Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование методов лабораторной диагностики листериоза

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савельева, Лариса Владимировна, Саратов

г: уу-з/ык-и

САРАТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.И.ВАВИЛОВА.

На правах рукописи

Савельева Лариса Владимировна

Усовершенствование методов лабораторной диагностики лис-

териоза.

03.00.07 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель профессор, доктор медицинских наук, Л. Ф.Зыкин

САРАТОВ 1999Г

- 2 -СОДЕРЖАНИЕ

Введение.................................................. 4

1. Литературный обзор..................................... 8

1.1. Возбудитель листериоза........................ 8

1.2. Листериоз как пищевая инфекция................ 17

1.3. Лабораторная диагностика листериоза........... 26

1.4. Методы генодиагностики листерий............... 36

Собственные исследования.................................. 40

2. Материалы и методы.......................................40

2.1. Штаммы.........................................40

2.2. Оборудование для метода косого освещения.......40

2.3 Метод холодового обогащения....................41

2.4. Конструирование новой селективной среды........41

2.5. Материалы для ПЦР..............................41

3. Конструирование селективной среды.......................43

3.1. Свойства штаммов...............................43

3.2. Выбор основы для селективной среды.............51

3.3. Выбор селективных добавок......................52

3.4. Апробация селективной среды в экспериментальных условиях.....................59

4. Применение усовершенствованных методов диагностики листериоза..............................................64

4.1. Апробация сред при исследовании пищевых продуктов и патматериала.......................65

4.2. Просмотр чашек под стереомикроскопом

в косопроходящем свете.........................70

4.3. Метод холодового обогащения....................71

4.4. ПЦР при диагностике листериоза.................73

Обсуждение результатов.....................................81

Выводы.....................................................86

Практические предложения....................................87

Список литературы..........................................88

Приложение................................................110

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Аг - антиген Ат - антитело

ИФА - иммуноферментный анализ

КОЕ - колонийобразующие единицы

МФА - метод флюоресцирующих антител

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РЛА - реакция латекс-агглютинации

РКОА- реакция коагглютинации

РИГА- реакция непрямой гемагглютинации

РНФ - реакция нарастания титра бактериофага

РСК - реакция связывания комплемента

ХЛ - хемолюминисценция

ВВЕДЕНИЕ

Листериоз является тяжелым инфекционным заболеванием многих видов животных и человека.С 1956 по 1990 г.г. в стране заболело листериозом 572584 животных. Летальность 33,1%. В 1992г. заболело 5962 животных, пало 2000. Из числа заболевших 77% падает на мрс(Бакулов И.А., Котляров В.М., 1992).В 1991-95гг. в РФ было обследовано на листериоз 6582 человека и выделено 14 культур.За этот период исследовано 54224 объекта внешней среды и изолировано 73 культуры (Опочинский Э.Ф., Тясто A.C., 1996). За последние годы возрос интерес, к этой инфекции. Участившиеся случаи этой болезни, широкая контаминация листериями пищевых продуктов и объектов внешней среды приводит к крупным вспышкам (Danleis-son-Tham M.-L., Jutell I. е.a. 1995; Seeliger H. 1988). Новая обстановка заставляет искать более совершенные методы лабораторной диагностики листериоза. Оказалось, что листериоз - сапроноз-ная инфекция т.е. возбудитель не только длительно переживает, но и размножается во внешней среде (Пушкарёва В. И., Емельяненко E.H.,Литвин В.Ю. и др. 1997). Листериозу подвержены не только беременные женщины и их потомство, но и люди пожилого возраста с отклонениями в иммунной системе, особенно принимающие корти-костероиды, которые используются при удалении опухолей, пересадке органов и т.п. Нередко возникают листериозные абсцессы после проведения полостных операций, часто в тканях, окружающих фистулу, у больных, находящихся на постоянном гемодиализе. (Козлова Д.И., Котляров В.М. и др. 1994; . J.McLauchlin, J.C.Low 1994; J.McLauchlin, L.Newton 1995).

В последние годы вспышки листериоза показали, что частой причиной инфекции являются пищевые продукты и корма (Бакулов И.А. и Васильев Д.А., 1991; Столярова Л.Г., ЕршиковаЮ.Е. 1997; Pospisal Е. 1988; Lieve M.F. е.а. 1995). В Саратовской области в 1989-93г.г.при бактериологическом исследовании на листериоз было обследовано 5282 овцы и выделено.87 культур, серологически в РСК за этот период исследовано 543285 овец и получено 1288 положительных результатов (Отчеты ветеринарного управления Саратовской области о заразных заболеваниях по форме 1-вет, 1989-93). За 1997 год в Перинатальном центре г.Энгельса была выделена 31 подтвержденная культура L.monocytogenes, когда обследованию были подвнргнуты 125 новорожденных и 38 рожениц(Михайлов А.В.и др., 1997).Число пунктов, неблагополучных по листериозу овец, в 10 раз превышает таковых по крупному рогатому скоту и в 7 раз - по свиньям. В РФ установлено 110 очагов листериоза крупного рогатого скота (Бакулов И.А. 1995).

Лабораторная диагностика листериоза в настоящее время включает методы: бактериологичекие (микроскопические исследования, культивирование), серологические (РСК, РИГА, РА) и патологоана-томические исследования.

Однако лабораторная диагностика этой инфекции нуждается в усовершенствовании, особенно в части разработки новых селективных сред для выделения листерий из кормов и пищевых продуктов, а также внедрении методов нового поколения, таких как полимеразная цепная реакция, иммуноферментный анализ, реакция Ко-агглютина-ции, Латекс-агглютинации и другие.

В литературе недавно появилось сообщение Martin R.S. е.а. (1995) об использовании метода просмотра чашек под стереомикрос-

копом при косом освещении. Авторы высоко оценивают эффективность этого метода. У нас для диагностики листериоза этот метод не применялся, хотя например, для обнаружения холерного вибриона он хорошо себя зарекомендовал (Донская Т.Н. и др., 1968):

За рубежом для диагностики листериоза широко применяются методы генодиагностики, в частности полимеразная цепная реакция (Со^еуп ЕЛ., 1991). В нашей стране она только начинает применяться, но уже доказано, что ПЦР является высоко эффективной и чувствительной (Ермолаева С.А., Зигангирова Н.А., 1994).

Цель исследования: целью настоящей работы являлось усовершенствование методов лабораторной диагностики листериоза: бактериологических (селективная среда, применение метода косого осве-щенйя колоний под стереомикроскопом, сред для холодового обогащения листерий), экспресс-методов (полимеразная цепная реакция).

Для выполнения поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. Разработать и апробировать селективную среду для выделения листерий из пищевых продуктов и кормов.

2. Применить метод косого освещения колоний под стереомикроскопом для выявления колоний листерий.

3. Усовершенствовать метод холодового обогащения для диагностики листериоза.

4. Применить полимеразную цепную реакцию для ускоренной диагностики листериоза.

Научная новизна:

Впервые в нашей стране предложена селективная среда, позволяющая выделять листерии и задерживать рост не только контамини-

рующих бактерий, но и грибов. Впервые применена модификация метода косого освещения колоний листерий под стеремикроскопом, отличающаяся от устройства, которое использовали иностранные исследователи (Martin R.S. е.а., 1995). Усовершенствован метод холо-дового обогащения для изоляции листерий. Была изучена возможность применения ПЦР для обнаружения листерий в молоке и показана высокая специфичность и чувствительность.

Практическая значимость:

1) Нбвая селективная среда используется при проведении занятий со студентами факультета ветеринарной медицины института ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского аграрного университета им.Н.И.Вавилова, а также в лаборатории Перинатального центра г.Энгельса.

2) Состав среды опубликован в Информационном листке 166-97

3) Подтверждено,, что молоко является важным фактором передачи возбудителя листериоза в Саратовской области.

Основные положения выносимые на защиту:

1) Обоснование и практическое применение усовершенствованных методов лабораторной диагностики листериоза: новой селективной среды, метода просмотра чашек с посевами под стереомикроскопом при косом освещении и холодовое обогащение.

2) Апробация нового эффективного метода лабораторной диагностики листериоза - полимеразной цепной реакции - ПЦР.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Возбудитель листериоза. .

Листериоз - инфекционная болезнь многих видов животных и человека. Эта болезнь проявляется в разных клинических формах, чаще всего с картиной поражения центральной нервной системы и половых органов. Возбудитель болезни является Listeria monocytogenes - короткая, грамположительная палочка, не образующая спор, правильной формы, размером 0,4-0,5 на 0,5-2мкм, с закругленными концами. Располагается в мазках либо поодиночно, либо в виде частокола, римской цифры V. В мазках из инфицированного материала или из жидкой среды встречаются листерии коккобактериальной формы размером 0,4-0,5x0,4-0,бмкм, Они могут ошибочно быть приняты за стрептококки. В более зрелых культурах могут встречаться формы в виде нитей длиной 6-20мкм. В старых культурах листерии теряют способность к сохранению окраски по Граму. Некислотоустойчивы, Smit S.(1962)(цит. по Бакулову И.А., Васильеву Д. А., 1991) сообщил о наличии мукополисахаридной капсулы у листерий. Г.М.Сомов с соав. (1997) при электоронной -микроскопии ультратонких срезов листерий на поверхности клеточной стенки обнаружил остатки капсида. Авторы утверждают, что листерии имеют микрокапсулу, величина которой варьирует у разных штаммов и выявляется лучше в случае выращивания при низкой температуре.

Листерии аэробы. Температурный диапазон роста от +1 до +44 С.

Однако, культура остается жизнеспособной и при более высоких температурах (до -70° - + 71°С). Температурный оптимум +25-37 С Листерии способны рости и размножаться в диапазоне рН=7,2-7,4. В аэробных условиях на кровяном агаре при +25-37° С и при рН=7,2-7,4 суточный рост листерий появляется в виде росинчатых колоний. Позднее колонии листерий становятся более крупными, серо-белыми. Они окружены узкой, но отчетливо видимой зоной бета-гемолиза. В аэробных условиях на МПА в оптимальном температурном диапазоне через 24-48 часов колонии имеют диаметр 0,5-1 мм, круглые, полупрозрачные в виде капли, выпуклые, с ясно очерченной поверхностью и ровными краями. При просмотре сбоку колонии преобретают голубоватый оттенок. В полужидкой 0,25% агаровой среде суточный рост по ходу укола. На МПБ растет медленно, но через 24-48 часов проявляется нежное, слабое помутнение при встряхивании образует поднимающуюся вверх косичку. Листерии являются типичными психрофилами т.е. способны существовать и размножаться при низких температурах. Так Kovgardn S.(1988)(цит. по Бакулову И.А., Васильеву Д.А.,1991) считает, что листерии обладают уникальной способностью размножаться при очень низкой температуре воды. Djeneich G (1985)(там же, с.24) изучал очищенные сточные воды городской канализации. Были выделены 214 штамма листерий, из них 92,5% принадлежали L.monocytogenes, 4,2%-L.innocua, 3,3%-L.seeligeri. Skovgard N. (1988)(там же с.24) отмечает, что в отличие от стафилококков, сальмонелл, иерсиний, которые погибают в неаэрированной холодной навозной жиже, листерии хорошо сохраняются в течение длительного времени. Есть данные о том, что листерии способны выживать даже в условиях Арктики.

Листерии ферментируют с образованием кислоты без газа глю-

козу, левулезу, рамнозу, салицин, замедленно - сахарозу, крахмал и глицерин; некоторые культуры разлагают лактозу и мальтозу, не образуют индола, аммиака и сероводорода, не восстанавливают нитраты и не гидролизуют мочевину. Культуры листерий имеют жгутики, подвижны, особенно при низких температурах и по этому признаку резко отличаются почти от всех видов коринебактерий и Erysipe-lotrix. Подвижность при комнатной температуре наиболее резко выражена. При +30 С и даже при +37 С она полностью не исчезает.Эффективным методом для доказательства подвижности является применение 0,2-0,4% питательного агара. По антигенному составу листе-рии имеют сложную антигенную структуру: 6 соматических и 4 жгутиковых антигена. Различают 4 основных серотипа листерий:

Таблица 1.1.

Антигенная структура и серотиповая принадлежность листерий

(по Петерсону).

1 1 I Серотип | 1 I Антигены i

1 1 1 1 1 соматические (0) | жгутиковый (H) |

1 i I 1 II II 1 (III)* 1 AB 1

| 2 |I II (III) 1 BD 1

|3 |1 IV (III) 1 AB 1

1 4 Г 1 1 V (III) 1 i ABC 1 i

Примечание: Антигенный фактор III обнаружился у всех серо-типов листерий в незначительных количествах.

- и -

Серологическому изучению листерий положил начало Seastone К. (1935)(цит. по Зеелегиру X., 1959). Snaltz Е. и Togunlelly (1939)(цит. по Бакулову И.А., Васильеву Д.А., 1991) предложили разделить листериозные штаммы на две серологические группы. Последний автор обозначил их как тип I и тип II. Штаммы I серогруп-пы чаще изолируются от грызунов, а II серогруппы - от с/х животных. Установлено, что серотипы никоим образом не 'коррелируют с определенными видами животных, а связь возможна между серотипом и территорией выделения штамма. В частности, на территории бывшего СССР чаще всего выделяют серовары I серогруппы. Душко Т.И. (1992) изучил моносахаридный состав цитоплазменных антигенов листерий и при этом выявил, что независимо от питательной среды для цитоплазменного антигена I серогруппы характерным является наличие галактозы N-ацетилманнозамина. При изучении белкового состава цитоплазменных антигенов листерий Душко Т.И. и Котляро-вым В. М.. (1992) было выявлено, что у цитоплазменных антигенов листерий есть белки, характерные не только для всего рода Listeria, но и для его отдельных видов.

Свежевыделенные из патологического материала штаммы листерий и гладкие лабораторные культуры обычно патогенны для животных. Это является важнейшим признаком. Поэтому испытание патогенности должно проводится при первоначальном выделении штаммов. Листерии выделяют в культуральную жидкость термолабильный гемолизин, который в результате активации его цистеином вызывает гемолиз эритроцитов голубя, кролика, морской свинки, лошади, а также липолитический фактор, вызывающий цитолиз культуры макрофагов. При распаде из микробных клеток листерий освобождается эндотоксин, который и обусловливает характерные изменения у животных и

людей. Goebel W. е. a.(1995) определили несколько генов вирулентности, так они выявили повышенный синтез различных цитокининов, стресс-протеинов и других клеточных протеинов не известного происхождения. Datta A.R.(1995) установил факторы, контролирующие экспрессию генов вирулентности Listeria monocytogenes: hly, pic A,mpl, prt А и др. Он также установил, что на экспрессию генов hly, pic A, mpl, prt А влияет температура окружающей среды, а на экспрессию гена hly кроме температуры, влияет концентрация NaCl, КС1, глюкозы, рН среды, тепловой шок и др.

Род листерий имеет несколько видов.На И Международном симпозиуме по проблемам листериоза (1992) определено, что в настоящее время существует 6 видов, представленных двумя близкородственными линиями: 1)L.ivanovii, L.innocua, L.Ivanovii ivanovil, L.ivanovli londoniensis, L.seeligeri, L.welchimeri; 2)L.grayi. Все виды и подвиды отличаются по свойствам фенотипа. На межродовом уровне род Listeria наиболее близко родственен роду Brochotrix. Особенно важно выявление двух подвидов у вида L.ivanovii. Листерии довольно пластичны в своей приспособляемости к условиям обитания. Существует несколько точек зрения о природе листериоза. Есть мнение, особенно активно отстаиваимое в последнее время Литвиным и его школой, что листериоз "сапроноз" т.е. его возбудитель- микроб, способный находиться и воспроизводиться в объектах внешней среды. Листериозом болеют как дикие, так и домашние животные, а также птицы. Случаи заболевания животных листериозом описаны в местностях с холодным, жарким и умеренным климатом.Среди домашних животных чаще всего поражаются овцы, кролики, крупный рогатый скот, затем в порядке убывания частоты козы, свиньи и птицы. В единичных случаях заболевают также и лошади. Зарегистрированы

единичные случаи болезни у собак и кошек. Заболевание листериозом среди овец часто сопровождается высоким отходом. Pallas-kae(1979)(цит. по Зеелигеру X., 1959) исчисляет смертность в 15-20%. У овец листериоз характеризуется довольно бурным течением: чаще всего смерть наступает уже через 2-3 дня после появления первых клинических симптомов:повышением температуры, отказ от корма и воды, поражение центральной нервной системы. Была выявлена также стертая форма течения со слабовыраженными симптомами. В ветеринарном руководстве Merck (1991) указано, что смерть может наступить через 4-48 часов после первых признаков болезни и выздоровление наступает крайне редко. У беременных животных развивается прежде всего гнойный метрит большей частью без видимых, сопутствующих явлений со стороны печени или центральной нервной системы и сами животные погибают, от инфекции. Интраутеринное ди-аплацентарное заражение приводит к септической инфекции плода с последующим абортом или мертворождением. Если заражение происходит в конце беременности, часто рождаются живые ягнята, но они вскоре погибают от септической формы л�