а/в

18 L.m. 1кр7 2,2x10' в/в 39 L.m. 15 7,0x10" с/в

19 L.m. 1кр9 4,8x10" в 40 ¿.от. 17 1,1x10" с/в

20 L.m. 1кр10 1,5x10' у/в 41 L.m. 5348 7,0x10" с/в

21 L.m. 1кр12 1,0x10' в/в - - -

Примечание: в/в - высоковирулентный; в - вирулентный; у/в - умеренновирулентный; с/в - слабовирулентный; а/в - авирулентный.

2.3.4. Оптимизация ПЦР-РВ для идентификации L. monocytogenes Следующим этапом работы была оптимизация ПЦР-РВ. При идентификации L. monocytogenes была разработана собственная система праймеров, но данная система оказалась менее чувствительной, чем праймеры L.T. Nguyen (2004) на два цикла (одно разведение) [15].

Оптимальный температурный режим реакции представлен в табл. 1.

Таблица 3

Оценка специфичности пранмеров для L. monocytogenes в ПЦР-РВ

Исследуемые штаммы Наличие экспоненциальной кривой По данным L.T. Nguyen, В.Е. Gillespie

L. monocytogenes 1кр4 + +

L. monocytogenes 1кр 9 +

L. monocytogenes 1кр10 +

L. monocytogenes К-4 +

L. innocua 1228 - -

L. innocua "I-I" - -

Е. coli 338 - -

Bacillus subtilis 6633 - -

Staphylococcus aureus 6538 - -

Salmonella dublin 373 - -

Отрицател. контроль - -

Примечание: « - »- отрицательная реакция;

« + » - положительная реакция.

Специфичность праймеров для L. monocytogenes определяли при идентификации с близкородственными бактериями. Было показано, что у всех бактерий, принадлежащих к виду L. monocytogenes, регистрировали рост флуоресценции выше порогового значения. При исследовании геномов бактерий других родов, а также вида L. innocua уровень сигнала флуоресценции не превышал порогового значения (табл. 3). Полученные результаты соответствуют данным литературных источников [15].

Рис. 2. Определения аналитической чувствительности ПЦР-РВ при идентификации L. monocytogenes (десятикратные разведения)

(ось х - количество циклов; ось у - уровень флуоресценции). Суточную культуру штамма L.monocytogenes «К-4», выращенную на КА,

использовали при определении чувствительности метода ПЦР-РВ.

Чувствительностью метода считали титр выделенной ДНК в наивысшем разведении, имевшим положительный результат в ПЦР-РВ. Для этого делали семь 10-кратных разведений: 1*107 КОЕ/см3, 1хЮ6 КОЕ/см3, 1*105 KOE/см3, 1х104 КОЕ/см3, 1х103 КОЕ/см3, 1х102 КОЕ/см3 10 КОЕ/см3 соответственно. Согласно полученным данным (рис. 2), рост флуоресцентного сигнала свидетельствует о присутствии генома L. monocytogenes в исследуемой пробе. По результатам исследования чувствительность метода составила 1 х 102 КОЕ/см3.

Следующим этапом работы было испытание 33 образцов сырого молока и 134 образцов мясной продукции в ПЦР-РВ для обнаружения генома L. monocytogenes.

В результате проведенных исследований геном L. monocytogenes был выявлен в 10 пробах мясной продукции. Эти данные подтверждены параллельными испытаниями этих же образцов в бактериологическом анализе [3].

С помощью средних значений Ст (пороговый цикл) была получена линейная регрессия зависимости числа порогового цикла ПЦР от разведения в 3-х

Пороговый цикл (Ст)

Рис. 3. Линейность результатов ПЦР-РВ при тестировании 10-кратных разведений выделенной ДНК L. monocytogenes.

Эффективность амплификации составила (Е) 91,4%, которая показывает количество полученных копий на единицу матрицы за 1 цикл.

2.3.5. Усовершенствование идентификации L. monocytogenes масс-спектрометрическим методом

Завершающим этапом работы, для получения достоверных результатов, было создание базы данных, состоявшей из 14 референтных штаммов L. monocytogenes, относящихся к 9 серотипам. Данная база была создана и обозначена как MSP_1 и при дальнейшей работе была включена в общую библиотеку Library BDAL «Bruker» как дополнительная ячейка.

Для создания базы данных использовали сумму из 40 единичных спектров для каждого референтного штамма, отобранных в ручном режиме с мощностью лазера 70%.

При создании базы данных с использованием референтных штаммов L. monocytogenes было выявлено, что все исследуемые штаммы имели общий пик с массой белка 4325±1,7 m/z и интенсивностью не менее 50% (табл. 4). Таблица 4

Определение масс белков, с высокой интенсивностью, референтных __ штаммов L. monocytogenes __

№ п/п Название штамма Сероти п Характерист.бел кового пика № п/п Номер штамма № Сероти п Характерист.бел кового пика

m/z % m/z %

1 10528 4ab 4325.8 4878.9 6427,5 100 76,5 74,2 8 4883 4с 4325,2 4878,0 5301,7 100 82,7 63,3

2 10888 4d 4324,9 5301,4 100 42 9 10527 4Ь 4324,6 4877,3 9753,6 51 100 63,1

3 71 4d 4325,0 5301,2 100 46,6 10 66 4Ь 4325,2 4878,2 9753,5 853 100 62,9

4 19118 4е 4326,2 5302,6 6428,0 100 45,6 51,8 11 82 4ab 4326,2 6427,9 41,7 100

5 74 4е 43253 5301,9 6426,9 100 40.3 39.4 12 15 1-2а 4325,1 6426,3 55 100

6 5214 4а 4324,5 4877,1 9753,7 49,8 100 65,2 13 17 1-2Ь 4325.8 4879.9 9758.7 45,9 100 65,8

7 57 4а 43243 4877,2 9753,8 483 100 68,4 14 5348 1-2с 4325,7 5302,1 100 54,2

Примечание: т/г - масса/время, % - интенсивность,

в качестве примера использовались белки с интенсивностью более 40%.

Штаммы №10528 (сер. 4ab), №10888 (сер. 4d), №19118 (сер. 4е), №4883 (сер. 4с), №5348 (сер. 1-2с), №71 (сер. 4d) и №74 (сер. 4е) имели интенсивность данного пика 100% (табл. 4).

При идентификации 16 штаммов и изолятов L. monocytogenes посредством базы данных производителя «Вгикег» (табл. 5) установлено, что логарифмический показатель видовой принадлежности L. monocytogenes находится в границах от 1,500 до 2,200. Полученные результаты свидетельствовали о возможной вероятности определения вида бактерии (рис. 4). Близкое межвидовое родство бактерий рода Listeria (имеющихся в базе данных «Вгикег») повлияло на идентификацию исследуемых 16 штаммов и изолятов L. monocytogenes. 7 из 16 штаммов были идентифицированы как бактерии вида L. innocua, а именно штаммы L. monocytogenes «634», «1кр11», «1 кр5», «1кр7», «1кр10», рыба №6 и изолят «L-1», которые на самом деле таковыми не являются (идентифицированы как бактерия вида L. monocytogenes бактериологическим анализом).

При исследовании с помощью созданной базы данных MSP1 (табл. 5) все 16 исследуемых штаммов и изолятов были идентифицированы как бактерия вида L. monocytogenes. Логарифмический показатель при идентификации находился в пределах от 2,444 до 2,721. Это свидетельствовало о высокой вероятности определения вида бактерии (рис. 4). По данным, представленным в табл. 5, видно, что большинство штаммов и изолятов L. monocytogenes, а именно штамм «К-4», «1кр9», «СЭС-33», «рыба №6», «1кр10», принадлежали к серотипу 1-2Ь.

Lg Критерий идентификации Оценка 1щентнф.

2.300... 3.000 Высокая веиоишость няентисЬикаиии BiiirJ (+++)

2.000 ... 2.299 Lamurjjmiíiiiiimaa uiB.uui<buK¡iuHiLuuju,_iu)jMuajiaH лкчпиАикаиия Bind (++)

1.700 ... 1.999 Возможная идентификация рода ( + )

0.000... 1.699 Отсутствие надежной и II'H i Hítiiík:)пм|| (-)

Рис. 4. Обработка полученных результатов на масс-спектрометре MALDI Autoflex III.

При анализе видового родства по белковому составу имеющихся в базах данных микроорганизмов получены следующие результаты: единственный штамм бактерий вида L. innocua, имеющийся в базе данных «Bruker», обладал тесным

межвидовым родством с референтными штаммами бактерий вида L. monocytogenes (также заложенных в базу данных прибора) (рис. 4). Возможно, это обусловлено наличием одного набора белков, но с разной степенью интенсивности. Следствием этого являлась большая погрешность при идентификации вида с использованием базы данных «Вгикег». Представленная шкала на дендрограмме показывает относительное межвидовое родство (по белковому составу) между микроорганизмами и выражается в условных единицах (рис. 5, 6, 7) (максимальное значение равно 2000 условных единиц (у.е.)).

На рис. 5 показано, что дистанция между штаммом L. innocua DSM 20649Т и штаммом L. monocytogenes DSM 20600Т базы данных производителя («Вгикег») составляла 140 у.е. Результаты сравнительного анализа штамма L. innocua базы данных «Вгикег» с созданной ячейкой MSP1 представлены на рис. 6.

Результаты, представленные на рис.6, позволяли заключить, что штамм L. innocua DSM 20649Т сильно отличается по белковому составу от референтных штаммов L. monocytogenes MSP1, в отличие от штаммов L. monocytogenes базы данных «Вгикег» (рис. 5).

MSP Dendrogram

ч

Listeria monocytogenes RV412_A1_2010_03 LBK Listeria monocytogenes MB_1601_05 THL Listeria monxftogenes Mb19348_1 CHB Ljsteria monocytogenes sar4B ATCC 19115 THL Listeria monocytogenes DSM 206C0T DSM

140 y.e.

Listeria innocua DSM 20EU9T DSM

Рис. 5. Межвидовое родство бактерий L. innocua и L. monocytogenes базы данных «Вгикег» по белковому составу.

Дистанция между штаммом L. innocua DSM 20649Т и L. monocytogenes ячейки MSP1 составляла 1570 у.е. (рис. 6). Исходя из полученных результатов, межвидовая специфичность бактерий в ячейке MSP_1 по отношению к бактериям вида L. innocua была в И,2 раза выше, чем у базы данных «Вгикег» (рис 5, 6).

Таблица 5

Идентификация н ссротипнрованне бактерий вида L. monocytogenes с использованием базы данных производителя («Вгикег») и _созданной базы MSP 1__

№ Исследуем. База данных производителя «Вгикег» Созданная база MSP 1, встроенная в общую базу

п/п штаммы и Прннадлеж-ть Идентифиц-ый Достов-ть Логарифмич. Прииадлеж-ть Идентифиц-ый Достов-ть Логарифмич.

изоляты к серотипу микроорган. исслед-я показатель (Lg) к серотипу микроорган. исслед-я показатель (Lg)

1 1 кр2 - L. топ. МВ1601 05 ++ 1,976±0,1 4d L. топ. Хг 71 +++ 2,644±0,011

2 К-4 - I. топ. MB 1934В +++ 2,196±0,079 l-2b L. топ. № 17 +++ 2,682±0,023

3 1кр9 - L. топ. МВ1601 05 ++ 1,966±0,024 l-2b L. топ. № 17 +++ 2,721±0,013

4 1крЗ - L. тои.20600Т ++ 1,746±0,02 4а L. топ. № 57 +++ 2,642±0,013

5 634 - L. inn. 20649Т ++ 2,128±0,03 4b L. топ. № 66 +++ 2,587±0,029

6 L-1 - L. inn. 20649Т ++ 2,012±0,045 4b L. топ. № 10527 +++ 2,487±0,018

7 L-2 - L. ШОИ.20600Т ++ 1,972±0,064 4a L. топ. № 5214 +++ 2,583±0,024

8 СЭС-33 - L. топ. MB1601 05 ++ 1,996±0,047 l-2b L. топ. № 17 +++ 2,603±0,013

9 1кр6 - L. топ. MB1601 05 ++ 1,947±0,06 4d L. топ. № 71 +++ 2,576±0,037

10 1 кр 1 1 - L. inn. 20649T + 1,858±0,041 l-2a L. топ. № 15 +++ 2,636±0,015

И 1кр5 - L. inn. 20649T + 1,508±0,04 4d L. топ. № 71 +++ 2,444±0,011

12 1кр4 - L. топ. MB1601 05 + 1,702*0,043 4ab L. топ. № 82 +++ 2,603±0,022

13 1кр23 - L. топ. MB1601 05 + 1,706±0,019 l-2a L. топ. № 15 +++ 2,640±0,03

14 1кр7 - L. inn. 20649T + 1,706±0,039 l-2a L. топ. № 15 +++ 2,675±0,012

15 рыба №6 - L. inn. 20649T ++ 2,18±0,203 l-2b L. топ. № 17 +++ 2,545±0,026

16 1кр10 - L. inn. 20649T ++ 2,066±0,069 l-2b L. топ. № 17 +++ 2,651*0,012

Примечание: 1,700<1^<2,000 - возможная вероятность идентификации вида бактерии (рис. 3), 2,300<Ь§<3,000 - высокая вероятность идентификации вида бактерии (рис. 3);

«-» - принадлежность к серотииу не определена, т.к. прибор не может ее определить в связи с отсутствием референтных штаммов с известным серотипом в базе данных производителя.

MSP Dendrogram

Listeria innocua DSM 20649T DSM Listen« monocytogenes spp10527 ser 4b Listens monocytogenes spp 4883 ser4c Listeria monocytogenes spp 5214 ser 4a Listeria monocytogenes spp 57 ser 4a Listeria monocytogenes spp 17 ser 1-2b Listeria monocytogenes spp 15 ser 1-2« Listens monocytogenes spp 74 ser 4e Listens monocytogenes spp 5343 ser 1-2c Listera monocytogenes spp 71 ser4d Listeria monocytogenes spp 19110 ser 4e Listeria monocytogenes spp 10888 ser 4d Listeria monocytohenes spp 66 ser 4b Listens monocytogenes spp 82 ssr 4%b Listeria monocytogenes spp 10528 s»r4sb

600 500 400 Distance Lev%l

Рис. 6. Межвидовое родство L. innocua базы данных «Вгикег» и monocytogenes созданной ячейки MSP_1.

Так как в общей базе (4125 микроорганизмов) имеется только 1 штамм бактерии вида L. innocua, то для получения более достоверных результатов была создана база данных MSP 2. В данную ячейку входят 5 изолятов бактерий вида L. innocua: «1-1», «1232», «L-М», «L-F» и «L-Р».

Рис. 7. Межвидовое родство бактерии вида L. innocua ячейки MSP_2 и monocytogenes, имеющихся в базе данных «Вгикег».

Для создания базы данных использовали сумму из 40 единичных спектров для каждого изолята, отобранных в ручном режиме с мощностью лазера 75%.

Исследование изолятов в ячейке MSP_2 (рис.7) показало, что дистанция между изолятами L. innocua (ячейки MSP 2) и 5 штаммами L. monocytogenes базы данных «Вгикег» составляла 1390 у.е., в отличие от минимальной дистанции L. innocua DSM 20649Т и штаммами L. monocytogenes базы данных «Вгикег», которая составляла всего 140 у.е. (рис. 5).

По результатам проведенных исследований можно сделать вывод о том, что межвидовая специфичность бактерий в ячейке MSP 2, состоящей из 5 изолятов бактерии вида L. innocua, по отношению к 5 штаммам L. monocytogenes базы данных «Вгикег», была в 9,92 раза выше, в отличие от штамма L. innocua DSM 20649Т, имеющегося в базе данных «Вгикег» (рис. 5, 7).

Как видно из результатов опытов, представленных на рисунках 5, 6, 7, культуры, заложенные в базу данных MSP1 и MSP 2 (для штаммов L. monocytogenes и изолятов L. innocua, соответственно), обладали более выраженной межвидовой специфичностью, чем бактерии, имеющиеся в базе данных «Вгикег».

Последним этапом нашей работы была идентификация бактерий вида L. monocytogenes масс-спектрометрическим методом, с использованием разных баз данных на примере изолята №608, выделенного и идентифицированного классическими методами из свиного шпика, поступившего с предприятий РФ.

О Шгмг*тк!<а|е1Ж!««А1аИ115т 15!6

Л LBiiNi»«*iiiCMflfc»DSH£imi4 1 io

Аимм^мРЯЖЦИ»_______

<+ jilai «гсч U i'i.wia ояшэигем ino ♦ idaiwIoeiDyJaTSTKU_____

Str*tr. bdtatPwt: Ш

> LaioHютоуода« ae ЯмПТ^^

tlr-ra Ttwrr/K. _

Q Ira4ti iu u ct l? и 1Л 9 Ыачтстсо«оягге1в»10Е!вю1Л

■ LiTflvi

9 Wearamc^oMreswEMiU)_

9 Uft«wrcct«te«i!»6ie<b

SdededMSPiflKJCiiietMSRilS!; S|»AuiiSraw[lW [

Примечание: слева - идентификация по базе данных «Вгикег», справа - идентификация по базе данных MSP_1 и MSP_2.

Рис.8 Идентификация изолята L. monocytogenes №608 масс-спектрометрическим методом с использованием разных баз данных. Идентификация изолята №608 масс-спектрометрическим методом с использованием базы данных «Вгикег» (рис. 8) показала, что данный

микроорганизм идентифицирован как бактерия вида L. monocytogenes с логарифмическим показателем, равным 2,232±0,034 - гарантированная идентификация рода и возможная идентификация вида бактерии «++» (рис. 4) по первой позиции (выделено зеленым). Также данный изолят был идентифицирован как бактерия вида L. innocua с логарифмическим показателем 2,193±0,028 -гарантированная идентификация рода и возможная идентификация вида бактерии «++» (рис. 4) по второй позиции (выделено красным). Следовательно, разница между первой и второй позицией была очень мала - 0,035 (2,232-2,193), поэтому утверждение, что данный изолят (образец, нанесенный на лунку планшета) являлся бактерией вида L. monocytogenes — сомнительно, так как он мог являться бактерией вида L. innocua (высокая достоверность определения рода Listeria, низкая достоверность определения вида L. monocytogenes).

Затем мы идентифицировали изолят №608 масс-спектрометрическим методом, используя базу данных производителя, со встроенными ячейками MSP1 и MSP_2 (рис. 7).

По полученным результатам изолят №608 был идентифицирован как бактерия вида L. monocytogenes серотип 4d (штамм №10888), с логарифмическим показателем, равным 2,611 ±0,016 lg — высокая вероятность определения вида бактерии - «+++» (рис. 3) по первой позиции (выделено зеленым). По второй позиции (выделено желтым), исследуемый изолят был идентифицирован как L. monocytogenes серотип 4d (штамм №71), с логарифмическим показателем 2,510±0,022 lg — высокая вероятность определения вида бактерии - «+++» (рис. 3). Таким образом, разница между первой и второй позицией составляла 0,101 lg, с учетом того, что на обеих позициях находилась бактерия вида L. monocytogenes одного серотипа (рис. 7), но разных референтных штаммов (штамм L. monocytogenes «71» и «10888»).

Для сравнения, изолят №608 был идентифицирован как бактерия вида L. innocua с логарифмическим показателем 2,401±0,027 lg по седьмой позиции (выделено красным) (рис. 8). Разница между L. monocytogenes и L. innocua при идентификации с использованием ячеек MSP_1 и MSP 2, встроенных в базу данных «Вгикег», была 0,210 lg (2,611-2,401), что в 6 раз (0,210/0,035) превышало разницу при идентификации данного изолята с использованием только базы данных «Вгикег».

3. Выводы

1. Изучены биологические свойства штаммов и изолятов листерий: 14 референтных штаммов, 24 штаммов (ГНУ «ВНИИВиМ») и 3 изолятов. Все культуры были идентифицированы как L. monocytogenes.

2. Изучена гемолитическая активность бактерий вида L. monocytogenes: 23 из 41 культуры продуцировали гемолизины на высоком уровне, 15 - на среднем уровне. Штаммы «1кр14», «82» вырабатывали гемолизины на низком уровне. Штамм «10528» не продуцировал данный экзотоксин.

3. Изучена фосфолипазная активность бактерий вида L. monocytogenes: 38 из 41 штамма продуцировали фосфолипазу С на высоком уровне, 2 штамма - на низком уровне. Штамм «10528» не вырабатывал фосфолипазу С.

4. При определении вирулентности листерий для лабораторных животных (LD50) было показано, что 38 штаммов и изолятов L. monocytogenes были вирулентны для белых мышей (значение LD50 варьировало в пределах от 104 КОЕ до Ю9КОЕ), 3 штамма были авирулентны.

5. Усовершенствована схема выделения и идентификации L. monocytogenes из патологического материала и пищевых продуктов. На этапе выделения чистой культуры была использована среда Агости-Оттавиани с селективными добавками и Колумбийский агар, а для идентификации L. monocytogenes были применены методы ПЦР-РВ и MALDI-TOF, что позволило сократить время выделения и идентификации L. monocytogenes с 4-6 (суток) до 2 суток.

6. Оптимизированы условия постановки ПЦР-РВ для выявления генома листерий в образцах пищевых продуктов и патологического материала. Посредством данного метода были идентифицированы 38 штаммов и 3 изолята данного вида. При испытании 167 образцов пищевых продуктов в ПЦР-РВ было обнаружено 10 проб, контаминированных бактерией L. monocytogenes (5,9% положительных проб).

7. Результаты изучения биологических свойств штаммов и изолятов L. monocytogenes и L. innocua, а также масс-спектрометрический анализ межвидового родства листерий по белковому составу послужили основой для создания базы данных (MSP1+MSP 2) при идентификации бактерий рода Listeria посредством

MALDI-TOF.

4. Список литературы

1. Бакулов И.А., Васильев Д.А. Листериоз как пищевая токсикоинфекция: монография. - Ульяновск, 1991. - 78 с.

2. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М.: Практика, 1999. - 351 с.

3. ГОСТ Р 51921-2002. Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes. - М.: Госстандарт России, 2002. - 18 с.

4. Карпова Т.Н., Ермолаева С.А., Лопырев И.В. Новые методы идентификации Listeria monocytogenes // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2001. - № 3. - С. 266-273.

5. Котлярова Г. А. Биологические свойства L-форм Listeria monocytogenes: автореф. дис. канд. биол. наук — Покров, 1970. — 20 с.

6. Методические рекомендации «Идентификация микроорганизмов с применением масс-спектрометра «microflex MALDI Biotyper» при исследовании продовольственного сырья и пищевых продуктов» / ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория, Россельхознадзор. - М., 2011.

7. Поставит В.А., Львов Д.К. Пищевые токсикоинфекции. - М.: Сокол, 1993.

-68 с.

8. Сапенко Т.П. Механизмы и роль освобождения поверхностного белкаАЛА во взаимодействии Listeria monocytogenes с эпителиальными клетками. - М.: НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, 2006. - 102 с.

9. Страчунский Л.С., Козлов С.Н. Антибиотики: клиническая фармакология. -Смоленск: АМИПРЕСС, 1994.-208 с.

10. Суняйкин А.И. Методические рекомендации по комплексной оценке культур Listeria monocytogenes на основе изучения фенотипических и генетических характеристик / ГНУ «ВВНИИВиМ». - Покров, 2010.

11. Antimicrobal resistance of Listeria monocytogenes human strains isolated since 1926 in France / C. Morvan, A. Moubareck, M. Leclercq [et al.] // Lirvo de actas do congresso: ISOPOL XVII. - Porto, 2010. - P. 108.

12. Antimicrobal susceptibilities of Listeria monocytogenes isolated in Japan / S. Monden, A. Okutani, H. Suzuki [et al.] // Lirvo de actas do congresso: ISOPOL XVII. -Porto, 2010.-P. 73.

13. Antimicrobal susceptibility among Listeria monocytogenes isolates from nonhuman sources in France over a ten year period / S. A. Granier, C. Moubarek, C. Colaneri [et al.] // Lirvo de actas do congresso: ISOPOL XVII. - Porto, 2010. - P. 63.

14. Application of 5-nuclease PCR for quantitative detection of Listeria monocytogenes in pure cultures, water, skim milk, and unpasteurized whole milk / H.K. Nogva, K. Rudi, K. Materstad [et al.] // Appl. Envir. Microbiol. - 2000. - Vol. 66. - P. 4266-4271.

15. Detection of Escherichia coli 0157:H7 and Listeria monocytogenes in beef products by real-time polymerase chain reaction / L.T. Nguyen, B.E. Gillespie, H.M. Nam, [et al.]//Foodborne Pathogenic and Disease.-2004.-Vol. 1, №4.-P. 231-240.

16. MALDI MS. A practical guide to instrumentation, methods and applications / ed. F. Hillencamp, J. P. Katalinic // Wiley, 2007. - 346 p.

5. Список работ, опубликованных автором по теме диссертации

1) Пискунов А.В. Шадрова Н.Б., Ручнова О.И. Изучение биологических свойств изолятов Listeria monocytogenes "L-l", "L-2" и Listeria innocua "1-1" // Ветеринария и кормление. - 2010. - № 6. - С. 46-47.

2) Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии для идентификации бактерий рода Listeria Í Пискунов А.В., Прунтова О.В., Шадрова Н.Б., Ручнова О.И. // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. М., - 2011. - Т. 9. -С. 242-249.

3) Пискунов А. В., Шадрова Н. Б. Анализ биологических свойств штаммов Listeria monocytogenes II Ветеринария и кормление. - 2011. - № 6. - С. 40-41.

4) Пискунов А. В., Прунтова О. В., Перевозчикова Н. А. Разработка ПЦР-РВ для идентификации Listeria monocytogenes в пищевых продуктах // Ветеринария и кормление. - 2012. - № 5: [материалы 3-й Междунар. науч.-практ. конф. "Достижения молодых ученых - в вет. практику"]. - С. 38-40.

5) Выявление Mycoplasma sp. 1220, вызвавшей случаи заболевания у гусей / Спрыгии А.В., Волохов Д.В., Бабин Ю.Ю., Пискунов А.В., Ирза В.Н. // Ветеринария сегодня. - 2013. - № 2 (5). - С. 23-28.

6. Список сокращений

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; КА - Колумбийский агар; КОЕ - колониеобразующая единица; МПБ - мясо-пептонный бульон; МУК - методические указания;

ХА - агар на основе мясного гидролизата по Хоттингеру; ХБ — бульон на основе мясного гидролизата по Хоттингеру; ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в «реальном времени»;

РФ - Российская Федерация;

СИБ - системы индикаторные бумажные;

Ст — пороговый цикл;

GP - gram-positive identification card - карты для идентификации ферментирующих и неферментирующих грамположительных бактерий; LD50 - 50% летальная доза;

MALDI - (matrix-assisted laser desorption/ionization) - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация;

MSP - mass-spectrum peptide - масс-спектр белка; RTC - real-time clock - режим «реального времени».

Подписано в печать 12 ноября 2013 г. Формат 60x90 1/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 80 экз. Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата ветеринарных наук, Пискунов, Антон Валерьевич, Владимир

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных»

На правах рукописи

04201450536 Пискунов Антон Валерьевич

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ LISTERIA MONOCYTOGENES

06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научный руководитель -

доктор биологических наук, профессор

ПРУНТОВА Ольга Владиславовна

ВЛАДИМИР - 2013

.j

Оглавление

Введение...................................................................................4

1. Обзор литературы......................................................................9

1.1. Экология л истерий.....................................................................9

1.2. Распространение в природе.........................................................10

1.3. Листериоз как пищевая токсикоинфекция.......................................11

1.4. Таксономия листерий................................................................14

1.5. Культурально-морфологические свойства L. monocytogenes................14

1.6. Биохимические свойства листерий................................................18

1.7. Антигенная структура листерий...................................................19

1.8. Патогенность листерий................................................................20

1.9. Факторы патогенности листерий..................................................21

1.10. Усовершенствованные и «быстрые» методы выделения и идентификации листерий.................................................................25

1.11. Использование ПЦР в диагностике листериоза27

1.12. Масс-спектрометрия как метод идентификации микроорганизмов......30

1.13. Заключение по обзору литературы..............................................33

2. Собственные исследования...............................................................35

2.1. Материалы............................................................................35

2.1.1. Культуры (штаммы и изоляты) микроорганизмов............................35

2.1.2. Питательные среды..................................................................35

2.1.3. Растворы и химреактивы............................................................37

2.1.4. Краски для микроскопических исследований.................................39

2.1.5. Оборудование........................................................................39

2.1.6. Животные............................................................................41

2.2. Методы.................................................................................41

2.2.1. Получение бактериальной массы................................................41

2.2.2. Методы определения культурально-морфологических свойств.........41

2.2.3. Методы определения биохимических свойств...............................42

2.2.4. Определение концентрации живых микробных клеток....................43

2.2.5. Методы определения чувствительности к антимикробным препаратам..................................................................................43

2.2.6. Определение гемолитической и фосфолипазной активности.....................43

2.2.7. Определение патогенности штаммов и изолятов.............................43

2.2.8. Идентификация листерий в ПЦР-РВ...........................................45

2.2.9. Идентификация листерий на масс-спектрометре MALDI..................47

3. Результаты собственных исследований..........................................48

3.1. Получение штаммов и изолятов листерий.......................................48

3.2. Определение биологических свойств культур (штаммов и изолятов)

L. monocytogenes ylL. innocua............................................................50

3.2.1. Тинкториальные свойства........................................................50

3.2.2. Морфология колоний..............................................................51

3.2.3. Культуральные свойства листерий и определение подвижности........52

3.2.4. Биохимические свойства.........................................................54

3.2.5. Гемолитическая активность......................................................57

3.2.6. Фосфолипазная активность......................................................59

3.2.7. Патогенные свойства...............................................................61

3.2.8. Изучение чувствительности к антибактериальным препаратам.........67

3.3. Оптимизация ПЦР-РВ для идентификации L. monocytogenes...............70

3.4. Усовершенствование идентификации L. monocytogenes масс-спектрометрическим методом...........................................................74

4. Обсуждение результатов............................................................91

5. Выводы.................................................................................104

6. Практические предложения......................................................106

7. Список литературы..................................................................107

8. Список сокращений.................................................................133

9. Приложения

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Listeria monocytogenes является причиной возникновения листериоза у животных и человека. В настоящее время данное заболевание все чаще регистрируется в виде пищевой токсикоинфекции. Это обусловлено повсеместным распространением листерий в природе, полиморфизмом клинических признаков болезни, высоким уровнем летальности при генерализированных формах инфекции, возрастающими объемами оборота кормов и пищевых продуктов (в частности продуктов быстрого питания). Учитывая способность листерий размножаться в готовых к употреблению пищевых продуктах, хранящихся в холодильниках при низких температурах (при +4°С), перерабатывающая и пищевая промышленность вынуждена расходовать огромные средства для предотвращения выпуска контаминированной продукции [19, 64].

Роль эпидемических вспышек возрастает в связи с потреблением пищевых продуктов, так 28 сентября 2011 г. произошла крупная вспышка пищевого листериоза в США, при которой было госпитализировано 90 человек, 13 человек погибло, источником заражения были дыни. 22 ноября 2012 года в 13 штатах и в округе Колумбия при вспышке пищевого листериоза заболело 20 человек, 4 из которых скончались. Источником заражения явился сыр «Рикотта», поступивший из Италии [110]. Снижение резистентности макроорганизма увеличивает риск возникновения пищевого листериоза [ 117, 163, 167].

Листериоз протекает наиболее тяжело у людей с первичными и вторичными иммунодефицитами, т.е. у беременных и новорожденных, пожилых людей, лиц, получающих стероидные препараты, иммунодепрессанты, злоупотребляющих алкоголем и наркотиками, ВИЧ-инфицированных [170, 217].

Работы по изучению листерий показывают, что L. monocytogenes адаптируется к факторам окружающей среды, особенно под воздействием

антропогенных факторов (применение антибиотиков, консервантов, дезинфицирующих средств и т.п.). Адаптация листерий выражается в изменении их биологических свойств. В основном адаптивные изменения проявляются невосприимчивостью к антибактериальным препаратам определенных групп, способностью образовывать биопленки, появлением авирулентных и слабовирулентных форм бактерий [35, 92, 93, 94, 183].

В РФ испытания пищевого сырья и пищевых продуктов на контаминацию L. monocytogenes проводят в соответствии с ГОСТ Р 519212002 бактериологическими методами, которые включают в себя выделение, идентификацию чистой культуры и постановку биопробы [5, 24]. За рубежом для идентификации бактерий вида L. monocytogenes, помимо классических методов, используют инструментальные методы идентификации [109, 202, 218,219].

Учитывая вышеизложенное, усовершенствование методов выделения и идентификации изолятов и штаммов L. monocytogenes, выделенных на территории РФ и за рубежом, имеет научное и практическое значение. Наша работа позволит дать качественную оценку циркуляции возбудителя пищевого листериоза, а усовершенствование методов выделения и идентификации листерий даст возможность выявлять возбудителя в пищевых продуктах и продуктах животного происхождения в кратчайшие сроки.

Цель и задачи исследований.

Основной целью данной работы являлось усовершенствование методов выделения и идентификации бактерий рода Listeria, в частности вида L. monocytogenes, полученных из различных пищевых продуктов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить культурально-морфологические и биохимические свойства референтных штаммов и изолятов L. monocytogenes и L. innocua при помощи традиционных бактериологических методов.

2. Охарактеризовать штаммы и изоляты по патогенности и

вирулентности на белых мышах.

3. Усовершенствовать схему выделения и идентификации L. monocytogenes из патологического материала и пищевых продуктов.

4. Оптимизировать метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для идентификации L. monocytogenes.

5. Создать базу данных для идентификации бактерий рода Listeria методом MALDI-TOF.

Научная новизна работы.

В результате проведенных исследований получено: 3 изолята L. monocytogenes и 5 изолятов L. innocua. Данные изоляты заложены в коллекцию бактериальных культур ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» референтной лаборатории болезней КРС, после изучения биологических свойств.

Изучены биологические свойства 14 референтных штаммов и 27 изолятов L. monocytogenes.

Усовершенствована схема выделения L. monocytogenes из патологического материала и пищевых продуктов.

Оптимизирована полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для идентификации L. monocytogenes.

Создана база данных для идентификации L. monocytogenes масс-спектрометрическим методом (MALDI Autoflex).

Практическая значимость работы.

В результате проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по выявлению генома L. monocytogenes в пищевых продуктах методом ПЦР-РВ», одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» (протокол № 6, 28.06.13), и «Методические рекомендации по идентификации L. monocytogenes с применением масс-спектрометра Autoflex MALDI biotyper», одобренные ученым советом и утвержденные директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» (протокол № 6, 28.06.13).

В коллекцию бактериальных культур ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», референтной лаборатории болезней КРС, после изучения биологических свойств заложены следующие изоляты: L. monocytogenes «Ь-1», «Ь-2», «№608» и L. innocua «1-1», «1228» «1229», «1231», «1232».

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты изучения биологических свойств 27 штаммов и изолятов L. monocytogenes, 14 референтных штаммов L. monocytogenes и 5 изолятов L. innocua;

- определение патогенности и вирулентности изолятов и референтных штаммов L. monocytogenes на белых мышах;

- оптимизация ПЦР-РВ для идентификации бактерий рода Listeria;

база данных для идентификации L. monocytogenes масс-спектрометр ическим методом.

Апробация результатов работы.

Основные материалы доложены и опубликованы в материалах научных конференций: «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику», посвященной 30-летию создания СМУ ФГБУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2010 г.), «Трансмиссивные заболевания животных: актуальные аспекты биобезопасности и контроля» (г. Алушта, Украина, 2012 г.), «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2012 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 20092012 гг.

Публикации результатов научных исследований.

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ в журналах и материалах научных конференций, 3 из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад аспиранта.

Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с Шадровой Н.Б., Спрыгиным А.В.,

Третьяковым А.В., Егоровой И.Ю., за что автор выражает им сердечную благодарность.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 134 страницах компьютерного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, выводы, практические предложения. Список литературы включает 226 источников: 86 отечественных и 140 зарубежных. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 20 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.

Благодарность.

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории, химического анализа, референтной лаборатории болезней КРС, лаборатории микробиологии ФГБУ «ВНИИЗЖ» а также лаборатории бактериологии (ГНУ «ВНИИВВиМ», г. Покров) за оказание консультационно-методической помощи.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Экология листерий

Листерии - микроорганизмы, широко распространенные в природе. Их присутствие в почве, водных источниках и растениях доказано научными исследователями. По данным В.И. Гершуна способность листерий размножаться в почве зависит от сезона года (температуры), фитомассы (гумуса), влажности и показаний рН. В почве с влажностью 15 - 26 % листерии не размножаются и их концентрация со временем снижается. При 40%-ной влажности почвы концентрация листерий увеличивается в 7 - 11 раз, а при влажности 55 - 70 % их количество увеличивается в 100 - 400 раз по отношению к первоначальному показателю [7, 12, 19, 20].

Наличие листерий в фекалиях животных и человека вызывает загрязнение сточных и поверхностных вод, что способствует возникновению вспышек листериоза [45, 136]. Так одним из главных факторов передачи возбудителя является водный фактор N. Stamatin с соавторами (1957) выделяли культуру листерий из поймы реки, причем источником заражения являлось мясоперерабатывающее предприятие, расположенное выше по ее течению [9, 63, 72]. По данным американской группы исследователей, изучавших распространение листерий в эстуарных водах Калифорнии, листерии были обнаружены в 81% случаев в пресной и слабосоленой воде. Причем вид Listeria monocytogenes доминировал в пресной воде, к которой имели доступ домашние и с/х животные [164, 210].

Высокая метоболическая пластичность листерий обуславливает их способность переходить из окружающей среды, где они ведут сапрофитический образ жизни, в организм теплокровных, в котором они проявляют свои паразитарные свойства, и снова реверсировать к сапрофитизму при возврате в окружающую среду [73, 131].

Из городских сточных вод Н. Geuenich, U. Miiller (1984) изолировали 697 штаммов листерий, 84% из которых составляли L. monocytogenes. Наиболее зараженной оказались малорастворимая и нерастворимая части

сточных вод. Эти авторы установили, что при биологической очистке не происходит снижения количества листерий в них, а даже наоборот, отмечали их размножение. Авторы предполагали, что листерии при биологической очистке размножаются внутриклеточно в организмах простейших [45].

В воде при оптимальных условиях листерии сохраняют свою жизнеспособность до 730 дней. В искусственно «инфицированной» воде, в летний период при колебании температуры воды от 7 до 23 °С, листерии сохраняли жизнеспособность до 70 дней. В зимний период, при колебании температур от +2 до состояния «лёд» - более 5 месяцев [80].

Устойчивость листерий к физико-химическим факторам очень высока, так например, при умеренных и низких температурах в почве листерии сохраняются и размножаются в течение 3 месяцев. Летом, при температуре 26 - 32°С, листерии сохраняются в почве до 30 дней, в навозе - 20 и в навозной жиже - 27 дней. Листерии способны к размножению в широком диапазоне температур (от +4 до +45°С), рН (4,9 - 8,0) и влажности (40-70%), в присутствии неорганических солей, например, №С1 (до 20%), и углекислого газа (до 15%) [12, 55, 78].

1.2. Распространение в природе По данным И.И. Гуславского (1980) листерии выделены от 103 видов животного мира. Это свидетельствует о повсеместном распространении листерий на земном шаре [26].

Резервуаром возбудителя в природе являются многие виды диких и синантропных грызунов, дикие травоядные и птицы, домашние и сельскохозяйственные животные (свиньи, мелкий и крупный рогатый скот, лошади, кролики), а также домашняя и декоративная птица (гуси, куры, утки, индюшки, голуби, попугаи и канарейки). Листерии также обнаружены у зайцев, леммингов, бобров, белок, лисиц, норок, енотов, песцов, диких копытных и птиц, а также в рыбе и морепродуктах [55, 57]. Основными переносчиками листериоза в дикой природе являются иксодовые и гамазовые клещи, вши, блохи, а также личинки оводов. Резервуаром листерий также

могут служить земноводные и пресмыкающиеся. Случаи заболевания листериозом наблюдали у собак и обезьян [45].

Чаще всего листериозом болеет мелкий рогатый скот, в частности овцы. Например, в Германии из 497 выделенных патогенных штаммов листерий 462 (93%) были выделены от овец [45].

Широкое распространение возбудителя инфекции во внешней среде обусловлено разнообразием механизмов и факторов передачи возбудителя листериоза. В естественных условиях листерии проникают в организм человека и животных через желудочно-кишечный тракт, органы дыхания, глаза, слизистые оболочки, поврежденную кожу, а также плаценту [78].

1.3. Листериоз как пищевая токсикоинфекция Пищевой листериоз - это инфекционное заболевание животных и человека. Несмотря на относительно невысокую заболеваемость человека, случаи смертельных исходов у заболевших регистрируются часто, особенно у людей с пониженным иммунитетом - это беременные женщины, новорожденные и люди пожилого возраста. Летальность составляет до 80% [47]. Листериоз у людей проявляется в следующих клинических формах: аборты и мертворождения у беременных женщин, септицемия и менингоэнцефалиты у новорождённых детей, глазожелезистая и ангинозно-железистая формы у подростков, листериозный сепсис у новорождённых, ангины, менингоэнцефалиты, урогенитальная патология у взрослых. Доминирующим проявлением инфекционного состояния при пищевом листериозе является здоровое носительство [5, 40].

До 1960 г. пищевой листериоз человека был редкостью. В 1960—1982 гг. сообщалось уже о боле